Summary
نحن هنا تقرير بروتوكول لتطوير نظام ثلاثي الأبعاد (3-D) من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (هيبسس) يسمى الجسم الجنين الحرة المصل (سفيب). ويمكن استخدام هذا النموذج 3-D مثل ثقافة شريحة عضوي النمط لنمذجة التنمية القشرية البشرية والاستجواب الفسيولوجي لتطوير الدوائر العصبية.
Abstract
على الرغم من أن عددا من نماذج المرض في المختبر تم تطويرها باستخدام هيبسس، أحد القيود هو أن هذه النظم ثنائية الأبعاد (2-D) قد لا تمثل الهندسة المعمارية الأساسية والتعقيد الوظيفي من الأفراد المتضررين الذين يحملون متغيرات الأمراض المشتبه بها. التقليدية 2-D نماذج تبقى تمثيلات غير مكتملة في الجسم الحي تشبه الهياكل ولا تعبر بشكل كاف عن تعقيد الدماغ. وهكذا، هناك حاجة ناشئة لمزيد من النماذج 3-D هيبسك القائمة التي يمكن أن تلخص بشكل أفضل التفاعلات الخلوية وظائف ينظر في نظام في الجسم الحي .
هنا نحن تقرير بروتوكول لتطوير نظام 3-D من هبسس غير متمايزة على أساس الجسم الجنين الحرة المصل (سفيب). هذا النموذج 3-D يعكس جوانب تطور القشرة المخية الجديدة البطينية ويسمح للدراسات في وظائف لا يتجزأ من الخلايا العصبية الحية وأنسجة سليمة مثل الهجرة والاتصال والتواصل، وحصيرةuration. على وجه التحديد، ونحن نبرهن على أن سفيبس باستخدام بروتوكول لدينا يمكن استجوابه باستخدام الفسيولوجية ذات الصلة والمحتوى عالية الخلية المقايسات القائمة مثل التصوير الكالسيوم، والتسجيلات متعددة القطب (ميي) التسجيلات دون كريوسكتيونينغ. في حالة التسجيلات ميي، ونحن نبرهن على أن سفيبس زيادة كل من ارتفاع النشاط والنشاط على مستوى الشبكة انفجار خلال زراعة على المدى الطويل. يوفر هذا البروتوكول سفيب نظام قوي وقابلة للتطوير لدراسة تطوير تشكيل الشبكة في نموذج 3-D الذي يلتقط جوانب التنمية القشرية في وقت مبكر.
Introduction
لقد سبق أن أبلغنا عن نظام نموذج ثلاثي الأبعاد، تم إنشاؤه من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة من قبل الإنسان (هبسس) التي تلخص بعض جوانب تطوير الشبكة القشرية في وقت مبكر 1 . هذا النموذج 3-D، وهي هيئة أجنة خالية من المصل (سفيب)، ويحسن على نماذج هيبسك التجميع بسيطة السابقة 2 ، 3 . وهناك مجموعة متزايدة من العمل تكشف عن أن الهياكل 3-D مثل سفيبس لدينا، والجوانب التقريبية للتنمية العصبية التي لوحظت عادة في الجسم الحي وفي وقت سابق نقطة من لوحظ في 2-الأبعاد (2-D) / أحادي الطبقة نماذج هيبسك 4 ، 5 . وقد ركزت الدراسات الأولية على التعقيد التنظيم الذاتي للهيئات 3-D دون إظهار تعقيدها الفسيولوجية 2 .
وقد تم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا على هيبس غير متمايزة المستمدة من الخلايا الليفية و خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (بمكس). يتم الحفاظ على هذه الخلايا على γ المشعاعات الماوس الجنينية المشع (ميفس). يتم تنظيف هذه المستعمرات هيبسك يدويا من خلايا متباينة عفوية، حصاد إنزيميا، ومعلق في المتوسطة التي تحتوي على رو-كيناز المانع Y-27632 (روكي). تخضع هبسس غير المتمايزة للتفكك والطرد المركزي قبل أن يتم نقلها إلى 96 جيدا لوحات التصاق منخفضة الخامس أسفل. بعد الطلاء، يبدأ الحث العصبي باستخدام تثبيط سماد المزدوج (SB431542 و LDN193189 جنبا إلى جنب مع ديكوب 1 (دك-1)) لدفع الأمامي الأمامي الجبهي الدماغ العصبي مصير النسب 6 . بعد 14 يوما، يتم نقل سفيبس إلى إدراج ثقافة الخلية في لوحة 6 جيدا. وبمجرد نقلها، تبدأ سفيبس الجولة في الانتشار ورقيقة، مع الحفاظ على اتصالات الشبكة المحلية كما هو الحال في كثير من الأحيان لوحظ في الاستعدادات زراعة شريحة عضوي الشكل الحصين باستخدام إدخال خلية ثقافة مماثلة 1 ،سس = "كريف"> 7.
استخدام منصة سفيب 3-D على أساس هذا الشكل هو قابل للإنتاج الفعال للشبكات القشرية التي يمكن استجوابها باستخدام المقايسات الفسيولوجية الخلية القائمة مثل التصوير الكالسيوم أو المقايسات الكهربية مثل تسجيلات خلية واحدة أو مجموعة متعددة القطب (ميي ) 1 - على الرغم من أن نظم 3-D تحمل علامات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقد أظهرت دراسات أخرى أن هذه الهيئات 3-D قد تتطلب أوقات حضانة أطول للسماح للبطء بطبيعتها وتيرة تطوير الأنسجة البشرية 8 . هذا البروتوكول سفيب يولد بنجاح 3-D سفيبس من هبسس غير المتمايزة التي تلتقط جوانب التنمية في وقت مبكر من القشرة.
إمكانات سفيبس لنماذج نموذجية الانحرافات في الاضطرابات العصبية هو قوة هذا النظام. و هيبسس المستمدة من أنسجة المريض يمكن أن تزرع في خلايا الجهاز العصبي التي تخضع للحمارأيس المتعلقة بيولوجيا الخلية وكذلك ما يصاحب ذلك التعبير الجيني. وتستخدم إيبسس الإنسان للتأكد من الملف الجيني من مجموعات كبيرة من الأفراد الذين يعانون من اضطرابات عصبية متفاوتة مع مسببات معقدة مثل اضطراب طيف التوحد (أسد)، الفصام 9 ، متلازمة ريت 10 ، ومرض الزهايمر 11 ، 12 . حتى وقت قريب، كانت نماذج إبسك عادة أحادي الطبقة الاستعدادات التي، في حين يتقن في تقييم التفاعلات الجزيئية، كانت غير كافية في فك رموز التفاعلات الخلوية المعقدة ينظر في الجسم الحي . وكانت النماذج الحيوانية البديل الافتراضي لإعادة إنشاء منصة الجهاز كله. وتعاني هذه النماذج الحيوانية من سوء ترجمة النتائج ولها قدرة محدودة على تكرار التشكيلات الجينية البشرية التي حددتها الدراسات الفحوصات الجينية الكبيرة. وهكذا، فإن تطوير نظم 3-D من إيبسس يضيف طبقة اللازمة من التعقيد في الإنساننمذجة المرض 13 ، 14 . الخطوة التالية لمنصات هيبسك 3D هو لاستيعاب متطلبات على نطاق واسع من فحص الإنتاجية العالية باستخدام فحوصات الخلية القائمة 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جيل الخلايا العصبية السلف
- الحفاظ على هبسس المستمدة من الخلايا الليفية و بمكس في 6 لوحات جيدا على γ المشعاع الماوس تغذية الخلايا الجنينية (ميف) طبقة الخلية في المتوسطة إيبسك الإنسان تستكمل مع جزيئات صغيرة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: الصيانة اليومية هي نسخة معدلة من الإجراءات المبلغ عنها سابقا 1 ، 16 .- لوحة 6 × 10 5 ميفس على كل بئر من لوحة 6-جيدا زراعة الأنسجة الصف في 300 ميكرولتر / ينصح جيدا المتوسطة (بروتوكول الشركة المصنعة التالية).
- بعد 48 ساعة، استبدال ميفس المتوسطة مع 300 ميكرولتر / جيدا هيبسك المتوسطة لمدة 1 ساعة قبل إضافة هيبسس.
- ذوبان الجليد بسرعة هيبسس في حمام مائي 37 درجة مئوية وإضافة ببطء 1 مل هبسك متوسطة قطرة. نقل هيبسس والمتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة المتوسطة لجلب الحجم الكلي إلى 5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 129 x ج، نضح سوبيرناتانت، بلطف إعادة تعليق بيليه في 1 مل وسط هيبسك مع المانع روك في تركيز 1: 1،000.
- لوحة تعليق الخلية (عادة المصنفة في 300،000 خلية / بئر) على طبقة الخلية ميف واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ، 95٪ الرطوبة.
- رصد ثقافة إبسك عن كثب باستخدام المجهر الضوئي. بعد 48 ساعة، وإزالة الثقافات التي لها حواف متفاوتة، نمت لتصبح الكيسي مثل أو تظهر مصفر البني تحت المجهر الضوئي للحد من التمايز عفوية.
ملاحظة: بعد 7-10 أيام، يجب أن تشكل مستعمرات هيبسك. يجب أن تكون المستعمرات مستديرة، مع حدود محددة بوضوح وكثافات خلية موحدة، وخالية من الخلايا غير موحدة معبأة بشكل فضفاض. - يدويا تحديد مستعمرات هيبسك مستديرة لمسح ثقافة الخلايا متباينة عفوية. توسيع المستعمرات من خلال وضعها على طبقات ميف جديدة. توسيع 1: 3 كل 7 أيام عندما الثقافات بالقرب كونفلنسي وتجميد 1 ، 16 .
- بعد التوسع وتجميد الخلايا (للنسخ الاحتياطي)، وتنمو مستعمرات هيبسك على لوحات حتى تصل إلى 50-75٪ التقاء.
- بعد سبعة أيام الطلاء، واستخدام العلاج الأنزيمية خفيفة (5-10 دقيقة مع 300 ميكرولتر من محلول انزيم) و تريتوراتيون لطيف (2-4 مرات مع ماصة 1000 ميكرولتر) لحصاد وإعداد هيبسس لتمايز الخلايا السلائف العصبية.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 x ج لمدة 4 دقائق، نضح طاف، و ريسوسبيند بيليه في 5 مل المتوسطة إيبسك الإنسان. نقل تعليق الخلية إلى 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 5 سم طبق ثقافة الخلية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية للقضاء على ميفس وتحقيق أقصى قدر من العائد هيبسك. نقل المتوسطة (مع الخلايا غير الملتصقة) إلى آخر 5 سم طبق الجيلاتين المغلفة.
- نقل الخلايا غير الملتصقة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل باستخدام ماصة نقل. شطف بلطف لوحات مع 3 مل المتوسطة وإضافته إلى أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 x ج لمدة 4 دقائق، نضح السوبرناتانت، و ريسوسبيند بلطف بيليه في المتوسط. تحديد عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي. لوحة 9000 خلية / جيدا في 96-جيدا منخفضة التصاق لوحة V- القاع.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 163 x ج لمدة 3 دقائق. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة و 5٪ كو 2 . باستخدام ماصة، وتغيير 50٪ المتوسطة كل يوم عن طريق إزالة نصف المتوسطة واستبدالها مع الطازجة كيميائيا تعريف التفريق المتوسطة 1 (DM1؛ الشكل 1 ؛ جدول المواد) لمدة 14 يوما.
2. المصل خالية الجسم إمبريويد (سفيب) التعريفي ( الشكل 2 )
- وضع 40 ميكرون ثقافة الخلية إدراج في لوحات 6 جيدا وإضافة 1 مل من DM1 المتوسطة على الأقل 1 ساعة قبل إضافة المجاميع.
- في يوم 14، ونقل المجاميع مع 20 ميكرولتر المتوسطة باستخدام 200 ميكرولتر طرف الفم واسعة على 40 ميكرون إدراج ثقافة الخلية وتغيير المتوسطة إلى DM2.
7 ، 17 ، 18 .- نقل 4-6 المجاميع إلى إدخال خلية واحدة إدراج والسماح مساحة كافية بين المجاميع. إزالة أكبر قدر ممكن من الحل الزائد باستخدام طرف ماصة غرامة (على سبيل المثال 200 ميكرولتر طرف).
ملاحظة: فمن المقبول لإزعاج لفترة وجيزة سفيب لأنها سوف تتحرك على إدراج ثقافة الخلية كحل في إزالتها من جميع أنحاء سفيبس. - الحفاظ على الثقافات في 1 مل من DM2 عند 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة و 5٪ كو 2 . باستخدام ماصة، وتغيير 75٪متوسطة كل يوم عن طريق إزالة ثلاثة أرباع المتوسط والاستعاضة عن ثلاثة أرباع المتوسطة الطازجة. على سبيل المثال، وإزالة 750 ميكرولتر من المتوسطة وإضافة 750 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
- نقل 4-6 المجاميع إلى إدخال خلية واحدة إدراج والسماح مساحة كافية بين المجاميع. إزالة أكبر قدر ممكن من الحل الزائد باستخدام طرف ماصة غرامة (على سبيل المثال 200 ميكرولتر طرف).
- بعد 14 يوما من الثقافة، والتبديل إلى DM3 المتوسطة مع 75٪ المتوسطة تغيير كل يوم و 16 يوما أخرى.
- للحفاظ على سفيبس على إدراج خلية ثقافة ما بعد 30 يوما، تغيير المتوسطة كل يوم لمدة 60 و 90 و 120 يوما.
ملاحظة: سوف سفيبس تنمو إلى حوالي 1000 ميكرون في القطر وعادة ما تكون 100-150 ميكرون سميكة 1 .
3. تحديد تكوين سفيب
- فصل سفيبس من إدراج بواسطة بيبتينغ بلطف المتوسطة باستخدام 200 ميكرولتر واسعة الفم ماصة طرف. لنقل سفيبس، واستخدام واسعة ماصة الفم تلميح شفط بلطف الأجسام في طرف ماصة. بعد تحميل سفيب في طرف ماصة، نقل بلطف إلى لوحات 12 جيدا وغسل مع 300 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة(بس) لكل بئر.
ملاحظة: سيتم تعليق سفيبس في حل في لوحات 12 جيدا. هذا أمر مهم للسماح الاختراق الكامل من مثبت، حل عرقلة، والأجسام المضادة. إذا كان استخدام سفيبس متعددة للتلطيخ، ويمكن إضافة ما يصل إلى 10 سفيبس لكل بئر من 12 لوحة جيدا. وهذا من شأنه الحفاظ على الحلول والأجسام المضادة. - إصلاح سفيبس مع 300 ميكرولتر لكل بئر 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة. غسل سفيبس الثابتة مرتين مع 300 ميكرولتر بس، 3-5 دقائق كل غسل.
تحذير: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع بارافورمالدهيد.
ملاحظة: دقق في إمونوريكتيفيتي إلى علامات لتحديد النضج، نوع الخلية وما إلى ذلك لسمات الخلايا العصبية في هذه الدراسة تم استخدام الدجاج Tuj1 في 1: 500، لعلامات إضافية يرجى الاطلاع على الجدول 2 والمراجع 1 ، 16 . - بيرمابيليز وكتلة مع 0.1٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني و 10٪ مصل حمار العادي (حجب الحل؛ 300 μ؛ L لكل بئر) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل حجب وعلاج سفيبس مع 300 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية في حجب الحل. احتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. غسل سفيبس ثلاث مرات (3-5 دقيقة لكل غسل) في 300 ميكرولتر بس تحتوي على 0.1٪ تريتون-X.
- إعداد الأجسام المضادة الثانوية 1: 1000 في حجب الحل. احتضان سفيبس لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية. غسل سفيبس مع 300 ميكرولتر بس، 3 مرات لمدة 3-5 دقائق لكل منهما.
ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن تحضير سفيبس للتصوير. - إلى الصورة، ماصة سفيبس على شريحة زجاجية باستخدام ماصة واسعة تحمل. إزالة الحل الزائد حول سفيب باستخدام شفط لطيف.
ملاحظة: لظروف مماثلة تلطيخ، سفيبس متعددة يمكن وضعها على الشريحة الزجاجية نفسها. - إضافة قطرة من وسط تصاعد على سفيبس، وضع ساترة الزجاج، وضغط بلطف لضمان عدم وجود فقاعات الهواء. السماح المتوسطة تصاعد إلى تتصلب والمضي قدما في التصوير والتقدير الكمي (الخطوة 3.8).
- أداء الكمي الخلية عن طريق اتخاذ مناطق متعددة من الفائدة (روي) عبر سفيب واستخدام Z- كومة جنبا إلى جنب مع صورة الإسقاط القصوى من خلال كل عائد الاستثمار على المجهر متحد البؤر القياسية كما هو موضح في المراجع 1 ، 16 .
ملاحظة: يمكن قياس سفيبس كله باستخدام البلاط على أساس الصورة (انظر المراجع 1 ، 16 لمزيد من التفاصيل). منذ سفيبس رقيقة إلى ما يقرب من 100 ميكرون، هناك تشتت الحد الأدنى من الضوء في الأنسجة، وبالتالي ليست هناك حاجة للمجهر 2 الفوتون. في وقت سابق من استخدام هذا البروتوكول مع الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الليفية إيبسس تنتج خريطة مصير سفيب التي كشفت بنية معقدة ومتنوعة مع المجموعات السكانية الفرعية من إنترنيورونس مع الهويات النسخي التي تشبه سغي والأمامي الدماغ الأمامي 1 ، 16.
4. تسجيل النشاط العصبي في سفيبس باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف
- إعداد 12-جيدا لوحات ميي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- غسل لوحات ميي 3 مرات لمدة 5 دقائق مع العقيمة H 2 O تحت ظروف معقمة لتنظيف. يغسل لمدة 5 دقائق مع 75٪ من الإيثانول ثم مع الإيثانول 100٪ لتعقيم لوحة.
- خبز لوحة مقلوب في الفرن لمدة 4-5 ح في 50 درجة مئوية لإتمام عملية التعقيم.
- إضافة 500 ميكرولتر 0.2٪ محلول البولي إثيلينيمين (بي) إلى كل بئر واحتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نضح بي وغسل الآبار 4x مع مقطر معقم H 2 O. الهواء الجاف في غطاء محرك السيارة بين عشية وضحاها.
- إعداد 20 ميكرولتر / مل حل من لامينين في L15 المتوسطة وإضافة 10 ميكرولتر لامينين إلى مركز كل بئر.
مالحظة: ال تقم بتغطية املرجع املرجعي وأقطاب التأريض. - إضافة العقيمة د 2 O إلى الخزانات المحيطة لمنع التبخر المتوسط أو لامينين.احتضان لوحة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة سفيبس (انظر الأقسام 1 و 2) لوحات ل مامين المغلفة لامينين عن طريق شفط لهم بلطف في غيض ماصة الفم واسعة ونقلها. إضافة 200 ميكرولتر DM2 المتوسطة إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة و 5٪ كو 2 .
- إضافة 200 ميكرولتر إضافية المتوسطة بعد 24 ساعة والسماح لها لاسترداد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 95٪ الرطوبة، و 5٪ كو 2 قبل قراءة لوحة.
- وضع لوحة الشرق الأوسط وأفريقيا في لوحة القارئ (مسخن إلى 37 درجة مئوية) لتسجيل النشاط العصبي. سجل النشاط لمدة 10 دقيقة مع برنامج تسجيل ميي المرتبطة بها. انظر المرجع 19 للحصول على التفاصيل.
- توليد البيانات الخام المستمر تيارات والمؤامرات النقطية من نشاط الخلايا العصبية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي 19 .
ملاحظة: تؤخذ التسجيلات ميي 7 أيام بعد طلاء سفيب. لهذه الدراسة، تم تسجيلات لمدة 10 دقيقة للكشف عن النشاط انفجار الشبكة، يخدعوتتبع دقيق، والمؤامرات النقطية. يمكن الحفاظ على سفيبس على المدى الطويل على لوحات ميي ويمكن تسجيلها على فترات أطول من الزمن باستخدام الظروف التي تسيطر عليها بيئيا ( الشكل 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سفيبس نمت باستخدام تقنيتنا أسفرت الأنسجة مع الخصائص المورفولوجية التي تشبه في وقت مبكر النامية القشرية منطقة تحت البطين مليئة الخلايا العصبية إيجابية Tuj1 إيجابية، فضلا عن الأسلاف العصبية ( الشكل 3A ). لوحظت العديد من الورديات النامية القشرية في الطبقات الخارجية والطبقات الداخلية من سفيب ( الشكل 3B ). الحافة الخارجية لل سفيب يشبه لوحة القشرية النامية التي تحتوي على الخلايا العصبية ما بعد البعوض. ويدعم هذا من قبل التعبير عن Brn2، علامة للأسلاف العصبية في الطبقات القشرية الخارجية الأكثر بطنية. وقد لوحظ أيضا خلايا إيجابية ريلين التي قد تكون خلايا كاجال-ريتزيوس أو أسلافها، والتي يتم التعبير عنها في الطبقات الخارجية للقشرة النامية في سفيبس ( الشكل 3C ). سفيبس نمت باستخدام هذا البروتوكول صريحة علامات متسقة مع الذيلية مختلطة (سغي) والعقدة الإنسينيك إميننس (مج) الأصل. ويمكن ملاحظة الخلايا التي تعبر عن علامة سغي Couptf2 والخلايا الأخرى التي تعبر عن علامة مج Nkx2.1 في الثقافات ( الشكل 3D ). وهذا قد يكون جزئيا بسبب استخدام دك-1 في البروتوكول، الذي ثبت أنه يعزز الأقدار وسطي 20 .
سفيبس المصنوعة باستخدام هذا البروتوكول العائد كلا من الكالريتينين و كالبيندين إيجابية إنتيرنيونس ( الشكل 4A ) وكذلك فغلوت الخلايا العصبية استثارة إيجابية و Tbr1 إيجابية الأسلاف العصبية غلوتاماترجيك ( الشكل 4B ). في المتوسط، لاحظنا أن 61٪ من إجمالي الخلايا في سفيبس هي فغلوت إيجابية و 43٪ هي Tbr1 إيجابية ( الشكل 4C ). وهذا يتفق مع التقارير الأخرى التي تستخدم بروتوكولات مماثلة 21 . بالإضافة إلى ذلك، سفيبس يمكن أن تخضع لفحوصات الفسيولوجية مثل الحية خلية التصوير الكالسيوم باستخدامعلامات مثل فلو-4، من أجل مراقبة وظيفة الشبكة العصبية في بيئة أكثر ذات الصلة فسيولوجيا ( الشكل 5 ). يمكن إخضاع سفيبس للتسجيلات ميي لفترات طويلة من الزمن وتظهر تطور انفجار القشرية على مستوى الشبكة ( الشكل 6 ).
الشكل 1: التخطيطي الخطوط العريضة للخطوات المبكرة في إعداد سفيبس. بعد أن تم حصاد إيبسس باستخدام التفكك الأنزيمية، وهي مطلية في لوحات 96-جيدا و الطرد المركزي في 163 x ج لمدة 3 دقائق للحث على التجميع السريع. بعد 14 يوما في المختبر (ديف) يمكن نقل مجاميع الخلايا من لوحات 96 جيدا عن طريق أنابيب واسعة تحمل على خلية ثقافة إدراج تحتوي على لوحات 6 جيدا. يرجى النقر هنا إلى السادسإو نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخط الزمني للتغيرات والمراحل المتوسطة خلال نمو وتوسعة سفيب. بعد نقل سفيبس إلى إدراج، فإنها تحت اثنين من التغييرات المتوسطة في 14 و 28 يوما في المختبر (ديف). وعادة ما يتم حصادها للتجارب في ديف 30 و 60 و 90. وتظهر األجزاء العليا مراحل مختلفة في هذه العملية. الحانات مقياس = 1،000 ميكرون (أقصى اليسار). 1،000 ميكرون (ديف 20)؛ 600 ميكرون (ديف 30)؛ 300 ميكرون (سفيب واحد). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخصائص المورفولوجية العامة تيك من سفيبس نمت باستخدام هذا البروتوكول. ( A ) الحافة الخارجية النموذجية لل سفيب معربا عن علامة نستين نستين (الأخضر)، والعلامة العصبية ما بعد الانقسامية Tuj1 (الأحمر) وصمة عار النووية (الأزرق). ( B ) سفيبس تظهر وريدات القشرية مميزة في كل من الطبقات الخارجية (الصورة اليسرى) والطبقات الداخلية (يمين). أنها تعبر عن كل من علامات العصبية السلف وناضجة. ( C ) الحافة الخارجية التمثيلية ل سفيب معربا عن الطبقة الخارجية / القشرة علامة علامة Brn2 (الأخضر) وعلامة سغ النامية Couptf2 (الأحمر). ( D ) سفيبس المصنوعة باستخدام هذا البروتوكول تمثل الهياكل القشرة المخية بطني كما رأينا PAX6 (أحمر) تلطيخ والتعبير عن علامات تتفق مع بعض أصول مج مثل Nxk2.1 (الأحمر). شريط مقياس = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
her.within الصفحات = "1"> 
الشكل 4: صور من أنواع الخلايا العصبية الرئيسية في سفيبس. ( A ) بعض الخلايا العصبية في سفيبس التعبير عن علامات متسقة مع إنترنيورونس القشرية مثل كالبيندين (الأخضر، صورة اليسار) والكالريتينين (الأخضر، الصورة اليمنى). ( B ) سفيبس تظهر فغلوت-1 الخلايا العصبية غلوتاماترجيك إيجابية (الأحمر، الصورة اليسرى) والأسلاف غلوتاماترجيك معربا عن Tbr1 (الأحمر، الصورة اليمنى). شريط مقياس = 40 ميكرون. ( C ) غلة نموذجية من الخلايا العصبية استثارة التعبير عن إما فغلوت-1 أو Tbr1 (شريط الخطأ = سيم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تسجيلات الكالسيوم الحية الخلية. </ سترونغ> (الصورة اليسرى) حافة الخارجي الممثل سفيب تعامل مع فلو-4، ومؤشر الكالسيوم العصبية. يتم وضع علامة على الخلايا لقياس عابرة الكالسيوم عفوية (مربعات ملونة متنوعة). (الصورة اليمنى) الخلايا المحددة التي تظهر عابرة الكالسيوم عفوية تميزت صناديق حمراء (آثار العليا) أو مربعات الخضراء (آثار أقل). شريط مقياس = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تسجيل مصفوفة متعددة القطب من سفيبس. (أعلى) صورة ممثل سفيب تعلق على لوحة ميي (مقياس شريط = 100 ميكرون). (الأوسط والسفلي) يمكن تسجيل سفيبس على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف على مدى فترات زمنية طويلة وتظهر النضج. (الأوسط والسفلي واليسار) خريطة رشقة واسعة النطاق لثلاث سفب مطلية على 3 آبار من 12-جيدا لوحة ميي، والألوان الداكنة تمثل أعلى ارتفاع النشاط العام الذي يزيد بين يوم 30 واليوم 90. (الأوسط والسفلي؛ إنزيتس) تظهر خريطة النشاط التراكمي زيادة في كثافة ارتفاع ومنطقة المسامير داخل الشبكات القشرية في سفبس بين يوم 30 واليوم 90. (الأوسط والسفلي، يمين) تظهر آثار الخام (العلوي) والمؤامرات النقطية جيدا (أقل) زيادة في عدد من المسامير وعدد رشقات نارية مع مرور الوقت. مما يدل على تشكيل شبكة أقوى في سفيبس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجسم المضاد | تخفيف | محيط |
| Nestin | 0.111111111 | الفأر |
| BRN-2 | 0.388888889 | أرنب |
| VGLUT1 | 0.111111111 | أرنب |
| Pax6 | 0.25 | أرنب |
| Calretinin | 0.180555556 | أرنب |
| Calbindin | 0.319444444 | أرنب |
| CoupTFII | 0.180555556 | الفأر |
| نككس 2.1 | 0.180555556 | أرنب |
| Tuj1 | 0.388888889 | دجاج |
| ريلين reelin | 0.388888889 | الفأر |
| Tbr1 | 0.180555556 | دجاج |
| NFH | 0.25 | الفأر |
الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر شروط لتمييز مصدر هيبسك في هيكل 3-D الذي يلخص مرحلة تنموية في وقت مبكر من القشرة الأمامية. هذا الإجراء يعطي الهياكل التي يمكن استجوابه لالكهربية في حين يجري أيضا قابلة للمجهر. التشكل النهائي لل سفيب يشبه ذلك من عضوي النمط الثقافات شريحة الدماغ ويسمح جودة عالية التصوير مبائر مفصل. هذا البروتوكول يمكن أن تولد بنجاح سفيبس من كل من الخلايا الليفية وحيدة الطرفية الدم أحادي النواة هيبس المستمدة من الخلية. سفيبس مصنوعة من الدم المحيطي النوى أحادي النواة هيبسس المستمدة من الخلايا تظهر خصائص مورفولوجية مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها من هيبسس المستمدة الليفية.
هذه العملية، مثل غيرها من مخططات 3-D، وتستخدم عظة جزيئات صغيرة خارج الخلية لتوجيه قرارات مصير الخلية. هذا جنبا إلى جنب مع الخصائص الجوهرية للاتصال خلية إلى خلية، والتي تخلق بيئة أكثر واقعية للصافيوتشكيل العمل وظيفة الخلايا العصبية. وقد أظهرت تقارير أخرى أن الجمع المناسب من إشارات جزيء صغير خارج الخلية كافية لمثل هذه القرارات مصير الخلايا مثل دوبرامينرجي الدماغ المتوسط 8 ، 22 ، إنترنيورونس القشرية 8 ، 16 ، 23 . ومع ذلك، نظم 3-D تظهر وقت النضج تسارع مقارنة مع 2-D يعادل 5 . عند إعطاء الوقت الكافي، أظهرت الثقافات 3-D زيادة النضج. هذه الصفات تجعل حججا قوية لفائدة منصات 3-D مثل سفيب. فائدة إضافية من المجهر الحية والعالية الجودة، جنبا إلى جنب مع المرونة من المواد المصدر، وجعل الحجج مقنعة لهذا البروتوكول.
بالإضافة إلى ذلك، سفيبس جعلت باستخدام هذا البروتوكول تبادل عدد من أوجه التشابه مع الدراسات الأخرى ذكرت 13 ، 24 . وفيما يتعلق المرجع 24 ، وهذا البروتوكول والتحقق الفسيولوجية من الخلايا العصبية قبل تواجده. على سبيل المثال، فإن الدراسات الواردة في المراجع 13 ، 24 ، وتستخدم إصدارات مماثلة من تثبيط سماد المزدوجة لاستخلاص الخلايا القشرية مثل الخلايا العصبية وحصلت على نسبة مماثلة من الخلايا العصبية الجلوتامرجية والأسلاف (~ 50٪). بالإضافة إلى ذلك، مارياني، J. وآخرون. (المرجع 13 ) تقرير Pax6 مماثلة وتلطيخ نيستين كما هذا البروتوكول في 25-30 نقطة الوقت اليوم. نوعيا، وأنماط تلطيخ ل Brn2 وكذلك التعبير عن الخلايا النجمية إيجابية غفاب مماثلة لتلك المذكورة في المرجع 24 . ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول لديه عدد من المزايا على اثنين من المنهجيات العضوي شائعة الاستخدام. أولا، مارياني، جيه وآخرون. 13 تقرير تطور دلكه إنترنيورونس إيجابي في يوم 50 و كونمثبتة فقط بواسطة أساليب إمونوستينينغ. باستخدام هذا البروتوكول، دلكه إنتيرنيونس إيجابية هي إنتاج في اليوم 30. تم تأكيد هذه إنترنيورونس كما وظيفية من قبل الكهربية واحدة خلية وتطبيق خلية واحدة الدوائية من غابا 16 . بالإضافة إلى ذلك، مؤلفو 13 يدعون الاتصال الوظيفي من الخلايا العصبية، ولكن تم تحديدها فقط باستخدام تلطيخ. وقد تعرضت سفيبس المصنوعة باستخدام هذا البروتوكول لشبكة واحدة الكهربائي التحفيز والتصوير الكالسيوم لإظهار أن تطوير الشبكات القشرية ترتبط وظيفية. باسكا، وآخرون. 24 القسم المجاميع باستخدام ناظم البرد للحصول على تسجيلات من هياكل تشبه العضوي. سفيبس المصنوعة باستخدام هذا البروتوكول لا تحتاج باجتزاء ويمكن تسجيلها مباشرة بينما في إدراج 1 . وقد أظهرت الخلايا العصبية المسجلة من سفيبس غير مقسمة إلى إمكانات العمل وإمكانات ما بعد التشابك المثبطة بعد سرتينg 1 ، 16 .
يمكن إجراء سفيبس باستخدام كل من الخلايا الليفية و بمكس كمادة البدء. ومن الممكن أيضا استخدام أنواع الأنسجة الأخرى التي تؤدي إلى هبسس (على سبيل المثال اللب الأسنان، القلفة، البول) 25 ، 26 ، 27 ، على الرغم من أن بعض الجزيئات الصغيرة قد تحتاج إلى تغيير لتحقيق نتائج مماثلة. لهذا البروتوكول، واستخدام دك-1 مهم في قيادة سفيب نحو مصير بطني 28 . هذا البطين هو المسؤول جزئيا عن التفريق بين إنترنيورونس مع أصول مثل سغ 16 . دك-1 هو جزيء صغير مكلفة، وبالتالي تركيزات عالية من القنفذ الصوتية يمكن استخدامها لتكملة دك-1 في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يجب تحديد تركيزات تثبيط ونت عبر دك-1 تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. بالإضافة إلى ذلك، XAV939، وآخر ونت إنهيبيتوr، يمكن استخدامها للمساعدة في دفع التمايز نحو مصير بطني، على الرغم من أن استخدام هذا المانع سوف تسفر الأنسجة التي تشترك هويات النسخي مع مج 23 .
عند تطوير أنظمة 3D هيبسك الثقافة مثل سفيبس الموصوفة في هذا البروتوكول، فمن المهم أن نضع في اعتبارنا أن هذه الهياكل تسفر عن كمية معتدلة من عدم التجانس من الثقافة إلى الثقافة. ويرجع ذلك جزئيا إلى الطبيعة العشوائية للتمايز الخلايا العصبية من إيبسس ويرجع ذلك إلى بدء الاتصال خلية خلية في سفيب مما أدى إلى عفوية الذاتية التنظيم الذاتي 29 ، 30 . ولذلك، من المهم تفسير فائدة هذه التقنية في سياق عدم التجانس. طرق للحد من تأثير عدم التجانس في هذا النظام تشمل خلق أعداد كبيرة من سفيبس بحيث تمثل الاختلاف الطبيعي في النظام، والالتزام الصارم لتركيزالكواشف وعدد الخلايا المصنفة في بداية كل تشغيل الإنتاج. فمن الأهمية بمكان أن تبدأ مع مستعمرات إيبسك نظيفة وتطبيق الحد الأدنى من تريتوراتيون خلال خطوة التفكك الأنزيمية خلال التفكك إيبسك لزيادة بقاء الخلية. بقاء الخلية بعد تريتوراتيون هو عامل مهم في الحصول على جودة عالية، سفيبس متسقة. كخطوة بديلة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، ويمكن التحقق من الجدوى بعد التفكك وقبل خطوات الطرد المركزي باستخدام الأزرق التريبان، إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا أن تتأثر قابليتها والتمايز العفوي إذا لم يتم استخدام روكي بشكل صحيح خلال الانفصال المبكر وخطوات التمايز. استخدام روكي وانخفاضه التدريجي خلال الأعلاف 50٪ على مدى 7-10 أيام الأولى أمر بالغ الأهمية ل سفيبس متسقة وعالية الجودة.
بالإضافة إلى ذلك، فإنه غالبا ما يكون مفيدا كخطوة التحقق من صحة للتحقق من النتائج في سفيبس 3D مع تلك التي لوحظت في خطوط الخلايا نفسها التي تم إنشاؤها باستخدام إعداد أحادي الطبقة. Understaندينغ كيفية مقارنة بين النظامين داخل كل مجموعة تجريبية مفيدة للغاية في فهم تعقيد نموذج المرض معين. وأخيرا، يمكن استخدام سفيبس لفرز وتنقية السكان الخلية باستخدام الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز لمزيد من الدراسة في نظام أحادي الطبقة 2D أكثر تجانسا 16 .
ومع ذلك، سفيبس التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول هي مفيدة لدراسة الصغيرة تطوير الدوائر القشرية. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية تنطوي على تعدد التسجيلات الكهربية مع نهج عالية المحتوى. في الواقع، يتم تصنيعها إدراج غرفة الخلية للاستخدام في شكل لوحة 96 جيدا. هذه الإدخالات يمكن استخدامها مع بروتوكول سفيب الموصوفة هنا بدلا من إدراج 6 جيدا. من أجل إظهار قابلية باستخدام هذه الطريقة، سوف تحتاج إلى إنشاء سفيبس باستخدام خطوط متعددة واستنساخ داخل أترابية معينة، وسوف تحتاج إلى أن يتم فحصها عبر مجموعة من المقايسات القائمة على الخلية قوية للبحث عن الاتساق وايوالثقافات رقيقة. على سبيل المثال، أرقام الخلايا العصبية، مورفولوجيا، وتطوير طبقة يمكن أن يعاير باستخدام شكل 96 جيدا. من الناحية المثالية، ينبغي أن تقترن فحوصات الخلية القائمة مع مقايسة الكهربية عالية المحتوى مثل الشرق الأوسط وأفريقيا، والتي هي أيضا قابلة لل 96 لوحات جيدا.
هذا المنبر سفيب وعد في فك رموز دور تطوير شبكة القشرية في وقت مبكر في الاضطرابات العصبية، لا سيما في الحالات التي يكون هناك تفاعل ممكن بين علم الوراثة والتنمية العصبية في وقت مبكر. لقد أثبتنا أنه يمكن علاجها مثل ثقافة شريحة كما هو مبين في الدراسات الفئران والماوس. دراسات مستقبلية مفيدة باستخدام هذا النظام يجب أن تركز على علم التشريح المقارن التنموي وعلم وظائف الأعضاء بين في الجسم الحي هياكل الماوس و سفيب. هذه البيانات المقارنة ستكون قوية جدا في تطوير نظام متعدية حقا لاكتشاف المخدرات والبحوث الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر إليزابيث بينيفيدس على التدقيق في هذه المقالة. نشكر درس. جون حسين وجين بلات لمناقشاتهم المفيدة وتعليقاتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
