Summary
Intracellulär kalcium återvinning spelar en avgörande roll i reglering av systolisk och diastolisk funktion i hjärtmuskelceller. Här beskriver vi ett protokoll för att utvärdera sarkoplasmatiska nätmagen Ca2 + reserv och diastoliskt kalcium borttagning funktion i hjärtmuskelceller genom en kalcium imaging system.
Abstract
Intracellulär kalcium återvinning spelar en avgörande roll i reglering av systolisk och diastolisk funktion i hjärtmuskelceller. Hjärt sarkoplasmatiska Retikulum (SR) fungerar som en Ca2 + reservoar för kontraktion, som reuptakes intracellulära Ca2 + under avkoppling. Den SR Ca2 + reserven tillgänglig för beats är bestämd för hjärt contractibility och borttagning av intracellulära Ca2 + är kritiska för diastolisk hjärtfunktion. Under vissa patofysiologiska förhållanden, såsom diabetes och hjärtsvikt, kan försämrad kalcium clearance och SR Ca2 + butik i hjärtmuskelcellerna vara inblandade i utvecklingen av hjärtdysfunktion. Här beskriver vi ett protokoll för att utvärdera SRCa2 + reserv och diastoliskt Ca2 + borttagning. Kort, en enda hjärtmuskelcellen isolerades enzymatiskt och intracellulära Ca2 + fluorescensen indikeras av Fura-2 spelades in av ett kalcium imaging system. För att anställa koffein för att inducera totala SR Ca2 + release, förinställningar vi en automatisk perfusion switch programmet genom interlinkmekanismen stimulering systemet och systemets perfusion. Sedan, mono-exponentiell kurva montering användes för att analysera decay tidskonstanter kalcium transienter och koffein-inducerad kalcium pulser. Därför bidrag den SR Ca2 +-ATPas (SERCA) och Na+-Ca2 + värmeväxlare (NCX) till diastoliskt kalcium borttagning utvärderades.
Introduction
Intracellulär kalcium ([Ca2 +]jag) återvinning spelar en avgörande roll i reglering av systolisk och diastolisk funktion i hjärtmuskelcellerna1. Som vi vet, initierar kalcium-inducerad Ca2 + utgivningen excitation-contraction koppling, som översätter den elektriska signalen till kontraktion. Membranet depolarisation aktiverar sarcolemmal L-typ Ca2 + kanaler, som inducerar Ca2 + släppa från SR i cytoplasman via ryanodine receptorer 2 (RyR2). Den övergående förhöjda cytoplasmiska Ca2 + initierar kontraktion av myofibrils. Under diastole, cytoplasmiska Ca2 + är reuptaken till SR genom att SR Ca2 +-ATPas 2 (SERCA2) och pumpade ur hjärtmuskelcellen via Na+-Ca2 + värmeväxlare (NCX)2. Denna process leder till kontraktion-avslappning återvinning i hjärtmuskelcellen.
Hjärt SR är ett nätverk för intracellulära membran som omger den kontraktila maskinen. Den fungerar som en Ca2 + reservoar för kontraktion och det återskapar intracellulära Ca2 + under avkoppling. Den SR Ca2 + reserven tillgänglig för beats är bestämd för hjärtats kontraktilitet. Samtidigt är avlägsnande av intracellulära Ca2 + kritiska för hjärt diastole. Under vissa patofysiologiska förhållanden, såsom diabetes och hjärtsvikt, nedsatt Ca2 + clearance och deprimerad SR Ca2 + kan butik i hjärtmuskelcellerna vara inblandade i processen hjärtdysfunktion2,3 ,4.
För mätning av SR Ca2 + release och diastoliskt Ca2 + borttagning i hjärtmuskelceller, det finns två allmänt använda metoder: integritet NCX nuvarande baserat på patch-clamp5,6, och koffein-inducerad Ca 2 + -pulsfunktion baserat påCa 2 + fluorescens imaging7,8,9. Det tidigare tillvägagångssättet beror på det faktum att de Ca2 + släppt från SR i hög grad pumpas ut ur cellen genom NCX. Detta tillvägagångssätt är dock begränsad av dess krav för avancerad utrustning och skicklig drift. I föreliggande studie beskriver vi ett praktiskt tillvägagångssätt för att bedöma SR Ca2 + reserv och Ca2 + borttagning i myocyter genom att mätaen koffein-inducerad Ca 2 + -pulsfunktion baserat på ett Ca2 + fluorescens imaging system. Kort, intracellulära Ca2 + fluorescens indikeras av Fura-2. Genom interlinkmekanismen stimulering systemet och perfusion system, presenterar vi ett program för växling perfusionen och pacing systemet automatiskt. 10 mM koffein var anställd att snabbt framkalla totalt Ca2 + release i SR. Exponentiell förruttnelse tidskonstanter (Tau) kalcium transienter och koffein-inducerad kalcium pulser erhölls från mono-exponentiell kurva montering, vilket återspeglar SERCA och NCX bidrag till diastoliskt Ca2 + borttagning med detta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla djurförsök har utförts i enlighet med protokoll som godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén vid Experimental Research Center, Kina kinesisk medicinsk vetenskapsakademi och Zhejiang University.
1. lösning förberedelse
- förbereda alla lösningar som beskrivs i tabell 1.
2. isolering av vänster kammare (LV) hjärtmuskelcellerna
Obs: LV hjärtmuskelcellerna är isolerade enzymatiskt med ett Langendroff perfusion system som tidigare beskrivna 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
- Ställa in Langendroff perfusion systemet. Fyll perfusion systemet med Normal Tyrode (NT) lösning, Ställ in temperaturen på 36.5 ° C och eliminera eventuella luftbubblor i röret.
- Väger och söva en Sprague-Dawley-råttor av intraperitoneal injektion (ip) av chloral hydrat (400 mg/kg). Bekräfta den anestetiska statusen genom att utvärdera svans eller tå nypa svar efter 5 min.
- Öppna bukhålan under processen xiphoid med en kirurgisk sax, lyft den xiphoid processen och öppna kistan med en sax. Ta bort hjärtsäck, något lyfta hjärtat med böjd pincett, identifiera aortabågen och avskuren hjärtat av sax från roten av aorta.
- Överföra hjärtat till en 60 mm maträtt och tvätta det med NT lösning. Håll aorta med två micro-dissekera pincett, och montera det på av perfusion kanylen och sedan fast ligera aorta på kanylen med kirurgiska suturer.
Obs: En skicklig operatör kan avsluta denna process inom 15 s. - BEGJUTA hjärtat med 30 mL NT lösning att återställa cirkulationen av kranskärlen. Växla sedan perfusatet till 30 mL Ca 2 +-gratis Tyrode lösning (10 mM taurin, 1 mg/mL BSA) för att stoppa hjärtslag. Nästa, växla perfusatet kollagenas A isolering lösning (0,6 mg/mL) för enzym matsmältning.
Obs: Använd kollagenas A för experiment med diabetiska råttor eller kollagenas II för experiment utan diabetiska råttor. - Efter matsmältningen för 20-25 min, snabbt ändra perfusion lösningen till den Ca 2 +-gratis Tyrode lösning för att stoppa ytterligare matsmältningen. Håll sedan, hjärtat med pincett, avskurna det från kanylen och placera hjärtat i en 35 mm maträtt innehållande KB lösning (se tabell 1).
- Dissekera LV väggen med sax och pincett. Avskuren i förmak, höger kammare och atrioventrikulärt korsningen område. Den återstående vävnaden är LV; över det till en ny 35 mm maträtt med KB lösning. Finhacka den LV vävnaden i små bitar.
- Försiktigt Pipettera bitar med en filtrerad plast dropper och resuspendera i 10 ml KB.
- Filtrera cellerna med 150 µm bländare rostfria filter och överföring till en 15 mL centrifugrör. Centrifugera vid 150 x g i 30 s och Kassera supernatanten. Återsuspendering myocyter i 10 mL KB lösning, fri nöja sig med 6 min, avlägsna supernatanten och resuspendera pelleten i 10 ml KB.
Obs: Alla åtgärder utfördes vid 36 ° C i lösningar som gasade med 100% O 2.
3. Kalcium återinförandet
- efter nöja 20 min i KB lösning, avlägsna supernatanten och slamma myocyter med kalcium återinförandet lösning A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-gratis Tyrode lösning, 1,5 mL NT lösning) för 10 min.
- Upprepa ovanstående procedur med kalcium återinförandet lösning B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-gratis Tyrode lösning, 3 mL NT lösning).
- Upprepa ovanstående procedur med NT lösning (1,2 mM Ca 2 +) att rena den tillgängliga myocyter. Lagra den isolerade LV myocyter i denna lösning och studera dem inom 4-6 h.
4. Ställ upp för Perfusion System
- ansluta inloppsröret med NT lösningen för kammaren perfusion ( figur 1A).
- För nål perfusionen i det målet myocyt, Anslut flera fat grenrör (t.ex., perfusion penna, kallad pencil hädanefter), fast i micromanipulator, till ventilen kontrollerad perfusion system. Lägg till NT lösning och 10 mM koffein lösning i varje kolumn av pennan ( figur 1A).
- Evakuera eventuella luftbubblor i rören för att undvika luft blockering.
- Räkna antalet DROPP från micron spetsen av pennan för 10 s, och manuellt justera den flödesregulator för att hålla flödet hastighet i en ungefärlig hastighet på 3 dropp/10 s.
5. Mätningar av intracellulära Ca 2 + övergående och Sarcomere förkorta 7 , 8 , 9
- pipett 10 µL cellsuspension på bilden räkna cell nummer i en cell-disk under mikroskopet, och beräkna densiteten. Späd myocyter till en ungefärlig koncentration av 50.000 celler/mL.
- Lägg till Fura-2 acetoximetyl (AM) lager (ett kalcium känsliga färgämne) i en 1 mL suspension av myocyter att föra slutliga koncentration till 2 µM. hålla i mörkret i 20 min i rumstemperatur.
- Centrifugera på 150 g i 30 s och resuspendera hjärtmuskelcellerna med NT lösning 2 ggr.
- Turn off ljuset och hålla cellerna i mörkret. Placera myocyter i perfusion kammaren för 15 min. Sedan starta kammare perfusionen (1,5 mL/min) med NT lösning. Tempo i myocyter med 1 Hz fält stimulering använder en stimulator (wave varaktighet 4.0 ms, pulsamplitud 8.0 V) för 5 min.
- Välj en myocyt med bra form (rod form, skarpa kanter och rensa cross strimmor) och stabil stimuleras twitch (ingen spontan kontraktion) under 10 x mikroskopiska objektiv. Nästa, ändra den mikroskopiska förstoringen 40 x, och rotera CCD kameraorientering för att hålla myocyt horisontalt.
- Ram den enda myocyt genom att justera cell inramning adaptern. Se till att bakgrunden framgår.
- Utsätta myocyter till ljuset som avges av en xenonlampa, med 340 eller 380 nm våglängd excitation filter, och bild myocyter genom ett 40 x-objektiv. Upptäcka fluorescens signal på 510 nm. Under tiden Observera sarcomere längd ändringarna av myocyter och registrera använder modulen mjuk kant samtidigt.
- Posten fluorescens av en dual-magnetiseringen fluorescens fotomultiplikatorn system. Kör programmet inspelning för kalcium imaging system, klicka " filen/ny fil " att skapa en ny inspelningsfil och klicka på den " start " knappen till synkront fluorescens och sarcomere postlängd.
6. Bedömning av SR Ca 2 + reserv och diastoliskt Ca 2 + borttagning funktion 7 , 8 , 9
- Interlink den " Aux Out " port i stimulatorn med den " Analog i " hamn på systemet för kontroll av ventil (t.ex., ventil commander, se Tabell för material) med en BNC-kabel (för att synkronisera den TTL-signalen).
- Förinställda ett program för att växla perfusion ventilerna automatiskt som tidigare beskrivits 8 , 9; Detaljerade anvisningar för drift listas enligt följande.
- Förinställda parametrarna i ventilen styra programvaran enligt tabell 2, och klicka på den " Ladda ner " knappen för att hämta sekvensen laddad i programmet. Klicka på den " Trigger " för att aktivera funktionen avtryckare.
Obs: Systemet för kontroll av ventil kan köra sekvensen efter signalen TTL. - Förinställa stimulatorn till sekvensläge, och ställa in parametrar enligt tabell 3.
- Förinställda parametrarna i ventilen styra programvaran enligt tabell 2, och klicka på den " Ladda ner " knappen för att hämta sekvensen laddad i programmet. Klicka på den " Trigger " för att aktivera funktionen avtryckare.
- Ställa stimulatorn på " S1 steg " till tempo LV myocyter vid 1 Hz. Starta nål perfusionen med hastighet av 1,5 mL/min med NT lösning.
Obs: Eftersom hastigheten på nålen strömmen är snabbare än kammare perfusion, ljus refraktionen av nålen strömmen är annorlunda från ljusbrytning i kammaren perfusion. Skillnaden av ljusbrytning visar utbudet av effektiva nål perfusion, som omger den målet myocyt. - Välj en mål myocyt under vyn strömsnål mikroskopiska (i sekvensen av nedströms till uppströms), och se till att det kan nås av micro spetsen på pennan. Ändra förstoringen Mikroskop till 400 x. Rotera CCD kameraorientering för att hålla myocyt i horisontellt läge. Justera öppningens rektangulära under cell inramning adaptern till ett passande fönster som fyller med myocyter. Säkerställa att det finns minimal bakgrund; Låt inte andra myocyter eller döda cellfragment fönster.
- Justera positionen av pennan fast på micromanipulator och placera försiktigt i micro spets på distansera av radien av vision fältet till det målet myocyt under 400 x lupp förstoring.
- Justera nålen stream för att främst täcka det målet myocyt och kontrollera att myocyt inte kan sopas bort av nålen flödet.
- Efter 60 s grundläggande pacing, rulla stimulator markören till den " D2 steg ".
Obs: Resten av protokollet kommer att utföras automatiskt av stimulator och ventil kontrollsystem. Baserat på ovanstående inställning, protokollet kan köras automatiskt som i figur 2A, 1 Hz grundläggande pacing med NT lösning för 60 s. Sedan Pausa pacing och fördröjning för 2 s, snabbt växla till 10 mM koffein perfusion för 15 s (att funktionellt släppa Ca 2 + lagring i SR), och sedan växla tillbaka till NT lösning. - i slutet av inspelningen, upptäcka bakgrunden fluorescensen för enskilda myocyter. Klicka på den " paus " knappen för att pausa filen inspelning, flytta vyn mikroskopiska på en närliggande tomt område. Klicka på den " post " knappen för att återuppta inspelningen i sekunder och registrera numeriska 340 och 380 nm intensitetsvärden för bakgrundskorrektion.
- Öppen den " drift/konstant " dialogrutan och fylla värdena i den " bakgrunden " bildar, respektive; programvaran kan korrigera Fura 2 ratio värden genom att subtrahera bakgrunden.
7. Data analys 9
- för mätningar av kalcium transienter och sarcomere förkorta det grundläggande pacing skedet, genomsnittlig twitch pulserna, och sedan analysera dynamiska parametrar, såsom kalcium transienter, tidskonstanten för kalcium övergående decay (Tau-1 Hz), använder programvaran automatiskt.
Obs: Om programvaran inte passar segmentet röta väl, exportera nedgång spårningen för manuell mono-exponentiell kurva montering. - För koffein-inducerad kalcium pulser, Välj bara pulsen med en brant våg för analys av kalcium borttagning funktion. Utesluta celler med signal störning, onormal puls, eller de som flöt bort midway.
- Mäta amplituden av koffein-inducerad kalcium puls (Ca-koffein, ett index av SRCa 2 + reserv).
- Få förfalla tidskonstanten för koffein-inducerad kalcium pulse (Tau-koffein) genom mono-exponentiell kurva montering (10 s varaktighet) manuellt från programvara ( figur 2 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här, vi illustrera streptozotocin (STZ) - inducerad diabetiska råttor (DM) och åldersmatchade Sprague - Dawley (SD) råttor till exempel. SD 8 veckor gamla hanråttor (200 ± 20 g) fick en intraperitoneal injektion av STZ (70 mg/kg, ip) för DM grupp eller citrat bufferten för kontrollgruppen. En vecka efter STZ administration, råttor med blodsockret > 16,7 mmol/L ansågs diabetiker. Efter 8 veckor var de LV myocyter enzymatiskt isolerade. Efter kalcium återinförande finns det ca 70-80% av myocyter som finns kvar i tillståndet överlevnad. Enda myocyter med en rod-form, tydliga strimmor och stabil sammandragningar valdes för inspelning (figur 1B). Som visas i figur 1A, ställa vi in kammare perfusion och nål perfusion för myocyter. Perfusion ventiler och pacing system bytte automatiskt av ett förinställt program som beskrivs i figur 2A. Den intracellulära kalcium fluorescensen spelades av en kalcium imaging system. Värden rapporterades som medelvärde ± SEM.
DM gruppen jämfört med gruppen SD, och visade signifikant lägre amplituden av koffein-inducerad kalcium puls (Ca-koffein) (0,332 ± 0,008 vs. 0,276 ± 0,008, t-test: p < 0,05) och en lägre fraktionerad kalcium frisättning SR (Ca-1 Hz / Ca-Caffeine) (78,5 ± 1,5% vs. 72,1 ± 1,0%, t-test: p < 0,05) (figur 2B). De Tau-1 Hz och Tau-koffein erhölls från mono-exponentiell kurva montering; DM gruppen visade anmärkningsvärd längre förfall tidskonstanter av koffein-inducerad kalcium puls (Tau-koffein) (1.822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0,088 ms, t-test, p < 0,05), och en högre nivå i Tau-1 Hz/Tau-koffein baserat (0,076 ± 0,003 vs. 0.086 ± 0,003, t-test, p < 0,05) än gruppen SD (figur 2D). Dessa resultat anges deprimerad SR Ca2 + reserven och nedsatt Ca2 + clearance hos diabetiker hjärtmuskelcellerna.
Figur 1. Illustration av perfusion system och isolerade LV myocyter. (A) Illustration av kammaren perfusion och penna perfusion. Pilarna anger flödesriktningen i NT lösningen i perfusion kammaren. Pennan ger perfusion kring de mål myocyt med NT eller koffein lösning. Micron spetsen kan manipuleras fritt över kammaren. (B) mikroskopisk bild av isolerade LV myocyter med en rod-form och rensa cross strimmor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bedömning av SR kalcium reserve och kalcium borttagning funktion. (A) Illustration av protokollet för växling perfusion ventiler och pacing systemet automatiskt. (B) statistik värden av SR Ca2 + reserv och SR fraktionerad Ca2 + släppa för 1 Hz stimuleras ryckningar i DM och SD-grupper. DM gruppen visade signifikant minskad SR Ca2 + reserv och SR fraktionerad Ca2 + release än gruppen SD. (C) programvara Kontrollpanelen visar ett manuellt mono-exponentiell kurva som passande för den förfalla time konstant av koffein-inducerad kalcium puls (Tau-koffein). (D) stapeldiagram jämföra Tau-koffein och Tau-1 Hz/Tau-koffein mellan grupperna DM och SD. DM gruppen visade signifikant förhöjda värden av Tau-koffein och Tau-1 Hz/Tau-koffein än gruppen SD. Värde = medelvärde ± SEM, t-test utfördes, *p < 0,05 jämfört med SD-gruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösningar | Innehållet (i mM) |
| Normal Tyrode (NT) lösning | 135 NaCl, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukos, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 1,2 CaCl2, justera pH med NaOH till 7,35 |
| Ca2 + gratis Tyrode lösning | 135 NaCl, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukos, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 10 taurin, justera pH med NaOH till 7,35 |
| Kollagenas isolering lösning | Kollagenas A eller kollagenas II + Ca2 + gratis Tyrode lösning |
| KB lösning | 120 KOH, 120 L-glutaminsyra, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 glukos, 20 taurin, justera pH till 7,35 med KOH |
| Koffein perfusion lösning | 10 koffein i NT lösning |
Tabell 1. Lösningar för LV myocyter isolering och cellular perfusion.
| Ventil | Tid (andra) |
| 2 | 15 |
| 1 | 60 |
Tabell 2. Förinställda parametrar i systemet för kontroll av ventil (ventil commander).
| Kontrollpanelens display | kommentar |
| 4.0 ms varaktighet | elektrisk stimulering fältet tid |
| 8.0 V | elektrisk spänning |
| S1 1.0 HZ 999S | hitta de mål myocyt på pacing status |
| D2 001S | Välj detta steg för att pausa pacing och fördröja 1s efter basal twitch inspelning |
| D3 015S * | ”*” anger att stimulatorn kan utsignal en 5V TTL |
| D4 060S | Slutför koffein perfusion och myocyt återställa till normalläge |
| SLUTET | rollback till S1 steg |
Tabell 3. Förinställning av parametrar i stimulatorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalcium flux släppt från SR är den största Ca2 + källan för systole i hjärtat. Till viss del, amplituden av SR Ca2 + innehåll och fraktionerad Ca återspeglar2 + släppt från SR SR Ca2 + reserven tillgängliga för hjärtats kontraktion. Däremot, beror Ca2 + reserven för SR på förmågan hos SR Ca2 + serotoninåterupptagshämmare, Ca2 + läcka av SR och deras balans över SR under diastole12,13,14. I vårt experiment syftar snabb tillämpning av 10 mM koffein till att framkalla totalt Ca2 + släpp och förhindra Ca2 + återupptaget i SR genom att öppna kanalen RyR. Amplituden av koffein-inducerad Ca2 + puls kan således användas som ett index av SR Ca2 + reserv. Med grundläggande pacing i 1 Hz och 3 Hz, kunde vi dessutom ytterligare undersöka frekvens-beroendet av SR lasten och dess underliggande mekanismen6.
Borttagning av Ca2 + i cytoplasman är kritiska för diastolisk hjärtfunktion. Som visas i figur 2A, skede 1 Hz fält stimulering, tillskrevs nedgången av kalcium transienter SERCA i SR, NCX i cytomembrane och långsam transportsystem (mitokondriell Ca2 + uniporter och sarcolemmal Ca2 + -ATPas). Som bidrag långsam mekanismer är försumbar, speglar decay tidskonstanten för Ca2 + övergående (Tau-1 Hz) aktiviteten kombinerade SERCA och NCX7,8,9. I skedet av koffein perfusion misslyckades SERCA att bygga SR kalcium reserven. Nedgången av koffein-inducerad kalcium puls (Tau-koffein) var således främst tillskrivas NCX. På motsvarande sätt är NCX funktion negativa som är relevanta för Tau-koffein. NCX bidrag till diastoliskt Ca2 + borttagning är positivt som är relevanta för förhållandet mellan Tau-1 Hz/Tau-koffein. SERCA bidrag är positiv som relevanta skillnaden mellan Tau-koffein och Tau-1 Hz7,8,9.
Att slutföra förfarandet (figur 2), det finns några tekniska viktiga punkter som bör noteras. För det första, om inrättande av ett automatiserat system är avgörande för att växla tempo och perfusion systemet exakt. Det förinställda programmet kunde styra fördröjningstiden exakt och tillämpa koffein perfusionen snabbt. Andra under processen är myocyter med risk för att spolas bort av perfusion lösningen. För att hålla myocyter stabilt följs till kammaren skålen, bör cellerna placeras i skålen för mer än 15 minuter innan inspelning.
Vidare, att inrätta en stabil nål perfusion system för tillämpning av koffein är ett annat viktigt steg. Det finns tre viktiga punkter för detta steg: (1) snabb kanal switch och slät nål perfusion, (2) välkontrollerade perfusion strömningshastighet och (3) rätt avstånd mellan nålspetsen och rikta myocyt. Olämplig inställning av flödeshastigheten, tip distans eller inblandning i växeln lösning kanal kan leda till misslyckande att förvärva en godtagbar koffein-inducerad kalcium puls. För koffein-inducerad kalcium pulser, kunde bara pulsen med en brant vågkam väljas för analys av kalcium borttagning funktion.
Den alternativa metoden som bygger på patch-clamp system kan ge relativt korrekta data. Vissa faktorer, såsom inåt-rättelse K+ nuvarande, kan dock påverka noggrannheten. Dessutom kan ett högre krav på avancerad utrustning, skickliga tekniker och tidsförbrukning också begränsa tillämpningen av patch-clamp. I viss mån har vår protokollet den begränsningen att det inte kunde ge direkta värden SR belastning eller SERCA och NCX verksamhet. Parametrarna (t.ex., Ca-koffein, Tau-koffein) endast återspegla förändrade SR innehåll och bidrag till diastoliskt Ca2 + borttagning indirekt. Detta protokoll har dock fördelen av bekvämlighet, mindre begränsning av teknik och utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (nr. 81100159, Dongwu Lai, 81401147, Juhong Zhang), medicin och hälsa Science Program av Zhejiangprovinsen (nr 201646246, Dongwu Lai) och hälsa vetenskapen och Plan för staden Hangzhou (nr 2013A28, Ding Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Alfa Aesar | 012314 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 012315 | |
| KCl | Alfa Aesar | 11595 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | A16828 | |
| NaOH | Alfa Aesar | A18395 | |
| KOH | Alfa Aesar | A18854 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | 011594 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 3337 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | A15031 | |
| Taurine | Alfa Aesar | A12403 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
- Capel, R. A., Terrar, D. A. The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat. Front Physiol. 6, 80 (2015).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).
- Pereira, L., et al. Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes. Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).
- Ferrantini, C., et al. R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility. J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).
- Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects. Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).
- Cheng, J., et al. CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).
- Lai, D., et al. The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling. J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).
- Lai, D., et al. Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes. J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).
- Xu, L., et al. Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice. Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).
- Roussel, J., et al. Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase. Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).
- Yaras, N., et al. Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart. Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).
- Hu, Y., et al. Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart. Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).
