Summary
Здесь мы сообщаем протокол о разработке трехмерной (трехмерной) системы из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), называемых свободным от сыворотки эмбриоидным телом (SFEB). Эта трехмерная модель может быть использована как органотипическая культура срезов для моделирования развития коры человека и физиологического опроса развивающихся нейронных цепей.
Abstract
Хотя ряд моделей in vitro- заболеваний был разработан с использованием hiPSCs, одно из ограничений заключается в том, что эти двумерные (двумерные) системы не могут представлять собой лежащую в основе цитоархитектурную и функциональную сложность затронутых лиц, несущих подозрительные варианты заболевания. Обычные 2-D модели остаются неполными представлениями in vivo- подобных структур и не адекватно фиксируют сложность мозга. Таким образом, появляется потребность в более трехмерных моделях на основе hiPSC, которые могут лучше повторять клеточные взаимодействия и функции, наблюдаемые в системе in vivo .
Здесь мы сообщаем протокол о разработке трехмерной системы из недифференцированных hiPSCs на основе свободного эмбриоидного тела без сыворотки (SFEB). Эта трехмерная модель отражает аспекты развивающегося вентрализованного неокортекса и позволяет изучать функции, неотъемлемые от живых нервных клеток и интактных тканей, таких как миграция, связь, связь и матгурирование. В частности, мы демонстрируем, что SFEB, использующие наш протокол, могут быть опрошены с использованием физиологически релевантных и высокоточных клеточных анализов, таких как изображения с кальцием, и записи с несколькими электродами (MEA) без криосекции. В случае MEA-записей мы демонстрируем, что SFEB увеличивают активность спайков и активность разрыва на сетевом уровне во время долгосрочного культивирования. Этот SFEB-протокол обеспечивает надежную и масштабируемую систему для изучения развития сети в трехмерной модели, которая отражает аспекты раннего развития коры.
Introduction
Ранее мы сообщали о трехмерной модельной системе, полученной из вызванных человеком человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые повторяют некоторые аспекты развития ранней корковой сети 1 . Эта трехмерная модель, не содержащая сыворотки эмбриоидный корпус (SFEB), улучшает предыдущие простые агрегатные модели hiPSC 2 , 3 . Растущий объем работы показывает, что трехмерные структуры, такие как наши SFEB, приблизительные аспекты развития нервной системы, обычно наблюдаемые in vivo и в более ранние моменты времени, чем наблюдаемые в двумерных (двумерных) / монослойных hiPSC-моделях 4 , 5 . Первоначальные исследования были сосредоточены на самоорганизующейся сложности трехмерных тел без демонстрации их физиологической сложности 2 .
Протокол, описанный здесь, был использован на недифференцированных hiPSCs, полученных из фибробластов и Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). Эти клетки поддерживаются на γ-облученных эмбриональных питателях мыши (MEFs). Эти колонии hiPSC вручную очищают от спонтанно дифференцированных клеток, ферментативно собирают и ресуспендируют в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы Y-27632 (ROCKi). Недифференцированные hiPSCs подвергают диссоциации и центрифугированию перед переносом на 96-луночные пластины с низкой адгезией V-bottom. После гальванирования нейронную индукцию инициируют с использованием двойного ингибирования SMAD (SB431542 и LDN193189 вместе с dickkopf 1 (DKK-1)) для приведения фронта переднего фронтального переднего мозгового нейрона-судьбы 6 . Через 14 дней SFEB переносят на вставки клеточной культуры в 6-луночный планшет. После переноса круглые SFEB начинают распространяться и тонкими, сохраняя при этом местные сетевые соединения, как это часто наблюдается в гиппокампальных органотипических средах для культивирования срезов, используя аналогичные вставки 1 культуры клеток ,Ss = "xref"> 7.
Использование трехмерной платформы на основе SFEB в этом формате поддается эффективному производству корковых сетей, которые могут быть опрошены с использованием физиологических анализов на основе клеток, таких как визуализация кальция или электрофизиологические анализы, такие как записи с одной ячейкой или многоэлектродная матрица (MEA ) 1 . Хотя в трехмерных системах имеются маркеры раннего развития коры головного мозга, другие исследования показали, что эти трехмерные тела могут потребовать более длительные периоды инкубации, чтобы обеспечить по своей сути более медленные темпы развития ткани человека 8 . Этот SFEB-протокол успешно генерирует трехмерные SFEB из недифференцированных hiPSC, которые захватывают аспекты раннего развития коры.
Потенциал SFEB для моделирования сетевых аберраций при неврологических расстройствах является сильной стороной этой системы. HiPSCs, полученные из ткани пациента, могут быть выращены в клетки нервной системы, которые подлежат ослаAys, относящихся к клеточной биологии, а также сопутствующей экспрессии генов. Человеческие iPSC используются для определения генетического профиля больших групп людей с различными неврологическими расстройствами с сложными этиологиями, такими как расстройство спектра аутизма (ASD), шизофрения 9 , синдром Ретта 10 и болезнь Альцгеймера 11 , 12 . До недавнего времени iPSC-модели обычно были монослойными препаратами, которые, хотя и умели оценивать молекулярные взаимодействия, были недостаточны в расшифровке сложных клеточных взаимодействий, наблюдаемых in vivo . Модели для животных были заменой по умолчанию для воссоздания платформы всего органа. Эти модели животных страдают от плохого перевода результатов и имеют ограниченную способность копировать генетические профили человека, идентифицированные крупными генетическими скрининговыми исследованиями. Таким образом, разработка трехмерных систем из iPSC добавляет необходимый уровень сложности в человеческийМоделирование заболеваний 13 , 14 . Следующим шагом для 3D-платформ hiPSC является удовлетворение больших требований к высокопроизводительному экранированию с использованием анализа на основе клеток 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация нейронных клеток-предшественников
- Поддержание hiPSCs, полученных из фибробластов и РВМС в 6-луночных планшетах на я-облученном клеточном слое эмбрионального питателя мыши (MEF) в среде iPSC человека, дополненной небольшими молекулами (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ. Ежедневное обслуживание - это модифицированная версия ранее описанных процедур 1 , 16 .- Пластина 6 x 10 5 MEF на каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования ткани в рекомендованном средстве 300 мкл / лунку (по протоколу производителя).
- Через 48 часов замените среду MEF средой hiPSC на 300 мкл / лунку в течение 1 часа перед добавлением hiPSC.
- Быстро оттаивайте hiPSC на водяной бане при 37 ° C и медленно добавляйте по каплям 1 мл hiPSC. Перенесите hiPSCs и среду в 15 мл коническую трубку. Добавьте среду, чтобы довести общий объем до 5 мл. Центрифуга в течение 4 мин при 129 × g, аспирация супернатыNt, осторожно повторно суспендируйте таблетку в 1 мл среды hiPSC с ингибитором ROCK при концентрации 1: 1000.
- Нанесите клеточную суспензию (обычно затравленную на 300 000 клеток / лунку) на слой ячейки MEF и инкубируйте при 37 ° С, 5% СО 2 , 95% -ной влажности.
- Следите за культурой iPSC с помощью светового микроскопа. Через 48 часов удаляют культуры с неровными краями, которые превращаются в кистозные или выглядят желтовато-коричневыми под световым микроскопом, чтобы свести к минимуму спонтанную дифференциацию.
ПРИМЕЧАНИЕ. Через 7 - 10 дней должны образовываться колонии hiPSC. Колонии должны быть круглыми, с четко определенными границами и равномерными плотностями клеток и лишенными свободно упакованных неравномерных клеток. - Вручную выберите круглые колонии hiPSC, чтобы очистить культуру спонтанно дифференцированных клеток. Разверните колонии, разместив их на свежих слоях MEF. Развернуть 1: 3 каждые 7 дней, когда культуры близки к слипанию и замораживаются 1 , 16 .
- После расширения и замораживания клеток (для резервного копирования) выращивайте колонии hiPSC на планшетах, пока они не достигнут слияния 50 - 75%.
- После семимесячной послеобеденной обработки используют мягкую ферментативную обработку (5-10 минут с 300 мкл раствора фермента) и нежное растирание (2-4 раза с пипеткой объемом 1000 мкл) для сбора и приготовления hiPSC для дифференцировки клеток нейронных предшественников.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 129 мкг в течение 4 мин, аспирируют супернатант и ресуспендируют гранулу в 5 мл человеческой iPSC-среде. Перенесите клеточную суспензию в 0,1% -ную желатиновую покрытую культуру для культивирования клеток 5 см в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы исключить MEF и максимизировать выход hiPSC. Перенесите среду (с неадгезивными клетками) в другую 5-сантиметровую чашку с желатином.
- Перенесите неадгезивные клетки в пробирку для центрифуги на 15 мл, используя переносную пипетку. Осторожно промойте планшеты 3 мл среды и добавьте их в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 129 мкг в течение 4 мин, аспирируют суперNatant и осторожно ресуспендировать гранулу в среде. Определите количество клеток, используя счетчик автоматических ячеек. Пластину 9000 клеток / лунку в 96-луночном планшете с низкой адгезией V-bottom.
- Центрифугируйте пластину при 163 × g в течение 3 мин. Инкубируйте пластину при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO 2 . Используя пипетку, каждый день меняйте 50% среды, удаляя половину среды и заменяя ее свежей химически определенной дифференцирующей средой 1 (DM1, рисунок 1 , таблица материалов) в течение 14 дней.
2. Индукция без эмбрионального тела без сыворотки (SFEB) ( рисунок 2 )
- Поместите 40 мкм клеточные культуральные вставки в 6-луночные планшеты и добавьте 1 мл среды DM1 по меньшей мере 1 час до добавления агрегатов.
- На 14-й день перенесите агрегаты с помощью среды 20 мкл, используя 200 мкл широкого кончика рта на 40 мкм клеточных культуральных вставках и измените среду на DM2.
7 , 17 , 18 .- Перенесите 4-6 агрегатов в одну вставку культуры клеток и обеспечите достаточное пространство между агрегатами. Удалите как можно больше избыточного раствора, используя тонкий наконечник пипетки ( например, 200 мкл наконечника).
ПРИМЕЧАНИЕ. Допустимо кратко помешать SFEB, поскольку они будут перемещаться по вставке культуры клеток в качестве решения, удаляемого из SFEB. - Поддерживать культуры в 1 мл DM2 при 37 ° C, 95% влажности и 5% CO 2 . Используя пипетку, измените 75%Каждый день, удаляя три четверти среды и заменяя три четверти свежей среды. Например, удалите 750 мкл среды и добавьте 750 мкл свежей среды.
- Перенесите 4-6 агрегатов в одну вставку культуры клеток и обеспечите достаточное пространство между агрегатами. Удалите как можно больше избыточного раствора, используя тонкий наконечник пипетки ( например, 200 мкл наконечника).
- Через 14 дней культуры переключитесь на среду DM3 с 75% -ным изменением среды через день и еще на 16 дней.
- Чтобы поддерживать SFEB на вставках клеточной культуры за 30 дней, измените среду через день на 60, 90 и 120 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: SFEB будут расти примерно до 1000 мкм в диаметре и, как правило, толщиной 100-150 мкм 1 .
3. Определение состава SFEB
- Отделите SFEB от вкладыша осторожно пипетирующей средой с помощью 200 мкл широкого кончика пипетки. Чтобы передать SFEB, используйте широкий наконечник пипетки, чтобы аккуратно всасывать тела в наконечник пипеток. После загрузки SFEB в наконечник пипетки осторожно переносите на 12-луночные планшеты и промывайте 300 мкл фосфатно-солевого раствора(PBS) на лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: SFEB будут суспендированы в растворе в 12-луночных планшетах. Это важно для полного проникновения фиксатора, блокирующего раствора и антител. При использовании нескольких SFEB для окрашивания на каждую лунку 12-луночного планшета можно добавить до 10 SFEB. Это позволит сохранить растворы и антитела. - Исправить SFEB с 300 мкл на лунку 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 30-45 мин. Вымойте фиксированные SFEB дважды с помощью 300 мкл PBS, по 3-5 минут каждого мытья.
Осторожно: При обращении с параформальдегидом используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
ПРИМЕЧАНИЕ. Зонд для иммунореактивности к маркерам для определения зрелости, типа клеток и т. Д. Для маркировки нейронов в этом исследовании цыпленок-Tuj1 использовался при 1: 500, для дополнительных маркеров см. Таблицу 2 и ссылки 1 , 16 . - Permeabilize и блок с 0,1% Triton-X100 в PBS и 10% нормальной сыворотке осла (блокирующий раствор, 300 μ, L на лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Удалите блокирующий раствор и обработайте SFEB с помощью 300 мкл первичных антител в блокирующем растворе. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи. Вымойте SFEB трижды (3-5 минут на промывку) в 300 мкл PBS, содержащем 0,1% Triton-X.
- Подготовьте вторичные антитела 1: 1000 в блокирующем растворе. Инкубируйте SFEB в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами. Вымойте SFEB с 300 мкл PBS, 3 раза по 3-5 минут каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе SFEB могут быть подготовлены для визуализации. - Для изображения пипетки SFEB на стеклянном слайде с помощью пипетки с широким отверстием. Удалите избыточное решение вокруг SFEB, используя мягкое всасывание.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для аналогичных условий окрашивания несколько SFEB могут быть размещены на одном стеклянном слайде. - Добавьте каплю монтажной среды на SFEB, поместите покровное стекло и осторожно нажмите, чтобы убедиться, что нет воздушных пузырьков. Позвольте установочной среде затвердеть и приступайте к отображению и количественной оценке (шаг 3.8).
- Выполните количественную оценку ячеек, взяв несколько областей интереса (ROI) через SFEB и используя z-стек в сочетании с максимальным проекционным изображением через каждый ROI на стандартном конфокальном микроскопе, как описано в ссылках 1 , 16 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Целые SFEB могут быть количественно определены с использованием графического моделирования (подробнее см. Ссылки 1 , 16 ). Так как SFEB тонкие до примерно 100 мкм, в ткани минимальное рассеяние света и, следовательно, нет необходимости в 2-фотонной микроскопии. Раннее использование этого протокола с iPSCs, полученных из фибробластов, вызвало карту судьбы SFEB, которая выявила сложную и разнообразную структуру с субпопуляциями интернейронов с идентификаторами транскрипции, которые были похожи на CGE и передние передние мозги судьбы 1 , 16.
4. Запись активности нейронов в SFEB с использованием MEA
- Подготовьте 12-луночные планшеты MEA в соответствии с инструкциями производителя.
- Промойте пластины MEA 3 раза в течение 5 минут стерильным H 2 O в асептических условиях для очистки. Промыть в течение 5 минут 75% этанолом, а затем 100% этанолом для стерилизации тарелки.
- Выпекайте пластину, перевернутую в духовке в течение 4-5 часов при температуре 50 ° C, чтобы завершить процесс стерилизации.
- Добавьте 500 мкл 0,2% раствора полиэтиленимина (PEI) в каждую лунку и инкубируйте 1 ч при комнатной температуре. Аспирируйте PEI и промывайте лунки 4 раза стерильным дистиллированным H 2 O. Воздух высушите в капоте в течение ночи.
- Подготовьте 20 мкл / мл раствора ламинина в среде L15 и добавьте 10 мкл ламинина в центр каждой лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не покрывайте окружающие опорные и заземляющие электроды. - Добавьте стерильные dH 2 O в окружающие резервуары для предотвращения испарения среды или ламинина.Инкубируйте планшет в течение 1 часа при 37 ° C.
- Добавьте SFEB (см. Разделы 1 и 2) к пластинам MEA с покрытием ламинином, аккуратно всасывая их в широкий наконечник пипетки и переносите их. Добавьте 200 мкл среды DM2 в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO 2 .
- Добавьте дополнительную среду 200 мкл через 24 часа и дайте ей восстановить в течение 30 минут при 37 ° C, влажности 95%, 5% CO 2 перед чтением пластины.
- Поместите пластину MEA в планшет-ридер (предварительно нагретый до 37 ° C) для регистрации активности нейронов. Запишите активность в течение 10 минут с помощью соответствующего программного обеспечения для записи MEA. Подробнее см. Ссылку 19 .
- Генерировать необработанные непрерывные данные и растровые графики активности нейронов с использованием программного обеспечения статистического анализа 19 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Записи MEA принимаются за 7 дней после нанесения SFEB. Для этого исследования записи проводили в течение 10 минут для обнаружения активности сетевого всплеска, conТонкий след и растровые графики. SFEB могут поддерживаться на долговременной основе на плитах MEA и могут регистрироваться в течение более длительных периодов времени с использованием экологически контролируемых условий ( рис. 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SFEB, выращенные с использованием нашей методики, дали ткань с морфологическими характеристиками, которые напоминают раннюю развивающуюся корковую субвентрикулярную зону, изобилующую обширными Tuj1-положительными нейронами, а также нейронными предшественниками ( рис. 3A ). Многочисленные развивающиеся корковые розетки наблюдались во внешних слоях и внутренних слоях SFEB ( рис. 3B ). Внешний край SFEB напоминает развивающуюся кортикальную пластинку, содержащую постмитотические нейроны. Это подтверждается выражением Brn2, маркера для нейронных предшественников в наиболее вентрализованных внешних кортикальных слоях. В SFEBs также наблюдаются положительные клетки Reelin, которые могут быть клетками Cajal-Retzius или их предшественниками, которые экспрессируются во внешних слоях развивающейся коры ( рис. 3C ). SFEB, выращенные с использованием этого протокола, выражают маркеры, соответствующие смешанному каудальному (CGE) и медиальному ганглииНицкого происхождения (MGE). Клетки, которые экспрессируют CGE-маркер Couptf2 и другие клетки, экспрессирующие маркер MGE Nkx2.1, могут наблюдаться в культурах ( рисунок 3D ). Это может быть частично связано с использованием DKK-1 в протоколе, который, как было показано, улучшает медиальные судьбы 20 .
SFEB, полученные с использованием этого протокола, дают как калретинин-, так и кальбиндин-позитивные интернейроны ( рис. 4A ), а также позитивные возбуждающие нейроны VGLUT и Tbr1-позитивные глутаматергические нейронные предшественники ( рис. 4B ). В среднем мы наблюдали, что 61% всех клеток в SFEB являются положительными VGLUT и 43% являются Tbr1-положительными ( рис. 4C ). Это согласуется с другими отчетами, использующими аналогичные протоколы 21 . Кроме того, SFEB могут подвергаться физиологическим анализам, таким как визуализация кальция живых клеток с использованиемМаркеры, такие как Fluo-4, чтобы наблюдать работу нейронной сети в более физиологически-зависимой среде ( рисунок 5 ). SFEB могут быть подвергнуты MEA-записям в течение длительных периодов времени и демонстрировать развитие кортикального разрыва сетевого уровня ( рис. 6 ).
Рисунок 1: Схема, описывающая ранние шаги по подготовке SFEB. После того, как iPSC были собраны с использованием ферментативной диссоциации, их высевают в 96-луночные планшеты и центрифугируют при 163 × g в течение 3 мин, чтобы вызвать быстрое агрегатирование. Через 14 дней клеточные агрегаты in vitro (DIV) могут переноситься из 96-луночных планшетов через пипетки с широким отверстием на 6-луночные планшеты с клеточной культурой. Нажмите здесь, чтобы перейти к viБолее крупная версия этого рисунка.
Рисунок 2: Временная шкала средних изменений и фаз во время роста и расширения SFEB. После того, как SFEB были перенесены на вкладыши, они подвергаются двум средним изменениям в 14 и 28 дней in vitro (DIV). Их обычно собирают для экспериментов в DIV 30, 60 и 90. Верхние вставки показывают различные фазы в этом процессе. Шкала шкалы = 1000 мкм (слева); 1000 мкм (DIV 20); 600 мкм (DIV 30); 300 мкм (единый SFEB). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Общие морфологические характеристикиТики SFEB, выращенных с использованием этого протокола. ( A ) Типичный внешний край SFEB, экспрессирующий маркер предшественника nestin (зеленый), постмитотический нейронный маркер Tuj1 (красный) и ядерное пятно (синий). ( B ) SFEB показывают характерные корковые розетки как на внешних слоях (левое изображение), так и на внутренних слоях (справа). Они выражают как предшественники, так и зрелые нейронные маркеры. ( C ) Репрезентативный внешний край SFEB, экспрессирующий маркер внешнего слоя / кортикальной пластины Brn2 (зеленый) и проявляющий маркер CGE Couptf2 (красный). ( D ) SFEB, изготовленные с использованием этого протокола, представляют собой вентрализованные неокортикальные структуры, наблюдаемые окрашиванием Pax6 (красным) и экспрессирующими маркерами, согласующимися с некоторыми источниками MGE, такими как Nxk2.1 (красный). Шкала шкалы = 40 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изображения основных типов нейронов в SFEB. ( A ) Некоторые нейроны в SFEBs выражают маркеры, соответствующие кортикальным интернейронам, таким как calbindin (зеленый, левый образ) и calretinin (зеленый, правый образ). ( B ) SFEB показывают VGLUT-1 положительные глутаматергические нейроны (красное, левое изображение) и глутаматергические предшественники, выражающие Tbr1 (красный, правый образ). Шкала шкалы = 40 мкм. ( C ) Типичные выходы возбуждающих нейронов, выражающих либо VGLUT-1, либо Tbr1 (ошибка бар = SEM). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Записи кальция в реальном времени. </ Strong> (Левое изображение) Репрезентативный внешний край SFEB, обработанный Fluo-4, индикатором кальция нейронов. Клетки маркируются для измерения спонтанных переходных процессов кальция (сортированные цветные коробки). (Правое изображение) Выбранные ячейки, демонстрирующие спонтанные переходные процессы кальция, отмеченные красными ящиками (верхние следы) или зеленые коробки (нижние следы). Шкала шкалы = 40 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Многоэлектродные записи массивов SFEB. (Сверху) Репрезентативное изображение SFEB, прикрепленного к пластине MEA (шкала шкалы = 100 мкм). (Средний и нижний) SFEB могут записываться на MEA в течение длительных периодов времени и демонстрировать созревание. (Средний и нижний, левый). Широкомасштабная карта всплесков 3 SFEB, нанесенных на 3 лунки 12-луночная пластинка MEA, более темные цвета представляют собой более высокую общую активность шипов, которая увеличивается с 30-дневного дня 90. (Средняя и нижняя, вставки). Карта совокупной активности показывает увеличение плотности пика и площади спайков внутри корковых сетей в SFEB между День 30 и день 90. (Средний и нижний, правый). Равные трассы (верхние) и сплошные растровые графики (ниже) показывают увеличение числа спайков и количества всплесков с течением времени; Что указывает на более сильное формирование сети в SFEB. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| антитело | разбавление | вид |
| Nestin | 0,111111111 | мышь |
| Brn-2 | 0,388888889 | Кролик |
| VGLUT1 | 0,111111111 | Кролик |
| Рах6 | 0,25 | Кролик |
| Calretinin | 0,180555556 | Кролик |
| кальбиндин | 0,319444444 | Кролик |
| CoupTFII | 0,180555556 | мышь |
| Nkx 2.1 | 0,180555556 | Кролик |
| Tuj1 | 0,388888889 | Курица |
| Reelin | 0,388888889 | мышь |
| tbr1 | 0,180555556 | Курица |
| NFH | 0,25 | мышь |
Таблица 1: Антитела, используемые в этом исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол обеспечивает условия для дифференциации источника hiPSC в трехмерную структуру, которая повторяет раннюю стадию развития лобной коры. Эта процедура дает структуры, которые могут быть опрошены для электрофизиологии, а также поддаются микроскопии. Окончательная морфология SFEB напоминает культуру органотипических культур среза мозга и позволяет получить высококачественную конфокальную визуализацию. Этот протокол может успешно генерировать SFEBs как из hiPSC фибробластов, так и из периферической крови, полученных из мононуклеарных клеток. SFEB, изготовленные из hiPSC с мононуклеарной клеткой периферической крови, обладают сходными морфологическими характеристиками, такими как созданные из фибробластов hiPSC.
Этот процесс, как и другие трехмерные схемы, использует небольшие молекулы внеклеточных сигналов для решения решений судьбы клеток. Это сочетается с внутренними свойствами контакта между ячейками, которые создают более реалистичную среду для сетиРабота и нейронная функция. Другие сообщения показали, что подходящая комбинация внеклеточных сигналов малой молекулы является достаточной для таких решений в отношении клеточной судьбы, таких как дофаминергический средний мозг 8 , 22 и корковые интернейроны 8 , 16 , 23 . Тем не менее, трехмерные системы демонстрируют ускоренное время созревания по сравнению с 2-D эквивалентами 5 . Когда дается адекватное время, трехмерные культуры проявляют повышенную зрелость. Такие качества дают веские аргументы в пользу полезности трехмерных платформ, таких как SFEB. Дополнительное преимущество живой и высококачественной микроскопии вместе с гибкостью исходного материала делает убедительные аргументы в пользу этого протокола.
Кроме того, SFEB, созданные с использованием этого протокола, имеют ряд сходств с другими опубликованными исследованиями 13 , 24 . Что касается ссылки 24 , этот протокол и физиологическая валидация нейронов предписывают его. Например, исследования, приведенные в ссылках 13 , 24 , используют аналогичные варианты двойного ингибирования SMAD для получения кортикальных нейронов и получают аналогичную долю глутаматергических нейронов и предшественников (~ 50%). Кроме того, Mariani, J. et al. (Ссылка 13 ) сообщают о подобных окрашиваниях Pax6 и Nestin в качестве этого протокола в 25-30-дневных временных точках. Качественно, окрашивающие структуры для Brn2, а также экспрессия положительных астроцитов GFAP аналогичны тем, которые приведены в ссылке 24 . Однако этот протокол имеет ряд преимуществ по сравнению с двумя обычно используемыми методиками органоидов. Во-первых, Mariani, J. et al. 13 сообщают о развитии положительных интернейронов Dlx на 50-й день иУкрепленные только методами иммуноокрашивания. Используя этот протокол, положительные интернейроны Dlx продуцируются на 30-й день. Эти интернейроны были подтверждены как функциональные с помощью электролизеологии с одной клеткой и фармакологического применения GABA 16 на основе одноклеточных клеток. Кроме того, авторы 13 заявили о функциональной связности нейронов, но были определены только с использованием окрашивания. SFEB, изготовленные с использованием этого протокола, подвергались сетевой одноэлектродной стимуляции и визуализации кальция, чтобы показать, что развивающиеся корковые сети связаны и функциональны. Pasca, et al. 24 разделяют агрегаты с использованием криостата для получения записей из органоидных структур. SFEB, созданные с использованием этого протокола, не требуют секционирования и могут быть записаны непосредственно во вставках 1 . Показано, что нейроны, зарегистрированные из несезонных SFEB, обладают потенциалами действия и ингибирующими постсинапсическими потенциалами после расщепленияГ 1 , 16 .
SFEB могут быть изготовлены с использованием как фибробластов, так и РВМС в качестве исходного материала. Также возможно использовать другие типы тканей, которые приводят к hiPSCs (например, зубной пульпе, крайней плоти, мочи) 25 , 26 , 27 , хотя некоторые из небольших молекул, возможно, потребуется изменить для достижения аналогичных результатов. Для этого протокола использование DKK-1 имеет важное значение для вождения SFEB в направлении вентрализованной судьбы 28 . Эта вентрализация частично отвечает за дифференциацию интернейронов с CGE-подобным происхождением 16 . DKK-1 - дорогая небольшая молекула, и поэтому высокие концентрации звукового ежа могут использоваться для дополнения DKK-1 в этом протоколе. Однако концентрации для ингибирования Wnt через DKK-1 должны определяться эмпирически конечным пользователем. Кроме того, XAV939, еще один ингибитор WntR, можно использовать для стимулирования дифференциации к вентрализованной судьбе, хотя использование этого ингибитора даст ткань, которая разделяет идентификаторы транскрипции с MGE 23 .
При разработке 3D-систем культуры hiPSC, таких как SFEB, описанных в этом протоколе, важно иметь в виду, что эти структуры дают умеренное количество гетерогенности от культуры к культуре. Это частично связано с стохастической природой дифференциации нейронов от iPSC и из-за инициирования контакта клеток-клеток в SFEB, что приводит к самопроизвольной самоорганизации 29 , 30 . Поэтому важно интерпретировать полезность этого метода в контексте гетерогенности. Способы минимизации влияния неоднородности в этой системе включают в себя создание большого количества SFEB, чтобы они представляли естественные изменения в системе, строго соблюдая концентрациюРеагентов и количества клеток, высеваемых в начале каждого производственного цикла. Крайне важно начинать с чистых колоний iPSC и применять минимальное растирание на стадии ферментативной диссоциации во время диссоциации iPSC для повышения жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток после растирания является важным фактором получения высококачественных, устойчивых SFEB. В качестве альтернативного этапа устранения неполадок жизнеспособность может быть проверена после диссоциации и перед стадиями центрифугирования с использованием трипанового синего, если это необходимо. Жизнеспособность и спонтанная дифференциация также могут быть затронуты, если ROCKi не используется должным образом во время ранних шагов диссоциации и дифференциации. Использование ROCKi и его ступенчатое снижение в течение 50% подачи в течение первых 7-10 дней является критическим для последовательных высококачественных SFEB.
Кроме того, часто полезно в качестве шага проверки для проверки результатов в 3D SFEB с теми, которые наблюдаются в тех же линиях клеток, созданных с использованием монослойного препарата. UnderstaКак взаимное сравнение двух систем в каждой экспериментальной когорте чрезвычайно полезно для понимания сложности данной модели болезни. Наконец, SFEB можно использовать для сортировки и очистки популяций клеток с использованием флуоресцентной активированной сортировки клеток для дальнейшего изучения в более однородной 2D монослойной системе 16 .
Тем не менее, SFEB, созданные с использованием этого протокола, полезны для изучения небольших развивающихся корковых схем. Будущие применения этой техники включают мультиплексирование электрофизиологических записей с использованием высококонцентрированных подходов. Действительно, вставки ячейки камеры изготовлены для использования в 96-луночном планшете. Эти вставки могут использоваться с протоколом SFEB, описанным здесь, вместо 6-позиционных вставок. Чтобы показать масштабируемость с помощью этого метода, SFEB необходимо будет создать с использованием нескольких линий и клонов в рамках данной когорты, и их необходимо будет проверить по множеству надежных анализов на основе клеток, чтобы искать согласованность wiТонких культур. Например, нейронные числа, морфология и развитие слоя могут быть проанализированы с использованием 96-луночного формата. В идеале, анализы на основе клеток следует сочетать с высокочувствительным электрофизиологическим анализом, таким как MEA, который также можно масштабировать до 96-луночных планшетов.
Эта платформа SFEB обещает расшифровать роль развития ранней кортикальной сети при неврологических расстройствах, особенно в тех случаях, когда существует возможное взаимодействие между генетикой и ранним развитием нервной системы. Мы продемонстрировали, что его можно рассматривать как культуру среза, как показано в исследованиях крыс и мышей. Полезные будущие исследования с использованием этой системы должны сосредоточиться на сравнительной анатомии и физиологии развития между структурами мыши и SFEB in vivo . Эти сравнительные данные были бы очень эффективными при разработке действительно трансляционной системы для открытия лекарств и фундаментальных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Элизабет Беневидес за корректуру статьи. Мы благодарим доктора. Джон Гуссман и Джин Блатт за их полезные обсуждения и комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
