Vurdering af Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve og intracellulære diastolisk Calcium fjernelse i isolerede ventrikulær Cardiomyocytes

Summary

Intracellulære calcium genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes. Her, beskriver vi en protokol for at vurdere sarcoplasmic reticulum Ca^{2 +} reserve og diastolisk calcium fjernelse funktion i cardiomyocytes af en calcium imaging system.

Abstract

Intracellulære calcium genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes. Hjerte sarcoplasmic reticulum (SR) fungerer som en Ca^{2 +} reservoir for sammentrækning, hvilke reuptakes intracellulære Ca^{2 +} under afslapning. SR Ca^{2 +} reserve til beats er praecise for hjerte contractibility, og fjernelse af intracellulære Ca^{2 +} er kritisk for diastolisk hjertefunktion. Under nogle patofysiologiske tilstande, såsom diabetes og hjertesvigt, kan nedsat calcium clearance og SR Ca^{2 +} butik i cardiomyocytes inddrages i udviklingen af cardiac dysfunktion. Her, beskriver vi en protokol for at vurdere SRCa^{2 +} reserve og diastolisk Ca^{2 +} fjernelse. Kort, et enkelt cardiomyocyte blev enzymatisk isoleret, og den intracellulære Ca^{2 +} fluorescens drejehastigheden Fura-2 blev optaget af et calcium imaging system. For at ansætte koffein for inducerende samlede SR Ca^{2 +} release, forudindstillede vi en automatisk perfusion switchprogram af interlinking-mekanismen stimulation- og perfusion-systemet. Derefter, mono-eksponentialkurve montering blev brugt til at analysere henfald tid konstanter af calcium transienter og koffein-induceret calcium pulser. I overensstemmelse hermed, bidrag fra SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) og Na⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX) til diastolisk calcium fjernelse blev evalueret.

Introduction

Intracellulære calcium ([Ca^{2 +}]_jeg) genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes¹. Som vi ved, indleder calcium-induceret Ca^{2 +} release excitation-sammentrækning kobling, hvilket oversætte det elektriske signal til sammentrækning. Membran depolarisering aktiverer sarcolemmal L-type Ca^{2 +} kanaler, som inducerer Ca^{2 +} udledning fra SR i cytoplasma via ryanodine receptorer 2 (RyR2). Den forbigående forhøjede cytoplasmatisk Ca^{2 +} indleder sammentrækning af myofibrils. Under diastolen, cytoplasmatisk Ca^{2 +} er reuptaken i SR med SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) og pumpes ud af cardiomyocyte via Na⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX)². Denne proces fører til sammentrækning-lempelse genbrug i cardiomyocyte.

Den kardiale SR er en intracellulær membran netværk, der omgiver de kontraktile maskineri. Det tjener som en Ca^{2 +} reservoir for sammentrækning, og det reabsorbs intracellulære Ca^{2 +} under afslapning. SR Ca^{2 +} reserve til beats er praecise for hjertets kontraktilitet. I mellemtiden, fjernelse af intracellulære Ca^{2 +} er kritisk for kardiale diastolen. Nogle patofysiologiske betingelser såsom diabetes og hjertesvigt, nedsat Ca^{2 +} clearance og deprimeret SR Ca^{2 +} kan butik i cardiomyocytes være involveret i processen med hjerte dysfunktion^{2,3 ,4}.

Til måling af SR Ca^{2 +} release og diastolisk Ca^{2 +} fjernelse i cardiomyocytes, der er to udbredte tilgange: integriteten af NCX nuværende baseret på patch-klemme^5,6, og koffein-induceret Ca ^{2 +} pulse baseret på Ca^{2 +} fluorescens imaging^7,8,9. Den tidligere tilgang afhænger det faktum, at den Ca^{2 +} frigivet fra SR er i vid udstrækning pumpes ud af cellen af NCX. Dog, denne fremgangsmåde er begrænset af sine krav af avanceret udstyr og dygtige drift. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en praktisk tilgang til at vurdere SR Ca^{2 +} reserve og Ca^{2 +} fjernelse i myocytes ved at måle en koffein-induceret Ca^{2 +} pulse baseret på en Ca^{2 +} fluorescens imaging system. Kort, intracellulære Ca^{2 +} Fluorescens er indiceret ved Fura-2. Ved en sammenknytning af stimulation system og perfusion, præsenterer vi et program for skifter perfusion og pacing system automatisk. 10 mM koffein var ansat til hurtigt inducerer samlede Ca^{2 +} udgivelse i SR. Eksponentiel henfald tid konstanter (Tau) af calcium transienter og koffein-induceret calcium pulser blev indhentet fra mono-eksponentiel kurve montering, som afspejler SERCA og NCX bidrag til diastolisk Ca^{2 +} fjernelse i overensstemmelse hermed.

Protocol

alle dyreforsøg blev udført efter protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på eksperimentelle Research Center, Kina kinesisk medicinsk akademi og Zhejiang University.

1. løsning forberedelse

1. forberede alle løsninger, som beskrevet i tabel 1.

2. isolation af venstre ventrikel (LV) Cardiomyocytes

NOTE: LV cardiomyocytes er isoleret enzymatisk ved hjælp af en Langendroff perfusion system som tidligere beskrevet ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

1. Angive Langendroff perfusion system. Fyld perfusion system med Normal Tyrode (NT) løsning, Indstil temperaturen på 36,5 ° C og fjerne eventuelle luftbobler i røret.
2. Vejer og bedøver Sprague-Dawley rotte ved intraperitoneal injektion (ip) af Kloral hydrat (400 mg/kg). Bekræfte bedøvelsesmiddel status ved at evaluere hale eller tå knivspids svar efter 5 min.
3. Åbner i bughulen under formet som et sværd proces med en kirurgisk saks, løfte formet som et sværd proces og åbne brystet med en saks. Fjerne at hjertesækken, lidt løft hjertet med buet pincet, identificere aortabuen og afskære hjertet af saks fra roden af aorta.
4. Overføre hjertet til en 60-mm parabol og vaske det med NT løsning. Hold aorta med to mikro-dissekere pincet, og montere det på Langendorff perfusion kanyle, og derefter fast ligate aorta på kanylen ved hjælp af kirurgiske suturer.
   Bemærk: En dygtig operatør kan afslutte denne proces inden for 15 s.
5. Perfuse hjerte med 30 mL NT løsning til at inddrive omsætning af kranspulsårerne. Skifter derefter til perfusate til 30 mL Ca ^{2 +}-gratis Tyrode løsning (10 mM taurin, 1 mg/mL BSA) for at stoppe hjerteslag. Derefter skal du bytte perfusate til Collagenase A isolation løsning (0,6 mg/mL) for enzymet fordøjelsen.
   Bemærk: Brug Collagenase A for eksperimenter med diabetisk rotter eller Collagenase II for eksperimenter uden diabetisk rotter.
6. Efter fordøjelsen i 20-25 min., hurtigt ændre perfusion løsning til Ca ^{2 +}-gratis Tyrode løsning for at stoppe yderligere fordøjelsen. Hold derefter, hjertet med pincet, afskåret fra kanylen og sted midt i en 35-mm skål indeholdende KB løsning (Se tabel 1).
7. Dissekere LV væggen med saks og pincet. Afbrød atrium, højre hjertekammer og atrioventrikulær junction område. De resterende væv er LV; overføre det ind i en ny 35 mm parabol med KB løsning. Hakkekød LV væv i små stykker.
8. Forsigtigt afpipetteres stykker med en filtreret plast dropper, og genopslæmmes i 10 mL KB løsning.
9. Filter celler med 150 µm blænde rustfrit stål filter og overførsel til en 15 mL centrifugeglas. Der centrifugeres ved 150 x g for 30 s og kassér supernatanten. Genopslæmmes myocytes i 10 mL KB løsning, gratis nøjes med 6 min, supernatanten, og genopslæmmes toerstoffet i 10 mL KB løsning.
   Bemærk: Alle trin er udført på 36 ° C i løsninger gasset med 100% O ₂.

3. Calcium genindførelse

1. efter afregning for 20 min i KB løsning, supernatanten fjernes, og genopslæmmes myocytes med calcium genindførelse opløsning A (0,3 mM Ca ^{2 +}, 4,5 mL Ca ^{2 +}-gratis Tyrode løsning, 1,5 mL NT løsning) for 10 min.
2. Genganger den ovenfor fremgangsmåde med calcium genindførelse løsning B (0,3 mM Ca ^{2 +}, 3 mL Ca ^{2 +}-gratis Tyrode løsning, 3 mL NT løsning).
3. Gentag ovenstående procedure med NT løsning (1,2 mM Ca ^{2 +}) til at rense de tilgængelige myocytes. Gemme den isolerede LV myocytes i denne løsning og studere dem inden for 4-6 h.

4. Sat op af Perfusion System

1. forbinde indstrømning tube med NT løsning for kammer perfusion ( figur 1A).
2. For nål perfusion af mål myocyte, Tilslut den multi tønde mangfoldige spids (fx, perfusion blyant, omtales som blyant fremover), fast i micromanipulator, at ventilen styres perfusion system. Føje NT løsning og 10 mM koffein løsning til hver kolonne af blyant ( figur 1A).
3. Evakuere eventuelle luftbobler i rør til at undgå luft blokering.
4. Antal dryp fra micron spidsen af blyanten for 10 s, og manuelt justere flow regulator til at holde flow hastighed med en omtrentlig hastighed af 3 drop/10 s.

5. Målinger af intracellulære Ca ^{2 +} forbigående og sarkomeret afkortning ^{7 , 8 , 9}

1. afpipetteres 10 µL cellesuspension på diaset, tælle celle numre af en celle counter under mikroskop, og massefylden beregnes. Fortynd myocytes til en omtrentlige koncentration af 50.000 celler/mL.
2. Tilføj Fura-2 acetoxymethyl (AM) bestand (et calcium følsomme farvestof) i en 1 mL suspension af myocytes at bringe de endelige koncentration til 2 µM. holde i mørke i 20 min. ved stuetemperatur.
3. Centrifuge på 150 g til 30 s, og genopslæmmes cardiomyocytes med NT løsning 2 gange.
4. Turn off lyset og holde cellerne i mørke. Sted myocytes i perfusion kammer for 15 min. Derefter starte kammer perfusion (1,5 mL/min.) med NT løsning. Tempo i myocytes med 1 Hz felt stimulation ved hjælp af en stimulator (bølge varighed 4.0 ms, pulse amplitude 8.0 V) i 5 min.
5. Vælg en myocyte med god form (stang form, skarpe kant, og fjern markeringen tværs riller) og stabil stimuleret spjæt (ingen spontan sammentrækning) under 10 x mikroskopiske mål linse. Næste, ændre den mikroskopiske forstørrelse til 40 x, og rotere CCD kamera-retning for at holde myocyte i en vandret position.
6. Ramme den enkelt myocyte ved at justere celle indramning adapter. Sikre, at baggrunden er klar.
7. Afsløre myocytes til en xenonlampe lysstyrken med 340 eller 380 nm bølgelængde excitation filtre, og billedet myocytes gennem en 40 x mål. Registrere fluorescens signal på 510 nm. I mellemtiden, Bemærk sarkomeret længde ændringer af myocytes og optage med modulet soft-kant samtidigt.
8. Optage fluorescens af en dual-excitation fluorescens photomultiplier system. Køre programmet optagelse for calcium imaging system, skal du klikke på " fil/ny fil " til at oprette en ny optagelse-fil, og klik på den " start " knap til synkront optage fluorescens og sarkomeret længde.

6. Vurdering af SR Ca ^{2 +} Reserve og diastolisk Ca ^{2 +} fjernelse funktion ^{7 , 8 , 9}

1. Interlink den " Aux Out " port i stimulator med den " Analog i " port på ventil kontrolsystem (f.eks. ventil commander, se Tabel af materialer) af et BNC-kablet (til at synkronisere TTL signal).
2. Forudindstillede et program for at skifte perfusion ventiler automatisk som tidligere beskrevet ^{8 , 9}; Detaljerede trin til operation er opført som følgende.
   1. Forudindstillede parametre i ventil kontrol software Ifølge tabel 2, og klik på den " Download " knap hen til dataoverføre sekvensen indlæses i programmet. Klik på den " TriggØh " knap til at aktivere funktionen trigger.
      Bemærk: Ventil kontrolsystem kan udføre rækkefølgen efter modtagelsen TTL signalet.
   2. Forudindstillede stimulator til sekvenstilstand, og Indstil parametrene ifølge tabel 3.
3. Sæt stimulator på " S1 trin " for at tempoet LV myocytes på 1 Hz. starte nål perfusion hastighed på 1,5 mL/min. med NT løsning.
   Bemærk: Fordi nålen stream hastighed er hurtigere end kammer perfusion, lys brydning af nålen stream er forskellig fra den lys brydning af kammeret perfusion. Forskellen på lys brydning angiver vifte af effektive nål perfusion, der omgiver målet myocyte.
4. Skal du vælge en target myocyte under visningen simpel kraft mikroskopiske (i rækkefølgen af downstream til upstream), og sørg for at det kan nås med micro spidsen af blyanten. Ændre mikroskop forstørrelse 400 x. Rotere CCD kamera-retning for at holde myocyte i den vandrette placering. Justere den rektangulære blænde under celle indramning adapter til en passende vindue, der fylder med myocytes. Sikre, at der er minimal baggrund; tillader ikke andre myocytes eller døde celle debris i dette vindue.
5. Justere placeringen af blyanten fast på micromanipulator, og Anbring forsigtigt mikro spidsen på afstand af radiussen af vision felt til target myocyte under 400 x mikroskop forstørrelse.
6. Justere nålen stream vifte at for det meste dækker target myocyte og sørg for, at myocyte ikke kan blive fejet væk af nålen flow.
7. Efter 60 s grundlæggende pacing, roll stimulator markøren til de " D2 skridt ".
   Bemærk: Resten af protokollen vil blive udført automatisk af stimulator og ventil kontrolsystem. Baseret på de ovenstående indstilling, protokollen kunne udføres automatisk som i figur 2A, 1 Hz grundlæggende pacing med NT løsning for 60 s. Derefter pause pacing og forsinkelse for 2 s, hurtigt skifte til 10 mM koffein perfusion for 15 s (til funktionelt frigive Ca ^{2 +} opbevaring i Den Slovakiske Republik), og derefter skifte tilbage til NT løsning.
8. i slutningen af optagelsen, opdage baggrund fluorescens for individuelle myocytes. Klik på den " pause " knappen for at pause filen optagelse, flytte den mikroskopiske udsigt til et nærliggende tomt område. Klik på den " post "-knappen for at genoptage indspilningen i sekunder, og optage numeriske 340 og 380 nm intensitetsværdierne for baggrundskorrektion.
9. Åbne den " drift/konstant " dialogboksen og udfylde værdier i den " baggrund " udgør henholdsvis; softwaren kan rette Fura 2 ratio værdierne ved at fratrække baggrunden.

7. Data analyse ⁹

1. For målinger af calcium transienter og sarkomeret afkortning på stadiet grundlæggende pacing, gennemsnitlig spjæt pulser, og derefter analysere dynamiske parametre, såsom calcium transienter, tid konstant calcium forbigående henfald (Tau-1 Hz), ved hjælp af softwaren automatisk.
   Bemærk: Hvis softwaren ikke passer henfald segment godt, eksportere tilbagegang spor til manuel mono-eksponentialkurve montering.
2. For koffein-induceret calcium pulser, Vælg kun pulsen med en stejl bølge for analyse af calcium fjernelse funktion. Udelukke celler med signal forstyrrelser, unormal puls, eller dem, der flød væk midway.
3. Måle amplitude af koffein-induceret calcium puls (Ca-koffein, et indeks af SRCa ^{2 +} reserve).
4. Få tænderne tid konstant af koffein-induceret calcium puls (Tau-koffein) af mono-eksponentialkurve montering (10 s varighed) manuelt fra softwaren ( figur 2 c).

Representative Results

Her, vi illustrere streptozotocin (STZ) - induceret diabetisk rotter (DM) og alder-matchede Sprague - Dawley (SD) rotter f.eks. 8-uge-forhenværende mandlige SD rotter (200 ± 20 g) modtaget en enkelt intraperitoneal injektion af STZ (70 mg/kg, ip) til DM gruppe eller citrat buffer for kontrolgruppen. Én uge efter administration af STZ rotter med blodglukose > 16,7 mmol/L blev anset for diabetisk. Efter 8 uger blev LV myocytes enzymatisk isoleret. Efter calcium genindsætning er der omkring 70-80% af myocytes, der forbliver i overlevelse tilstand. Kun myocytes med en stang-figur, klart riller og stabil sammentrækninger blev udvalgt til optagelse (figur 1B). Som vist i figur 1A, nedsat vi kammer perfusion og nål perfusion for myocytes. Perfusion ventiler og pacing system blev automatisk skiftede af en forudindstillet programmet som beskrevet i figur 2A. Intracellulære calcium fluorescens blev optaget af en calcium imaging system. Værdier blev rapporteret som gennemsnit ± SEM.

Sammenlignet med SD-gruppen, gruppen DM viste signifikant lavere amplitude af koffein-induceret calcium puls (Ca-koffein) (0.332 ± 0,008 vs. 0,276 ± 0,008, t-test: p < 0,05) og en lavere fraktioneret calcium udgivelse SR (Ca-1 Hz / Ca-Caffeine) (78,5 ± 1,5% vs. 72.1 ± 1,0%, t-test: p < 0,05) (figur 2B). Tau-1 Hz og Tau-koffein blev indhentet fra mono-eksponentiel kurve montering; DM-gruppen viste bemærkelsesværdige længere henfald tid konstanter af koffein-induceret calcium puls (Tau-koffein) (1.822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0.088 ms, t-test, p < 0,05), og et højere niveau i Tau-1 Hz/Tau-koffein ratio (0.076 ± 0,003 vs. 0.086 ± 0,003, t-test, p < 0,05) end gruppen SD (figur 2D). Disse resultater angivet den deprimerede SR Ca^{2 +} reserve og nedsat Ca^{2 +} rydning i diabetisk cardiomyocytes.

Figur 1. Illustration af perfusion system og isolerede LV myocytes. (A) Illustration af kammeret perfusion og blyant perfusion. Pilene angiver strømningsretning af NT løsning i perfusion kammer. Blyanten giver perfusion omkring target myocyte med NT eller koffein løsning. Micron tip kan manipuleres frit over salen. (B) mikroskopiske udsigt over isoleret LV myocytes med en stang-form og klar cross riller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Vurdering af SR calcium reserve og calcium fjernelse funktion. (A) Illustration af protokollen til skifte perfusion ventiler og pacing system automatisk. (B) statistiske værdier af SR Ca^{2 +} reserve og SR fraktioneret Ca^{2 +} overgang til 1 Hz stimuleret sitren i DM og SD grupper. DM-gruppen viste signifikant nedsat SR Ca^{2 +} reserve og SR fraktioneret Ca^{2 +} frigive end SD-gruppen. (C) Software panelet viser et manuelt mono-eksponentiel kurve montering for at tænderne tid konstant af koffein-induceret calcium puls (Tau-koffein). (D) søjlediagrammer sammenligning af Tau-koffein og Tau-1 Hz/Tau-koffein mellem DM og SD grupper. Gruppen DM viste signifikant øget værdier af Tau-koffein og Tau-1 Hz/Tau-koffein end SD-gruppen. Værdi = gennemsnit ± SEM, t-test blev udført, *p < 0,05 sammenlignet med gruppen SD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Løsninger	Indholdet (i mM)
Normal Tyrode (NT) løsning	135 NaCl, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukose, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 1,2 CaCl2, Juster pH med NaOH til 7,35
Ca2 + gratis Tyrode løsning	135 NaCl, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukose, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 10 taurin, justere pH med NaOH til 7,35
Collagenase isoleret løsning	Collagenase A eller Collagenase II + Ca2 + gratis Tyrode løsning
KB løsning	120 KOH, 120 L-glutaminsyre, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 glukose, 20 taurin, justere pH til 7,35 med KOH
Koffein perfusion løsning	10 koffein i NT løsning

Tabel 1. Løsninger til LV myocytes isolation og cellulære perfusion.

Ventil	Tid (andet)
2	15
1	60

Tabel 2. Forudindstillede parametre i ventil kontrolsystem (ventil commander).

Kontrolpanelets display	kommentar
4.0 ms varighed	elektrisk stimulation felt tid
8.0 V	elektrisk spænding
S1 1,0 HZ 999S	Find mål myocyte på pacing status
D2 001S	Marker dette trin til pause pacing og forsinke 1s efter basal spjæt optagelse
D3 015S *	"*" angiver, at stimulatoren kan udsende en 5V TTL signal
D4 060S	Udfør koffein perfusion og myocyte gendanne til normal tilstand
UDGANGEN	rollback til S1 trin

Tabel 3. Forudindstilling af parametre i stimulatoren.

Discussion

Calcium flux frigivet fra SR er den største Ca^{2 +} kilde for systole i hjertet. Til nogle omfang, amplitude af SR Ca^{2 +} indhold og fraktioneret Ca afspejler^{2 +} frigivet fra SR den SR Ca^{2 +} reserve tilgængelige for hjertets sammentrækning. På den anden side afhænger Ca^{2 +} reserven af SR af SR Ca^{2 +} reuptake, Ca^{2 +} lækage af SR og deres balance evne på tværs af SR under diastolen^12,13,14. I vores eksperiment, hurtig anvendelse af 10 mM koffein har til formål at fremkalde samlede Ca^{2 +} frigive og forhindre Ca^{2 +} reuptake i SR ved at åbne RyR kanal. Amplituden af den koffein-induceret Ca^{2 +} pulse kunne således bruges som et indeks af SR Ca^{2 +} reserve. Derudover med grundlæggende pacing i 1 Hz og 3 Hz, kunne vi yderligere undersøge frekvens-afhængighed af SR belastning og dens underliggende mekanisme⁶.

Fjernelse af Ca^{2 +} i cytoplasma er kritisk for diastolisk hjertefunktion. Som vist i figur 2A, i fase 1 Hz felt stimulation, blev nedgangen i calcium transienter tilskrevet SERCA i SR, NCX i cytomembrane, og langsom transportsystemer (mitokondrie Ca^{2 +} uniporter og sarcolemmal Ca^{2 +} -ATPase). Som bidrag til langsom mekanismer er ubetydelig, afspejler henfald tid konstant af Ca^{2 +} forbigående (Tau-1 Hz) den kombinerede aktivitet af SERCA og NCX^7,8,9. I fase af koffein perfusion undladt SERCA at bygge SR calcium reserve. Således var nedgangen i koffein-induceret calcium puls (Tau-koffein) hovedsagelig tilskrives NCX. Tilsvarende, NCX funktionen er negative relevant til Tau-koffein. NCX bidrag til diastolisk Ca^{2 +} fjernelse er positivt som relevante for forholdet mellem Tau-1 Hz/Tau-koffein. SERCA bidrag er positivt som relevante for forskellen mellem Tau-koffein og Tau-1 Hz^7,8,9.

Fuldført proceduren (figur 2), der er nogle tekniske nøglepunkter, der bør bemærkes. For det første om oprettelse af en automatiseret system er afgørende for at skifte pacing og perfusion systemet præcist. Den forudindstillede program kunne styre forsinkelsestiden præcist og anvende koffein perfusion hurtigt. For det andet, i løbet af processen er myocytes med risiko for at blive skyllet væk af perfusion løsning. For at holde myocytes stabilt levet op til fadet, kammer, skal cellerne placeres i skålen i mere end 15 minutter før optagelse.

Yderligere, at oprette en stabil nål perfusion system for anvendelse af koffein er en anden afgørende skridt. Der er tre centrale punkter for dette trin: (1) hurtig channel-switch og glat nål perfusion, (2) velkontrollerede perfusion strømningshastighed og (3) korrekt afstand mellem nål-spids og målrette myocyte. Upassende indstilling af strømningshastighed, tip afstand eller indblanding i parameteren løsning kanal kan resultere i svigt ved at erhverve en acceptabel koffein-induceret calcium puls. Koffein-induceret calcium pulser, kunne kun pulsen med en stejl bølgetop være markeret for analyse af calcium fjernelse funktion.

Den alternative metode baseret på patch-clamp system kan give forholdsvis nøjagtige data. Men, nogle faktorer, såsom indad-rektifikation K⁺ løbende, kan påvirke nøjagtigheden. Desuden kan en højere krav af avanceret udstyr, dygtig tekniker og tidsforbrug også begrænse anvendelse af patch-klemme. Til en vis grad har vores protokol den begrænsning, at det ikke kunne give direkte værdier af SR belastning eller aktivitet af SERCA og NCX. Parametre (f.eks.Ca-koffein, Tau-koffein) kun afspejler skiftende SR indhold og bidrag til diastolisk Ca^{2 +} fjernelse indirekte. Denne protokol har dog fordelen af bekvemmelighed, mindre begrænsning af teknik og udstyr.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucose	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutamic	Alfa Aesar	A15031
Taurine	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436