Summary
פיתחנו שיטה כדי להסיר בהצלחה, לעבד, קטע, כתם, להערכה histopathological, רקמת החלב שנקבע במקור על שקופיות כמו mounts שלם. שיטה זו עשויה לקדם את איסוף והערכה של בלוטת החלב כולו mounts במחקרים הנחייה מבחן הרבייה.
Abstract
התפתחות בלוטת החלב הנורמלית עשויה להשתנות על ידי חשיפה לחומרים רעילים סביבתיים ומוצרים פרמצבטיים, חשיפה מוגזמת להורמונים ושינויים גנטיים. בלוטת החלב כולו mounts הם שיטה זולה כדי ללכוד את התקדמות שינויים מורפולוגיים שעשויים להתעורר לאחר החשיפה. עם זאת, בשלב מאוחר יותר בחיים, כאשר הפרעות נוטות יותר לפתח, ההסתמכות הבלעדית על שיטה אחת זו לא תמיד מספקת מספיק מידע כדי לבצע אבחנה נכונה של חריגות. מבחינה היסטורית, במחקרים כימיים מבחן קו מנחה, בלוטת החלב אחד מוסר ב necropsy ומוכן כמו hematoxylin ו eosin (H & E) מוכתם בסעיף. שילובם של אוסף שלם של חולי כליה וניתוחם מקטין את הסבירות להערכה שלילית שגויה. הערכה של כל הר מוגבל על ידי נוכחות של אחד או שניים בלוטות החלב כולו בשקופית, ובמקרים מסוימים, את הפרעות שנצפו הר שלם הם לאלא מיוצגים באופן אחיד בחלק H & E. מטרת מחקר זה היתה לפתח פרוטוקול להמרת mountsipped כל החלב hs כדי H & E- כתמים מוכתמים כך נגעים שאחרת היה החמיצו או שקשה לאבחן ניתן לזהות. כאן, אנו מפרטים שיטה לייצר באיכות גבוהה, paraffin- מוטבע H & E סעיף מתוך בלוטת החלב כי הוכנה בתחילה כמו הר שלם. לעומת רקמה שהוכנה במתכוון עבור חתך H & E, כל ההר דורש הכנה נוספת להסרת רקמות ועיבוד. עם זאת, שיטה זו נחשבת זולה, כפי שהוא דורש ריאגנטים מעבדה משותפת זמן נוסף קטן. כתוצאה מכך, שיטה זו יכולה לספק מידע רב ערך על איך חשיפות כימיות וסביבתיות לשנות את התפתחות החלב רגילה, כמו גם להציג שינויים המתרחשים בגלל שינויים גנטיים.
Introduction
הכל mountis החלב שיטה שימושית וזולה מיושמת רבים עכברים ועכבר מחקרים כדי להבין הן נורמלי כימית-המושרה, התפתחות חריגה. באופן כללי, בלוטת החלב שנאספה בשלבים שונים במהלך התפתחות המכרסמים ( כלומר, גיל ההתבגרות, ההתבגרות, אמצע עד מאוחר ההריון, ואת שלב הפירוק) יראה שינויים מורפולוגיים בארכיטקטורה רקמות הסלולר מושפעים על ידי פרקרין, האנדוקרינית, גורמים אוטוקרינית 1 . ב עכברוש ההזדקנות, מנות אפיתל ו סטרומה של הבלוטה הופכים צפופים יותר ויותר, מה שהופך מדידה פרמטרים מורפולוגיים קשה בהר שלם. לכן, זה נוהג נפוץ לאסוף בלוטה להערכה היסטולוגית לזהות שינויים ברמה מיקרוסקופית. שני התהליכים שימושיים במיוחד במחקרים העוסקים בחשיפה כימית ( כלומר, סביבתיים או פרמצבטיים) או כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים המלווים בגורם גנטיAtions.
טכניקות ויכולות לשימוש בלוטת החלב בהערכת הסיכון ממשיכות להתפתח. בעוד הכנה שלמה הר היא שגרתית סטנדרטית, שינויים חתך להמשיך 2 , 3 . קבוצות מחקר רבות מרקעים שונים (למשל , אקדמיה, ממשל ותעשייה) התאימו חלקים קטנטריים / אורכיים של רקמת החלב כשיטה מועדפת, בעוד שחלק מהמעבדות עדיין משתמשות בקטעים חתוכים דרך העור 4 . השיטה השנייה תוצאות ייצוג מופרז של העור (העור), ולא רקמת עניין: אפיתל בלוטת החלב 2 . חתכים העטרה או האורך הם שימושיים יותר לאפיון רקמות נורמלי 5 לשפר באופן משמעותי את איתור של ליקויים נגעים בשל שטח הפנים מוגברת ומספר המבנים הנוכחיים. בסך הכל, זה עושה את כל מוUnt שיטה מתאימה להערכת histopathological השוואתית של בלוטת החלב 1 , 2 . בין אם באמצעות עכבר או עכברוש, תחזור, ושימור של 4 וה 5 th בלוטות מפשעתי מומלץ מאוד עבור ההשוואה של הר השלם כדי מדור H & E נגדי.
כאשר נעשה שימוש בשילוב, סעיף H & E ואת הר שלם לספק תיאור מדויק של השינויים הסלולר ומורפולוגי הנגרמת על ידי חשיפה סביבתית. זה נכון במיוחד מסוימים זנים מכרסם שבו המודל בעל רגישות נמוכה להיווצרות הגידול או גידול אינו גלוי לעין. בנסיבות מסוימות, לא ניתן תמיד להשיג את הרקמה הנדרשת באמצעות שתי הטכניקות ( כלומר, כמות רקמה לא מספקת, משאבים או תוצאות ניסיוניות בלתי צפויות). במקרה שלנו, הפרעות נצפו הר שלם החלב, ואילו histopathoהממצאים הלוגיים בבלוטת H & E הנגדית היו ברובם נורמליים. הפער המכריע בין הבלוטות הנגדיות הוביל אותנו לפתח הליך חסכוני ויעיל כדי לזהות את החריגות של כל mounts. באמצעות עיבוד עיבוד שונה תהליך ההטבעה, באיכות גבוהה H & E- מוכתמים סעיפים היו מוכנים מ mounts מוטבע paraffin כולו. אנו לדמיין את הפרוטוקול הזה הופך כלי זיהוי רב עוצמה עבור השפעות חשיפה כימית, שיפור השוואות בין המעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל שימוש בבעלי חיים ונהלים עבור מחקר זה אושרו על ידי המעבדה NIEHS בעלי חיים
טיפול ושימוש הוועדה נערך במסגרת איגוד הערכה והסמכה של
מעבדה טיפול בבעלי חיים מוכר מתקן.
1. החלב שלמה הר הכנה 2 , 3 , 6 , 7
- הוצא את בלוטות החלב המשפיעות מצד אחד של עכבר CD-1 לא בהריון, כמתואר בהתייחסות 3 , ומקם אותן על שקף טעונה אלקטרוסטטית.
- מכסים את הבלוטה עם נייר שאינו מקל או הסרט ומניחים שקופית נוספת על גבי. הוסף לחץ ( כלומר, משקולות מים) לשקופית כדי להפיץ את בלוטת החוצה שטוח כך הבלוטה ידבק לשקופית עבור קיבעון.
- להטביע את השקופיות ב מקבע ( למשל, אתנול 100%, כלורופורם, חומצה אצטית קרחוני ביחס 6: 3: 1)לילה בטמפרטורת החדר.
- הסר את הבלוטות מן מקבע ולשטוף באתנול במשך 15-30 דקות. לאחר 30 דקות לשטוף, בהדרגה לשנות למים על ידי שפכו החוצה 1/3 של אתנול והוספת מים. בואו לשטוף לשבת על 5 דקות בכל פעם, וחזור עם תוספת של מים 3 פעמים.
- כתם ( למשל, פתרון alarm carmine) עבור 12-24 שעות.
הערה: רקמות עבה ידרוש פעמים מכתים ארוכים יותר. ראה התייחסות 3 לפרטים מכתים. - יוצקים את הכתם לאחר הזמן המוקצב ולשטוף את השקופיות במים במשך 30 s. מייבשים את הרקמות על ידי שטיפת השקופיות באתנול 70% במשך 15 דקות, ואחריו ביצוע לשטוף 15 דקות באתנול 95% ו לשטוף הסופי באתנול 100% במשך 20 דקות.
- נקה את השומן מן הרקמות על ידי הצבת אותם קסילן למשך מינימום של 24 שעות, או יותר אם הרקמה היא עבה, כך שכל האזורים אטומים או לבנים מוסרים.
- הסר את הרקמה של קסילן להוסיף במהירות מ 'Ounting בינוני לשקופית, כדי למנוע התייבשות רקמה; במקום קוברסליפ. אפשר לשקף להתייבש לפחות 48 שעות.
- להעריך את הרקמה רכוב כולו על חריגות, כמתואר 2 .
הערה: כאשר נגעים מזוהים ב mounts שלם חתך יש צורך להקים את זהותם, השלבים הבאים יש לעקוב.
2. הסרת הר שלם של החזה משקופית זכוכית
- הסר את coverslip ו המדיום הרכבה על ידי שקע החזה כל שקע הר בצנצנת מכתים זכוכית מלא קסילן לילה.
הערה: רקמות עבות יותר שקופיות עם פתרון הרכבה מוגזמת עשוי לדרוש זמן נוסף להסרת coverslip. - לאחר לילה הראשון להשרות, במקום שקופיות קסילן טרי להשרות 6 שעות. בצע אחד הסופי להשרות קסילן טרי בן לילה.
הערה: coverslip יהיה בקלות ליפול את השקופית לאחר האחרון להשרות. - עם agיד אהוב, להחזיק את השקופית להסיר בזהירות את coverslip עם זוג מלקחיים כדי להבטיח כי הוא הוסר חתיכה אחת.
הערה: במידה וה- coverslip עדיין מחובר לשקופית הזכוכית, המשיכו לשטוף עד שניתן יהיה להסיר אותו במאמץ קל. - לאחר coverslip מוסר, להחזיק את השקופית בניצב על צלחת פטרי זכוכית המכילים קסילן, בזהירות לקחת חד חד פעמי, להב גילוח והחלק את הלהב בתנועה אחת בשקופית.
- לאחר הרקמה מוסר, במהירות להטביע את פנקס החלב לתוך צלחת פטרי מלא זכוכית קסילן כדי להבטיח כי הרקמה לא באוויר יבש.
הערה: היזהר בשלב זה. כל הר הוא דק (≤ 1 מ"מ), ושביר מ xylene עיבוד. כל רשמים או דמעות עשויים לשנות את המורפולוגיה של הרקמה ולסבך הערכות מאוחר יותר.
3. עיבוד רקמות
- לאחר הרקמה היא בצלחת פטרי, בזהירות להעביר אותולקלטת היסטולוגיה מסומנת. תפוס את קצה כרית השומן עם מלקחיים בוטה, משונן- tipped מלקחיים כדי למזער נזק לרקמות.
- באמצעות סכין גילוח, לחתוך רקמות גדולות יותר (במיוחד עבור חולדות) במחצית ולמקם אותם שתי קלטות שכותרתו נפרדת כי יהיה להתאים את גודל הרקמה. מניחים את הרקמה בצד ימין למעלה (להשתמש בלוטות הלימפה כהפניה). ודא כי הרקמה בלי בלוטות הלימפה נשמרת באותו מקום, זקוף כאשר הוא מועבר הקלטת.
- מניחים את הקלטת לתוך מיכל של קסילן עד 2 שעות לפני הצבת אותו במעבד רקמות.
הערה: מומלץ לעבד את הדגימות באותו יום שבו הן ממוקמות לתוך הקלטת. מורחבת השריית קסילן לא נבדק. - טען את המספר המרבי של קלטות לתוך מעבד רקמות ביד.
- לפני תחילת, לתכנת את כל ריאגנטים אשר ישמשו בתהליך זה לתוך רשימת המעבד של המעבד. כדי להפוך את התנועה לאוטומטיתמתחנה אחת לאחרת, להשתמש באפשרויות התפריט וליצור תוכנית חדשה. לאחר השלמת כל השלבים, בחר 'אישור' כדי להמשיך.
הערה: המעבד יאפשר לעיין בכל פרטי התחנות לפני תחילת העבודה.- אוטומציה של המעבד להשרות את הקלטות ב קסילן במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ואחריו השני להשרות קסילן טרי תחת אותם תנאים. אוטומציה של המעבד כדי להסיר את הקלטות מן הפתרון קסילן ולהעביר את הרקמות לתחנה הבאה המכיל 1: 1 קסילן: תערובת פרפין מותכת, מוגדר על 60 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות.
הערה: המעבד לאחר מכן להעביר את הקלטות לתוך תא חדש המכיל פרפין מותך עבור 1 שעות. לאחר 1 שעה, דגימות יועברו באופן אוטומטי לתא חדש של פרפין מותך טריים יעובדו עבור 2 שעות נוספות. שני השלבים מתבצעים ב 60 ° C. - המעבד לאחר מכן מעביר את הקלטות לתחנה המכילה פרה מותכתFfin עבור 1 h. לאחר מכן, הדגימות מועברות באופן אוטומטי לתחנה הסופית של פרפין מותך טריים ומעובד עבור 2 שעות נוספות. שני השלבים מתבצעים ב 60 ° C.
- אוטומציה של המעבד להשרות את הקלטות ב קסילן במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ואחריו השני להשרות קסילן טרי תחת אותם תנאים. אוטומציה של המעבד כדי להסיר את הקלטות מן הפתרון קסילן ולהעביר את הרקמות לתחנה הבאה המכיל 1: 1 קסילן: תערובת פרפין מותכת, מוגדר על 60 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות.
4. הטבעת רקמת החלב המעובד
- מניחים את הקלטות ב 58 ° C פרפין מחזיק טנק של תחנת הטבעה עד מוכן להטביע את הרקמה בתבנית.
- הסר את מכסה הקלטת כדי לקבוע את גודל עובש הטוב ביותר עבור הרקמה. ודא כי עובש גדול מספיק כדי להתאים את הרקמה, ולהשאיר מספיק מקום יש גבול ללא רקמות של פרפין סביב המערכת.
- הוסף 3-4 מ"מ של פרפין מותכת על התבנית לכוון את החלב כולו הר משטח, שהיה סמוך לתחתית שקופיות הזכוכית ואת החלק התחתון של קלטת, פונה למעלה בתבנית.
- מעבירים את התבנית לצלחת קירור במהירות להתאים את הרקמה לפי הצורך, כך מקביל עובש באוקטום.
הערה: לאחר hardens hardens, את הרקמה יהיה besecured במקום. - בעזרת מלקחיים חמים, במקום את החלק התחתון, שכותרתו של הקלטת על גבי התבנית; לחץ בחוזקה באמצעות מלקחיים.
- הוסף נוסף פרפין מותך על התבנית בתנועה מתמשכת כדי לכסות את הקלטת כולה. מעבירים את התבנית מהצלחת החמה לצלחת קרה כדי להשלים התקשות של הבלוק.
- הסר את הבלוק מן התבנית כאשר פרפין לחלוטין solidifies כדי למנוע סדקים או בועות אוויר.
הערה: אחסן את הרקמות מוטבע paraffin בטמפרטורת החדר עד מוכן סעיף.
5. חתך את רקמת החלב paraffin- מוטבע על המיקרוטום
- לפני חתך, דגירה בלוקים פרפין ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
הערה: יהיה אמצעי גובר הרכבה בבלוק מן הרקמה coverslipped המקורי הר. מצמרר את הבלוק משפר חתך בלוק ו סרט. - הכן את המיקרופוןRotome על ידי הפעלת על אמבט מים, המכיל מים מזוקקים טריים, ולהתאים את הטמפרטורה ל 42-45 מעלות צלזיוס. מניחים טריים, להב פרופיל נמוך על microtome ולהגדיר אותו 4 מיקרומטר.
הערה: איכות סעיף מופחת עם סעיפים עבים יותר מ 4 מיקרומטר בגלל נוכחות של המדידה הרכבה שיורית ברקמה. - הכנס את הבלוק לתוך microtome עם שעווה מול להב מיושר עם המטוס האנכי. לאחר מכן, להרטיב קטע של פד גזה במים קרים ומניחים אותו על הבלוק במשך כמה דקות.
- חלק את הבלוק על ידי סיבוב הגלגל הגדול בתנועה בכיוון השעון, בשילוב עם גלגל מתקדם גס, עד פנים מלא או קטע נציג של בלוק מתקבל.
הערה: הרקמה היא רזה בגלל ניקוי קסילן במהלך תהליך הר כולו. יישור בלוק כראוי עם להב כדי למזער את מספר הקיצוצים בקבלת קטע נציג. - בחר את הסרטסעיף למעלה ביד, בזהירות לצוף את הסרט באמבטיה חמימה (45 מעלות צלזיוס) מים (מוכן מראש), לאפשר קמטים רקמות להתפזר בזהירות לצוף קטע על שקופית זכוכית נקי.
- מניחים את השקופיות זקוף על מתלה ייבוש להסיר מים עודף. דגירה השקופיות בתיבת שקופיות נפתחה מעט לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
6. אוטומטי ו ידני H & E מכתים של רקמות החלב סעיף
- לפני מכתים, השקופיות מאוחסנים בטמפרטורת החדר.
- עבור מכתים אוטומטיים, בחר H & E מתוך אפשרויות הכתם בתפריט הראשי. Deparaffinization, מכתים, והתייבשות כולם הושלמו על כתם אוטומטי. השתמש בינוני הרכבה ו coverslip כדי לטעון את החלקים.
- אם מכתים את השקופיות באופן ידני, deparaffinize את הסעיפים על ידי שקוע שקופיות קסילן במשך 5 דקות. העברת קסילן טרי וחזור במשך 5 דקות.
- Rehydrate את השקופיות על ידי שקוע הEm פעמיים באתנול 100% עבור 3 דקות כל אחד, ואחריו שתי חזרות באתנול טרי 95% ושני שוטף נפרד 1X לשטוף 1X ב 5 דקות כל אחד.
- שוטפים את השקופיות במים מזוקקים.
- מוסיפים את השקופיות כדי hematoxylin עבור 1-2 דקות. הסר את השקופיות ולשטוף אותם עם מי ברז פועל במשך 5 דקות.
הערה: מסנן hematoxylin לפני כל שימוש. - מניחים את השקופיות ב 1% חומצה אצטית קרחוני עבור 30 s כדי לקדם את בידול צבע, ולאחר מכן לשטוף במי ברז ברז במשך 1 דקות.
- הוסף שקופיות ל 1X PBS עבור 30 שניות עד 1 דקות כחול סעיפים רקמה, ואחריו שטיפה 5 דקות במי ברז ולאחר מכן ב אלכוהול 95% עבור 15 - 20 s.
- Counterstain עם פתרון eosin במשך 30 דקות עד 1. בעקבות זאת, לייבש את השקופיות פעמיים באתנול טרי 95%, ואחריו שתי חזרות טריות באתנול 100%. בצע כל לשטוף במשך 5 דקות.
- נקה את השקופיות קסילן, עם שני שינויים קסילן במשך 5 דקות כל אחד.
- Coverslipאת החלק רקמות עם הרכבה בינונית ויבשה שטוחה בטמפרטורת החדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו יעילה ב סיוע עם אבחנות כי ייתכן אחרת החמיצו אם המקורי H & מקביל סעיף H של פנקס החלב לא הראו שינויים היסטולוגיים. עם זאת, התוצאה תהיה שימושית רק אם הטיפול נלקח במהלך ההכנות הראשונית הר, כמו גם במהלך הכנת הרקמה להערכה היסטולוגית. הטבעה פרפין יספק הגנה יעזור לשמר את הרקמה עבור חתך בעתיד.
כדי לקבוע את עובי אידיאלי של רקמת החלב, 4 מיקרומטר ו -6 מיקרומטר סעיפים הוכנו. בדקנו עומקים שהיו גדולים משולי השגיאה של μm ± 1 על המיקרוטום. חלקים של עובי 6 מיקרומטר ( איור 1 א ) היו צפופים מאוד עם תאים קומפקטיים. בסך הכל, השקפים חסרים פרטים סלולריים שונים, כי יהיה צורך לעשות מזהיםקרח. העובי האופטימלי היה 4 מיקרומטר ( איור 1 ב ). רקמות אלה סיפקו את התוצאות הטובות ביותר, כאשר אזורים אפיתל ו סטרומה סוגי התא המתאים היו להבחין בקלות.
שקופיות ממחקר גדול ומתמשך שימשו להמחשת הקלות והתועלת של שיטה זו. בחלק מהמקרים נמצא כי מקטע ה - H & E המקורי מ - 14 חודשים של צאצאי CD-1 בתולה, נמצא בעל ממצאים סותרים לעומת הר שלם של החלב הנגדי מאותו בעל חיים. נגעו בכל הר, אך לא ניתן היה לזהותם ללא חתכים וכתמים נוספים. דוגמאות משני בעלי חיים שונים נבחרו כמקרים מייצגים. בשני המקרים נעשה שימוש בחלק אחד לצורך הכתמה, אך בוצעו מספר חתכים עד לקבלת קטע מייצג. הקיצוצים המעטים היו נחוצים כדי להשיג קטע נציג, שכן ההכנות הקודמות של כל הרכס פינו מוSt של פנקס השומן, משאיר את הבלוטה רזה מאוד לעומת בלוטת החלב שהוכנה במקור עבור הטבעת פרפין, אשר מוקף בלוק שומן סמיך. איור 2 א 'איור 3 להמחיש סעיפים היסטולוגית של בלוטות שנבחנו כרגיל. שתי הבלוטות מראות מבנים ductal מוקף אוכלוסייה עשירה ואמיגוציט עשיר. כל צינור הוא מרופד על ידי שכבה אחת של תאים אפיתל פשוטים cuboidal ומתוחזק על ידי שכבה שנייה של תאים בזל, המורכב בעיקר תאים myoepithelial, אלא גם מקיפה גזע ואוכלוסיות תאים אב. מייצג את כל mounts צדדי ( תרשימים 2 ב ו איור 3 ב ) הציג צינורות ו stroma עם אטימות מוגברת. עם זאת, היה קשה לקבוע אם העמימות היא תוצאה של שינויים היפרפלסטיים, דלקתיים או נויפלסטיים עםUt בעל קטע H & E שיכול לספק פרטים סלולריים נפרדים.
מרובע כולו mounts מן החיות אותו שימשו ליישם את השיטה המתוארת כאן ניתן לראות באיור 2 C ו- D ואיור 3 C ו- D. הדגימות באיור 2 C & D אובחנו כמו דלקת perivascular בשל מספר מוגבר של לימפוציטים שהיו נוכחים סביב כלי דם גדול בסעיף בלוטת החלב. במקרה השני, ארכיטקטורת הבלוטה החלבית נשמרה אך היא הורחבה על ידי הגדלת מספר וגודל של alveoli ו צינוריות (lobuloalveolar hyperplasia). תאי אפיתל שמימיים היו מובחנים היטב, מעוגלים, לעתים קרובות- vacuolated, ויצרו שכבת קונצנטריים אחת סביב לומן כי בדרך כלל הכיל נוזל חלבון. דוקTs היו מרופדים על ידי תאים עמודתיים היו דומים לתאים alveolar, עם אפיתל מובחן היטב שיצרו שכבה אחת קונצנטריים. פנוטיפ זה נצפה לרוב בלוטות החלב של עכברים באמצע עכברים וחולדות. זה לא צריך להיות מבולבל עם מבנים lobuloalveolar בלוטות החלב של עכברים זכרים בוגרים 8 . אצל בלוטת החלב הבוגרת, אלוולי בולטים וצינורות אינם נדירים, אבל האלוויולי והצינורות מסודרים באפיתל מרובד, עם קובודיאלי גבוה וקטן לתאי אפיתל קצרים.
איור 1 : עובי מומלץ עבור בלוטת החלב העכבר כולו ל H & E סעיפים . A) 6 מיקרומטר ו B) 4 מיקרומטר. ההחלטות של מבנים בלוטת החלב לא היו אופטימליים להערכה histopathological באמצעות עבה (6 - & #181; מ '), ולכן סעיף 4 מיקרומטר מומלץ. נתון זה שונה מ- Tucker et al. 9 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : הר שלם כדי H & E סעיף של דלקת perivascular. תמונה זו היא בלוטת החלב העכבר שנאסף בדיאסטרוס. א) פורמלין קבוע H & E בלוטת החלב ללא שינויים היסטופתוגרפיים. ב) סעיף מקביל הר שלם, עם אזורים של אטימות מוגברת (אזור מוקף). ג) הגדלה 20x של קטע H & E מן הר שלם החלב (אזור מוקף). אשכולות של תאים מונונוגרעיניים הקיפו את כלי הדם והשתרעו ברקמת השומן שסביבה. ד) ThE הגדלה 40x של קטע H & E מ הר שלם החלב (אזור מוקף) מראה בפירוט רב יותר כי רוב האוכלוסייה mononuclear מורכב לימפוציטים ומדגיש את חומרת הדלקת perivascular. נתון זה שונה מ- Tucker et al. 9 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : הר שלם כדי H & E סעיף היפרפלזיה השוליים lobular . תמונה זו היא בלוטת החלב העכבר שנאסף בדיאסטרוס. א) פורמלין קבוע H & E בלוטת החלב ללא שינויים היסטופתולוגיים. ב) סעיף מקביל הר שלם עם אטימות מוגברת באזורים ductal ו סטרומה (הם בתיבהא). ג) הגדלה 20x של קטע H & E מן הר שלם החלב (אזור מוקף). ארכיטקטורה לובולית נשמר אבל הוגדל multifocally על ידי הגדלת מספר וגודל של alveoli ו צינוריות נורמלי (lobuloalveolar hyperplasia). D) הגדלה 40x של קטע H & E מן הר שלם החלב (אזור מוקף) מגלה כי המורחבת האוניות להכיל מספר מוגבר של alveoli וצינורות כי הם בשורה על ידי תאים אפיתל מובחנים היטב, לעתים קרובות, vacuolated, אשר יוצרים lumens המכילים נוזל חלבונים. נתון זה שונה מ- Tucker et al. 9 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הר בלוטת החלב כולו הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי להמחיש את התפתחות החלב הנורמלי שינויים מורפולוגיים שעשויים להתעורר ולהתמיד בעקבות החשיפה לכימיקלים, כולל משברים האנדוקרינית. כאשר כל הר ו H & E סעיף מאותו בעל חיים מוערכים יחד, הם יכולים לספק תמונה חזותית מדויקת של שינויים מוקדמים, אשר יכול להתקדם למצב חולה יותר.
היכולת להשיג מידע שימושי זה טמונה להבטיח כי הטיפול נלקח כדי לשמר ולא להתפשר מורפולוגיה בלוטתית בעת הסרת הרקמה. בעוד המכרסמים יש מספר אתרי בלוטת חלב ממוקמים בילטרלי לאורך הקיר הגבה, מומלץ לאסוף את בלוטות 4 וה 5 th למזער התאוששות רקמת שריר. אזור ההתקשרות הפטמה ואת הצומת הלימפה צריך להיות גם נוכחים, כפי שהם משמשים ציוני דרך מורפולוגיים שימושי. בלוטת צריך להיות גם להפיץ ו למתוחChed פני משטח שטוח ( כלומר, שקופית זכוכית, cardstock, או בד) כדי לחקות מקרוב את המבנה הטבעי של הרקמה באתרם . חריגות בתוך בלוטת החלב הם בדרך כלל לא נראה עד לאחר בלוטה כבר defatted ב קסילן או כבר מוכתמים carmine. שלא כמו רקמת החלב כי היה מוכן במקור עבור חתך היסטולוגית, הר שלם הוסר מן הזכוכית עבור הטבעת פרפין יהיה דק מאוד שביר. דגימות מלקחיים ודמעות רקמה יש להימנע, כפי שהם עשויים לשנות מורפולוגיה הסלולר ולעשות הערכות היסטופתולוגיות של המוצר המוגמר קשה.
לאחר ההר כולו כבר מוטבע paraffin, לפני חתך, מומלץ לאפשר את בלוקים לדגור על -20 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. צעד זה משפר את היכולת להשיג קטע רקמה נציג אופטימלי בסרט. חתך של הרקמה ב 6 מיקרומטר ( איור 1 א ) 9 איור 1 ב ' ) 9 , כל התכונות הסלולר, כולל רקמות אפיתל וחודר stromal שמסביב, זוהו בקלות. כמו כן יש לציין כי למרות חלקים אלה היו מוכתמים בעבר carmine, הכתם לא היה גלוי לאחר חתך ולא הפריע מכתים H & E. לכן, צעד דה מכתים לא היה הכרחי בפרוטוקול. למרות קטעי רקמות היו מוכתמות אך ורק עם H & E, אנו מצפים עם שינויים קלים, כתמים היסטוכימיים אחרים ואולי אימונוהיסטוכימיים עשוי להיות ישים לאחר חתך הושלם. עם זאת, זה היה מעבר להיקף של פרוטוקול זה ידרוש חקירה נוספת כדי לקבוע את התנאים האופטימליים עבור כתמים אלה.
הליך זה פותח משום שראינו ממצאים סותרים בין מי שנאסף באופן שגרתיLe mounts ו contralateral H & E- מוכתמת בלוטת החלב סעיפים מאותו בעל חיים. פרוטוקולים דומים החלב קיימים 6 , 10 ; עם זאת, הנהלים לא היו מפורטים או קל לעקוב. שיטות אלה הקימו בסיס לפיתוח הפרוטוקול שלנו. מורפולוגיה בלוטת רגיל נצפתה H & E- מוכתם רקמת רקמות ( איור 2 א ו איור 3 א ) 1 , בעוד mounts שלם משלים חשף תכונות מורפולוגיות חריגות רבות ( איור 2 ב ואיור 3 ב ) 9 . על ידי ביצוע היסטולוגיה על כל mounts, נוכל לסווג את תכונות חריגות. לדוגמה, דלקת perivascular ו hyperlasia lobuloalveolar זוהה בשני מקרים נפרדים שהיו שונים לעומתE & E הממצאים שנצפו הצדדים הנגדי ( איור 2 C ו- D ו איור 3 C ו- D ) 9 .
לידע של המחברים, אין דיווחים ידועים על פערים בבלוטות החלב הדומות לאלה שנצפו במחקר המתמשך שלנו. עם זאת, זה יכול להיות בגלל בעיות עיצוב ניסיוני ולא חוסר התרחשות, כמו בלוטת החלב הוא אסף רק לעתים קרובות עבור יישום אחד או ניתוח זה אינו כרוך מורפולוגיה, כגון RT-PCR או כתמים המערבי. עם זאת, ניסויים רבים לשלב יישומים מרובים הדורשים כמות נאותה של רקמות עבור כל נקודת קצה. בלוטות המפשעה הם הבחירה המועדפת עבור mounts כולו ויישומים במורד הזרם כי הם רק לעתים רחוקות יש לזהם הרקמות המקיפות כמו בלוטות החזה ( כלומר, זיהום שרירים) ובגלל בלוטות הלימפה החלבית המעי הגס לספק valuציוני דרך עבור אוריינטציה והשוואה בין בלוטות. לכן, להחליט איזה בלוטה וכמה הבלוטה יוקדש לכל יישום ישפיע על דיוק של זיהוי. תעדוף לשימוש של בלוטת החלב צריך להיות עבור: 1) כולה הר המורכב של בלוטות 4 וה 5 th כולו, 2 היסטולוגיה) של 4 הנגדיים ה בלוטה המכילה כמה בלוטה לימפה לשימוש כציון דרך, ו 3) בלוטת 5 th הנגדי (ללא קשר הלימפה מזהם) עבור יישומים במורד הזרם (כלומר, RNA, DNA, וחלבון). אם חריגה גלוי ב necropsy, הר שלם צריך לקחת העדפה לאוסף היסטולוגיה.
כמו בכל פרוטוקול, יש מגבלות נלוות; את הצורך להרוס לצמיתות את כל ההר במהלך החתך ויש רקמות מוגבל לשימוש בניתוח חלופי, למשל. לכן, אנו ממליצים בהרחבה תיעוד כולו mounts עם שולחן העבודה של sCanner לייצר תמונות דיגיטליות לניתוח עתידי והפניה. כמו כן, אם מכתים לא יתרחש בתוך חודש, להגביל את מספר סעיפים לחתוך כדי לשמר את הרקמה עבור כל ניתוח עתידי. היתרונות של הר שלם זה כדי H & E שיטת סעיף להכריע את המגבלות, כך זה יכול להיות מיושם אוניברסלית למחקרים החלב מעורבים דיסציפלינות מרובות, במיוחד toxicology. מספר מחקרים המשתמשים בכימיקלים עם השפעות אנדוקריניות ידועות כללו גרסה שונה של פרוטוקול זה, הוכחת תחולתו 11 , 12 , 13 . ממצאים ממחקרים אלה עשויים לסייע בהפחתת הסיכויים שלילית שלילית בבדיקה כימית, אך עשויים גם לספק מידע חדש או נוסף, שניתן להשתמש בהם לקבלת החלטות רגולטוריות והערכת סיכונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין למחברים אינטרסים מתנגשים להצהיר בהקשר למחקר, להמחשה ו / או לפרסום מאמר זה.
Acknowledgments
המחברים היו רוצים להכיר פאם Ovwigho, טנט ג 'ונס, ו נטשה קלייטון, NIEHS, על המומחיות הטכנית שלהם תמיכה עם הפרויקט הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , In press (2017).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
- Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
- Whole mount preparations. , Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
