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Neuroscience

फिजियोलॉजिकल रिलेशियल एसेस के प्रयोग से 3-डी स्टेम सेल कल्चर की पूछताछ के लिए हाईपीएससी डिरेक्ट सीरम फ्री एम्ब्रॉयड बॉडीज का विकास करना

Published: July 20, 2017 doi: 10.3791/55799
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Hussman Institute for Autism

Summary

यहां हम मानव प्रेरित-प्लुपीप्रोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से तीन आयामी (3-डी) प्रणाली विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जिन्हें सीरम मुक्त भ्रूण निकाय (एसएफईबी) कहा जाता है। यह 3-डी मॉडल का उपयोग मानवीय कॉर्टिकल विकास मॉडल के लिए एक अंगोपाटिक टुकड़ा संस्कृति की तरह किया जा सकता है और तंत्रिका सर्किट के विकास की शारीरिक पूछताछ के लिए किया जा सकता है।

Abstract

हालांकि इन्हें एचआईपीएससी के जरिये इन विट्रो बीमारियों के कई मॉडल विकसित किए गए हैं, एक सीमा यह है कि ये दो-आयामी (2-डी) प्रणालियां संक्रमित बीमारियों के प्रकार वाले संक्रमित व्यक्तियों की अंतर्निहित साइटोरेक्टिचचर और कार्यात्मक जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती हैं। परंपरागत 2-डी मॉडल विवो -जैसे संरचनाओं में अपूर्ण निरूपण रहते हैं और मस्तिष्क की जटिलता को पर्याप्त रूप से नहीं पकड़ते हैं। इस प्रकार, 3 डी एचपीएससी आधारित मॉडल के लिए एक उभरती हुई आवश्यकता है जो सेल्युलर इंटरैक्शन और कार्यों को एक विवो सिस्टम में देखा जा सकता है।

यहां हम सीरम मुक्त भ्रूण निकाय शरीर (एसएफईबी) के आधार पर अल्पसंख्यक HIPSCs से 3-डी प्रणाली विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। यह 3-डी मॉडल एक विक्रमित विक्रय किए गए नियोकार्टेक्स के पहलुओं को दर्पण करता है और अध्ययन, तंत्रिका कोशिकाओं और प्रवासन, कनेक्टिविटी, संचार और चटाई जैसे अक्षत ऊतक के अभिन्न अंगों में अध्ययन की अनुमति देता हैuration। विशेष रूप से, हम यह दिखाते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करते हुए एसएफईबी कैलीशियम इमेजिंग, और बहु-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) रिकॉर्डिंग के बिना क्रोसिंग के बिना शारीरिक-प्रासंगिक और उच्च-सामग्री वाले सेल आधारित एशेज का उपयोग कर पूछताछ कर सकते हैं। विदेश मंत्रालय के रिकॉर्डिंग के मामले में, हम यह दर्शाते हैं कि दीर्घकालिक खेती के दौरान एसएफईबी स्पाइक गतिविधि और नेटवर्क-स्तर की बड़बड़ाना गतिविधि दोनों में वृद्धि करते हैं। यह एसएफईबी प्रोटोकॉल 3-डी मॉडल में नेटवर्क निर्माण के विकास के अध्ययन के लिए एक मजबूत और स्केलेबल सिस्टम प्रदान करता है जो प्रारंभिक कॉर्टिकल विकास के पहलुओं को कैप्चर करता है।

Introduction

हमने पहले 3-डी मॉडल प्रणाली की सूचना दी है, जो मरीज से व्युत्पन्न मानव प्रेरित प्लूिपोटेंट स्टेम सेल (एचईपीएससी) से उत्पन्न होता है जो प्रारंभिक कॉर्टिकल नेटवर्क डेवलपमेंट 1 के कुछ पहलुओं का पुनर्कथन करता है। यह 3-डी मॉडल, एक सीरम मुक्त भ्रूण निकाय (एसएफईबी), पिछली सरल एकत्रीकरण हायपीएससी मॉडल 2 , 3 पर सुधार करता है। कार्य का एक बढ़ता हुआ शरीर यह खुलासा करता है कि हमारे एसएफईबी जैसे 3-डी ढांचे, तंत्रिकाय विकास के अनुमानित पहलुओं को सामान्यतः विवो में देखा जाता है और 2-डीमेंटल (2-डी) / मॉलालेयर हायपीएससी मॉडल 4 , 5 में देखे जाने से पहले के समय में। प्रारंभिक अध्ययन 3-डी निकायों की स्वयं-संगठित जटिलता को अपनी शारीरिक जटिलता 2 का प्रदर्शन किए बिना केंद्रित किया गया है।

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग फायब्रोबलास्ट्स से प्राप्त अल्पसंख्यक HIPSCs पर किया गया है और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) ये कोशिकाएं γ- विकिरणित माउस भ्रूणीय फीडर (एमईएफ) पर रखी जाती हैं। इन हायपीएससी कॉलोनियों को मैन्युअल रूप से अलग-अलग भेदभावित कोशिकाओं से साफ किया जाता है, एंजाइमेटिक काटा जाता है, और आरओ-किनास इनबीटर वाई -27632 (रोक्की) वाले मध्यम में रिसाव किया गया है। Undifferentiated hiPSCs 96-अच्छी तरह से कम आसंजन वी-नीचे प्लेटों में स्थानांतरित होने से पहले पृथक्करण और केन्द्रापसारक के अधीन हैं। चढ़ाना के बाद, न्यूरल प्रेरण दोहरी एसएएम 401542 और एलडीएन 1 9 58 9 को डिककॉप्फ़ 1 (डीकेके -1) के साथ शुरू किया जाता है ताकि एक अग्रस्थ अग्रगण्य न्यूरॉनल-भाग्य वंश 6 को चलाया जा सके। 14 दिनों के बाद, SFEBs को 6-अच्छी तरह से प्लेट में सेल संस्कृति आवेषण में स्थानांतरित किया जाता है। एक बार स्थानांतरित होने पर, दौर एसएफईबी फैल और पतली शुरू हो जाती है, जबकि स्थानीय नेटवर्क कनेक्शन को बनाए रखते हुए अक्सर हिप्पोकैम्पल इंडोटेपिक स्लाइस संस्कृति की तैयारी में समान सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग करते हुए देखा जाता है 1 ,Ss = "xref"> 7

इस प्रारूप में एक एसएफईबी आधारित 3-डी प्लेटफॉर्म का उपयोग कॉर्टिकल नेटवर्क के कुशल उत्पादन के लिए सहज है, जिसे कैल्शियम इमेजिंग या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल एशेज जैसे एकल कोशिका रिकॉर्डिंग या मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) के आधार पर सेल आधारित शारीरिक assays का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है। 1 ) हालांकि 3 डी सिस्टम प्रारंभिक कोर्टिकल विकास के मार्करों को सहन करते हैं, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि इन 3-डी निकायों को मानव ऊतक विकास 8 की स्वाभाविक धीमी गति के लिए अधिक ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है। इस एसएफईबी प्रोटोकॉल ने आसानी से 3 डी एसएफईबी जनरेट किया है जो कि कोर्टेक्स के शुरुआती विकास के पहलुओं को प्राप्त करते हैं।

तंत्रिका संबंधी विकारों में मॉडल अपहरण के लिए एसएफईबी की क्षमता इस प्रणाली की ताकत है। रोगियों के ऊतकों से प्राप्त hiPSCs तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं में विकसित हो सकते हैं जो गधे के अधीन हैंसेल बायोलॉजी के साथ ही सहवर्ती जीन अभिव्यक्ति से संबंधित एआईएस आइटिज़्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (एएसडी), स्कीज़ोफ्रेनिया 9 , रिट सिंड्रोम 10 , और अल्जाइमर रोग 11 , 12 जैसी जटिल एटिओगॉल्स के साथ अलग-अलग स्नायविक विकार वाले व्यक्तियों के बड़े समूहों के आनुवंशिक प्रोफाइल का पता लगाने के लिए मानव आईपीएस एस का उपयोग किया जा रहा है। हाल ही में जब तक आईपीएससी मॉडल आम तौर पर मोनोलायर तैयारी थे, जबकि आणविक बातचीत का मूल्यांकन करने में निपुण, विवो में देखी गई जटिल सेलुलर इंटरैक्शन को समझने में अपर्याप्त थे। पूरे इंजन के मंच को पुनः बनाने के लिए पशु मॉडल डिफ़ॉल्ट विकल्प रहे हैं। इन जानवरों के मॉडल निष्कर्षों के खराब अनुवाद से ग्रस्त हैं और बड़े आनुवांशिक स्क्रीनिंग अध्ययनों द्वारा पहचाने जाने वाले मानव आनुवंशिक प्रोफाइल को दोहराने की सीमित क्षमता है। इस प्रकार, आईपीएससी से 3 डी सिस्टम का विकास मानव में जटिलता की एक आवश्यक परत जोड़ता हैबीमारी मॉडलिंग 13 , 14 3 डी हाईपसी प्लेटफार्मों के लिए अगले कदम सेल आधारित एलेक्स 15 का उपयोग करके उच्च थ्रूपूट स्क्रीनिंग के बड़े पैमाने पर आवश्यकताओं को समायोजित करना है।

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Protocol

1. तंत्रिका जनजातीय कोशिकाओं का निर्माण

  1. छोटे-अणुओं (सामग्री तालिका देखें) के साथ पूरक मानव आईपीएससी माध्यम में एक γ विकिरणित माउस भ्रूण फीडर (एमईएफ) सेल परत पर 6-अच्छी तरह प्लेटों में फाइब्रोब्लास्ट्स और पीबीएमसी से बनाए गए hiPSC बनाए रखें।
    नोट: दैनिक रखरखाव पहले की रिपोर्ट की गई प्रक्रियाओं 1 , 16 का एक संशोधित संस्करण है।
    1. 300 μL / अच्छी तरह से सिफारिश की गई मध्यम (निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद) में 6-अच्छी टिशू कल्चर ग्रेड प्लेट के प्रत्येक कुएं पर 6 x 10 5 MEF प्लेट।
    2. 48 घंटे के बाद, एचईपीएससी जोड़ने से पहले 1 घंटे के लिए 300 μL / अच्छी तरह से एचपीएससी माध्यम के साथ MEFs मध्यम की जगह।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस के पानी के स्नान में एचपीएससी को जल्दी से पिघलना और धीरे-धीरे 1 एमएल हायपीएससी मध्यम ड्रॉप डाउन जोड़ दें। एचपीएससी और मध्यम 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण करें। कुल मात्रा 5 एमएल लाने के लिए माध्यम जोड़ें। 12 मिनट में 4 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, supernata महाप्राण हूँएनटी, गोली को 1 एमएल एचपीएससी माध्यम से रॉक अवरोध करने वाला 1: 1,000 एकाग्रता पर धीरे-से बंद कर दिया।
    4. सेल की निलंबन (आमतौर पर 300,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से सीढ़ी जाती है) MEF सेल परत पर और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 , 95% नमी पर सेते हैं।
    5. एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करके आईपीएसएससी संस्कृति पर बारीकी से मॉनिटर करें। 48 घंटे के बाद, असमान किनारों वाले संस्कृतियों को हटाएं, सहज रूप से भेदभाव को कम करने के लिए प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के तहत पित्ताशय की तरह या पीले-भूरे रंग के दिखाई देने लगे हैं।
      नोट: 7 से 10 दिनों के बाद, हायपीएससी कॉलोनियों का निर्माण होना चाहिए। कालोनियों को गोल होना चाहिए, स्पष्ट रूप से परिभाषित सीमाओं और समान कोशिका घनत्व के साथ, और ढीले पैक वाले गैर-वर्दी कोशिकाओं से रहित होना चाहिए।
    6. स्वैच्छिक विभेदित कोशिकाओं की संस्कृति को साफ करने के लिए मैन्युअल रूप से राशन हायपीएससी कॉलोनियों का चयन करें। ताजा MEF परतों पर उन्हें डालकर कालोनियों का विस्तार करें। विस्तार 1: 3 हर 7 दिन जब संस्कृतियों के निकट संस्कृतियों और फ्रीज 1 , 16 ।
  2. विस्तार और ठंड कोशिकाओं (बैकअप के लिए) के बाद, प्लेट्स पर एचपीएससी कॉलोनियों को तब तक बढ़ाना जब तक कि वे 50 से 75% संगम तक नहीं पहुंचते।
  3. चढ़ाई करने के लिए सात दिनों के बाद, हल्के एंजाइमेटिक उपचार (300 μL एंजाइम समाधान के साथ 5-10 मिनट) और कोमल ट्रिप्रेशन (एक 1,000 μL pipet के साथ 2-4 बार) का उपयोग करें और तंत्रिका अग्रदूत सेल भेदभाव के लिए hiPSCs तैयार करें।
  4. 4 मिनट के लिए 12 9 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण हूँ, और 5 एमएल मानव आईपीएसस्क माध्यम में गोली resuspend। सेल निलंबन को 0.1% जिलेटिन लेपित 5 सेमी सेल कल्चर डिशियम में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एमईएफ को खत्म करने और हायपीएससी यील्ड को अधिकतम करने के लिए स्थानांतरण करें। मध्यम (गैर-पक्षपाती कोशिकाओं के साथ) दूसरे 5 सेमी जिलेटिन लेपित डिश में स्थानांतरण करें।
  5. एक गैर-अनुदायी कोशिकाओं को ट्रांसफर पीपेट का उपयोग करके 15 एमएल की अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। धीरे से 3 एमएल मध्यम के साथ प्लेटें कुल्ला और 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
  6. 4 मिनट के लिए 12 9 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, सुपर महाप्राणनटंट, और धीरे से मध्यम में गोली resuspend। एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल गिनती निर्धारित करें। प्लेट 9,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से कम आसंजन वी-नीचे प्लेट में
  7. 3 मिनट के लिए 163 xg पर प्लेट को अपकेंद्रित करें 37 डिग्री सेल्सियस, 95% नमी और 5% सीओ 2 में प्लेट को सेते हैं। पिपेट का प्रयोग करके, हर दूसरे दिन 50% माध्यम को बदलने के लिए माध्यम का आधा हिस्सा निकालकर और इसे 14 दिनों के लिए ताजा रासायनिक-परिभाषित विभेदक माध्यम 1 (डीएम 1; चित्रा 1 ; सामग्री की सामग्री) से बदलकर

2. सीरम मुक्त एम्बॉयड बॉडी (एसएफईबी) इंडक्शन ( चित्रा 2 )

  1. प्लेस 40 सुक्ष्ममापी सेल संस्कृति 6 अच्छी तरह प्लेटों में सम्मिलित करता है और 1 एमएल डीएम 1 मध्यम जोड़ों के अलावा कम से कम 1 घंटे पहले जोड़ें।
  2. 14 दिन पर, 20 माइक्रोन माध्यम के साथ समुच्चय को 200 माइक्रोन सेल की संस्कृति सम्मिलित करने पर 200 μL विस्तृत मुंह टिप का स्थानांतरण करें और मध्यम को डीएम 2 में बदल दें।
    7 , 17 , 18 से ली गई अंगोटीपिक हिप्पोकैम्पल टुकड़ा संस्कृतियों के साथ उपयोग किया जाता है।
    1. एक सेल संस्कृति डालने के लिए 4-6 समुच्चय को स्थानांतरित करें और समुच्चय के बीच पर्याप्त स्थान दें। ठीक विंदुक टिप ( जैसे 200 μL टिप) का उपयोग कर जितना संभव हो उतना अधिक समाधान निकालें।
      नोट: SFEB को आस-पास से हटाए जाने के समाधान के रूप में वे सेल संस्कृति डालने पर जाने के लिए संक्षिप्त रूप से SFEB को परेशान करने के लिए स्वीकार्य है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस, 95% नमी और 5% सीओ 2 में डीएम 2 के 1 एमएल में संस्कृतियां बनाए रखें विंदुक का उपयोग करना, 75%माध्यम के माध्यम से तीन तिमाहियों को हटाने और तीन तिमाहियों के साथ ताजा माध्यम की जगह के माध्यम से हर दूसरे दिन उदाहरण के लिए, 750 μL मध्यम निकालें और ताजा मध्यम 750 μL जोड़ें।
  3. 14 दिनों की संस्कृति के बाद, डीएम 3 माध्यम पर स्विच करें, जिसमें हर दूसरे दिन 75% मध्यम परिवर्तन होता है और एक और 16 दिनों के लिए।
  4. 30 दिनों से अधिक सेल संस्कृति आवेषण पर एसएफईबी बनाए रखने के लिए, हर दूसरे दिन मध्यम, 60, 90 और 120 दिनों के लिए बदलें।
    नोट: SFEBs व्यास के बारे में 1,000 माइक्रोन तक बढ़ेगा और आमतौर पर 100-150 माइक्रोन मोटी 1 हैं ।

3. एसएफईबी संरचना निर्धारित करना

  1. एक 200 μL विस्तृत मुंह विंदुक टिप का उपयोग करके धीरे से pipetting माध्यम से डालने से SFEBs अलग। SFEBs को स्थानांतरित करने के लिए, एक व्यापक मुंह विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए धीरे से pipet टिप में निकायों निकालना पीईपीटी टिप में एसईएफबी को लोड करने के बाद, धीरे-धीरे 12-अच्छी तरह प्लेट्स में स्थानांतरण करें और 300 μL फॉस्फेट बफर खारा(पीबीएस) प्रति अच्छी तरह से
    नोट: 12-अच्छी तरह प्लेटों में समाधान में SFEBs को निलंबित कर दिया जाएगा। यह लगानेवाला, अवरुद्ध समाधान, और एंटीबॉडी के पूर्ण प्रवेश की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। यदि धुंधला हो जाने के लिए कई एसएफबीबी इस्तेमाल कर रहे हैं, तो एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति 10 एसएफबीबी तक बढ़ सकते हैं यह समाधान और एंटीबॉडी का संरक्षण करेगा
  2. 30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 300 μL प्रति 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड के साथ एसईएफबी को ठीक करें। 300 μL पीबीएस, 3-5 मिनट प्रत्येक धोने के साथ दो बार निश्चित एसएफईबी धो लें
    सावधानी: पैराफॉर्मैल्डीहाइड को संभालने के दौरान उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    नोट: परिपक्वता, सेल प्रकार इत्यादि निर्धारित करने के लिए मार्करों को immunoreactivity के लिए जांच। इस अध्ययन में न्यूरॉन्स को चिह्नित करने के लिए चिकन-तुज 1 को 1: 500 पर इस्तेमाल किया गया था, अतिरिक्त मार्करों के लिए कृपया टेबल 2 और संदर्भ 1 , 16 देखें ।
  3. पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 और 10% सामान्य गधा सीरम (अवरुद्ध समाधान; 300 μ; एल प्रति अच्छी तरह से) 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर।
  4. अवरुद्ध समाधान निकालें और समाधान अवरुद्ध में 300 μL प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ SFEBs का इलाज करें। 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं। 300 μL पीबीएस युक्त 0.1% ट्राइटॉन-एक्स में एसईएफबी तीन बार धोएं (3-5 मिनट प्रति धो)
  5. अवरोधन समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी 1: 1000 तैयार करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एसएफबीबी सेते। 300 μL पीबीएस के साथ एसईएफबी धोएं, 3-5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं।
    नोट: इस स्तर पर इमेजिंग के लिए एसएफईबी तैयार किया जा सकता है।
  6. छवि के लिए, पिपेट एक व्यापक बोर विंदुक का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर SFEBs। कोमल चूषण का उपयोग कर SFEB के आसपास अतिरिक्त समाधान निकालें।
    नोट: समान धुंधला स्थितियों के लिए, एक से अधिक एसएफईबी को एक ही ग्लास स्लाइड पर रखा जा सकता है।
  7. SFEBs पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें, एक ग्लास कवरलाप रखें, और धीरे से यह सुनिश्चित करने के लिए दबाएं कि कोई हवाई बुलबुले नहीं हैं। बढ़ते माध्यम को कठोर करने दें और इमेजिंग और मात्रा का ठहराव (चरण 3.8) पर जाएं।
  8. संदर्भ 1 , 16 में वर्णित मानक मानकीकरण सूक्ष्मदर्शी पर प्रत्येक आरओआई के माध्यम से अधिकतम प्रक्षेपण छवि के साथ संयुक्त रूप से एसएफईबी के कई क्षेत्रों को लेकर ब्याज के क्षेत्र में (आरओआई) और ज़े-स्टैक का उपयोग करके सेल मात्रा का ठहराव करना।
    नोट: पूरे एसएफईबी को छवि-आधारित टाइलिंग का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है (विवरण के लिए संदर्भ 1 , 16 देखें)। चूंकि एसएफईबी लगभग 100 माइक्रोन तक पतली है, इसलिए ऊतक में हल्की छिड़कना है और इस प्रकार 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता नहीं है। पहले इस प्रोटोकॉल का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न आईपीएससीएस के साथ एक एसएफबी भाग्य मानचित्र का उत्पादन किया जिसमें सीजीई और पूर्वकाल अग्रमस्तिष्क भाग्य 1 , 16 के समान ट्रांसक्रिप्शनल पहचान वाले इंटीनेट्यूरंस के उप-जनक के साथ जटिल और विविध संरचना का पता चला ।

4. विदेश मंत्रालय द्वारा उपयोग किए जाने वाले एसएफईबी में न्यूरोनल गतिविधि को रिकॉर्ड करना

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 12-अच्छी तरह से एमईए प्लेट तैयार करें।
  2. साफ करने के लिए सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत बाँझ एच 2 हे के साथ 5 मिनट के लिए विदेश मंत्रालय की प्लेटें 3 बार धोएं। 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल के साथ धो लें और फिर प्लेट को बाँझ बनाने के लिए 100% इथेनॉल के साथ धोएं।
  3. नसबंदी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 घंटे के लिए एक ओवन में उलटे प्लेट सेंकना।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μL 0.2% पॉलीथिलीनिमन समाधान (पीई) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे सेवन करें। पीई की आकांक्षा और कुओं 4x बाँझ डिस्टिल्ड एच 2 ओ के साथ धो लो। वायु में सूखी हुड रातोंरात।
  5. एल 15 माध्यम में 20 μL / एमएल समाधान का लैमिनिन तैयार करें और प्रत्येक कुएं के केंद्र में 10 μL लमिनिन जोड़ें।
    नोट: आसपास के संदर्भ और ग्राउंडिंग इलेक्ट्रोड को कोट न करें।
  6. मध्यम या लमिनिन वाष्पीकरण को रोकने के लिए आसपास के जलाशयों में बाँझ डीएच 2 ओ जोड़ें।37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेट को सेते
  7. धीरे-धीरे उन्हें विस्तृत मुंह विंदुक टिप में लटाने और उन्हें स्थानांतरित करके एलिनिन लेपित एमईए प्लेट्स में एसएफईबी (अनुभाग 1 और 2 देखें) जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से 200 μL डीएम 2 मध्यम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ 2 पर रातोंरात सेवन करें।
  8. 24 घंटे के बाद एक अतिरिक्त 200 μL मध्यम जोड़ें और इसे प्लेट पढ़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस, 95% नमी, 5% सीओ 2 पर 30 मिनट के लिए ठीक होने दें।
  9. न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए प्लेट रीडर (37 डिग्री सेल्सियस के लिए preheated) में विदेश मंत्रालय की प्लेट रखें। संबद्ध मीयादी रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ 10 मिनट के लिए रिकॉर्ड गतिविधि। विवरण के लिए संदर्भ 1 देखें
  10. कच्चे डेटा-निरंतर नदियों और neuronal गतिविधि के रेखापुंज भूखंडों सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 19 उत्पन्न करें।
    नोट: MEA रिकॉर्डिंग 7 दिनों के बाद SFEB चढ़ाना ले जाया जाता है। इस अध्ययन के लिए, नेटवर्क फट गतिविधि का पता लगाने के लिए रिकॉर्डिंग 10 मिनट के लिए ली गई थीसूक्ष्म ट्रेस, और रेखापुंज भूखंड एसईएफबी को विदेश मंत्रालय की प्लेटों पर दीर्घकालिक बनाए रखा जा सकता है और इसे पर्यावरणीय रूप से नियंत्रित परिस्थितियों ( चित्रा 6 ) का उपयोग करते हुए लंबे समय तक दर्ज किया जा सकता है।

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Representative Results

हमारे तकनीक का उपयोग करते हुए एसएफईबी विकसित हुए ट्यूशन को रूपात्मक विशेषताओं के साथ मिला है जो कि शुरुआती विकासशील काउर्टेलिक सबवेन्ट्रिकुलर जोन के साथ व्यापक टुज 1-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के साथ-साथ न्यूरल प्रीजेनेटर ( चित्रा 3 ए ) के साथ भरा हुआ है। बाहरी परतों और एसईएफबी ( आकृति 3 बी ) के अंदरूनी परतों में कई विकासशील कॉर्टिकल रोज़ों को देखा गया। एसएफईबी का बाहरी किनारा एक विकसित कॉर्टिकल प्लेट वाला होता है जिसमें पोस्टमिमिटिक न्यूरॉन्स होते हैं। यह ब्रैन 2 की अभिव्यक्ति के द्वारा समर्थित है, जो सबसे अधिक आवृत बाहरी कॉर्टिकल परतों में तंत्रिका पूर्वज के लिए एक मार्कर है। रिसेलिन पॉजिटिव सेल, जो कैजल-रेटेजियस कोशिकाओं या उनके प्रजनन हो सकते हैं, जो कि विकासशील प्रांतस्था के बाहरी परतों में व्यक्त किए जाते हैं, उन्हें एसएफईबी ( चित्रा -3 सी ) में देखा जाता है। SFEBs इस प्रोटोकॉल एक्सप्रेस मार्कर का उपयोग कर मिश्रित कंडल (सीजीई) और औसत दर्जे का गैन्ज़्लियोNic eminence (MGE) मूल CGE मार्कर Couptf2 और MGE मार्कर Nkx2.1 व्यक्त अन्य कोशिकाओं संस्कृतियों ( चित्रा 3 डी ) में मनाया जा सकता है कि कक्ष। प्रोटोकॉल में डीकेके -1 के उपयोग के कारण यह भाग में हो सकता है, जो कि मध्यवर्गीय भाग्य 20 को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है।

एसएफईबी ने इस प्रोटोकॉल का उपयोग कैल्टेतिनिन- और कैल्बिनडिन-पॉजिटिव इन्टरवायरन ( चित्रा 4 ए ) के साथ-साथ वीजीएलयूयूटीयूटी पॉजिटिव न्यूरॉन्स और टीबीआर 1-पॉजिटिव ग्लूटामेटरगिक तंत्रिका प्रजनन ( चित्रा 4 बी ) दोनों का इस्तेमाल किया। औसतन, हमने देखा है कि एसएफईबी में कुल कोशिकाओं का 61% वीजीएलयूयूटी सकारात्मक है और 43% टीबीआर 1 पॉजिटिव ( चित्रा 4 सी ) हैं। यह समान प्रोटोकॉल 21 का उपयोग करते हुए अन्य रिपोर्टों के अनुरूप है इसके अतिरिक्त, SFEBs का प्रयोग शारीरिक कैंची के अधीन हो सकता है जैसे लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करअधिक भौतिक-संबंधी वातावरण ( चित्रा 5 ) में न्यूरल नेटवर्क फ़ंक्शन का पालन करने के लिए फ्लू -4 जैसे मार्कर। एसएफईबी को लंबे समय के लिए विदेश मंत्रालय के रिकॉर्डिंग के अधीन किया जा सकता है और कॉर्टिकल नेटवर्क स्तर के फटाके के विकास ( चित्रा 6 ) दिखा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: एसईएफबी तैयार करने में प्रारंभिक कदमों को तैयार करने के लिए योजनाबद्ध। एक एंजाइमिक असंतुलन का उपयोग कर आईपीएससी का उत्पादन किया जाने के बाद, वे 96-अच्छी तरह प्लेट्स में चढ़ाए जाते हैं और एकत्रीकरण के लिए 163 xg पर 3 मिनट के लिए त्वरित एकत्रीकरण प्रेरित करते हैं। इन विट्रो (डीआईवी) कोशिकाओं के 14 दिनों के बाद सेल कल्चर डालने वाले 6-अच्छी तरह प्लेट्स पर विस्तृत बोर पाइप्स के माध्यम से 96-अच्छी तरह प्लेट्स से स्थानांतरित किया जा सकता है। कृपया यहां क्लिक करें viईव इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण

चित्र 2
चित्रा 2: एसईईबी ग्रोथ एंड एक्सपेंशन के दौरान मध्यम परिवर्तन और चरण की समय रेखा। एसईएफबी को आवेषण में स्थानांतरित कर दिए जाने के बाद, वे इन विट्रो (डीआईवी) में 14 और 28 दिनों में दो माध्यमिक बदलाव करते हैं। इन्हें आम तौर पर डीआईवी 30, 60 और 90 के प्रयोगों के लिए काटा जाता है। ऊपरी ऊपरी हिस्से इस प्रक्रिया में अलग-अलग चरण दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 1,000 सुक्ष्ममापी (बहुत बाएं); 1,000 माइक्रोन (डीआईवी 20); 600 माइक्रोन (डीआईवी 30); 300 माइक्रोन (एकल एसएफईबी) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: जनरल मोर्फ़ोलॉजिकल कैरेक्टरसइस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करते हुए एसएफईबी के टियांक्स बढ़ते हैं। ( ए ) एसईएफबी के ठेठ बाहरी छोर जो पूर्वनिर्मित मार्कर नेस्टिन (हरा) को व्यक्त करते हैं, पोस्ट-माइॉटोसिस तंत्रिका मार्कर तुज 1 (लाल) और परमाणु दाग ​​(नीला)। ( बी ) एसएफईबी बाहरी परतों (बायां छवि) और आंतरिक परतों (दाएं) दोनों में विशेषता वाले cortical rosettes दिखाते हैं वे दोनों पूर्वजों और परिपक्व न्यूरोनल मार्करों को व्यक्त करते हैं। ( सी ) बाहरी परत / कोर्टिक प्लेट मार्कर ब्रान 2 (हरा) और विकासशील सीजीई मार्केट कप्प्टफ 2 (लाल) को व्यक्त करने वाले एक एसएफईबी के एक बाहरी बाहरी किनारे। ( डी ) इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले एसएफईबी ने निगेटिव नेकोर्टिकल स्ट्रक्चर का प्रतिनिधित्व किया है जैसा कि पैक्स 6 (लाल) धुंधला और एनएक्सक 2.1 (लाल) जैसे कुछ एमजेई मूल के अनुरूप दिखने वाले मार्करों द्वारा देखा गया है। स्केल बार = 40 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 4: एसईएफबी में प्रमुख न्यूरोनल सेल प्रकार की छवियां ( ए ) एसएफईबी में कुछ न्यूरॉन्स कैल्साइंडिन (हरे, बायां छवि) और कैलटेटिनिन (हरे रंग की, सही छवि) जैसे कॉर्टिकल इंटीनेटों के अनुरूप मार्करों का प्रदर्शन करते हैं। ( बी ) एसएफईबी टीबीआर 1 (लाल, सही छवि) को अभिव्यक्त करते हुए वीजीएलयूटी -1 पॉजिटिव ग्लूटामाएटेरगिक न्यूरॉन्स (लाल, बायां छवि) और ग्लूटामेटरजीक प्रजनकों दिखाते हैं। स्केल बार = 40 माइक्रोन ( सी ) उत्तेजक न्यूरॉन्स की विशिष्ट पैदावार जिसमें वीजीएलयूटीयूटी -1 या टीबीआर 1 (त्रुटि बार = एसईएम) है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: लाइव-सेल कैल्शियम रिकॉर्डिंग। </ मजबूत> (वाम छवि) प्रतिनिधि बाहरी बाहरी एसएफईबी फ्लू -4 के साथ इलाज किया गया, एक न्यूरॉनल कैल्शियम सूचक। कोशिकाओं को सहज कैल्शियम यात्रियों (मिश्रित रंग बक्से) के माप के लिए चिह्नित किया जाता है। (दायां छवि) लाल बक्से (ऊपरी निशान) या हरे रंग की बक्से (निचले निशान) द्वारा चिह्नित सहज कैल्शियम यात्रियों का प्रदर्शन करने वाले चयनित कक्ष। स्केल बार = 40 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: एसईएफबी के बहु-इलेक्ट्रोड एरे रिकॉर्डिंग (शीर्ष) विदेश मंत्रालय की प्लेट (स्केल बार = 100 माइक्रोन) से जुड़ी एसएफईबी की प्रतिनिधि छवि। (मध्य और नीचे) लंबी अवधि के दौरान विदेश मंत्रालयों पर एसईएफबी दर्ज किए जा सकते हैं और परिपक्वता दिखा सकते हैं। (मध्य और नीचे; बाएं) 3 एसएफबी के एक व्यापक चौड़े फट का नक्शा 1 के 3 कुएं पर चढ़ाया गया2-अच्छी तरह से एमईए की प्लेट, गहरा रंग उच्चतम स्पाइक गतिविधि दर्शाती है जो दिन 30 और दिन 90 के बीच बढ़ जाती है। (मध्य और नीचे; इनसेट) संचयी गतिविधि का नक्शा स्पाइक घनत्व में वृद्धि और एसएफईबी के बीच कॉर्टिकल नेटवर्क के भीतर स्पाइक्स का क्षेत्र दिन 30 और दिन 90. (मध्य और नीचे, दाएं) कच्चे निशान (ऊपरी) और पूरी तरह से रेखापुंज भूखंड (निचले) समय के साथ स्पाइक्स की संख्या और फटने की संख्या में वृद्धि दर्शाते हैं; एसएफईबी में मजबूत नेटवर्क बनाने का संकेत इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

एंटीबॉडी पतला करने की क्रिया जाति
nestin 0.११,११,११,१११ माउस
Brn -2 0.388888,889 खरगोश
VGLUT1 0.११,११,११,१११ खरगोश
Pax6 0.25 खरगोश
Calretinin 0.१८,०५,५५,५५६ खरगोश
Calbindin 0.३१,९४,४४,४४४ खरगोश
CoupTFII 0.१८,०५,५५,५५६ माउस
एनकेएक्स 2.1 0.१८,०५,५५,५५६ खरगोश
Tuj1 0.३८,८८,८८,८८९ मुर्गी
रील में 0.३८,८८,८८,८८९ माउस
Tbr1 0.१८,०५,५५,५५६ मुर्गी
NFH 0.25 माउस

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक hiPSC स्रोत को 3 डी संरचना में अंतर करने की स्थिति प्रदान करता है जो ललाट कॉर्टेक्स के प्रारंभिक विकास चरण को पुनरावृत्त करता है। यह प्रक्रिया उन संरचनाओं की पैदावार करती है जिन्हें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए पूछताछ की जा सकती है जबकि माइक्रोस्कोपी के लिए भी उपयोग किया जा सकता है। एसएफईबी का आखिरी आकारिकी संगठनों के आकार के मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों की तरह है और उच्च गुणवत्ता वाले विस्तृत कन्फोकल इमेजिंग की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल एफएफबीबोलास्ट और पेरिफेरल-रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल-एनएक्टेड हायपीएससी दोनों से सफलतापूर्वक एसएफईबी उत्पन्न कर सकता है। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल से प्राप्त एचईपीएससी से बनाए गए एसएफईबी समान रूपवाचक लक्षण दिखाते हैं जो फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न हाईपीएससी से बनाए गए हैं।

यह प्रक्रिया, जैसे अन्य 3-डी योजनाएं, सेल भाग्य के फैसले को निर्देशित करने के लिए छोटे अणु कोशिकीय संकेतों का इस्तेमाल करती हैं। यह सेल-टू-सेल संपर्क के आंतरिक गुणों के साथ मिलाया जाता है, जो नेट के लिए अधिक यथार्थवादी वातावरण बनाता हैकाम का गठन और न्यूरोनल फ़ंक्शन अन्य रिपोर्टों से पता चला है कि छोटे अणु कोशिकी संकेतों का उपयुक्त संयोजन ऐसे सेल भाग्य के फैसले के लिए पर्याप्त है जैसे कि मध्य-बौद्ध डोपामिनर्जिक 8 , 22 , और कॉर्टिकल इन्टरनेट 8 , 16 , 23 । हालांकि, 3 डी सिस्टम 2-डी समकक्ष 5 की तुलना में एक त्वरित परिपक्वता समय दिखाते हैं। जब पर्याप्त समय दिया गया तो 3-डी संस्कृतियों ने परिपक्व होने वाली वृत्तियों को दिखाया है। इस तरह के गुण SFEB जैसे 3-डी प्लेटफार्मों की उपयोगिता के लिए मजबूत तर्क बनाते हैं। लाइव और उच्च गुणवत्ता वाली माइक्रोस्कोपी का अतिरिक्त लाभ, साथ में स्रोत सामग्री की लचीलेपन के साथ, इस प्रोटोकॉल के लिए आकर्षक तर्क बनाते हैं।

इसके अतिरिक्त, एसएफईबी ने इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अन्य रिपोर्ट किए गए अध्ययनों के साथ कई समानताएं साझा की हैं , 13 , 24 संदर्भ के संदर्भ में 24 , इस प्रोटोकॉल और न्यूरॉन्स की शारीरिक मान्यता इसे पूर्व-तिथि उदाहरण के लिए, सन्दर्भ 13 , 24 में रिपोर्ट किए गए अध्ययनों में , दोहरी एसएएमएडी अवरोध के इसी प्रकार के संस्करणों का उपयोग न्यूरॉन्स जैसे कॉर्टिकल प्राप्त करने के लिए किया गया था और ग्लूटामेटेरगिक न्यूरॉन्स और प्रजनन (~ 50%) का समान अनुपात प्राप्त किया था। इसके अतिरिक्त, मैरिएनी, जे एट अल (संदर्भ 13 ) इस प्रोटोकॉल के 25-30 दिन के समय बिंदुओं पर समान पैक्स 6 और नेस्टिन स्टेंसिंग की रिपोर्ट करें। गुणात्मक रूप से, Brn2 के लिए धुंधला पैटर्न और साथ ही जीएफ़एपी पॉजिटिव एस्ट्रोसाइट्स की अभिव्यक्ति संदर्भ 24 में रिपोर्ट के समान है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में आमतौर पर दो सामान्य उपयोग किए गए अंगणों के तरीकों पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, मैरिएनी, जे एट अल 13 दिन के 50 वें दिन डीएलएक्स पॉजिटिव इंटरन्यूरन्स के विकास की रिपोर्ट करेंकेवल immunostaining तरीकों द्वारा पुष्टि की इस प्रोटोकॉल का प्रयोग करते हुए, 30 दिन में डीएलएक्स पॉजिटिव इंटर्न्यूरोन का उत्पादन होता है। इन इंटीनेटों को एक सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और जीएएए 16 के एकल सेल औषधीय अनुप्रयोग द्वारा कार्यात्मक के रूप में पुष्टि की गई थी। इसके अतिरिक्त, 13 के लेखकों ने न्यूरॉन्स की कार्यात्मक कनेक्टिविटी का दावा किया है, लेकिन यह केवल धुंधला हो जाने के कारण ही निर्धारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले एसएफईबी ने नेटवर्क सिंगल-इलेक्ट्रोड उत्तेजना और कैल्शियम इमेजिंग के अधीन किया गया है ताकि यह दिखाया जा सके कि कॉर्टिकल नेटवर्क विकसित हो रहे हैं और कार्यात्मक हैं। पासका, एट अल 24 अनुभाग में ऑरोऑनॉइड-जैसी संरचनाओं से रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक cryostat का उपयोग करते हुए समुच्चय। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले एसएफईबी सेक्शनिंग की आवश्यकता नहीं है और आवेषण 1 में सीधे दर्ज किया जा सकता है। गैर-अनुभाग वाले एसएफईबी से दर्ज किए गए न्यूरॉन्स को एक्शन पॉजिटिव और सैंटिन के बाद इन-सिनेकेटिक पॉजिटिव को रोकना दिखाया गया हैजी 1 , 16

एसएफईबी दोनों फाइब्रोब्लास्ट्स और पीबीएमसी का प्रयोग शुरू करने वाली सामग्री के रूप में किया जा सकता है। अन्य ऊतक-प्रकारों का उपयोग करना भी संभव है, जो कि हायपीएससी (जैसे दंत पल्प, फर्शिन, मूत्र) में परिणाम 25 , 26 , 27 , हालांकि समान परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ छोटे अणुओं को बदलना पड़ सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, डीकेके -1 का इस्तेमाल एसएफईबी को वायुप्रचारित भाग्य 28 की ओर ले जाने में महत्वपूर्ण है। सीएजी-जैसे मूल 16 के साथ इंटर्न्यूरन्स के भेदभाव के लिए यह वेंट्रेशन आंशिक रूप से ज़िम्मेदार है। डीकेके -1 एक महंगा छोटा अणु है और इस प्रकार ध्वनि प्रोटोकॉल में डीकेके -1 पूरक करने के लिए सोनिक हेजहोग की उच्च सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, डीकेके -1 के माध्यम से Wnt अवरोधन की सांद्रता अंत उपयोगकर्ता द्वारा अनुभवपूर्वक निर्धारित की जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, XAV939, एक अन्य WNT अवरोधनआर, एक वायुप्रदीक्षित भाग्य के लिए ड्राइव भेदभाव की मदद के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इस अवरोधक का उपयोग ऊतक उत्पन्न करेगा जो कि एमजीजी 23 के साथ ट्रांस्क्रिप्शनल पहचान साझा करेगा।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित SFEBs जैसे 3D hiPSC संस्कृति प्रणालियों का विकास करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन संरचनाओं ने संस्कृति से संस्कृति की विविधता की एक मध्यम राशि उपज की है। यह आंशिक रूप से आईपीएससी से न्यूरोनल भेदभाव की स्टेक्स्टिक प्रकृति के कारण है और एसएफईबी में सेल-सेल संपर्क दीक्षा के कारण होता है जिसके परिणामस्वरूप स्वाभाविक आत्म-संगठन 29 , 30 होता है । इसलिए, विविधता के संदर्भ में इस तकनीक की उपयोगिता की व्याख्या करना महत्वपूर्ण है। इस प्रणाली में विविधता के प्रभाव को कम करने के तरीके में शामिल हैं, बड़ी संख्या में एसएफईबी बनाने ताकि वे सिस्टम में प्राकृतिक भिन्नता का प्रतिनिधित्व कर सकें, जो कि सख्ती से एकाग्रता का पालनअभिकर्मकों और कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक उत्पादन चलाने की शुरुआत में वरीयता दी। स्वच्छ आईपीएससी कॉलोनियों के साथ शुरू करना और सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए आईपीएससी विस्थापन के दौरान एंजाइमिक पृथक्करण चरण के दौरान न्यूनतम ट्रिप्टेशन को लागू करना महत्वपूर्ण है। उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने में ट्रिप्रेशन के बाद सेल व्यवहार्यता एक महत्वपूर्ण कारक है, सुसंगत SFEBs एक वैकल्पिक समस्या निवारण चरण के रूप में, विस्थापन के बाद व्यवहार्यता की जांच की जा सकती है और ट्रांस्पैन नीली का उपयोग करते हुए सेंट्रीफेगेशन स्टेप्स से पहले, यदि आवश्यक हो। व्यवहार्यता और सहजता से भेदभाव भी प्रभावित हो सकता है अगर प्रारंभिक असहयोग और भेदभाव के चरणों के दौरान रोक्की का उचित उपयोग नहीं किया जाता है। पहले 7-10 दिनों में 50% फीड के दौरान रोक्की का उपयोग और इसके कदम-दर-चरण में कमी लगातार, उच्च गुणवत्ता वाले एसएफईबी के लिए महत्वपूर्ण है।

इसके अतिरिक्त, यह अक्सर 3 डी एसईएफबी में परिणामों की जांच करने के लिए सत्यापन चरण के रूप में उपयोगी होता है, जो कि एक मोनोलायर तैयारी के उपयोग से बनाए गए एक ही सेल लाइन में मनाए गए हैं। समझयह बताते हुए कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के भीतर दो प्रणालियों को क्रॉस-एपरेन्ट कैसे दिया जाता है, दी गई बीमारी मॉडल की जटिलता को समझने में बहुत उपयोगी है। अंत में, एसएफईबी का इस्तेमाल सेल आबादी को एक और एकसमान 2 डी मोनोलायर सिस्टम 16 में आगे के अध्ययन के लिए फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके सॉर्ट करने और शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है।

इसके बावजूद, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एसएफईबी छोटे विकासशील कॉर्टिकल सर्किटों के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में उच्च-सामग्री दृष्टिकोण के साथ इलेक्ट्रोफिजिकल रिकॉर्डिंग मल्टीप्लेक्सिंग शामिल हैं। दरअसल, सेल चैंबर आवेषण 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में उपयोग के लिए निर्मित होते हैं। इन आवेषण का उपयोग 6-अच्छी तरह से सम्मिलित जगहों के स्थान पर वर्णित SFEB प्रोटोकॉल के साथ किया जा सकता है इस पद्धति का उपयोग करते हुए स्केलेबिलिटी दिखाने के लिए, एसईएफबी को किसी दिए गए पलटन के भीतर एकाधिक लाइनों और क्लोनों का उपयोग करने की आवश्यकता होगी और उसे स्थिर सेल-आधारित एनाल्स के एक सेट में जांच की आवश्यकता होगी जिससे कि स्थिरता के लिए देखेंपतली संस्कृतियां उदाहरण के लिए, न्यूरॉनल नंबर, आकृति विज्ञान, और परत विकास को 96-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करने पर विचार किया जा सकता है। आदर्श रूप से, सेल आधारित एहसास को एक उच्च-सामग्री इलैक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परख जैसे एमईए, के साथ जोड़ा जाना चाहिए, जो 96-अच्छी तरह प्लेटों के लिए भी स्केल योग्य है।

यह एसईएफबी मंच ने न्यूरोलॉजिकल विकारों में प्रारंभिक कॉर्टिकल नेटवर्क के विकास की भूमिका को समझने का वादा किया है, विशेषकर उन मामलों में जहां आनुवंशिकी और शुरुआती तंत्रिका विकास के बीच संभव बातचीत है। हमने यह दर्शाया है कि चूहे और माउस अध्ययनों में दिखाया गया है कि यह एक टुकड़ा संस्कृति की तरह ज्यादा इलाज किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए उपयोगी भविष्य के अध्ययन के लिए विकास की तुलनात्मक शरीर रचना और शरीर विज्ञान के बीच माउस और एसईएफबी के विवो ढांचे के बीच होना चाहिए। ड्रग की खोज और बुनियादी शोध के लिए सही मायने में अनुवाद प्रणाली विकसित करने में यह तुलनात्मक डेटा बहुत शक्तिशाली होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतियोगी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

हम आलेख प्रूफरीडिंग के लिए एलिजाबेथ बेनिविड्स का धन्यवाद करते हैं। हम डॉ। धन्यवाद उनके सहायक चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए जॉन हस्मन और जीन ब्लैट

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components 
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) STEMCELL Technologies 0-5835 250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) GlobalStem GSM-2001
Name Company  Catalog Number Comments
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 Invitrogen 10565018 385 mL
Knockout Serum Replacement Invitrogen 10828028 20% 100 mL
Pen/Strep Invitrogen 15140122 5 mL
Glutamax 200 mM Invitrogen 35050061 5 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid Invitrogen 11140050 5 mL
2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid Invitrogen 21985023 900 μL
Name Company  Catalog Number Comments
DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 Invitrogen 10565018 500 mL
Glutamax 200 mM Invitrogen 35050061 5 mL
Pen/Strep Invitrogen 15140122 5 mL
N-2 Supplement (100x), liquid Invitrogen 17502048 10 mL
Name Company  Catalog Number Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), liquid Invitrogen 21103049 500 mL
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid Invitrogen 12587010 10 mL
Glutamax 200 mM Invitrogen 35050061 5 mL
Pen/Strep Invitrogen 15140122 5 mL
Name Company  Catalog Number Comments
Small Molecules
Thiazovivin Stemgent 04-0017 2 μM
SB431542 Stemgent 04-0010-10 1:1,000 (10 μM)
Dorsomorphin Stemgent 04-0024 1 μM
LDN-193189 Stemgent 04-0074-10 250 nM
Y27632 (ROCKi) Stemgent 04-0012-10 10 μM
Name Company  Catalog Number Comments
Recombinant Protiens
DKK-1 Peprotech 120-30 200 ng/mL
Name Company  Catalog Number Comments
Components/Materials
Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter Millicell PICM0RG50
Mouse Embryonic Fibroblasts GlobalStem GSC-6301G
96 well V bottom w/Lids Evergreen 222-8031-01V
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent ThermoFisher A1110501
TritonX-100 ThermoFisher 85111
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 500 mL
Normal Donkey Serum Jackson Labs 017-000-121
Leibovitz's L-15 Medium ThermoFisher 11415114 500 mL
DRAQ5 (Nuclear Marker) ThermoFisher 65-0880-96
MEA Plates Axion Biosystems M768-GL1-30Pt200
6 well flat bottom Falcon 353046
Name Company  Catalog Number Comments
Antibody
Nestin Millipore MAB5326
Brn-2 Protein tech 14596-1-AP
VGLUT1 Synaptic Systems 135 303
Pax6 abcam ab5790
Calretinin abcam ab702
Calbindin abcam ab11426
CoupTFII R&D Systems PPH714700
Nkx 2.1 abcam ab12650
Tuj1 abcam ab41489
Reelin Millipore MAB5364
Tbr1 Millipore MAB2261
NFH Dako M0762

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तंत्रिका विज्ञान अंक 125 आईपीएससी 3 डी एसएफबी न्यूरॉन्स मानव कॉर्टिकल विकास फिजियोलॉजी
फिजियोलॉजिकल रिलेशियल एसेस के प्रयोग से 3-डी स्टेम सेल कल्चर की पूछताछ के लिए हाईपीएससी डिरेक्ट सीरम फ्री एम्ब्रॉयड बॉडीज का विकास करना
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Phillips, A. W., Nestor, J. E., Nestor, M. W. Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays. J. Vis. Exp. (125), e55799, doi:10.3791/55799 (2017).

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