Summary
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.
Abstract
למרות שמספר מודלים של מחלות חוץ-גופית פותחו באמצעות hiPSCs, מגבלה אחת היא שמערכות דו-מימדיות אלו (2-D) אינן מייצגות את המורכבות הקיטורית והפונקציונלית הבסיסית של החולים הנגועים הנושאים גרסאות חשודות של המחלה. מודלים 2-D קונבנציונאלי להישאר ייצוגים שלמים במבנים דמויי vivo ואינם ללכוד כראוי את המורכבות של המוח. לכן, יש צורך המתעוררים יותר 3-D מודלים מבוססי hiPSC שיכולים לשחזר טוב יותר את אינטראקציות הסלולר פונקציות לראות במערכת vivo .
כאן אנו מדווחים פרוטוקול לפתח מערכת 3-D מ hiPSCs בלתי מובחנים על בסיס הגוף העובר ללא תמותה (SFEB). מודל תלת-ממדי זה משקף היבטים של ניאוקורטקס מתפתח ומאפשר מחקרים לתפקודים אינטגראליים לתאים עצביים חיים ורקמות שלמות כגון הגירה, קישוריות, תקשורת ומחצלתרוויה. באופן ספציפי, אנו מדגימים כי SFEBs באמצעות פרוטוקול שלנו ניתן לחקור באמצעות מבחני התא רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה תוכן מבוסס כגון הדמיה סידן, ומערכות אלקטרודה רב (MEA) הקלטות ללא cryosectioning. במקרה של הקלטות MEA, אנו מראים כי SFEBs להגביר את פעילות ספייק פעילות ברמת הרשת מתפרץ במהלך תרבות לטווח ארוך. פרוטוקול SFEB זה מספק מערכת חזקה וניתנת להרחבה ללימוד פיתוח רשת במודל תלת-ממדי, אשר לוכד היבטים של התפתחות קליפת המוח.
Introduction
יש לנו בעבר דיווחו על מודל 3-D מודל, שנוצר מחולה נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent המושרה (hiPSCs) כי recapitulates כמה היבטים של פיתוח רשת קליפתית מוקדם 1 . זה מודל 3-D, גוף ללא עוברים בסרום (SFEB), משפר על מודלים פשוטים לשעבר hiPSC צבירה 2 , 3 . גוף גדל והולך של עבודה הוא חושף כי 3-D מבנים כמו SFEBs שלנו, ההיבטים המקורבים של התפתחות עצביים נפוץ נצפה in vivo ובנקודת זמן מוקדמת יותר מאשר שנצפה 2 מימדי (2-D) / monolayer hiPSC מודלים 4 , 5 . מחקרים ראשוניים כבר התמקדו המורכבות של ארגון העצמית של גופי 3-D ללא הוכחת המורכבות 2 הפיזיולוגיות שלהם.
הפרוטוקול המתואר כאן נעשה שימוש על hiPSCs מובחנים הנגזרים fibroblasts ו תאי דם מונונוגרעיניים היקפיים (PBMCs). תאים אלה נשמרים על מזוהמים עכבר מזוהמים γ (MEFs). מושבות אלה hiPSC מנוקים באופן ידני של תאים מובחנים ספונטנית, שנקטפו אנזימטית, resuspended בינוני המכיל Rho-Kinase מעכב Y-27632 (ROCKi). Uniferentiated hiPSCs נתונים דיסוציאציה ו צנטריפוגה לפני מועברים 96 נמוך נמוך הידבקות V- צלחות התחתונה. לאחר ציפוי, אינדוקציה עצבית היא יזמה באמצעות עיכוב SMAD כפול (SB431542 ו LDN193189 יחד עם dickkopf 1 (DKK-1)) לנהוג הקדמי חזיתית הקדמית forberrain neuronal- גורל השושלת 6 . לאחר 14 ימים, SFEBs מועברים מוסיף תרבות התא בצלחת 6-היטב. לאחר שהועברו, SFEBs עגול מתחילים להתפשט ודק, תוך שמירה על חיבורי הרשת המקומית כפי שנצפה לעתים קרובות בהכנות בהיפוקמפוס organotypic פרוסה תרבות באמצעות הוספת תאים דומים תרבות 1 ,Ss = "xref"> 7.
השימוש SFEB מבוסס 3-D פלטפורמת בפורמט זה מקובל הייצור היעיל של רשתות קליפת המוח, כי ניתן לחקור באמצעות מבחני פיזיולוגיים מבוססי תא כגון הדמיה סידן או מבחני אלקטרופיזי כגון הקלטות תא בודד או רב אלקטרודה מערך (MEA ) 1 . למרות 3-D מערכות לשאת את סמנים של התפתחות קליפת המוח מוקדם, מחקרים אחרים הראו כי אלה 3-D גופים עשויים לדרוש פעמים הדגירה ארוכה כדי לאפשר את קצב איטי מטבעו של התפתחות רקמת האדם 8 . זה פרוטוקול SFEB בהצלחה מייצר 3-D SFEBs מ hiPSCs לא מובחן כי לוכדת היבטים של התפתחות מוקדמת של קליפת המוח.
הפוטנציאל של SFEBs כדי מודל סטיות רשת בהפרעות נוירולוגיות הוא כוח של מערכת זו. את hiPSCs נגזר רקמת החולה ניתן לגדל לתוך התאים של מערכת העצבים כי הם כפופים התחתAys הקשורים לביולוגיה התא, כמו גם ביטוי גנטי במקביל. משתמשים ב- iPSCs כדי לבדוק את הפרופיל הגנטי של קבוצות גדולות של אנשים עם הפרעות נוירולוגיות שונות עם אטיולוגיות מורכבות כגון הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), סכיזופרניה 9 , תסמונת רט, 10 ואלצהיימר 11 , 12 . עד לאחרונה, מודלים iPSC היו בדרך כלל ההכנות monolayer, כי בעוד בקיאים בהערכת אינטראקציות מולקולריות, לא היו מספיק לפענח את האינטראקציות הסלולר המורכב לראות in vivo . מודלים של בעלי חיים היו תחליף ברירת המחדל עבור מחדש את פלטפורמת האיבר כולו. מודלים אלה של בעלי חיים סובלים מתרגום גרוע של הממצאים ויש להם יכולת מוגבלת לשכפל פרופילים גנטיים אנושיים שזוהו על ידי מחקרים גדולים של בדיקות גנטיות. לפיכך, הפיתוח של מערכות תלת ממדיות מ- iPSCs מוסיף שכבה של מורכבות אנושיתדוגמנות 13 , 14 . השלב הבא עבור פלטפורמות hiPSC 3D היא להתאים את דרישות בקנה מידה גדול של הקרנה תפוקה גבוהה באמצעות מבחני תאים מבוסס 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדור של תאים עצביים עצביים
- שמור hiPSCs נגזר fibroblasts ו PBMCs ב 6 גם צלחות על γ- מוקרן העכבר עובריים מזין (MEF) שכבת התא במדיום iPSC האדם בתוספת קטנה מולקולות (ראה את טבלת החומרים).
הערה: תחזוקה יומית היא גרסה שונה של פרוצדורות שדווחו בעבר , 1 , 16 .- צלחת 6 x 10 5 MEFs על גבי כל היטב של 6-רקמה צלחת כיתה תרבותית 300 בינוני μL / מומלץ גם (להלן פרוטוקול של היצרן).
- לאחר 48 שעות, להחליף בינוני MEFs עם 300 μL / מדיום hiPSC היטב עבור 1 שעות לפני הוספת hiPSCs.
- להפשיר במהירות hiPSCs אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים לאט להוסיף 1 מ"ל hiPSC dropwise בינוני. מעבירים את hiPSCs בינוני עד צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף בינוני כדי להביא את הנפח הכולל ל 5 מ"ל. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 129 xg, לשאוב את supernataNt, בעדינות מחדש להשעות את גלולה במדיום 1 מ"ל hiPSC עם מעכב ROCK ב 1: 1 ריכוז.
- פלייט ההשעיה התא (בדרך כלל seeded ב 300,000 תאים / טוב) על שכבת תא MEF ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 , לחות 95%.
- צג תרבות iPSC מקרוב באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר 48 שעות, להסיר תרבויות בעלות קצוות לא אחידים, גדלו להיות כמו סיסטיק או להיראות חום צהבהב תחת מיקרוסקופ אור כדי למזער בידול ספונטני.
הערה: לאחר 7-10 ימים, מושבות hiPSC צריכות להיווצר. המושבות צריכות להיות עגולות, עם גבולות מוגדרים בבירור וצפיפות תאים אחידה, נטולי תאים לא אחידים רופפים. - באופן ידני לבחור מושבות hiPSC כדי לנקות את התרבות של תאים מובחנים באופן ספונטני. הרחב את המושבות על ידי הצבת אותם על שכבות חדשות MEF. הרחב 1: 3 כל 7 ימים כאשר תרבויות ליד confluency להקפיא 1 , 16 .
- לאחר הרחבת תאי הקפאה (לגיבוי), לגדול מושבות hiPSC על צלחות עד שהם מגיעים 50 - 75% מפגש.
- שבעה ימים לאחר ציפוי, להשתמש בטיפול אנזימטי קלה (5-10 דקות עם 300 μL 300 של פתרון האנזים) וטחינה דקה עדינה (2-4 פעמים עם 1,000 μL pipet) למסוק ולהכין hiPSCs עבור הבדל תאים עצביים מבשר.
- צנטריפוגה ההשעיה תא ב XG 129 במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל iPSC בינוני האדם. מעבירים את ההשעיה תא על 0.1% ג 'לטין מצופה 5 ס"מ צלחת תרבות התא עבור 1 שעה ב 37 ° C לחסל MEFs כדי למקסם את התשואה hiPSC. מעבירים את המדיום (עם תאים שאינם חסיד) כדי עוד 5 ס"מ צלחת מצופה ג 'לטין.
- מעבירים את התאים שאינם חסיד לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל באמצעות טפטפת העברת. בעדינות לשטוף את הצלחות עם בינוני 3 מ"ל ולהוסיף אותו לצינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגה ההשעיה התא 129 xg במשך 4 דקות, לשאוב את סופרNatant, ו resuspend בעדינות גלולה בינוני. קבע את ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. פלייט 9,000 תאים / גם צלחת 96-נמוך נמוך V- התחתונה.
- צנטריפוגה את הצלחת ב XG 163 במשך 3 דקות. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו 5% CO 2 . באמצעות פיפטה, לשנות בינוני 50% מדי יום ביומו על ידי הסרת חצי המדיום והחלפתו עם בינוני טרי מוגדרים כימית בינוני 1 (DM1, איור 1 , טבלה של חומרים) במשך 14 ימים.
2. סרום ללא עוברים גוף Embuction (SFEB) אינדוקציה ( איור 2 )
- מקום 40 מיקרומטר תא התרבות מוסיף צלחות 6-היטב ולהוסיף בינוני 1 מ"ל DM1 לפחות 1 שעות לפני תוספת של אגרגטים.
- ביום 14, להעביר את אגרגטים עם בינוני 20 μL באמצעות 200 μL קצה הפה רחב על 40 מיקרומטר תרבית תאים מוסיף ולשנות את המדיום כדי DM2.
7 , 17 , 18 .- העברת 4-6 אגרגטים לתרבות אחת התא להוסיף ולאפשר מרחב הולם בין אגרגטים. הסר כמו פתרון עודף ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה בסדר ( למשל 200 עצה μL).
הערה: זה מקובל להפריע לזמן קצר SFEB כפי שהם יעברו על תרבית תרבות התא כמו פתרון הוסר סביב SFEBs. - לשמור על תרבויות 1 מ"ל של DM2 ב 37 ° C, לחות 95% ו 5% CO 2 . באמצעות פיפטה, לשנות 75%מדי יום ביומו על ידי הסרת שלושה רבעים של המדיום והחלפה עם שלושה רבעים בינוני טרי. לדוגמה, להסיר 750 μL של המדיום ולהוסיף 750 μL של המדיום הטרי.
- העברת 4-6 אגרגטים לתרבות אחת התא להוסיף ולאפשר מרחב הולם בין אגרגטים. הסר כמו פתרון עודף ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה בסדר ( למשל 200 עצה μL).
- לאחר 14 ימים של תרבות, לעבור המדיום DM3 עם 75% בינוני לשנות כל יום אחר במשך 16 ימים נוספים.
- כדי לשמור על SFEBs על הוספת תרבית תאים מעבר 30 יום, לשנות את המדיום כל יום אחר עבור 60, 90 ו - 120 ימים.
הערה: SFEBs יגדל ל כ 1000 מיקרומטר בקוטר והם בדרך כלל 100-150 מיקרומטר עבה 1 .
3. קביעת הרכב SFEB
- לנתק את SFEBs מן להכניס ידי pipetting בעדינות בינוני באמצעות 200 μL רחב פיפטה קצה פיפטה. כדי להעביר את SFEBs, השתמש קצה פיפטה רחב פה לשאוב בעדינות את הגופים לתוך קצה פיפטה. לאחר טעינת SFEB לתוך קצה פיפטה, בעדינות להעביר צלחות 12 גם ולשטוף עם 300 μL פוספט שנאגרו מלוחים(PBS) לכל טוב.
הערה: SFEBs יושעה בפתרון 12 צלחות. זה חשוב כדי לאפשר חדירה מלאה של מקבע, פתרון חסימה, ונוגדנים. אם משתמשים SFEBs מרובים עבור מכתים, עד 10 SFEBs ניתן להוסיף היטב של צלחת 12 גם. זה יהיה לשמר פתרונות ונוגדנים. - תקן SFEBs עם μL 300 לכל paraformaldehyde טוב 4% בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות. לשטוף SFEBs קבוע פעמיים עם 300 μL PBS, 3-5 דקות כל לשטוף.
זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול paraformaldehyde.
הערה: בדוק עבור immunoreactivity לסמנים לקבוע בגרות, סוג התא וכו 'לסימון נוירונים במחקר זה עוף-Tuj1 שימש ב 1: 500, עבור סמנים נוספים אנא ראה טבלה 2 והפניות 1 , 16 . - Permeabilize ולחסום עם 0.1% Triton-X100 ב PBS ו 10% בסרום חמור רגיל (חסימת פתרון; 300 μ, L לכל טוב) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- הסר את פתרון חסימת ולטפל SFEBs עם 300 נוגדנים העיקרי μL בפתרון חסימה. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף SFEBs שלוש פעמים (3-5 דקות לכל לשטוף) ב 300 μL PBS המכיל 0.1% Triton-X.
- הכן נוגדנים משני 1: 1000 ב חסימת פתרון. דגירה SFEBs במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משני. לשטוף SFEBs עם 300 μL PBS, 3 פעמים במשך 3-5 דקות כל אחד.
הערה: בשלב זה SFEBs יכול להיות מוכן הדמיה. - כדי תמונה, SFEBs פיפטה על גבי שקופית זכוכית באמצעות פיפטה רחב נשא. הסר פתרון עודף סביב SFEB באמצעות יניקה עדינה.
הערה: עבור תנאי מכתים דומים, SFEBs מרובים ניתן להציב על שקופית זכוכית זהה. - הוסף טיפה של המדיום הרכבה על SFEBs, במקום coverslip זכוכית, ולחץ בעדינות כדי לוודא שאין בועות אוויר. אפשר המדיום גובר להתקדם ולהמשיך הדמיה וכימות (שלב 3.8).
- בצע כימות תאים על ידי לקיחת מספר אזורים של עניין (ROI) על פני SFEB ושימוש z- מחסנית בשילוב עם תמונה היטל מקסימלי דרך החזר על כל ROI על מיקרוסקופ confocal רגיל כמתואר הפניות 1 , 16 .
הערה: כל SFEBs ניתן לכמת באמצעות ריצוף תמונה מבוסס (ראה הפניות 1 , 16 לפרטים). מאז SFEBs דק כ 100 מיקרומטר, יש פיזור מינימלי של אור הרקמה ולכן אין צורך במיקרוסקופ 2 פוטון. שימושים קודמים של פרוטוקול זה עם iPSCs נגזר fibroblast הפיק מפת הגורל SFEB כי גילה מבנה מורכב ומגוונים עם subpopulations של interneurons עם זהויות תעתיק הדומה CGE ו קדמי forebrain גורל 1 , 16.
4. הקלטה הפעילות העצבית SFEBs באמצעות MEAs
- הכן 12-היטב MEA צלחות לפי הוראות היצרן.
- לשטוף את צלחות MEA 3 פעמים במשך 5 דקות עם סטרילי H 2 O תחת תנאים aseptic לניקוי. לשטוף במשך 5 דקות עם אתנול 75% ולאחר מכן עם אתנול 100% לעקר את הצלחת.
- אופים את הצלחת הפוכה בתנור במשך 4-5 שעות ב 50 ° C כדי להשלים את תהליך העיקור.
- הוסף 500 μL תמיסת polyethyleneimine 0.2% (PEI) כדי היטב כל דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר. לשאוב PEI ולשטוף את הבארות 4x עם סטרילי מזוקק H 2 O. האוויר יבש במכסה המנוע בן לילה.
- הכן 20 μL פתרון / מ"ל של laminin במדיום L15 ולהוסיף 10 laminin μL למרכז של כל טוב.
הערה: אין לכסות את ההתייחסות הסמויה ואת האלקטרודות הארקה. - הוסף סטרילי dH 2 O על המאגרים הסובבים כדי למנוע אידוי בינוני או laminin.דגירה את הצלחת עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף SFEBs (ראה סעיפים 1 ו -2) כדי laminin מצופה צלחות MEA ידי יניקה בעדינות אותם לתוך קצה פיפטה פה רחב ולהעביר אותם. הוסף 200 מדיום DM2 μL היטב כל דגירה לילה ב 37 ° C, לחות 95% ו 5% CO 2 .
- הוסף בינוני 200 μL נוסף לאחר 24 שעות ולאפשר לו להתאושש במשך 30 דקות ב 37 ° C, לחות 95%, 5% CO 2 לפני קריאת הצלחת.
- מניחים את הצלחת MEA בקורא צלחת (שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) כדי להקליט פעילות העצבית. פעילות שיא במשך 10 דקות עם תוכנת הקלטה MEA הקשורים. למידע נוסף, עיין בסעיף 19 .
- יצירת נתונים גולמיים רציף זרמים מגרשים סריקה של הפעילות העצבית באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי 19 .
הערה: הקלטות MEA נלקחים 7 ימים לכתוב SFEB ציפוי. עבור מחקר זה, הקלטות נלקחו במשך 10 דקות כדי לזהות פעילות פרץ ברשת, conעקבות רזה, מגרשים רסטר. SFEBs ניתן להישמר לטווח ארוך על לוחות MEA והוא יכול להיות מוקלט על פני תקופות זמן ארוכות יותר באמצעות תנאים בשליטה סביבתית ( איור 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SFEBs גדל באמצעות הטכניקה שלנו הניב רקמה עם מאפיינים מורפולוגיים הדומים לאזור תת קליפת המוח המוקדם קליפת המוח גדוש נוירונים חיוביים Tuj1 חיובי, כמו גם אבות עצביים ( איור 3 א ). רבים פיתחו שושנות קליפת המוח נצפו השכבות החיצוניות השכבות הפנימיות של SFEB ( איור 3 ב ). הקצה החיצוני של SFEB דומה צלחת קליפת המוח המכיל נוירונים postmitotic. זה נתמך על ידי הביטוי של Brn2, סמן עבור אבות עצביים בשכבות הקורטיקליים החיצוני ביותר מבוזרת. Reelin תאים חיוביים שעשויים להיות תאים Cajal-Retzius או אבותיהם, אשר באים לידי ביטוי השכבות החיצוניות של קליפת ההתפתחות נצפים גם SFEBs ( איור 3 ג ). SFEBs גדל באמצעות פרוטוקול זה להביע סמנים בקנה אחד עם זנב מעורב (CGE) ו ganglio המדיאלימקור השראה (MGE). תאים המבטאים את הסמן CGE Couptf2 ותאים אחרים להביע MGE סמן Nkx2.1 ניתן להבחין בתרבויות ( איור 3D ). זה יכול להיות בין השאר בשל השימוש DKK-1 בפרוטוקול, אשר הוכח כדי לשפר את גורל המדיאלי 20 .
SFEBs שנעשו באמצעות פרוטוקול זה תשואה הן caleurinin ו- calbindin חיובי interneurons ( איור 4 א ), כמו גם VGLUT נוירונים מעוררים חיוביים ואבות נוי חיובי גלוטמטרגי Tbr1 חיובי ( איור 4 ב ). בממוצע, ראינו כי 61% מכלל התאים SFEBs הם VGLUT חיובי ו 43% הם Tbr1 חיובי ( איור 4 ג ). זה עולה בקנה אחד עם דוחות אחרים באמצעות פרוטוקולים דומים 21 . בנוסף, SFEBs יכול להיות כפוף מבחני פיזיולוגיים כגון לחיות תא סידן הדמיה באמצעותסמנים כגון Fluo-4, כדי לבחון את תפקוד הרשת העצבית בסביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית ( איור 5 ). SFEBs יכול להיות נתון הקלטות MEA לתקופות ארוכות של זמן ולהראות התפתחות של ההתפוצצות ברמת הרשת קליפת המוח ( איור 6 ).
איור 1: סכמטי מתאר את השלבים המוקדמים בהכנת SFEBs. לאחר iPSCs נקצרו באמצעות דיסוציאציה אנזימטית, הם מצופה צלחות 96-היטב ו centrifuged ב XG 163 למשך 3 דקות כדי לגרום צבירה מהירה. לאחר 14 ימים במבחנה (DIV) אגרגטים תא יכול להיות מועבר מ 96 צלחות גם דרך צינורות רחבים נשא על גבי תרבית תאים להוסיף המכילים 6-גם צלחות. אנא לחץ כאןEw גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: קו הזמן של שינויים בינוניים ושלבים במהלך הצמיחה וההרחבה של SFEB. לאחר SFEBs הועברו מוסיף, הם תחת ללכת שני שינויים בינוניים ב 14 ו - 28 ימים במבחנה (DIV). הם בדרך כלל שנקטפו עבור ניסויים ב DIV 30, 60 ו 90. החלקים העליונים מראים שלבים שונים בתהליך זה. סולם ברים = 1,000 מיקרומטר (משמאל); 1000 מיקרומטר (DIV 20); 600 מיקרומטר (DIV 30); 300 מיקרומטר (SFEB יחיד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אפיון מורפולוגי כללי טיקים של SFEBs גדל באמצעות פרוטוקול זה. ( א ) קצה חיצוני אופייני של SFEB להביע את סמן סמן nestin (ירוק), פוסט מיטוטי סמן עצבי Tuj1 (אדום) ואת הכתם הגרעיני (כחול). ( ב ) SFEBs להראות שושנות אופייניות קליפת המוח בשתי השכבות החיצוניות (התמונה השמאלית) ואת השכבות הפנימיות (מימין). הם מבטאים שני אבות וסמנים בוגרים נוירונים. ( C ) קצה החיצוני נציג של SFEB להביע את השכבה החיצונית / סמן קליפת המוח קליפ BRN2 (ירוק) ואת פיתוח CGE סמן Couptf2 (אדום). ( D ) SFEBs שנעשו באמצעות פרוטוקול זה מייצג מבנים neocortical מבוזרת כפי שניתן לראות על ידי מכתים Pax6 (אדום) ו סמנים אקספרס בקנה אחד עם כמה מקורות MGE כגון Nxk2.1 (אדום). סולם בר = 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Her.within-page = "1"> 
איור 4: תמונות של סוגי תאים עצביים עיקריים ב SFEBs. ( A ) כמה נוירונים SFEBs להביע סמנים בקנה אחד עם interneurons קליפת המוח כגון calbindin (ירוק, התמונה השמאלית) ו calretinin (ירוק, התמונה הימנית). ( B ) SFEBs להראות VGLUT-1 נוירונים גלוטמטרגיים חיוביים (אדום, תמונה שמאל) ואבות glutamatergic להביע Tbr1 (אדום, תמונה ימנית). סולם בר = 40 מיקרומטר. ( ג ) תשואות אופייניות של נוירונים מעוררים המבטאים או VGLUT-1 או Tbr1 (סרגל שגיאה = SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: סידן סידן חי הקלטות/ Strong> (תמונה שמאלית) קצה החיצוני נציג SFEB שטופלו עם Fluo-4, אינדיקטור סידן עצבי. תאים מסומנים למדידה של טרמינטים סידן ספונטני (תיבות צבע שונות). תאים נבחרים מדגימים טרמינטים סידן ספונטניים מסומנים על ידי תיבות אדומות (עקבות העליונים) או תיבות ירוקות (עקבות נמוכים). סולם בר = 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: Multi-electrode מערך הקלטות של SFEBs. (למעלה) נציג תמונה של SFEB המצורפת צלחת MEA (קנה מידה בר = 100 מיקרומטר). (באמצע ותחתון) SFEBs ניתן להקליט על MEAs על פני תקופות זמן ארוכות ולהראות הבשלה. (התיכון והתחתון, משמאל) מפה מפורטת היטב של 3 SFEBs מצופה על 3 בארות של 1צלחת MEA 2-well, צבעים כהים מייצגים פעילות ספייק כללית גבוהה יותר שמתרחבת בין יום 30 לבין יום 90. (התיכון והתחתון, הקטעים) מפת הפעילות המצטברת מראה עלייה בצפיפות ספייק ואזור הקוצים בתוך רשתות קליפת המוח ב- SFEBs 30 יום ויום 90. (באמצע ותחתון, ימין) עקבות גלם (העליון) ואת כל חלקה היטב סריקה מגרשים (נמוך) להראות עלייה במספר קוצים ומספר התפרצויות לאורך זמן; המעידים על היווצרות רשת חזקה יותר ב SFEBs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| נוֹגְדָן | מְהִילָה | מִין |
| Nestin | 0.111111111 | עכבר |
| ברן -2 | 0.388888889 | אַרנֶבֶת |
| VGLUT1 | 0.111111111 | אַרנֶבֶת |
| Pax6 | 0.25 | אַרנֶבֶת |
| קאלרטינין | 0.180555556 | אַרנֶבֶת |
| קאלבינדין | 0.319444444 | אַרנֶבֶת |
| CoupTFII | 0.180555556 | עכבר |
| Nkx 2.1 | 0.180555556 | אַרנֶבֶת |
| Tuj1 | 0.388888889 | עוף |
| סליל | 0.388888889 | עכבר |
| Tbr1 | 0.180555556 | עוף |
| NFH | 0.25 | עכבר |
טבלה 1: נוגדנים המשמשים במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק את התנאים להבדיל מקור hiPSC לתוך מבנה 3-D כי recapitulates בשלב התפתחותי מוקדם של קליפת המוח הקדמית. הליך זה מניב מבנים שניתן לחקור עבור electrophysiology בעת גם להיות מקובל למיקרוסקופ. מורפולוגיה הסופי של SFEB דומה לזו של תרבויות פרוסות המוח organotypic ומאפשר הדמיה confocal מפורט באיכות גבוהה. פרוטוקול זה יכול בהצלחה לייצר SFEBs משני fibroblast ו היקפי דם mononuclear תאים נגזר hiPSCs. SFEBs שנעשו מן הדם ההיקפי mononuclear התא הנגזרות hiPSCs התערוכה מאפיינים מורפולוגיים דומים לאלה שנוצרו מן hiPSCs הנגזרות fibroblast.
תהליך זה, כמו תוכניות אחרות 3-D, מנצל מולקולה קטנה רמזים תאיים להנחות החלטות גורל התא. זה משולב עם התכונות המהותיות של קשר תא אל תא, אשר ליצור סביבה מציאותית יותר עבור הרשתהיווצרות עבודה ותפקוד נוירוני. דיווחים אחרים הראו כי השילוב המתאים של אותות מולקולה קטנה תאיים מספיק עבור החלטות כאלה גורל התא כגון midoprain dopaminergic 8 , 22 , ו interneurons קליפת המוח 8 , 16 , 23 . עם זאת, 3-D מערכות להציג זמן התבגרות מואצת לעומת מקבילים 2-D 5 . כאשר נתון מספיק זמן, 3-D תרבויות הראו בגרות מוגברת. תכונות אלה הופכות טיעונים חזקים עבור התועלת של פלטפורמות תלת ממדיות כמו SFEB. היתרון הנוסף של מיקרוסקופיה חיה באיכות גבוהה, יחד עם הגמישות של חומר המקור, להפוך טיעונים משכנעת עבור פרוטוקול זה.
בנוסף, SFEBs שנעשו באמצעות פרוטוקול זה לשתף מספר קווי דמיון עם מחקרים אחרים דיווחו 13 , 24. לגבי התייחסות 24 , פרוטוקול זה ואת האימות הפיזיולוגי של נוירונים מראש תאריכים זה. לדוגמה, המחקרים דיווחו על הפניות 13 , 24 , להשתמש בגרסאות דומות של עיכוב SMAD כפול כדי להפיק קליפת המוח כמו נוירונים וקיבל שיעור דומה של נוירונים גלוטמטריים ואבות (~ 50%). בנוסף, Mariani, ג 'יי et al. (התייחסות 13 ) דו"ח דומה Pax6 ו Nestin מכתים כמו פרוטוקול זה ב 25-30 נקודות זמן ביום. איכותית, דפוסי מכתים עבור Brn2, כמו גם את הביטוי של האסטרוציטים חיובי GFAP דומים לזה שדווח בהתייחסות 24 . עם זאת, פרוטוקול זה יש מספר יתרונות על פני שני מתודולוגיות אורגנואידים נפוץ. ראשית, מריאני, ג '. 13 לדווח על התפתחות של intereurons חיובי Dlx ביום 50 ו conFirmed רק על ידי שיטות immunostaining. באמצעות פרוטוקול זה, Interneurons חיובי Dlx הם לייצר ביום 30. אלה interneurons אושרו כמו פונקציונלי על ידי תא יחיד electrophysiology ויישום תא יחיד פרמקולוגי של GABA 16 . בנוסף, מחברי 13 טוענים קישוריות תפקודית של נוירונים, אבל זה נקבע רק באמצעות מכתים. SFEBs שנעשו באמצעות פרוטוקול זה היו נתונים לרשת אחת אלקטרודה גירוי וסידן הדמיה כדי להראות כי פיתוח רשתות קליפת המוח מחוברים ופונקציונלי. Pasca, et al. 24 סעיף אגרגטים באמצעות cryostat כדי לקבל הקלטות ממבנים דמויי אורגנואידים. SFEBs שנעשו באמצעות פרוטוקול זה לא צריך חתך וניתן להקליט ישירות תוך הוספת 1 . נוירונים שנרשמו SFEBs שאינם חתכים הוכחו יש פוטנציאל פעולה פוטנציאליים שלאחר סינפטית מעכב לאחר מיוןG 1 , 16 .
SFEBs ניתן לעשות שימוש הן fibroblasts ו PBMCs כמו חומר המוצא. ניתן גם להשתמש בסוגי רקמה אחרים, אשר גורמים ל- hiPSCs (כגון עיסת שיניים, עורלה, שתן) 25 , 26 , 27 , למרות שחלק מהמולקולות הקטנות עשויות להשתנות כדי להשיג תוצאות דומות. עבור פרוטוקול זה, השימוש DKK-1 חשוב נהיגה SFEB לקראת גורל מתון 28 . פיזור זה אחראי באופן חלקי על בידול של interneurons עם CGE כמו מקורות 16 . DKK-1 הוא מולקולה קטנה יקר ולכן ריכוזים גבוהים של קיפוד קולי יכול לשמש כדי להשלים DKK-1 בפרוטוקול זה. עם זאת, הריכוז של עיכוב Wnt באמצעות DKK-1 חייב להיקבע באופן אמפירי על ידי משתמש הקצה. בנוסף, XAV939, עוד מעכב WntR, ניתן להשתמש כדי לסייע הבדל הכונן לעבר הגורל מופרך, אם כי השימוש במעכב זה יניב רקמה כי מניות זהויות תעתיק עם MGE 23 .
כאשר בפיתוח מערכות תרבות hiPSC 3D כמו SFEBs המתואר בפרוטוקול זה, חשוב לזכור כי מבנים אלה מניבים כמות מתונה של הטרוגניות מתרבות לתרבות. זה בחלקו בשל אופי סטוכסטי של בידול נוירוני מ iPSCs ובשל תא תא קשר קשר ב SFEB וכתוצאה מכך ספונטנית עצמית עצמית ארגון 29 , 30 . לכן, חשוב לפרש את התועלת של טכניקה זו בהקשר של הטרוגניות. דרכים למזעור ההשפעה של ההטרוגניות במערכת זו כוללים, יצירת מספר גדול של SFEBs, כך שהם מייצגים וריאציה טבעית של המערכת, בקפדנות דבקות בריכוז שלריאגנטים ומספר התאים seeded בתחילת כל ריצה הייצור. זה קריטי להתחיל עם מושבות iPSC נקי ליישם טחינה דקה במהלך שלב ניתוק אנזימטי במהלך ניתוק iPSC כדי להגדיל את הכדאיות התא. הכדאיות התא לאחר טחינה דקה הוא גורם חשוב בקבלת SFEBs באיכות גבוהה. כצעד לפתרון בעיות חלופי, הכדאיות ניתן לבדוק לאחר ניתוק ולפני הצעדים צנטריפוגה באמצעות טריפאן כחול, במידת הצורך. הישימות וההבחנה הספונטנית יכולות להיות מושפעות גם אם ROCKi אינו משמש כראוי במהלך הצעדים הראשונים של ניתוק ודיפרנציאציה. השימוש ב- ROCKi והירידה בהדרגה במהלך הזנות של 50% במשך 7-10 הימים הראשונים היא קריטית עבור SFEBs עקביים ואיכותיים.
בנוסף, לעתים קרובות הוא שימושי כצעד אימות כדי לבדוק את התוצאות SFEBs 3D עם אלה שנצפו שורות תאים אותו נוצר באמצעות הכנה monolayer. ללא שם: UnderstaNding איך שתי מערכות לחצות השוואה בתוך כל קוהורט הניסוי הוא מאוד שימושי בהבנת המורכבות של מודל מחלה נתון. לבסוף, SFEBs ניתן להשתמש כדי למיין ולטהר אוכלוסיות תאים באמצעות מינון תא מופעל פלורסנט למחקר נוסף במערכת monolayer 2D הומוגנית יותר 16 .
עם זאת, SFEBs שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה שימושיים ללימוד מעגלים קטנים בפיתוח קליפת המוח. יישומים עתידיים של טכניקה זו כרוכים בריבוב הקלטות אלקטרוניות עם גישות תוכן גבוהה. ואכן, מוסיף תא תא מיוצרים לשימוש בפורמט 96-היטב צלחת. אלה מוסיף יכול לשמש עם פרוטוקול SFEB המתואר כאן במקום של 6-מוסיף היטב. על מנת להציג מדרגיות בשיטה זו, SFEBs יצטרכו ליצור באמצעות קווים מרובים שיבוטים בתוך קוהורט נתון ויהיה צורך הוקרן על פני קבוצה של מבחני מבוססי תאים חזקים לחפש עקביות wiתרבויות דקות. לדוגמה, מספרים נוירונים, מורפולוגיה, ופיתוח שכבת יכול להיות assayed באמצעות פורמט 96-well. באופן אידיאלי, מבחני תאים מבוססי צריך להיות משולב עם assay electrophysiological תוכן גבוהה כגון MEA, אשר גם מדרגי ל 96 צלחות היטב.
פלטפורמת SFEB זו מבטיחה לפענח את תפקידה של התפתחות רשת קורטיקלית מוקדמת בהפרעות נוירולוגיות, במיוחד במקרים בהם קיימת אינטראקציה אפשרית בין גנטיקה לבין התפתחות עצבית מוקדמת. הוכחנו כי זה יכול להיות מטופל כמו תרבות פרוסה כפי שמוצג עכברוש מחקרים עכבר. מחקרים עתידיים שימושיים באמצעות מערכת זו צריכים להתמקד באנטומיה השוואתית הפיזיולוגיה הפיזיולוגית בין מבנים vivo של העכבר SFEB. נתונים השוואתיים אלו יהיו חזקים מאוד בפיתוח מערכת טרנסלציונית אמיתית לגילוי סמים ומחקר בסיסי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים אליזבת Benevides להגהה את המאמר. אנו מודים לד"ר. ג 'ון Hussman ו ג' ין בלאט על דיונים מועילים שלהם הערות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
