Summary
Nous avons développé une méthode pour éliminer, traiter, sectionner et tacher avec succès, pour l'évaluation histopathologique, des tissus mammaires qui avaient initialement été fixés sur des diapositives en tant que supports complets. Cette méthode peut favoriser la collecte et l'évaluation des montants entiers de la glande mammaire dans les études de référence sur les tests reproductifs et de développement.
Abstract
Le développement normal de la glande mammaire peut être modifié par l'exposition à des substances toxiques pour l'environnement et à des produits pharmaceutiques, une exposition excessive aux hormones et des modifications génétiques. Les supports complets de la glande mammaire sont une méthode peu coûteuse pour capturer la progression des changements morphologiques qui peuvent survenir après l'exposition. Cependant, dans la vie plus tard, lorsque les anomalies sont plus enclines à se développer, la seule dépendance à cette méthode peut ne pas toujours fournir suffisamment d'informations pour faire un diagnostic approprié de l'anomalie. Historiquement, dans les études de référence sur les tests chimiques, une seule glande mammaire est enlevée à la nécropsie et préparée comme une section conservée à l'hématoxyline et à l'éosine (H & E). L'incorporation de la collecte et de l'analyse de la totalité de la mammographie contralatérale diminue la probabilité d'une évaluation faussement négative. L'évaluation de l'ensemble de la monture est limitée par la présence d'une ou deux glandes mammaires entières sur une glissière et, dans certains cas, les anomalies observées dans l'ensemble de la monture ne sont pasT uniformément représenté dans la section H & E. L'objectif de cette étude était d'élaborer un protocole pour convertir des supports complets mammaires coulés en sections teintées H & E afin que les lésions qui auraient autrement été manquées ou difficiles à diagnostiquer puissent être identifiées. Ici, nous détaillons une méthode pour produire une section H & E intégrée à la paraffine de haute qualité à partir d'une glande mammaire initialement préparée en tant que monture complète. Par rapport à un tissu qui a été préparé intentionnellement pour la sectionnement H & E, toute la monture nécessite une préparation supplémentaire pour l'élimination et le traitement des tissus. Cependant, cette méthode est considérée comme peu coûteuse, car elle nécessite des réactifs de laboratoire communs et peu de temps supplémentaire. En conséquence, cette méthode peut fournir des informations précieuses sur la façon dont les expositions chimiques et environnementales altèrent le développement mammaire normal, ainsi que les changements d'affichage qui se produisent à cause des modifications génétiques.
Introduction
L'ensemble complet mammaire est une méthode utile et peu coûteuse mise en œuvre dans de nombreuses études de rat et de souris pour comprendre à la fois un développement anormal normal et chimiquement induit et anormal. En général, une glande mammaire recueillie à différents stades pendant le développement des rongeurs ( c'est-à-dire l' adolescence, la puberté, la gestation moyenne et tardive et la phase d'involution) montrera des changements morphologiques dans l'architecture tissulaire et cellulaire influencée par les facteurs paracrins, endocriniens et autocrins 1 . Dans le rat vieillissant, les portions épithéliales et stromales de la glande deviennent de plus en plus denses, ce qui rend difficile la mesure des paramètres morphologiques dans une monture complète. Ainsi, il est courant de collecter une glande pour une évaluation histologique afin d'identifier les changements au niveau microscopique. Les deux processus sont particulièrement utiles dans les études portant sur l' exposition chimique (c. -à- environnement ou pharmaceutique) ou d'examiner les changements morphologiques accompagnée de génétique alterTions.
Les techniques et les capacités d'utilisation de la glande mammaire dans l'évaluation des risques continuent d'évoluer. Bien que la préparation complète soit routinière et standardisée, les modifications apportées à la section continuent 2 , 3 . Beaucoup de groupes de recherche issus de divers horizons ( c.-à-d. Le milieu universitaire, le gouvernement et l'industrie) ont adapté les sections coronales / longitudinales du tissu mammaire comme méthode préférée, alors que certains laboratoires utilisent encore des coupes transversales à travers la peau 4 . Cette dernière méthode entraîne une représentation excessive de l'épiderme (peau), plutôt que le tissu d'intérêt: l'épithélium 2 de la glande mammaire. Les sections coronales ou longitudinales sont plus utiles pour caractériser le tissu normal 5 et améliorent considérablement la détection d'anomalies et de lésions en raison de la surface accrue et du nombre de structures présentes. Dans l'ensemble, cela rend tout le mondeUne méthode appropriée pour l'évaluation histopathologique comparative de la glande mammaire 1 , 2 . Que ce soit à l' aide d' une souris ou un rat, la récupération et la conservation de la 4 e et 5 e ganglions inguinaux est fortement recommandé pour la comparaison de l'ensemble de montage à une section controlatéral H & E.
Lorsqu'ils sont utilisés en combinaison, la section H & E et le support complet fournissent un compte rendu précis des changements cellulaires et morphologiques induits par l'exposition environnementale. Ceci est particulièrement vrai dans certaines souches de rongeurs dans lesquelles le modèle possède une faible susceptibilité à la formation de la tumeur ou une tumeur n'est pas très visible. Dans certaines circonstances, l'obtention du tissu requis peut ne pas toujours être possible en utilisant les deux techniques ( c.-à-d . Une quantité suffisante de tissus, des ressources ou des résultats expérimentaux inattendus). Dans notre cas, des anomalies ont été observées dans la monture totale mammaire, alors que l'histopathoLes découvertes logiques dans la glande de H & E contralatérale étaient généralement normales. L'écart écrasant entre les glandes contralatérales nous a amené à développer une procédure économique et efficace pour identifier les anomalies dans l'ensemble des montures. À l'aide d'une procédure de traitement et d'encastrement modifiée, des sections colorées H & E de haute qualité ont été préparées à partir de supports entiers intégrés à la paraffine. Nous envisageons que ce protocole devient un puissant outil de détection pour les effets d'exposition chimique, améliorant les comparaisons entre laboratoires.
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Protocol
Tous les animaux utilisés et les procédures pour cette étude ont été approuvés par le NIEHS Laboratory Animal
Comité de soins et d'utilisation et mené dans une association pour l'évaluation et l'accréditation de
Installation de laboratoire agréée pour soins aux animaux.
1. Préparation 2 , 3 , 6 , 7
- Retirez les glandes mammaires inguinales d'un côté d'une souris femelle CD-1 non enceinte, comme décrit dans la référence 3 , et placez-les sur une glissière chargée électrostatiquement.
- Couvrez la glande avec du papier antiadhésif ou du film et placez une autre glissière sur le dessus. Ajoutez de la pression ( c.-à-d., Poids de l'eau) à la glissière pour étaler la glande à plat de façon à ce que la glande se colle à la glissière pour la fixation.
- Immerger les glissières dans le fixateur ( par exemple, éthanol à 100%, chloroforme et acide acétique glacial dans un rapport 6: 3: 1)Nuit à température ambiante.
- Retirez les glandes du fixateur et lavez-les à l'éthanol pendant 15 à 30 minutes. Après le lavage de 30 minutes, changez graduellement à l'eau en versant 1/3 de l'éthanol et en ajoutant de l'eau. Laissez le lavage s'asseoir pendant environ 5 minutes à chaque fois, et répétez avec l'addition d'eau 3 fois.
- Tache ( p. Ex., Solution d'alun de carmin) pendant 12 à 24 heures.
NOTE: Les tissus plus épais nécessiteront des temps de coloration plus longs. Voir la référence 3 pour la coloration des détails. - Verser la tache après le temps alloué et rincer les lames dans l'eau pendant 30 s. Déhydrate les tissus en lavant les lames dans de l'éthanol à 70% pendant 15 minutes, puis en effectuant un lavage de 15 minutes dans de l'éthanol à 95% et un lavage final à 100% d'éthanol pendant 20 minutes.
- Effacez la graisse des tissus en les plaçant dans du xylène pendant au moins 24 h, ou plus longtemps si le tissu est épais, de sorte que toutes les zones opaques ou blanches sont enlevées.
- Retirez le tissu du xylène et ajoutez rapidement mMilieu de la glissière pour éviter la déshydratation des tissus; Placez une lamelle sur le dessus. Laissez la glissière sécher pendant au moins 48 h.
- Évaluer le tissu total pour les anomalies, tel que décrit en 2 .
REMARQUE: Lorsque des lésions sont détectées dans des supports entiers et que la section est nécessaire pour établir leur identité, les étapes suivantes doivent être suivies.
2. Suppression du montage entier mammaire d'une glissière en verre
- Enlevez la lamelle et le support de montage en immergeant la glissière de montage total mammaire dans un pot de teinture en verre rempli de xylène pendant la nuit.
REMARQUE: Des tissus et des lames plus épais avec une solution de montage excessive peuvent nécessiter un temps supplémentaire pour l'élimination des lamelles. - Après le trempage initial pendant la nuit, placez les diapositives dans du xylène frais et trempez pendant 6 h. Effectuez un dernier trempe dans du xylène frais pendant la nuit.
REMARQUE: la lamelle couvre facilement le toboggan après le dernier trempe. - Avec agMain aimée, tenir la glissière et retirer soigneusement la lamelle avec une pince pour s'assurer qu'elle est enlevée d'une seule pièce.
REMARQUE: dans le cas où la lamelle est toujours attachée à la glissière en verre, continuez à tremper jusqu'à ce qu'elle puisse être enlevée avec peu d'effort. - Une fois que le lamelle a été enlevé, maintenez la glissière perpendiculairement à une boîte en Pétri en verre contenant du xylène, prenez soigneusement une lame de rasoir nette et jetable et faites glisser la lame en un seul mouvement vers le bas de la glissière.
- Une fois que le tissu a été enlevé, immergez rapidement le tampon mammaire dans une boîte en Pétri en verre rempli de xylène pour vous assurer que le tissu ne sèche pas.
REMARQUE: faites attention à cette étape. Le support complet est mince (≤ 1 mm) et fragile par le traitement au xylène. Toute impression ou larme peut changer la morphologie du tissu et compliquer les évaluations ultérieures.
3. Traitement des tissus
- Une fois que le tissu est dans la boîte de Petri, passez-le soigneusementÀ une cassette histologique étiquetée. Prenez le bord du coussinet gras avec une pince à pointe dentée à becs serrés pour minimiser les dommages causés par les tissus.
- À l'aide d'un rasoir, couper les tissus plus gros (en particulier pour les rats) en deux et les placer dans deux cassettes étiquetées séparées qui vont accueillir la taille du tissu. Placez le tissu vers le haut (utilisez le ganglion lymphatique comme référence). Assurez-vous que le tissu sans ganglion lymphatique est maintenu dans la même position verticale lorsqu'il est transféré sur la cassette.
- Placez la cassette dans un récipient de xylène jusqu'à 2 h avant de le placer dans le processeur de tissu.
REMARQUE: Il est recommandé de traiter les échantillons le même jour où ils sont placés dans la cassette. Le trempage prolongé dans le xylène n'a pas été testé. - Chargez le nombre maximum de cassettes dans le processeur de tissu à la main.
- Avant le début, programmez tous les réactifs qui seront utilisés pour ce processus dans la liste des réactifs du processeur. Pour automatiser le mouvementD'une station à l'autre, utilisez les options du menu et créez un nouveau programme. Lorsque toutes les étapes sont terminées, sélectionnez «OK» pour continuer.
REMARQUE: Le processeur permettra d'examiner tous les détails de la station avant de commencer.- Automatiser le processeur pour tremper les cassettes dans du xylène pendant 30 min à 37 ° C, suivie d'un second trempage dans du xylene frais dans les mêmes conditions. Automatiser le processeur pour enlever les cassettes de la solution de xylène et transférer les tissus dans la station suivante contenant un mélange 1: 1 xylène: paraffine fondue, réglé à 60 ° C, pendant 30 minutes.
REMARQUE: Le processeur transfère ensuite les cassettes dans une nouvelle chambre contenant de la paraffine fondue pendant 1 h. Après 1 h, les échantillons seront automatiquement transférés dans une nouvelle chambre de paraffine fondue fraîche et seront traités pendant 2 h supplémentaires. Les deux étapes sont effectuées à 60 ° C. - Le processeur transfère ensuite les cassettes à la station contenant un paraplongeFfin pendant 1 h. Ensuite, les échantillons sont automatiquement transférés dans la station finale de paraffine fondue fraîche et traités pendant 2 h supplémentaires. Les deux étapes sont effectuées à 60 ° C.
- Automatiser le processeur pour tremper les cassettes dans du xylène pendant 30 min à 37 ° C, suivie d'un second trempage dans du xylene frais dans les mêmes conditions. Automatiser le processeur pour enlever les cassettes de la solution de xylène et transférer les tissus dans la station suivante contenant un mélange 1: 1 xylène: paraffine fondue, réglé à 60 ° C, pendant 30 minutes.
4. Incorporation du tissu mammaire transformé
- Placez les cassettes dans le réservoir de réserve de paraffine à 58 ° C de la station d'imbibition jusqu'à ce que vous soyez prêt à intégrer le tissu dans le moule.
- Retirez le couvercle de la cassette pour déterminer la meilleure taille de moule pour le tissu. Assurez-vous que le moule est assez grand pour accueillir les tissus, et laisser suffisamment de place pour avoir une bordure de paraffine sans tissus autour du périmètre.
- Ajouter 3-4 mm de paraffine fondue au moule et orienter la surface de montage total mammaire, qui était adjacente au fond de la glissière en verre et au fond de la cassette, vers le haut dans le moule.
- Transférer le moule sur une plaque de refroidissement et ajuster rapidement le tissu au besoin de sorte qu'il soit parallèle au moule bOttom.
REMARQUE: Une fois que la paraffine durcit, le tissu sera soigné en place. - À l'aide de pinces chaudes, placez la moitié inférieure étiquetée de la cassette sur le dessus du moule; Appuyez fermement sur la pince.
- Ajouter de la paraffine fondue additionnelle au moule dans un mouvement continu pour recouvrir toute la cassette. Déplacez le moule de la plaque chaude à une plaque froide pour compléter le durcissement du bloc.
- Retirez le bloc du moule lorsque la paraffine se solidifie complètement pour éviter les fissures ou les bulles d'air.
REMARQUE: conservez les tissus intégrés à la paraffine à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être sectionnés.
5. Sectionnement du tissu mammaire intégré à la paraffine sur le microtome
- Avant la section, incuber les blocs de paraffines à -20 ° C pendant 1 h.
REMARQUE: Il y aura un support de support résiduel dans le bloc à partir du tissu suspendu original. Le refroidissement du bloc améliore la sectionnement des blocs et le ruban adhésif. - Préparez le microRotome en allumant le bain-marie, contenant de l'eau distillée fraîche, et réglez la température à 42-45 ° C. Placez une lame fraîche et bas sur le microtome et réglez-la à 4 μm.
REMARQUE: la qualité de la section est réduite avec des sections supérieures à 4 μm en raison de la présence d'un support résiduel dans le tissu. - Insérez le bloc dans le microtome avec la cire face à la lame et aligné avec le plan vertical. Ensuite, humidifiez une section de gaze à l'eau froide et placez-la sur le bloc pendant plusieurs minutes.
- Sectionz le bloc en tournant la grande roue dans le sens des aiguilles d'une montre, en combinaison avec la roue avancée grossière, jusqu'à ce qu'un visage complet ou une section représentative du bloc soit obtenu.
REMARQUE: Le tissu est mince en raison du déblais de xylène pendant le processus de montage total. Alignez le bloc correctement avec la lame pour minimiser le nombre de coupures dans l'obtention d'une section représentative. - Choisissez le rubanSectionner à la main, soignez soigneusement le ruban dans le bain-marie chaud (45 ° C) (préparé par avance), laissez les rides des tissus se dissiper et faites flotter avec soin une section sur une glissière de verre propre.
- Placez les glissières sur un support de séchage pour éliminer l'excès d'eau. Incuber les glissières dans une boîte coulissante légèrement ouverte pendant une nuit à 37 ° C.
6. Coloration automatisée et manuelle des H & E des tissus mammaires coupés
- Avant la coloration, les diapositives sont conservées à température ambiante.
- Pour la coloration automatisée, sélectionnez H & E à partir des options de tache sur le menu principal. La déparaffinisation, la coloration et la déshydratation sont toutes complétées sur le tache automatisé. Utilisez un support de montage et une lamelle pour monter les sections.
- Si vous coloriez manuellement les diapositives, déparaffinez les sections en immergeant les glissières dans du xylene pendant 5 minutes. Transférer au xylène frais et répéter pendant 5 min.
- Réhydratez les diapositives en immergeantEm deux fois dans de l'éthanol à 100% pendant 3 min chacun, suivi de deux répétitions dans de l'éthanol à 95% frais et deux lavages séparés dans un tampon de lavage 1X à 5 min chacun.
- Rincer les lames dans de l'eau distillée.
- Ajouter les diapositives à l'hématoxyline pendant 1 à 2 minutes. Retirez les glissières et rincez-les avec de l'eau courante pendant 5 min.
REMARQUE: Filtrer l'hématoxyline avant chaque utilisation. - Placez les diapositives dans de l'acide acétique glacial à 1% pendant 30 s pour favoriser la différenciation des couleurs, puis rincer l'eau du robinet pendant 1 min.
- Ajoutez les diapositives à 1X PBS pendant 30 s à 1 min pour les sections bleues des tissus, suivies d'un rinçage de 5 minutes dans de l'eau du robinet puis d'un alcool à 95% pendant 15 à 20 s.
- Contreposer avec une solution d'éosine pendant 30 s à 1 min. Ensuite, déshydratez les diapositives deux fois dans de l'éthanol frais à 95%, puis deux répétitions fraîches à 100% d'éthanol. Effectuez chaque lavage pendant 5 min.
- Effacez les diapositives en xylène, avec deux changements de xylène pendant 5 minutes chacun.
- CoverslipLa section de tissu avec le support de montage et sèche à plat à la température ambiante.
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Representative Results
Cette méthode est efficace pour aider les diagnostics qui auraient peut-être été manquants si la section originale de H & E contralatérale du tampon mammaire n'a montré aucun changement histologique. Cependant, le résultat ne sera utile que si des soins sont pris lors de la préparation initiale intégrale, ainsi que lors de la préparation du tissu pour l'évaluation histologique. L'incorporation de la paraffine fournira une protection et aidera à préserver le tissu pour la section ultérieure.
Pour déterminer l'épaisseur idéale du tissu mammaire, on a préparé des sections de 4 μm et 6 μm. Nous avons testé des profondeurs supérieures à la marge d'erreur de ± 1 μm sur le microtome. Les sections d'une épaisseur de 6 μm ( Figure 1A ) étaient très denses avec des cellules compactes. Dans l'ensemble, les diapositives manquaient de détails cellulaires distincts qui seraient nécessaires pour créer un identifiant appropriéIcation. L'épaisseur optimale était de 4 μm ( figure 1B ). Ces tissus ont fourni les meilleurs résultats, où les zones épithéliales et stromales et les types de cellules correspondantes se distinguent facilement.
Des diapositives provenant d'une grande étude en cours ont été utilisées pour illustrer la facilité et l'utilité de cette méthode. Dans plusieurs cas, la section H & E originale des descendants de CD-1 vierges de 14 mois a eu des résultats contradictoires par rapport à la monture de mammifère contralatérale du même animal. Les lésions étaient évidentes dans toute la monture, mais ne pouvaient être identifiées sans autre section et coloration. Les échantillons provenant de deux animaux différents ont été choisis comme cas représentatifs. Dans les deux cas, une seule section a été utilisée pour la coloration, mais plusieurs coupures ont été effectuées jusqu'à ce qu'une section représentative soit obtenue. Très peu de coupures ont été nécessaires pour obtenir une section représentative, car les préparations antérieures de montage complet ont été effacéesSt du tampon gras, laissant la glande très mince par rapport à une glande mammaire préparée à l'origine pour l'encastrement de la paraffine, entouré d'un tampon gras et gras. La figure 2 A et la figure 3 A illustrent les sections histologiques des glandes qui ont été jugées normales. Les deux glandes présentent des structures canalaires entourées d'une population robuste et homogène et riche en adipocytes. Chaque canal est doublé par une seule couche de cellules épithéliales cubiques simples et est maintenu par une deuxième couche de cellules basales, principalement composée de cellules myo-épithéliales, mais englobant aussi les populations de cellules souches et progénitrices. Les montants entiers contralatéraux représentatifs ( Figures 2B et Figure 3 B ) ont démontré des canalisations et des stroma avec une opacité accrue. Cependant, il était difficile de déterminer si l'opacité était le résultat d'altérations hyperplasiques, inflammatoires ou néoplasiques sansUt ayant une section H & E qui pourrait fournir des détails cellulaires distincts.
Des supports entiers contralatéraux provenant des mêmes animaux ont été utilisés pour mettre en oeuvre la méthode décrite ici et peuvent être observés sur les figures 2 C et D et Figure 3 C et D. Les échantillons de la figure 2 C & D ont été diagnostiqués comme une inflammation périvasculaire en raison du nombre accru de lymphocytes présents sur un grand vaisseau sanguin dans la section de la glande mammaire. Pour le deuxième cas, l'architecture lobulaire des glandes mammaires a été maintenue, mais a été élargie de façon multifonctionnelle par l'augmentation du nombre et de la taille des alvéoles et des conduits normaux (hyperplasie lobuloalveolar). Les cellules épithéliales alvéolaires étaient bien différenciées, rondes, souvent vacuolées, et formaient une couche concentrique autour d'une lumière qui contenait généralement du fluide protéinique. DucLes cellules étaient enroulées par des cellules colloques et étaient similaires aux cellules alvéolaires, avec un épithélium bien différencié qui formait une couche concentrique. Ce phénotype est le plus souvent observé dans les glandes mammaires des souris et des rats à mi-grossesse. Cela ne doit pas être confondu avec les structures lobuloalveolaires dans les glandes mammaires des rats mâles adultes 8 . Dans la glande mammaire masculine adulte, les alvéoles sont proéminentes et les conduits sont peu fréquents, mais les alvéoles et les conduits sont doublés par un épithélium stratifié, avec des cellules epitheliales colossales larges, vacuolées et à colonne courte.
Figure 1 : épaisseur recommandée pour le montage intégral de la glande mammaire de souris sur les sections H & E. A) 6 μm et B) 4 μm. Les résolutions des structures des glandes mammaires n'étaient pas optimales pour l'évaluation histopathologique en utilisant le plus épais (6 - & #181; m), de sorte que la section de 4 μm est recommandée. Ce chiffre a été modifié de Tucker et al. 9 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Partie intégrale à la section H & E de l'inflammation périvasculaire. Cette image est une glande mammaire de souris qui a été recueillie dans diestrus. A) Section de la glande mammaire H & E fixée à la formaline avec aucune altération histopathologique. B) Section de montage total contraalitaire, avec des zones d'opacité accrue (zone encadrée). C) 20x grossissement d'une section H & E à partir d'un support total mammaire (zone encadrée). Des grappes de cellules mononucléaires entouraient le vaisseau sanguin et se prolongaient dans le tissu adipeux environnant. D) ThLe grossissement de 40 000 d'une section H & E à partir d'un ensemble entier mammaire (zone encadrée) montre plus en détail que la majorité de la population mononucléaire est constituée de lymphocytes et souligne la gravité de l'inflammation périvasculaire. Ce chiffre a été modifié de Tucker et al. 9 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Montage complet dans la section H & E de l'hyperplasie alvéolaire lobulaire . Cette image est une glande mammaire de souris qui a été recueillie dans diestrus. A) Section de la glande mammaire H & E fixée à la formaline avec aucune altération histopathologique. B) Section de montage total contralaté avec une opacité accrue dans les zones ducale et stromale (en boîte sontune). C) 20x grossissement d'une section H & E à partir d'un support total mammaire (zone encadrée). L'architecture lobulaire a été maintenue, mais a été élargie de façon multifonctionnelle par l'augmentation du nombre et de la taille des alvéoles et des conduits normaux (hyperplasie lobuloalveolar). D) Le grossissement de 40x d'une section H & E à partir d'un ensemble entier mammaire (zone en caisse) révèle que les lobules agrandis contiennent un nombre accru d'alvéoles et de conduits qui sont bordés par des cellules épithéliales bien différenciées, souvent vacuolées, qui forment des lombes qui contiennent Fluide protéinique. Ce chiffre a été modifié de Tucker et al. 9 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'ensemble complet de la glande mammaire est un outil puissant qui peut être utilisé pour illustrer le développement mammaire normal et les altérations morphologiques qui peuvent survenir et persister après l'exposition aux produits chimiques, y compris les perturbateurs endocriniens. Lorsqu'une partie intégrale et la section H & E du même animal sont évaluées ensemble, elles peuvent fournir un aperçu visuel précis des altérations précoces, qui peuvent progresser dans un état plus malade.
La capacité d'obtenir cette information utile consiste à garantir que des soins soient pris pour préserver et ne pas compromettre la morphologie glandulaire lors de l'élimination du tissu. Alors que le rongeur a plusieurs sites de la glande mammaire bilatérale situés le long de la paroi dorsale, il est recommandé de recueillir les 4 e et 5 e glandes pour minimiser la récupération des tissus musculaires. La zone de fixation du tétine et le ganglion lymphatique devraient également être présents, car ils servent de repères morphologiques utiles. La glande doit également être étalée et étaléeched sur une surface plane ( par exemple, une lame de verre, du papier cartonné, ou de tissu) pour imiter étroitement la structure naturelle du tissu in situ. Les anomalies dans la glande mammaire ne sont habituellement visibles qu'après que la glande a été dégraissée dans du xylene ou a été colorée au carmin. Contrairement au tissu mammaire qui a été préparé à l'origine pour la sectionnement histologique, une monture totale retirée du verre pour l'enrobage de paraffine sera extrêmement mince et fragile. Les impressions de la pince et les larmes des tissus devraient être évitées, car elles modifieront éventuellement la morphologie cellulaire et rendront les évaluations histopathologiques du produit finis difficiles.
Une fois que la monture entière a été mise en paraffine, avant la section, il est recommandé de laisser les blocs incuber à -20 ° C pendant 1 h. Cette étape améliore la capacité d'obtenir une section de tissu représentative optimale dans un ruban. Section du tissu à 6 μm ( Figure 1A ) 9 Figure 1B ) 9 , toutes les caractéristiques cellulaires, y compris le tissu épithélial et les infiltrats stomacaux environnants, ont été facilement identifiées. Il convient également de noter que, bien que ces sections aient précédemment été colorées au carmin, la tache n'était pas visible après la coupe et n'a pas entravé la coloration H & E. Par conséquent, une étape de décoloration n'était pas nécessaire dans le protocole. Bien que les coupes de tissus aient été colorées uniquement avec H & E, nous nous attendons à des modifications mineures, d'autres taches histochimiques et éventuellement immunohistochimiques pourraient être applicables une fois la section terminée. Cependant, il était au-delà de l'étendue de ce protocole et nécessiterait une enquête plus approfondie pour déterminer les conditions optimales pour ces taches.
Cette procédure a été développée parce que nous avons observé des découvertes discordantes entre collectivement collectéesLes peuplements et les tronçons de glandes mammaires colorés contrôlés par H & E contralatéraux du même animal. Des protocoles mammaires similaires existent 6 , 10 ; Cependant, les procédures n'étaient pas détaillées ni faciles à suivre. Ces méthodes ont établi une base pour le développement de notre protocole. La morphologie de la glande normale a été observée dans les sections de tissus colorés par H & E ( Figure 2 A et Figure 3 A ) 1 , tandis que les supports complets complets ont révélé de nombreuses caractéristiques morphologiques anormales ( Figure 2 B et Figure 3 B ) 9 . En effectuant l'histologie sur l'ensemble des montures, nous pourrions classer les caractéristiques anormales. Par exemple, l'inflammation périvasculaire et l'hyperplasie lobuloalveolaire ont été identifiées dans deux cas séparés qui étaient disparates par rapport àLes résultats de H & E observés dans les côtés contralatéraux ( Figure 2 C et D et Figure 3 C et D ) 9 .
Pour les connaissances des auteurs, il n'y a pas de rapports connus sur les écarts de la glande mammaire semblables à ceux observés dans notre étude en cours. Cependant, cela peut être dû à des problèmes de conception expérimentale plutôt qu'à un manque d'occurrence, car la glande mammaire est souvent uniquement collectée pour une application ou une analyse qui n'implique pas la morphologie, comme la RT-PCR ou le Western Blots. Cependant, de nombreuses expériences incorporent des applications multiples nécessitant une quantité adéquate de tissu pour chaque point final. Les glandes inguinales sont le choix privilégié pour les montages entiers et les applications en aval, car ils ont rarement des tissus environnants comme les glandes thoraciques ( c.-à-d. La contamination musculaire) et parce que les ganglions lymphatiques mammaires inguinaux fournissent une valeurRepères capables d'orientation et de comparaison entre les glandes. Par conséquent, décider quelle glande et quelle quantité de glande seront dédiées à chaque application influenceront la précision de la détection. Priorisation pour l'utilisation de la glande mammaire doit être: 1) un ensemble de monture composée de l'ensemble des 4 ème et 5 ème glandes, 2) l' histologie du controlatéral 4 ème glande contenant certains ganglions lymphatiques pour une utilisation en tant que point de repère, et 3) La 5ème glande contralatérale (sans ganglion lymphatique contaminant) pour les applications en aval ( c.-à-d. L' ARN, l'ADN et la protéine). Si une anomalie est visible lors de la nécropsie, un ensemble entier devrait prendre la préférence pour la collecte d'histologie.
Comme pour tout protocole, il y a des limitations qui l'accompagnent; La nécessité de détruire en permanence tout le montage pendant la section et avoir des tissus limités pour l'utilisation dans des analyses alternatives, par exemple. Ainsi, nous recommandons de documenter de manière exhaustive des montages entiers avec un ordinateur de bureauCanner pour produire des images numériques pour une analyse et une référence futures. En outre, si la coloration ne se produira pas dans un mois, limitez le nombre de sections coupées pour préserver le tissu pour toute analyse future. Les avantages de cette méthode de montage intégrale à la méthode H & E l'emportent sur les limites, de manière à pouvoir s'appliquer universellement aux études mammaires impliquant de multiples disciplines, en particulier la toxicologie. Plusieurs études utilisant des produits chimiques ayant des effets endocriniens connus ont inclus une version modifiée de ce protocole, démontrant son applicabilité 11 , 12 , 13 . Les résultats de ces études peuvent aider à réduire les chances d'un faux négatif dans les tests chimiques, mais peuvent également fournir des informations nouvelles ou complémentaires qui peuvent être utilisées pour les décisions réglementaires et d'évaluation des risques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt contradictoire à déclarer en relation avec la recherche, l'auteur et / ou la publication de cet article.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier Pam Ovwigho, Tenette Jones et Natasha Clayton, NIEHS, pour leur expertise technique et leur soutien avec ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , In press (2017).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
- Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
- Whole mount preparations. , Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
