Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Sektion Mammary Gland Hele Montage til Lesion Identifikation

doi: 10.3791/55796 Published: July 24, 2017

Summary

Vi udviklede en metode til succesfuld fjernelse, behandling, afsnittet og pletter, til histopatologisk evaluering, brystvæv, der oprindeligt var blevet fastgjort på dias som hele fester. Denne metode kan fremme indsamling og evaluering af brystkirtler hele fester i reproduktive og udviklingsmæssige test guideline undersøgelser.

Abstract

Normal udvikling i brystkirtlen kan ændres ved udsættelse for miljømæssige toksiske stoffer og lægemidler, overdreven eksponering for hormoner og genetiske ændringer. Mammekirtler hele fester er en billig metode til at fange progressionen af ​​morfologiske forandringer, der kan opstå efter eksponering. Men i senere liv, når abnormiteter er mere tilbøjelige til at udvikle sig, kan enlig afhængighed af denne ene metode ikke altid give tilstrækkelig information til at foretage en korrekt diagnose af abnormiteten. Historisk set fjernes en enkelt brystkirtlen ved undersøgelse af kemisk test retningslinier ved nekropsy og fremstilles som en hæmoxylin og eosin (H & E) -farvet sektion. Inkorporering af kontralaterale brystmonterede samlinger og analyser reducerer sandsynligheden for en falsk-negativ vurdering. Evaluering af hele bjerget er begrænset af tilstedeværelsen af ​​en eller to hele brystkirtler på et dias, og i nogle tilfælde er de abnormiteter, der observeres i hele bjerget, ikkeT ensartet repræsenteret i H & E sektionen. Målet med denne undersøgelse var at udvikle en protokol til omdannelse af dækkede brysthuller til H & E-farvede sektioner, således at læsioner, der ellers ville være blevet savnet eller som er vanskelige at diagnosticere, kan identificeres. Her beskriver vi en metode til fremstilling af en højkvalitets paraffinindlejret H & E-sektion fra en brystkirtle, der oprindeligt var forberedt som en hel montering. Sammenlignet med et væv, der var forsætligt forberedt til H & E-sektion, kræver hele bærepladen yderligere forberedelse til fjernelse og behandling af væv. Denne metode anses imidlertid for billig, da det kræver fælles laboratoriereagenser og lidt ekstra tid. Som følge heraf kan denne metode give uvurderlig information om, hvordan kemiske og miljømæssige eksponeringer ændrer normal brystudvikling, samt viser ændringer, der opstår på grund af genetiske modifikationer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brysthulen er en nyttig og billig metode, der implementeres i mange rotte- og musestudier for at forstå både normal og kemisk induceret, abnorm udvikling. I almindelighed vil en brystkirtle indsamlet på forskellige stadier under udvikling af gnaver ( dvs. ungdomsår, puberteten, mellem- til sen-gestation og involutionfasen) vise morfologiske forandringer i væv og cellulær arkitektur påvirket af parakrine, endokrine og autokrine faktorer 1 . I den aldrende rotte bliver de epitheliale og stromale dele af kirtlen mere og mere tætte, hvilket gør måling af morfologiske parametre vanskelige i en hel mount. Således er det almindeligt at samle en kirtel til histologisk evaluering for at identificere ændringer på et mikroskopisk niveau. Begge processer er særligt nyttige i undersøgelser, der involverer kemisk eksponering ( dvs. miljømæssige eller farmaceutiske) eller at undersøge de morfologiske forandringer ledsaget af genetisk altertioner.

Teknikker og evner til brug af brystkirtlen i risikovurdering fortsætter med at udvikle sig. Mens fuldmontering er rutinemæssig og standardiseret, fortsætter modifikationer til snitning 2 , 3 . Mange forskergrupper fra forskellige baggrunde ( dvs. akademi, regering og industri) har tilpasset koronale / langsgående sektioner af brystvæv som en foretrukket metode, mens nogle laboratorier stadig bruger tværsnit gennem huden 4 . Sidstnævnte metode resulterer i en uforholdsmæssig repræsentation af epidermis (hud), snarere end væv af interesse: brystkirtlen epitel 2 . Koronale eller langsgående sektioner er mere anvendelige til karakterisering af normalt væv 5 og forbedrer markant påvisning af abnormiteter og læsioner på grund af det forøgede overfladeareal og antallet af strukturer, der er til stede. Samlet set gør dette hele moIkke en egnet metode til den sammenlignende histopatologiske vurdering af brystkirtlen 1 , 2 . Hvorvidt bruger en mus eller en rotte, selektion, og bevarelse af 4 og 5. ingvinale kirtler anbefales til sammenligning af hele mount til en kontralateral H & E sektion.

Når de anvendes i kombination, giver H & E-sektionen og hele monteringen en præcis redegørelse for de cellulære og morfologiske forandringer, der er forårsaget af miljøeksponering. Dette gælder især i visse gnaverstammer, hvor modellen har en lav modtagelighed for tumordannelse, eller en tumor er ikke groft synlig. Under visse omstændigheder kan det ikke altid være muligt at opnå det krævede væv ved hjælp af begge teknikker ( dvs. utilstrækkelig vævsmængde, ressourcer eller uventede eksperimentelle resultater). I vores tilfælde blev der observeret abnormiteter i hele brystet, mens histopathoLogiske fund i den kontralaterale H & E-kirtlen var for det meste normale. Den overvældende uoverensstemmelse mellem de kontralaterale kirtler førte os til at udvikle en økonomisk og effektiv procedure til at identificere abnormiteterne i hele monteringen. Ved anvendelse af en modificeret behandlings- og indlejringsprocedure blev H & E-farvede sektioner af høj kvalitet fremstillet af paraffinindlejrede hele fester. Vi forestiller os, at denne protokol bliver et kraftigt detekteringsværktøj til kemiske eksponeringseffekter, der forbedrer interlab sammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyreanvendelser og procedurer til denne undersøgelse blev godkendt af NIEHS Laboratory Animal

Pleje- og brugskomité og ledet i en sammenslutning for vurdering og akkreditering af

Laboratoriedyrpleje akkrediteret facilitet.

1. Mammary Whole Mount forberedelse 2 , 3 , 6 , 7

  1. Fjern de indinale brystkirtler fra den ene side af en ikke-gravid CD-1 hunmus, som beskrevet i reference 3 , og anbring dem på et elektrostatisk ladet dias.
  2. Dæk kirtlen med non-stick papir eller film og sæt et nyt lys oven på toppen. Tilsæt tryk ( dvs. vandvægte) til glideren for at sprede kirtlen ud fladt, så kirtlen vil holde sig til glideren til fastgørelse.
  3. Sænk diasene i fixativet ( fx 100% ethanol, chloroform og iseddikesyre i forholdet 6: 3: 1)Natten over ved stuetemperatur.
  4. Fjern kirtlerne fra fikseringsmidlet og vask i ethanol i 15-30 minutter. Efter 30 minutters vask skiftes der gradvist til vand ved at hælde 1/3 af ethanolet og tilsætte vand. Lad vasken sidde i ca. 5 minutter hver gang, og gentag med tilsætning af vand 3 gange.
  5. Stain ( f.eks. Carmine alum-opløsning) i 12-24 timer.
    BEMÆRK: Tykkere væv vil kræve længere farvningstider. Se reference 3 for farvning detaljer.
  6. Hæld pletten ud efter den tildelte tid og skyl skinnerne i vand i 30 s. Dehydrere vævene ved at vaske diasene i 70% ethanol i 15 minutter efterfulgt af at udføre en 15 minutters vask i 95% ethanol og en endelig vask i 100% ethanol i 20 minutter.
  7. Fjern fedtet fra vævene ved at placere dem i xylen i mindst 24 timer eller længere, hvis vævet er tykt, så at eventuelle uigennemsigtige eller hvide områder fjernes.
  8. Fjern vævet fra xylenet og tilføj hurtigt mSkarp medium til diaset for at undgå væv dehydrering; Læg en dæksel på toppen. Lad glideren tørre i mindst 48 timer.
  9. Evaluer det helmonterede væv for abnormiteter som beskrevet i 2 .
    BEMÆRK: Når læsioner opdages i hele monteringer, og sektioner er nødvendige for at fastslå deres identitet, skal følgende trin følges.

2. Fjernelse af Mammary Whole Mount fra et glas Slide

  1. Fjern dækslet og monteringsmediet ved at nedsænke brysthulet hele monteret dias i en glas farveskål fyldt med xylen natten over.
    BEMÆRK: Tykkere væv og dias med overdreven monteringsløsning kan kræve yderligere tid til afdækning af afdækningen.
  2. Efter den indledende natten overblødning skal du sætte gliderne i frisk xylen og bløde i 6 timer. Udfør en endelig suge i frisk xylen natten over.
    BEMÆRK: Dækslet slipper let af glideren efter den sidste sug.
  3. Med agElskede hånd, hold glideren og fjern forsigtigt dækslet med et par tang for at sikre, at det fjernes i ét stykke.
    BEMÆRK: I tilfælde af at dækslet stadig er fastgjort til glasskinnen, fortsæt opsugning, indtil det kan fjernes med ringe indsats.
  4. Når afdækningen er fjernet, hold glideren vinkelret på en glas-petriskål indeholdende xylen, tag forsigtigt et skarpt, engangsbæret knivblad og glid bladet i en enkelt bevægelse ned ad objektglaset.
  5. Når vævet er fjernet, nedsænk hurtigt brystpuden i en xylenfyldt glas petriskål for at sikre, at vævet ikke lufttørrer.
    BEMÆRK: Pas på med dette trin. Hele bjerget er tyndt (≤ 1 mm) og skrøbeligt fra xylenbearbejdning. Eventuelle indtryk eller tårer kan ændre vævets morfologi og komplicere senere evalueringer.

3. Tissue Processing

  1. Når vævet er i petriskålen, skal du omhyggeligt overføre detTil en mærket histologi-kassette. Tag fat i kanten af ​​fedtpladen med stumpede, serrated-tipped tang for at minimere vævsskade.
    1. Ved hjælp af en barbermaskine skal du klippe større væv (især til rotter) i halve og placere dem i to separate mærkede kassetter, der rummer vævsstørrelsen. Placer vævet højre op (brug lymfeknude som reference). Sørg for, at vævet uden lymfeknude holdes i samme oprejst stilling, når det overføres til kassetten.
  2. Placer kassetten i en beholder med xylen i op til 2 timer, før den placeres i vævsprocessoren.
    BEMÆRK: Det anbefales at behandle prøverne samme dag, de placeres i kassetten. Udvidet blødning i xylen er ikke blevet testet.
  3. Indlæs det maksimale antal kassetter i vævsprocessoren manuelt.
  4. Før begyndelsen skal du programmere alle reagenser, der skal bruges til denne proces, til processorens reagensliste. At automatisere bevægelseFra en station til den næste, brug menupunkterne og opret et nyt program. Når alle trin er gennemført, skal du vælge 'OK' for at fortsætte.
    BEMÆRK: Processoren giver mulighed for gennemgang af alle stationsoplysninger inden start.
    1. Automatiser processoren til at suge kassetterne i xylen i 30 minutter ved 37 ° C efterfulgt af en anden blød i frisk xylen under de samme betingelser. Automatiser processoren til at fjerne kassetterne fra xylenopløsningen og overfør vævene til den næste station, der indeholder en 1: 1 xylen: smeltet paraffinblanding sat til 60 ° C i 30 minutter.
      BEMÆRK: Processoren overfører derefter kassetterne til et nyt kammer, der indeholder smeltet paraffin i 1 time. Efter 1 time overføres prøverne automatisk til et nyt kammer af frisk smeltet paraffin og vil blive behandlet i yderligere 2 timer. Begge trin udføres ved 60 ° C.
    2. Processoren overfører derefter kassetterne til stationen, der indeholder smeltet paraFf i 1 time. Derefter overføres prøverne automatisk til den endelige station af frisk smeltet paraffin og behandles i yderligere 2 timer. Begge trin udføres ved 60 ° C.

4. Embedding af den behandlede mammesvæv

  1. Placer kassetterne i 58 ° C paraffinholdigtanken på indlejringsstationen, indtil de er klar til at indlejre vævet i formen.
  2. Fjern kassettedækslet for at bestemme den bedste formstørrelse for vævet. Sørg for, at støbeformen er stor nok til at rumme vævet og efterlade nok plads til at have en vævfri kant af paraffin omkring omkredsen.
  3. Tilsæt 3-4 mm smeltet parafin til støbeformen og orienter brysthulets helmonterede overflade, der var ved siden af ​​glaspladens bund og bunden af ​​kassetten, der vender opad i formen.
  4. Overfør formen til en køleplade og juster vævet hurtigt efter behov, så det er parallelt med formen bottom.
    BEMÆRK: Når paraffinet hærder, vil vævet blive sikret på plads.
  5. Ved hjælp af varme tænger anbringes den mærkede nederste halvdel af kassetten oven på formen Tryk let på tangene.
  6. Tilsæt yderligere smeltet paraffin til formen i en kontinuerlig bevægelse for at dække hele kassetten. Flyt formen fra den varme plade til en kold plade for at afslutte hærdningen af ​​blokken.
  7. Fjern blokken fra formen, når paraffinen fuldstændigt størkner for at undgå revner eller luftbobler.
    BEMÆRK: Opbevar de paraffinindlejrede væv ved stuetemperatur indtil klar til sektion.

5. Sektionering af den paraffinindlejrede mammavæv på mikrotomen

  1. Inden snitning inkuberes paraffinblokkene ved -20 ° C i 1 time.
    BEMÆRK: Der vil være resterende monteringsmedium i blokken fra det originale dækslipede fuldvæv. Chilling blokken forbedrer blokafsnit og ribboning.
  2. Forbered mikrofonenRotom ved at tænde vandbadet, der indeholder frisk destilleret vand, og juster temperaturen til 42-45 ° C. Placer et nyt, lavt profilblad på mikrotomen og sæt det på 4 μm.
    BEMÆRK: Sektionskvalitet reduceres med sektioner tykkere end 4 μm på grund af tilstedeværelsen af ​​resterende monteringsmedium i vævet.
  3. Indsæt blokken i mikrotomet med voks vendt mod bladet og justeret med lodret plan. Derefter fugtes en del af gasbindestang i koldt vand og placeres på blokken i flere minutter.
  4. Sæt blokken ved at dreje det store hjul i retning med uret i kombination med det grove avancerede hjul, indtil der opnås et fuldt ansigt eller et repræsentativt blokblok.
    BEMÆRK: Vævet er tyndt på grund af xylentrensning under hele monteringsprocessen. Juster blokken ordentligt med bladet for at minimere antallet af nedskæringer ved opnåelse af et repræsentativt afsnit.
  5. Vælg båndetSektion med hånden skal du forsigtigt flyde båndet i det varme (45 ° C) vandbad (forberedt på forhånd), lad vævskrympes forsvinde og forsigtigt flyde et afsnit på en ren glasskinne.
  6. Placer diasene oprejst på et tørreholder for at fjerne overskydende vand. Inkuber gliderne i en let åbnet glideboks natten over ved 37 ° C.

6. Automatiseret og manuel H & E-farvning af delte mavevæv

  1. Før farvning opbevares diasene ved stuetemperatur.
  2. Til automatisk farvning skal du vælge H & E fra farvemulighederne i hovedmenuen. Deparaffinisering, farvning og dehydrering er alle afsluttet på den automatiserede farvestof. Brug monteringsmedium og dæksel til montering af sektionerne.
  3. Hvis man manuelt farer gliderne, afgraveres sektionerne ved at nedsænke gliderne i xylen i 5 minutter. Overfør til frisk xylen og gentag i 5 min.
  4. Rehydrer diasene ved at nedsænke thEm to gange i 100% ethanol i 3 minutter hver efterfulgt af to gentagelser i frisk 95% ethanol og to separate vaske i 1X vaskebuffer på 5 minutter hver.
  5. Skyl diaserne i destilleret vand.
  6. Tilsæt diasene til hæmatoxylinet i 1-2 minutter. Fjern gliderne og skyll dem med rindende vand i 5 minutter.
    BEMÆRK: Filtrer hæmatoxylin forud for hver brug.
  7. Placer diasene i 1% iseddikesyre i 30 sekunder for at fremme farvedifferentiering, og skyll derefter i rindende vand fra vand i 1 min.
  8. Tilsæt lysbilleder til 1X PBS i 30 s til 1 min til blå vævssektionerne efterfulgt af en 5 min skylning i ledningsvand og derefter i 95% alkohol i 15-20 s.
  9. Counterstain med eosinopløsning i 30 s til 1 min. Derefter dehydreres diasene to gange i frisk 95% ethanol, efterfulgt af to friske gentagelser i 100% ethanol. Udfør hver vask i 5 minutter.
  10. Ryd gliderne i xylen, med to ændringer i xylen i 5 minutter hver.
  11. dækglasVævsafsnittet med monteringsmedium og tørt fladt natten over ved stuetemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne metode er effektiv til at hjælpe med diagnoser, der ellers kunne være gået glip af, hvis den oprindelige kontralaterale H & E sektion af brystpuden ikke viste nogen histologiske ændringer. Udfaldet vil dog kun være nyttigt, hvis der tages forsigtighed under den indledende fuldmontering, samt under forberedelsen af ​​vævet til den histologiske evaluering. Paraffinindlejring vil give beskyttelse og vil medvirke til at bevare vævet til fremtidig sektion.

For at bestemme den ideelle tykkelse af brystvævet blev 4 μm og 6 μm sektioner fremstillet. Vi testede dybder, der var større end fejlmarginen på ± 1 μm på mikrotomenet. Sektioner af en tykkelse på 6 μm ( Figur 1A ) var meget tætte med kompakte celler. Samlet set manglede diasene tydelige cellulære detaljer, som ville være nødvendige for at få en korrekt identifikationgement. Den optimale tykkelse var 4 μm ( figur 1B ). Disse væv gav de bedste resultater, hvor epitel- og stromarealer og tilsvarende celletyper let blev skelnet.

Slides fra en stor, løbende undersøgelse blev brugt til at illustrere enkelheden og nytteværdien af ​​denne metode. I flere tilfælde viste den oprindelige H & E-sektion fra 14 måneder gamle jomfruhvide CD-1-afkom til at have modstridende fund sammenlignet med den kontralaterale brysthelefuge fra det samme dyr. Lesioner var tydelige i hele bjerget, men kunne ikke identificeres uden yderligere snitning og farvning. Prøver fra to forskellige dyr blev valgt som repræsentative tilfælde. I begge tilfælde blev en enkelt sektion brugt til farvning, men flere nedskæringer blev foretaget, indtil et repræsentativt afsnit blev opnået. Meget få nedskæringer var nødvendige for at få en repræsentativ sektion, da tidligere forberedelser af hele monteringen blev ryddetSt af fedtpuden, der forlader kirtlen meget tynd sammenlignet med en brystkirtlen, der oprindeligt var forberedt til paraffinindlejring, som er omgivet af en tykk fedtpude. Figur 2 A og Figur 3 A illustrerer histologiske afsnit af kirtler, der blev vurderet som normalt. Begge kirtler viser duktale strukturer omgivet af en robust og homogen adipocytrige befolkning. Hver kanal er foret med et enkelt lag af enkle kuboidale epitelceller og opretholdes af et andet lag af basale celler, hovedsagelig sammensat af myoepithelialceller, men omfatter også stamme- og stamcellepopulationer. De repræsentative kontralaterale hylstre ( fig. 2B og fig. 3B ) demonstrerede kanaler og stroma med forøget opacitet. Det var imidlertid vanskeligt at afgøre, om opaqueness var resultatet af hyperplastiske, inflammatoriske eller neoplastiske ændringer medUd at have en H & E sektion, der kunne give forskellige cellulære detaljer.

Kontralaterale hylstre fra de samme dyr blev anvendt til at implementere den her beskrevne fremgangsmåde og kan observeres i figur 2 C og D og figur 3 C og D. Prøverne i figur 2 C & D blev diagnosticeret som perivaskulær inflammation på grund af det forøgede antal lymfocytter, som var til stede omkring en stor blodkar i brystkirtlen. For det andet tilfælde blev brystkirtlen lobulær arkitektur opretholdt, men blev forstørret multifokalt af det øgede antal og størrelsen af ​​normale alveoler og kanaler (lobuloalveolær hyperplasi). Alveolære epithelceller blev godt differentieret, runde, ofte vakuolerede og dannede et koncentrisk lag omkring et lumen, der typisk indeholdt proteinholdigt fluidum. DucT'er blev foret af columnarceller og lignede alveolære celler med et godt differentieret epitel som dannede et koncentrisk lag. Denne fænotype observeres oftest i brystkirtlerne hos mid-gravide mus og rotter. Dette bør ikke forveksles med lobuloalveolære strukturer i brystkirtlerne hos voksne hanrotter 8 . I den voksne mandlige brystkirtlen er alveoler fremtrædende, og kanaler er sjældne, men alveolerne og kanalerne er foret med stratificeret epitel, med høje, vakuolerede kuoidale til korte columna epithelceller.

figur 1
Figur 1 : Anbefalet tykkelse til muskirtlen hele mount til H & E sektioner . A) 6 μm og B) 4 μm. Beslutningerne på brystkirtlen strukturer var ikke optimale til histopatologisk evaluering ved anvendelse af den tykkere (6 - & #181; m) sektioner, så 4-μm sektionen anbefales. Denne figur er blevet modificeret fra Tucker et al. 9 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2 : Hele montering til H & E-sektionen af ​​perivaskulær inflammation. Dette billede er en muskirtler, der blev samlet i diestrus. A) Formalin-fast H & E-brystkirtelsektion uden histopatogiske ændringer. B) Kontralaterale helmonterede sektioner med områder med øget opacitet (boksområde). C) 20x forstørrelse af en H & E sektion fra en brysthulmontering (boxed area). Klynger af mononukleære celler omringede blodkaret og udvidet til det omgivende fedtvæv. D) ThE 40x forstørrelse af en H & E sektion fra en brysthelefelt (boksområde) viser mere detaljeret, at størstedelen af ​​den mononukleære population består af lymfocytter og fremhæver sværhedsgraden af ​​den perivaskulære inflammation. Denne figur er blevet modificeret fra Tucker et al. 9 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3 : Hele montering til H & E-sektionen af ​​lobular alveolær hyperplasi . Dette billede er en muskirtler, der blev samlet i diestrus. A) Formalin-fast H & E-brystkirtelsektion uden histopatologiske ændringer. B) Kontralateral helmonteret sektion med øget opacitet i duktale og stromale områder (boks eren). C) 20x forstørrelse af en H & E sektion fra en brysthulmontering (boxed area). Lobulær arkitektur blev opretholdt, men blev forstørret multifokalt af det øgede antal og størrelse af normale alveoler og kanaler (lobuloalveolær hyperplasi). D) 40x forstørrelsen af ​​en H & E sektion fra en brysthelefelt (boxed area) viser, at de forstørrede lobler indeholder et øget antal alveoler og kanaler, der er foret med vel differentierede, ofte vakuolerede epithelceller, der danner lumen, som indeholder Proteinholdigt væske. Denne figur er blevet modificeret fra Tucker et al. 9 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brystkirtlen hele mount er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at illustrere den normale brystudvikling og morfologiske ændringer, der kan opstå og vedvarer efter udsættelse for kemikalier, herunder hormonforstyrrende stoffer. Når en hel mount og H & E sektion fra det samme dyr vurderes sammen, kan de give et nøjagtigt visuelt snapshot af tidlige ændringer, som kan udvikle sig til en mere syg tilstand.

Evnen til at opnå denne nyttige information ligger i at sikre, at der tages omhu for at bevare og ikke kompromittere glandular morfologi, når vævet fjernes. Mens gnaveren har flere brystkirtelspecifikke lokaliseret bilateralt langs den dorsale væg, anbefales det at indsamle de 4 og 5. kirtler til at minimere muskelvæv recovery. Tippepladsområdet og lymfeknude bør også være til stede, da de tjener som nyttige morfologiske landemærker. Kirtlen skal også spredes og stræChed på tværs af en flad overflade ( dvs. en glasskinne, karton eller klud) for nøje at efterligne vævs naturlige struktur på stedet . Abnormiteter i brystkirtlen er normalt ikke synlige, før kirtlen er blevet fedtet i xylen eller har været karminfarvet. I modsætning til brystvæv, der oprindeligt var forberedt til histologisk snitning, vil en hel fjerdedel fjernet fra glasset til paraffinindlejring være ekstremt tynd og skrøbelig. Tvangsindtryk og vævstår skal undgås, da de muligvis vil ændre cellemorfologi og gøre histopatologiske vurderinger af det færdige produkt svært.

Når hele foden er blevet paraffinindlejret, anbefales det at lade blokerne inkuberes ved -20 ° C i 1 time før snitning. Dette trin forbedrer evnen til at opnå en optimal repræsentativ vævssektion i et bånd. Sektionering af vævet ved 6 μm ( Figur 1A ) 9 figur 1B ) 9 blev alle cellulære træk, herunder epitelvæv og omgivende stromale infiltrationer, let identificeret. Det skal også bemærkes, at selvom disse sektioner tidligere var karminfarvede, var pletten ikke synlig efter snitning og interfererede ikke med H & E-farvning. Derfor var et de-farvningstrin ikke nødvendigt i protokollen. Selv om vævssektioner blev farvet udelukkende med H & E, forventer vi med mindre ændringer, kan andre histokemiske og muligvis immunohistokemiske pletter være gældende, når sektion er afsluttet. Det var dog uden for omfanget af denne protokol og vil kræve yderligere undersøgelser for at bestemme de optimale betingelser for disse pletter.

Denne procedure blev udviklet, fordi vi observerede uoverensstemmende fund mellem rutinemæssigt indsamlede hvemLe mounts og kontralaterale H & E-farvede brystkirtelsektioner fra samme dyr. Lignende brystprotokoller findes 6 , 10 ; Procedurerne var imidlertid ikke detaljerede eller lette at følge. Disse metoder dannede grundlag for udviklingen af ​​vores protokol. Normal kirtelmorfologi blev observeret i de H & E-farvede vævssektioner ( figur 2A og figur 3A ) 1 , medens de komplementære helmonteringer afslørede talrige unormale morfologiske egenskaber ( figur 2b og figur 3b ) 9 . Ved at udføre histologi på hele monteringen kunne vi klassificere de unormale egenskaber. For eksempel blev perivaskulær inflammation og lobuloalveolær hyperplasi identificeret i to separate tilfælde, der var forskellige i forhold til thE H & E-fund observeret i de kontralaterale sider ( figur 2 C og D og figur 3 C og D ) 9 .

Til forfatterens viden er der ikke kendte rapporter om uoverensstemmelser i brystkirtlen, der ligner dem, der observeres i vores igangværende undersøgelse. Dette kan dog skyldes eksperimentelle designproblemer i stedet for manglende forekomst, da brystkirtlen ofte kun indsamles til en applikation eller analyse, der ikke involverer morfologi, såsom RT-PCR eller Western blots. Imidlertid indbefatter mange eksperimenter flere applikationer, der kræver en tilstrækkelig mængde væv til hvert slutpunkt. Den indinale kirtler er det foretrukne valg for hele fester og downstream applikationer, fordi de sjældent har forurenende omgivende væv som thoracalkirtlerne ( dvs. muskelforurening) og fordi de indinale brystlymfeknuder giver værdiMulige landemærker til orientering og sammenligning på tværs af kirtler. Derfor vil beslutningen om hvilken kirtel og hvor meget af kirtlen der vil blive afsat til hver ansøgning påvirke detektionens præcision. Prioritering for anvendelsen af mælkekirtlen bør være: 1) et helt mount sammensat af hele 4 og 5. kirtler, 2) histologi af den kontralaterale 4. kirtel indeholdende noget lymfeknuden til anvendelse som en milepæl, og 3) den kontralaterale 5 th kirtel (uden kontaminerende lymfeknude) til downstream-applikationer (dvs. RNA, DNA og protein). Hvis en unormalitet er synlig ved necropsy, bør en hel mount foretrække histologiindsamling.

Som med enhver protokol er der ledsagende begrænsninger; Behovet for permanent at ødelægge hele bjerget under snitning og have begrænset væv til anvendelse i alternative analyser. Derfor anbefaler vi omfattende dokumentation af hele monteringer med en desktop sCanner til at producere digitale billeder til fremtidig analyse og reference. Hvis der ikke forekommer farvning inden for en måned, begrænses antallet af sektioner til at bevare vævet til fremtidige analyser. Fordelene ved denne hele mount til H & E sektionsmetode opvejer begrænsningerne, således at den kan anvendes universelt til bryststudier, der involverer flere discipliner, især toksikologi. Flere undersøgelser, der bruger kemikalier med kendte endokrine virkninger, har inkluderet en modificeret version af denne protokol, der viser dets anvendelighed 11 , 12 , 13 . Resultater fra disse undersøgelser kan bidrage til at reducere chancerne for et falsk negativt i kemisk test, men kan også give nye eller yderligere oplysninger, der kan bruges til beslutninger om risikovurdering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen modstridende interesser til at erklære i forbindelse med forskning, forfatterskab og / eller offentliggørelse af denne artikel.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Pam Ovwigho, Tenette Jones og Natasha Clayton, NIEHS, for deres tekniske ekspertise og støtte med dette projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Permount Thermo Fisher Scientific SP15-100 mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor Leica Biosystems Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome Thermo Fisher Scientific  905200
Paraffin Leica Biosystems EM-400
Superfrost plus microscope slides Thermo Fisher Scientific 4951PLUS-001 electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1 Thermo Fisher Scientific 12-548-5P coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific A78000014
Sta-On Leica Biosystems 3803107 liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711 Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) 72711
Eosin Leica Biosystems 3801600
Lithium Carbonate SkyTech Laboratories LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38-500 needed in Carnoy's fixative
Chloroform Macron Fine Chemicals 4440-04 needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol The Warner Graham Company 6505001050000 needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol The Warner Graham Company 6505011137320190
Carmine Alum Sigma-Aldrich C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra Sigma-Aldrich A7210-500G
Automation wash buffer, 20X Biocare Medical TWB945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119, (8), 1053-1061 (2011).
  2. Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41, (2), 190-209 (2013).
  3. Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. In press (2017).
  4. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
  5. Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
  6. Mammary gland whole mount processing and staining. Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
  7. Whole mount preparations. Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
  8. Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44, (7), 1034-1058 (2016).
  9. Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44, (7), 1059-1064 (2016).
  10. Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63, (4), 317-324 (2011).
  11. Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146, (9), 4138-4147 (2005).
  12. Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147, (10), 4871-4882 (2006).
  13. Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18, (6), 803-811 (2004).
Sektion Mammary Gland Hele Montage til Lesion Identifikation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).More

Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. J. Vis. Exp. (125), e55796, doi:10.3791/55796 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter