Summary
Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.
Abstract
Embora uma série de modelos de doenças in vitro tenham sido desenvolvidos usando o HiPSCs, uma limitação é que esses sistemas bidimensionais (2-D) podem não representar a complexidade subjacente citocárdica e funcional dos indivíduos afetados portadores de variantes de doença suspeitas. Os modelos 2-D convencionais permanecem representações incompletas de estruturas semelhantes a in vivo e não capturam adequadamente a complexidade do cérebro. Assim, há uma necessidade emergente de mais modelos baseados em HiPSC 3-D, que podem melhor recapitular as interações e funções celulares observadas em um sistema in vivo .
Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema 3-D a partir de hiPSCs indiferenciados com base no corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D espelha aspectos de um neocórtex ventralizado em desenvolvimento e permite estudos sobre funções integrantes de células neurais vivas e tecido intacto, como migração, conectividade, comunicação e tapeteUração. Especificamente, demonstramos que os SFEBs que usam nosso protocolo podem ser interrogados usando ensaios baseados em células fisiologicamente relevantes e de alto conteúdo, tais como imagens de cálcio e gravações de matrizes múltiplas (MEA) sem criosecção. No caso das gravações MEA, demonstramos que os SFEBs aumentam tanto a atividade do ponto como a atividade de explosão no nível da rede durante o cultivo a longo prazo. Este protocolo SFEB fornece um sistema robusto e escalável para o estudo do desenvolvimento da formação da rede em um modelo 3-D que captura aspectos do desenvolvimento cortical inicial.
Introduction
Já relatamos um sistema modelo 3-D, gerado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), que recapitulam alguns aspectos do desenvolvimento inicial da rede cortical 1 . Este modelo 3-D, um corpo embrionário isento de soro (SFEB), melhora os modelos 2 , 3 de agregação simples anteriores de agregação. Um corpo crescente de trabalho revela que estruturas tridimensionais, como nossas SFEBs, aspectos aproximados do desenvolvimento neural comumente observados in vivo e em um ponto de tempo anterior ao observado nos modelos hipsc 2-dimensional (2-D) / monocamada 4 , 5 . Os estudos iniciais têm sido focados na complexidade auto-organizada dos corpos 3-D sem demonstrar sua complexidade fisiológica 2 .
O protocolo descrito aqui foi usado em hiPSCs indiferenciados derivados de fibroblastos e Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Essas células são mantidas em alimentadores embrionários de ratos irradiados com γ (MEFs). Estas colônias HiPSC são limpas manualmente de células diferenciadas espontaneamente, colhidas enzimaticamente e ressuspensas em meio contendo inibidor de Rho-quinases Y-27632 (ROCKi). HiPSCs indiferenciados são submetidos à dissociação e centrifugação antes de serem transferidos para placas de 96 poços de baixa aderência em V. Após o chapeamento, a indução neural é iniciada usando a inibição dupla de SMAD (SB431542 e LDN193189, juntamente com dickkopf 1 (DKK-1)) para direcionar uma linhagem do farol neurônio anterior-frontal do prosencéfalo 6 . Após 14 dias, os SFEBs são transferidos para inserções de cultura de células em uma placa de 6 poços. Uma vez transferidos, os SFEB redondos começam a se espalhar e fino, mantendo conexões de rede locais, como é freqüentemente observado em preparações de cultura de fatia organotípicas do hipocampo usando inserções similares de cultura celular 1 ,Ss = "xref"> 7.
O uso de uma plataforma 3-D baseada em SFEB neste formato é passível de produção eficiente de redes corticais que podem ser interrogadas usando ensaios fisiológicos baseados em células, tais como imagens de cálcio ou ensaios eletrofisiológicos, como gravações de células únicas ou matrizes de vários eletrodos (MEA ) 1 . Embora os sistemas 3-D tenham marcadores do desenvolvimento cortical precoce, outros estudos mostraram que esses corpos 3-D podem exigir tempos de incubação mais longos para permitir o ritmo inerentemente mais lento do desenvolvimento de tecido humano 8 . Este protocolo SFEB gera com sucesso 3-D SFEBs de hiPSCs indiferenciados que captura aspectos do desenvolvimento inicial do córtex.
O potencial de SFEBs para modelar aberrações de rede em distúrbios neurológicos é uma força desse sistema. Os hiPSCs derivados do tecido do paciente podem ser cultivados em células do sistema nervoso que estão sujeitas a bundaSão relacionados à biologia celular, bem como a expressão de genes concomitantes. IPSCs humanos estão a ser usada para determinar o perfil genético de grandes grupos de indivíduos com diferentes distúrbios neurológicos com etiologias complexas, tais como a desordem do espectro do autismo (ASD), esquizofrenia 9, síndrome de Rett 10, e doença de Alzheimer 11, 12. Até recentemente, os modelos iPSC eram tipicamente preparações monocamadas que, embora proficientes na avaliação de interações moleculares, eram inadequadas na decifração das interações celulares complexas vistas in vivo . Os modelos de animais têm sido o substituto padrão para recriar a plataforma do órgão inteiro. Esses modelos animais estão atormentados pela má tradução de achados e têm capacidade limitada para replicar perfis genéticos humanos identificados por grandes estudos de triagem genética. Assim, o desenvolvimento de sistemas 3-D de iPSCs adiciona uma camada necessária de complexidade em humanosModelagem da doença 13 , 14 . O próximo passo para as plataformas 3D HiPSC é acomodar os requisitos de grande escala de rastreio de alto rendimento usando ensaios baseados em células 15 .
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Protocol
1. Geração de células progenitoras neuronais
- Manter o HiPSCs derivados de fibroblastos e PBMCs em placas de 6 poços em uma camada celular de alimentador embrionário de mouse irradiado (MEF) em meio iPSC humano suplementado com pequenas moléculas (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A manutenção diária é uma versão modificada dos procedimentos relatados anteriormente 1 , 16 .- Placa 6 x 10 5 MEFs em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços em 300 μL / meio recomendado para recomendação (seguindo o protocolo do fabricante).
- Após 48 h, substitua o meio MEF com 300 μL / poço de meio hiPSC durante 1 h antes de adicionar oiPSCs.
- Descongelar rapidamente o HiPSCs em um banho-maria a 37 ° C e adicionar lentamente 1 mL de meio hiPSC gota a gota. Transfira o hiPSCs e o tubo cônico médio para 15 mL. Adicione o meio para aumentar o volume total para 5 mL. Centrífuga por 4 min a 129 xg, aspira a supernataNt, recoloque suavemente o sedimento em 1 ml de meio HiPSC com inibidor de ROCK a uma concentração de 1: 1000.
- Placa a suspensão celular (tipicamente semeada a 300 000 células / poço) na camada de células MEF e incube a 37 ° C, 5% de CO 2 , 95% de umidade.
- Monitore a cultura iPSC de perto usando um microscópio de luz. Após 48 h, remova culturas com bordas irregulares, cresceu para se tornar cística ou pareça marrom-amarelada sob o microscópio de luz para minimizar a diferenciação espontânea.
NOTA: Após 7 a 10 dias, as colônias do hiPSC devem se formar. As colônias devem ser redondas, com bordas claramente definidas e densidades celulares uniformes, e desprovidas de células não uniformes compactas. - Selecione manualmente as colônias rondas do hiPSC para limpar a cultura de células diferenciadas espontaneamente. Expanda as colônias colocando-as em camadas MEF frescas. Expandir 1: 3 a cada 7 dias quando culturas próximas da confluência e congelar 1 , 16 .
- Após células de expansão e congelamento (para backup), crie colônias de hiPSC em placas até chegarem a 50 a 75% de confluência.
- Pós-revestimento de sete dias, uso de tratamento enzimático leve (5-10 min com 300 μL de solução enzimática) e trituração suave (2-4 vezes com uma pipeta de 1.000 μL) para colher e preparar HiPSCs para a diferenciação de células precursoras neurais.
- Centrifugar a suspensão celular a 129 xg durante 4 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de meio iPSC humano. Transfira a suspensão celular para uma placa de cultura de células de 5 cm revestida com gelatina a 0,1% durante 1 h a 37 ° C para eliminar MEFs e para maximizar o rendimento hiPSC. Transfira o meio (com células não aderentes) para outro prato revestido com gelatina de 5 cm.
- Transfira as células não aderentes para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta de transferência. Lavar suavemente os pratos com 3 mL de meio e adicioná-lo ao tubo de 15 mL.
- Centrifugue a suspensão celular a 129 xg por 4 min, aspirar o superNaturalmente e ressuspenda gentilmente a pelota em meio. Determine a contagem de células usando um contador de células automatizado. Placa 9.000 células / poço em uma placa de 96 poços de baixa aderência em V.
- Centrifugue a placa a 163 xg por 3 min. Incube a placa a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO 2 . Usando uma pipeta, mude 50% de média a cada dois dias, removendo metade do meio e substituindo-o por meio de diferenciação 1 (DM1, Figura 1 , Tabela de Materiais), quimicamente definido, durante 14 dias.
2. Indução do corpo embrionário livre de soro (SFEB) ( Figura 2 )
- Coloque inserções de cultura celular de 40 μm em placas de 6 poços e adicione 1 mL de meio DM1 pelo menos 1 h antes da adição de agregados.
- No dia 14, transfira os agregados com 20 μL de meio usando uma ponta de boca de 200 μL de largura para inserções de cultura celular de 40 μm e mude o meio para DM2.
7 , 17 , 18 .- Transfira 4-6 agregados para uma inserção de cultura celular e permita um espaço adequado entre os agregados. Remova o excesso de solução possível com uma ponta fina de pipeta ( por exemplo, dica de 200 μL).
NOTA: É aceitável perturbar brevemente o SFEB à medida que eles se moverão na inserção de cultura celular como a solução removida em torno dos SFEBs. - Manter as culturas em 1 mL de DM2 a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO 2 . Usando uma pipeta, mude 75%Médio todos os dias, removendo três quartos do meio e substituindo por três quartos de meio fresco. Por exemplo, remova 750 μL de meio e adicione 750 μL de meio fresco.
- Transfira 4-6 agregados para uma inserção de cultura celular e permita um espaço adequado entre os agregados. Remova o excesso de solução possível com uma ponta fina de pipeta ( por exemplo, dica de 200 μL).
- Após 14 dias de cultura, mude para o meio DM3 com 75% de mudança média a cada dois dias e por mais 16 dias.
- Para manter os SFEBs em inserções de cultura de células além de 30 dias, altere a média todos os dias durante 60, 90 e 120 dias.
NOTA: Os SFEBs crescerão para cerca de 1.000 μm de diâmetro e são tipicamente de 100-150 μm de espessura 1 .
3. Determinando a Composição do SFEB
- Destaque os SFEBs da inserção por meio de pipetagem suave usando uma ponta de pipeta de boca de 200 μL. Para transferir os SFEBs, use uma ponta de pipeta de boca larga para succionar suavemente os corpos na ponta da pipeta. Depois de carregar o SFEB na ponta da pipeta, transferir suavemente para placas de 12 poços e lavar com 300 μL de solução salina tamponada com fosfato(PBS) por poço.
NOTA: Os SFEBs serão suspensos em solução nas placas de 12 poços. Isto é importante para permitir a penetração total do fixador, a solução de bloqueio e os anticorpos. Se estiver usando vários SFEBs para coloração, podem ser adicionados até 10 SFEB por poço de uma placa de 12 poços. Isso irá economizar soluções e anticorpos. - Fixar SFEB com 300 μL por poço 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 30-45 min. Lave os SFEB fixos duas vezes com 300 μL de PBS, 3-5 min cada lavagem.
Cuidado: Usar equipamento de proteção pessoal adequado ao manusear paraformaldeído.
NOTA: Sonda para imunorreatividade para marcadores para determinar a maturidade, tipo de célula, etc. Para marcar os neurônios neste estudo, o frango-Tuj1 foi utilizado em 1: 500, para marcadores adicionais, ver Tabela 2 e referências 1 , 16 . - Permeabilize e bloqueie com 0,1% de Triton-X100 em PBS e 10% de soro de burro normal (solução de bloqueio, 300 μ; L por poço) durante 1 h à temperatura ambiente.
- Remova a solução de bloqueio e trate SFEBs com 300 μL de anticorpos primários em solução de bloqueio. Incubar a 4 ° C durante a noite. Lavar SFEBs três vezes (3-5 min por lavagem) em 300 μL de PBS contendo 0,1% de Triton-X.
- Preparar anticorpos secundários 1: 1000 em solução de bloqueio. Incubar SFEB durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários. Lavar SFEBs com 300 μL de PBS, 3 vezes por 3-5 min cada.
NOTA: Nesta fase, os SFEB podem ser preparados para imagens. - Para imagem, pipette SFEBs em um slide de vidro usando uma pipeta de diâmetro largo. Remova o excesso de solução em torno do SFEB usando sucção suave.
NOTA: Para condições de coloração semelhantes, vários SFEBs podem ser colocados no mesmo slide de vidro. - Adicione uma gota de meio de montagem nos SFEBs, coloque uma lamínula de vidro e pressione suavemente para garantir que não haja bolhas de ar. Permitir que o meio de montagem se endureça e proceda à imagem e quantificação (passo 3.8).
- Execute a quantificação celular tomando múltiplas regiões de interesse (ROI) em todo o SFEB e usando uma pilha z combinada com uma imagem de projeção máxima através de cada ROI em um microscópio confocal padrão conforme descrito nas referências 1 , 16 .
NOTA: SFEBs inteiros podem ser quantificados usando telhas baseadas em imagens (veja referências 1 , 16 para detalhes). Uma vez que os SFEBs são finos para aproximadamente 100 μm, há uma dispersão mínima de luz no tecido e, portanto, não há necessidade de microscopia de 2 fótons. Os usos anteriores deste protocolo com iPSCs derivados de fibroblastos produziram um mapa de destino SFEB que revelou estrutura complexa e diversa com subpopulações de interneurônios com identidades transcricionais que se assemelhavam ao CGE e ao passado do prosencéfalo anterior 1 , 16.
4. Gravação da atividade neuronal nos SFEBs usando MEAs
- Prepare placas de MEA de 12 poços de acordo com as instruções do fabricante.
- Lave as placas MEA 3 vezes durante 5 min com H 2 O estéril em condições assépticas para limpar. Lavar durante 5 min com 75% de etanol e depois com 100% de etanol para esterilizar a placa.
- Asse o prato invertido num forno por 4-5 h a 50 ° C para completar o processo de esterilização.
- Adicione 500 μL de solução de polietilenoimina a 0,2% (PEI) a cada poço e incuba 1 h à temperatura ambiente. Aspirar PEI e lavar os poços 4x com H 2 O destilado estéril. Ar seco no capô durante a noite.
- Prepare uma solução de laminina de 20 μL / mL em meio L15 e adicione 10 μL de laminina ao centro de cada poço.
NOTA: Não cubra os eletrodos de referência e de aterramento circundantes. - Adicione dH 2 O esterilizado aos reservatórios circundantes para evitar a evaporação média ou laminina.Incubar a placa durante 1 h a 37 ° C.
- Adicione SFEBs (veja as seções 1 e 2) às placas MEA revestidas com laminina, suavizando-as suavemente até uma ponta de pipeta de boca larga e transfira-os. Adicione 200 μL de meio DM2 a cada poço e incube durante a noite a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO 2 .
- Adicione mais 200 μl de meio após 24 h e permita que ele se recupere durante 30 min a 37 ° C, 95% de umidade, 5% de CO 2 antes de ler a placa.
- Coloque a placa MEA no leitor de placas (pré-aquecido a 37 ° C) para registrar a atividade neuronal. Registre a atividade por 10 minutos com o software de gravação MEA associado. Consulte a referência 19 para obter detalhes.
- Gerar dados brutos - fluxos contínuos e tramas raster da atividade neuronal usando o software de análise estatística 19 .
NOTA: as gravações MEA são tomadas 7 dias após a colocação do SFEB. Para este estudo, as gravações foram realizadas por 10 min para detectar a atividade de explosão da rede, conRastro contínuo e tramas rásticas. Os SFEB podem ser mantidos a longo prazo em placas de MEA e podem ser gravados por longos períodos de tempo usando condições ambientalmente controladas ( Figura 6 ).
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Representative Results
Os SFEB crescidos usando nossa técnica produziram tecido com características morfológicas que se assemelham a uma zona subventricular cortical desenvolvida inicialmente repleta de extensos neurônios Tuj1-positivos, bem como progenitores neurais ( Figura 3A ). Numerosas rosetas corticais em desenvolvimento foram observadas nas camadas externas e camadas internas do SFEB ( Figura 3B ). A borda externa do SFEB se assemelha a uma placa cortical em desenvolvimento contendo neurônios pós-mitóticos. Isto é suportado pela expressão de Brn2, um marcador para progenitores neurais nas camadas cortical externas mais ventricalizadas. As células positivas de Reelin que podem ser células Cajal-Retzius ou seus progenitores, que são expressas nas camadas externas do córtex em desenvolvimento também são observadas em SFEBs ( Figura 3C ). SFEBs crescidos usando este protocolo expressam marcadores consistentes com um gaiola caudal mista (CGE) e medialOrigem de eminência (MGE). As células que expressam o marcador de CGE Couptf2 e outras células que expressam o marcador MGE Nkx2.1 podem ser observadas nas culturas ( Figura 3D ). Isso pode ser em parte devido ao uso de DKK-1 no protocolo, o que mostrou melhorar os destinos médios 20 .
Os SFEB feitos com este protocolo produz tanto interneurônios de calretinina e positivos à calbindina ( Figura 4A ) como também os neurônios excitatórios VGLUT positivos e os progenitores neurais glutamatérgicos Tbr1 positivos ( Figura 4B ). Em média, observamos que 61% das células totais em SFEBs são VGLUT positivas e 43% são Tbr1-positivas ( Figura 4C ). Isso é consistente com outros relatórios usando protocolos similares 21 . Além disso, os SFEB podem ser sujeitos a ensaios fisiológicos, como imagens de cálcio em células vivas usandoMarcadores como o Fluo-4, para observar a função da rede neural em um ambiente mais fisiologicamente relevante ( Figura 5 ). Os SFEB podem ser submetidos a gravações MEA por longos períodos de tempo e mostrar o desenvolvimento do estouro cortical do nível da rede ( Figura 6 ).
Figura 1: Esquema descrevendo os primeiros passos na preparação de SFEBs. Depois que os iPSCs foram colhidos usando uma dissociação enzimática, eles são plaqueados em placas de 96 poços e centrifugados a 163 xg durante 3 min para induzir agregação rápida. Após 14 dias, os agregados de células in vitro (DIV) podem ser transferidos a partir de placas de 96 poços através de pipetas de diâmetro largo para placas de 6 poços contendo inserção de cultura de células. Clique aqui para verEw uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Linha de tempo de Mudanças Médias e Fases durante o Crescimento e Expansão do SFEB. Depois que os SFEBs foram transferidos para inserções, eles seguem duas mudanças médias em 14 e 28 dias in vitro (DIV). Normalmente são colhidas para experiências no DIV 30, 60 e 90. As inserções superiores mostram diferentes fases nesse processo. Barras de escala = 1000 μm (à esquerda); 1000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (SFEB único). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Caracteres morfológicos geraisTics de SFEBs crescidos usando este protocolo. ( A ) Borda externa típica de um SFEB que expressa o marcador de progenitor nestin (verde), o marcador neural pós-mitótico Tuj1 (vermelho) e a mancha nuclear (azul). ( B ) Os SFEBs apresentam rosetas corticais características nas camadas exteriores (imagem esquerda) e camadas internas (direita). Eles expressam marcadores neuronais progenitores e maduros. ( C ) Um bordo externo representativo de um SFEB que expressa a camada externa / marcador de placa cortical Brn2 (verde) e o marcador CGE de desenvolvimento Couptf2 (vermelho). ( D ) Os SFEB feitos com este protocolo representam estruturas neocorticais ventricais, como visto pela coloração Pax6 (vermelha) e marcadores expressos consistentes com algumas origens MGE, como Nxk2.1 (vermelho). Barra de escala = 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4: Imagens de maiores tipos de células neuronais em SFEBs. ( A ) Alguns neurônios em SFEBs expressam marcadores consistentes com interneurônios corticais, como calbindina (verde, imagem esquerda) e calretinina (verde, imagem certa). ( B ) Os SFEBs mostram neurônios glutamatérgicos positivos VGLUT-1 (imagem vermelha, esquerda) e progenitores glutamatérgicos expressando Tbr1 (vermelho, imagem direita). Barra de escala = 40 μm. ( C ) Rendimentos típicos de neurônios excitatórios que expressam VGLUT-1 ou Tbr1 (barra de erro = SEM). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 5: Gravações de cálcio em células vivas. </ Strong> (Imagem à esquerda) SFEB de bordo exterior representativo tratado com Fluo-4, um indicador de cálcio neuronal. As células são marcadas para a medição de transientes de cálcio espontâneos (caixas de cores variadas). (Imagem direita) Células selecionadas que demonstram transientes de cálcio espontâneos marcados por caixas vermelhas (traços superiores) ou caixas verdes (traços mais baixos). Barra de escala = 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 6: Gravações de matrizes multi-eletrodos de SFEBs. (Parte superior) Imagem representativa do SFEB anexada a uma placa MEA (Scale bar = 100 μm). (Médio e inferior) Os SFEB podem ser gravados em MEAs em longos períodos de tempo e mostrar maturação. (Meio e inferior; esquerda) Um mapa de explosão bem vasto de 3 SFEBs em 3 poços de 1Placa MEA de 2 poços, cores mais escuras representam maior atividade de espiga global que aumenta entre o dia 30 e o dia 90. (Insetos médio e inferior) O mapa de atividades cumulativas mostra um aumento na densidade de espiga e na área de espinhas dentro de redes corticais em SFEBs entre Dia 30 e dia 90. (Médio e inferior, à direita) Traços cruciais (superior) e parcelas de quadriculação inteira (inferior) mostram um aumento no número de espigas e o número de explosões ao longo do tempo; Indicativo de formação de rede mais forte em SFEBs. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
| Anticorpo | Diluição | Espécies |
| Nestin | 0.111111111 | Rato |
| Brn-2 | 0,388888889 | Coelho |
| VGLUT1 | 0.111111111 | Coelho |
| Pax6 | 0,25 | Coelho |
| Calretinina | 0.180555556 | Coelho |
| Calbindin | 0.319444444 | Coelho |
| CoupTFII | 0.180555556 | Rato |
| Nkx 2.1 | 0.180555556 | Coelho |
| Tuj1 | 0.388888889 | Frango |
| Reelin | 0.388888889 | Rato |
| Tbr1 | 0.180555556 | Frango |
| NFH | 0,25 | Rato |
Tabela 1: Anticorpos Usados neste Estudo.
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Discussion
O protocolo descrito aqui fornece as condições para diferenciar uma fonte hiPSC em uma estrutura 3-D que recapitula um estágio inicial de desenvolvimento do córtex frontal. Este procedimento produz estruturas que podem ser interrogadas para eletrofisiologia, ao mesmo tempo que são passíveis de microscopia. A morfologia final do SFEB se assemelha à das culturas de fatia de cérebro organotípica e permite uma imagem confocal detalhada de alta qualidade. Este protocolo pode gerar com sucesso SFEBs de ambos os hiPSCs de células fibroblastras e de sangue-sangue mononuclear. Os SFEB feitos a partir de sangue Hiperceptivos de células mononucleares de sangue periférico exibem características morfológicas semelhantes às criadas a partir de hiPSCs derivadas de fibroblastos.
Este processo, como outros esquemas tridimensionais, utiliza pistas extracelulares de moléculas pequenas para orientar as decisões do destino das células. Isso é combinado com as propriedades intrínsecas do contato célula a célula, que criam um ambiente mais realista para a redeFormação do trabalho e função neuronal. Outros relatórios mostraram que a combinação apropriada dos sinais extracelulares de moléculas pequenas é suficiente para tais decisões de destino celular, como o dopaminérgico 8 , 22 e os interneurônios corticais 8 , 16 , 23 . No entanto, os sistemas 3-D exibem um tempo de maturação acelerado em comparação com equivalentes 2-D 5 . Quando o tempo é adequado, as culturas 3-D mostraram maior maturidade. Tais qualidades fazem argumentos fortes para a utilidade das plataformas 3D como o SFEB. O benefício adicional de microscopia ao vivo e de alta qualidade, juntamente com a flexibilidade do material de origem, fazem argumentos convincentes para este protocolo.
Além disso, os SFEB feitos usando este protocolo compartilham uma série de semelhanças com outros estudos relatados 13 , 24 . Com relação à referência 24 , este protocolo e a validação fisiológica dos neurônios o antecipa. Por exemplo, os estudos relatados nas referências 13 , 24 , usam versões semelhantes de inibição dupla de SMAD para derivar neurônios corticais e obtiveram uma proporção similar de neurônios glutamatérgicos e progenitores (~ 50%). Adicionalmente, Mariani, J. et al. (Referência 13 ) relatam manchas semelhantes de Pax6 e Nestin como este protocolo em pontos de tempo de 25-30 dias. Qualitativamente, os padrões de coloração para Brn2, bem como a expressão de astrocitos positivos para GFAP são semelhantes aos reportados na referência 24 . No entanto, este protocolo tem uma série de vantagens sobre as duas metodologias de organoides comumente usadas. Primeiro, Mariani, J. et al. 13 relatam o desenvolvimento de interneurônios Dlx positivos no dia 50 e conFirmado apenas por métodos de imunocoloração. Usando este protocolo, os interneurônios Dlx positivos são produzidos no dia 30. Estes interneurônios foram confirmados como funcionais por eletrofisiologia de célula única e aplicação farmacológica de célula única de GABA 16 . Além disso, os autores de 13 afirmam conectividade funcional de neurônios, mas foi determinado apenas usando coloração. Os SFEB feitos usando este protocolo foram submetidos a estimulação de eletrodo único de rede e imagem de cálcio para mostrar que o desenvolvimento de redes corticais está conectado e funcional. Pasca, et al. 24 separe os agregados utilizando um criostato para obter gravações de estruturas semelhantes a organo. Os SFEB feitos usando este protocolo não precisam de seção e podem ser gravados diretamente nas inserções 1 . Os neurônios registrados de SFEBs não-seccionados demonstraram ter potenciais de ação e potenciais pós-sinápticos inibitórios após triagemG 1 , 16 .
Os SFEBs podem ser feitos usando fibroblastos e PBMC como material de partida. Também é possível usar outros tipos de tecido que resultam em HiPSCs (por exemplo, polpa dentária, prepúcio, urina) 25 , 26 , 27 , embora algumas das pequenas moléculas possam precisar ser alteradas para obter resultados semelhantes. Para este protocolo, o uso de DKK-1 é importante na direção do SFEB em direção a um destino ventriculado 28 . Esta ventralização é parcialmente responsável pela diferenciação de interneurônios com origens tipo CGE 16 . DKK-1 é uma molécula pequena cara e, portanto, altas concentrações de hedgehog sonic podem ser usadas para suplementar DKK-1 neste protocolo. No entanto, as concentrações para inibição de Wnt via DKK-1 devem ser determinadas empiricamente pelo usuário final. Além disso, XAV939, outro inibidor de WntR, pode ser usado para ajudar a direcionar a diferenciação para um destino ventriculado, embora o uso deste inibidor produza tecido que compartilhe identidades transcripcionais com o MGE 23 .
Ao desenvolver sistemas de cultura 3D HiPSC como os SFEB descritos neste protocolo, é importante ter em mente que essas estruturas produzem uma quantidade moderada de heterogeneidade de cultura para cultura. Isto é parcialmente devido à natureza estocástica da diferenciação neuronal de iPSCs e devido à iniciação do contato célula-célula no SFEB, resultando em auto-organização intrínseca espontânea 29 , 30 . Portanto, é importante interpretar a utilidade desta técnica no contexto da heterogeneidade. Formas de minimizar o impacto da heterogeneidade neste sistema incluem, criando um grande número de SFEBs para que eles representem variação natural no sistema, aderindo rigorosamente à concentração deReagentes e o número de células semeadas no início de cada produção. É fundamental começar com colônias BLSC limpas e aplicar uma trituração mínima durante o passo de dissociação enzimática durante a dissociação iPSC para aumentar a viabilidade celular. A viabilidade celular após a trituração é um fator importante na obtenção de SFEB consistentes e de alta qualidade. Como um passo alternativo de solução de problemas, a viabilidade pode ser verificada após a dissociação e antes dos passos de centrifugação usando azul de tripano, se necessário. A viabilidade e a diferenciação espontânea também podem ser afetadas se o ROCKi não for utilizado corretamente durante as primeiras etapas de dissociação e diferenciação. O uso de ROCKi e sua diminuição gradual durante os feeds de 50% nos primeiros 7-10 dias é crítico para SFEB consistentes e de alta qualidade.
Além disso, muitas vezes é útil como uma etapa de validação para verificar os resultados em SFEBs 3D com os observados nas mesmas linhas celulares criadas usando uma preparação monocamada. UnderstaComo os dois sistemas de comparação cruzada dentro de cada coorte experimental é extremamente útil na compreensão da complexidade de um determinado modelo de doença. Finalmente, os SFEBs podem ser usados para classificar e purificar populações de células usando a classificação de células ativadas fluorescentes para estudo posterior em um sistema de monocamada 2D mais homogêneo 16 .
No entanto, os SFEB criados usando este protocolo são úteis para o estudo de pequenos circuitos corticais em desenvolvimento. As aplicações futuras desta técnica envolvem multiplexação de gravações eletrofisiológicas com abordagens de alto conteúdo. De fato, as inserções da câmara celular são fabricadas para uso em formato de placa de 96 poços. Essas inserções podem ser usadas com o protocolo SFEB descrito aqui no lugar das inserções de 6 poços. Para mostrar a escalabilidade usando este método, os SFEBs precisarão ser criados usando múltiplas linhas e clones dentro de uma determinada coorte e precisarão ser selecionados em um conjunto de ensaios baseados em células robustas para procurar consistência.Culturas finas. Por exemplo, números neuronais, morfologia e desenvolvimento de camada podem ser testados usando um formato de 96 poços. Idealmente, os ensaios baseados em células devem ser combinados com um ensaio eletrofisiológico de alto conteúdo, como o MEA, que também é escalável para placas de 96 poços.
Esta plataforma SFEB tem a promessa de decifrar o papel do desenvolvimento inicial da rede cortical em distúrbios neurológicos, particularmente nos casos em que existe uma possível interação entre a genética e o desenvolvimento neural precoce. Demonstrou-se que pode ser tratado como uma cultura de fatia como mostrado em estudos de ratos e ratos. Estudos futuros úteis usando este sistema devem centrar-se na anatomia e fisiologia comparativa do desenvolvimento entre as estruturas in vivo do mouse e o SFEB. Estes dados comparativos seriam muito poderosos no desenvolvimento de um sistema verdadeiramente translacional para descoberta de medicamentos e pesquisa básica.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Elizabeth Benevides pela revisão do artigo. Agradecemos aos Drs. John Hussman e Gene Blatt para suas discussões e comentários úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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