Summary
Qui viene riportato un protocollo per sviluppare un sistema tridimensionale (3-D) da cellule staminali pluripotenziali umane (hiPSCs) chiamate il corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D può essere utilizzato come una cultura di fetta organotipica per modellare lo sviluppo corticale umano e per l'interrogatorio fisiologico dei circuiti neurali in via di sviluppo.
Abstract
Sebbene siano stati sviluppati alcuni modelli di malattia in vitro usando hiPSCs, una limitazione è che questi sistemi bidimensionali (2-D) non possono rappresentare la complessità cytoarchitectural e funzionale sottostante degli individui affetti che trasportano varianti di malattia sospette. I modelli 2D convenzionali rimangono rappresentazioni incomplete di strutture in vivo e non catturano adeguatamente la complessità del cervello. Pertanto, esiste un'esigenza emergente per altri modelli basati su 3-D hiPSC che possono meglio ricapitolare le interazioni cellulari e le funzioni viste in un sistema in vivo .
Qui si segnalano un protocollo per sviluppare un sistema 3-D da hiPSC indifferenziati basato sul corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D riflette aspetti di un neocortex ventralizzato in sviluppo e consente di studiare funzioni integrali a cellule neurali viventi e tessuti intatti come migrazione, connettività, comunicazione e matriceURATA. In particolare, dimostriamo che i SFEB che utilizzano il nostro protocollo possono essere interrogati utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti e basati su cellule ad alto contenuto, come ad esempio la formazione di calcio e le registrazioni multi-elettrodi (MEA) senza cryosectioning. Nel caso delle registrazioni MEA, dimostriamo che gli SFEB aumentano l'attività di picco e la rottura a livello di rete durante la coltura a lungo termine. Questo protocollo SFEB fornisce un sistema robusto e scalabile per lo studio dello sviluppo della formazione di reti in un modello 3-D che cattura gli aspetti dello sviluppo corticale precoce.
Introduction
Abbiamo precedentemente segnalato un sistema di modelli a 3, generato da cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti derivate dal paziente (hiPSCs) che ricapitulano alcuni aspetti dello sviluppo della rete corticale precoce 1 . Questo modello 3-D, un corpo embrionale libero senza sforzo (SFEB), migliora sui precedenti modelli di hiPSC semplici aggregazione 2 , 3 . Un crescente numero di lavori sta rivelando che le strutture a 3-D come le nostre SFEB, gli aspetti approssimativi dello sviluppo neurale comunemente osservati in vivo e in un momento precedente rispetto a quelli osservati nei modelli 2D (2D) / monolayer hiPSC 4 , 5 . Gli studi iniziali sono stati focalizzati sulla complessità autoorganizzativa degli organi 3-D senza dimostrare la loro complessità fisiologica 2 .
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato su hiPSC indifferenziati derivati da fibroblasti e Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs). Queste cellule sono mantenute su alimentatori embrionali (MEF) erogati da γ-irradiati. Queste colonie hiPSC vengono pulite manualmente da cellule spontaneamente differenziate, raccolte enzimaticamente e risospese in mezzo contenente inibitore Rho-Kinasi Y-27632 (ROCKi). I hiPSC indifferenziati vengono sottoposti a dissociazione e centrifugazione prima di essere trasferiti in piastre a basso tenore a basso tenore a 96 pozzetti. Dopo la placcatura, l'induzione neurale viene avviata usando la doppia inibizione SMAD (SB431542 e LDN193189 insieme a dickkopf 1 (DKK-1)) per guidare un linfoidale neurone-fate anteriore-frontale 6 . Dopo 14 giorni, i SFEB vengono trasferiti a inserti di coltura cellulare in un piatto a 6 pozzetti. Una volta trasferiti, i SFEB rotondi iniziano a diffondersi e sottili, pur mantenendo le connessioni di rete locali come spesso si osserva nelle preparazioni di coltura organotipica di fetta di ippocampo usando inserti simili della coltura cellulare 1 ,Ss = "xref"> 7.
L'utilizzo di una piattaforma 3-D basata su SFEB in questo formato è suscettibile di un'efficiente produzione di reti corticali che possono essere interrogate utilizzando saggi fisiologici basati su cellule come l'imaging di calcio o analisi elettrofisiologiche come registrazioni singole o array multi-elettrodo (MEA ) 1 . Sebbene i sistemi 3-D abbiano i marcatori dello sviluppo corticale precoce, altri studi hanno dimostrato che questi corpi a 3-D potrebbero richiedere tempi di incubazione più lunghi per consentire il ritmo intrinsecamente più lento dello sviluppo del tessuto umano 8 . Questo protocollo SFEB genera con successo SFEB a 3-D da hiPSC indifferenziati che cattura gli aspetti dello sviluppo precoce della corteccia.
Il potenziale di SFEB per modellare le aberrazioni di rete nei disturbi neurologici è una forza di questo sistema. Gli hiPSC derivati dal tessuto del paziente possono essere coltivati in cellule del sistema nervoso soggette a culoAys correlati alla biologia cellulare e all'espressione genica concomitante. IPSC umani vengono utilizzati per accertare il profilo genetico di grandi gruppi di individui con disturbi neurologici variabili con etiologie complesse come il disturbo dello spettro autistico (ASD), la schizofrenia 9 , la sindrome di Rett 10 e la malattia di Alzheimer 11 , 12 . Fino a poco tempo fa i modelli iPSC sono stati tipicamente preparati monostrato che, pur avendo esperienza nella valutazione delle interazioni molecolari, erano inadeguate nel decifrare le complesse interazioni cellulari viste in vivo . I modelli animali sono stati il sostituto predefinito per ricreare la piattaforma di organo intero. Questi modelli animali sono afflitti dalla scarsa traduzione dei risultati e hanno limitato capacità di replicare profili genetici umani identificati da grandi studi di screening genetico. Pertanto, lo sviluppo di sistemi 3-D da iPSC aggiunge un necessario livello di complessità nell'uomoModellazione delle malattie 13 , 14 . Il passo successivo per le piattaforme 3D hiPSC è quello di soddisfare i requisiti di grande scala di screening ad alto rendimento utilizzando i test a base di celle 15 .
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Protocol
1. Generazione di cellule progenitrici neurali
- Mantenere hiPSC derivati da fibroblasti e PBMC in piastre a 6 pozzetti su uno strato di cellule embrionali (MEF) di tipo γ-irradiato nel mezzo umano iPSC integrato con piccole molecole (vedi tabella dei materiali).
NOTA: la manutenzione giornaliera è una versione modificata delle procedure precedentemente riportate 1 , 16 .- Piastra 6 x 10 5 MEF su ciascun pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 6 pozzetti in 300 μL / media raccomandata (seguendo il protocollo del produttore).
- Dopo 48 h, sostituire il mezzo di MEF con 300 μL / pozzetto hiPSC medium per 1 h prima di aggiungere hiPSCs.
- Rapidamente scongelare hiPSCs in un bagno d'acqua di 37 ° C e aggiungere lentamente 1 ml di mezzo hiPSC in goccia. Trasferire i hiPSC e il mezzo a un tubo conico da 15 ml. Aggiungere mezzo per portare il volume totale a 5 ml. Centrifugare per 4 min a 129 xg, aspirare la supernataNt, riposizionare delicatamente il pellet in 1 mL di mezzo hiPSC con inibitore ROCK a concentrazione di 1: 1000.
- Piattare la sospensione cellulare (tipicamente seminata a 300.000 cellule / pozzetto) sullo strato di cellule MEF e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 , 95% di umidità.
- Monitorare la cultura iPSC utilizzando attentamente un microscopio leggero. Dopo 48 ore, togliere le colture che presentano spigoli irregolari, diventano cisti-simili o appaiono marrone giallastro sotto il microscopio per minimizzare la differenziazione spontanea.
NOTA: Dopo 7 - 10 giorni, le colonie hiPSC dovrebbero formarsi. Le colonie dovrebbero essere rotonde, con frontiere chiaramente definite e densità cellulari uniformi e prive di cellule non uniformi imballate. - Selezionare manualmente le colonie hiPSC rotonde per liberare la cultura delle cellule spontaneamente differenziate. Espandere le colonie posizionandole su strati MEF freschi. Espandere 1: 3 ogni 7 giorni quando le culture vicino confluenza e congelare 1 , 16 .
- Dopo l'espansione e la congelazione delle celle (per il backup), coltivare le colonie hiPSC sulle piastre fino a raggiungere la confluenza del 50-75%.
- Dopo 7 giorni di placcatura, utilizzare un trattamento enzimatico lieve (5-10 min con 300 μL di soluzione enzimatica) e una triturazione delicata (2-4 volte con una pipetta da 1000 μL) per raccogliere e preparare hiPSC per la differenziazione delle cellule dei precursori neurali.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 129 xg per 4 min, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di iPSC umano. Trasferire la sospensione cellulare in un gel da 0,1% di gelato rivestito da 5 cm per 1 h a 37 ° C per eliminare i MEF e massimizzare la resa hiPSC. Trasferire il mezzo (con cellule non aderenti) ad un altro piatto rivestito con gelatina da 5 cm.
- Trasferire le cellule non aderenti in un tubo centrifugo da 15 ml utilizzando una pipetta di trasferimento. Risciacquare delicatamente le piastre con 3 ml di media e aggiungerlo al tubo da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 129 xg per 4 min, aspirare il superE riposizionare delicatamente il pellet in mezzo. Determinare il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di celle automatiche. Piastra 9.000 celle / pozzetto in una piastra di fondo a basso tenore a 96 pozzetti.
- Centrifugare la piastra a 163 xg per 3 min. Incubare la piastra a 37 ° C, umidità del 95% e 5% CO 2 . Utilizzando una pipetta, cambiare il 50% di media ogni altro giorno rimuovendo la metà del mezzo e sostituendolo con un nuovo mezzo di differenziazione chimico definito 1 (DM1; Figura 1 ; Tabella dei Materiali) per 14 giorni.
2. Induzione del corpo embrionale senza emorragie (SFEB) ( Figura 2 )
- Inserire gli inserti di coltura di cellule da 40 μm in lastre a 6 pozzetti e aggiungere 1 mL di mezzo DM1 almeno 1 h prima dell'aggiunta di aggregati.
- Il giorno 14, trasferire gli aggregati con 20 μL di mezzo utilizzando una punta di bocca larga da 200 μL su inserti di coltura di cellule da 40 μm e cambiare il mezzo a DM2.
7 , 17 , 18 .- Trasferisci 4-6 aggregati ad un inserto di coltura cellulare e permette spazio sufficiente tra gli aggregati. Rimuovere la soluzione più eccessiva possibile utilizzando una punta fine pipetta ( ad es. 200 μL di punta).
NOTA: È accettabile disturbare brevemente l'SFEB mentre si muoveranno sull'inserto della coltura cellulare come soluzione in rimosso da circa i SFEB. - Mantenere le colture in 1 ml di DM2 a 37 ° C, umidità del 95% e 5% di CO 2 . Utilizzando una pipetta, cambiate il 75%Media ogni due giorni rimuovendo tre quarti del mezzo e sostituendo con tre quarti freschi. Ad esempio, rimuovere 750 μl di mezzo e aggiungere 750 μl di terreno fresco.
- Trasferisci 4-6 aggregati ad un inserto di coltura cellulare e permette spazio sufficiente tra gli aggregati. Rimuovere la soluzione più eccessiva possibile utilizzando una punta fine pipetta ( ad es. 200 μL di punta).
- Dopo 14 giorni di coltura, passare al mezzo DM3 con il 75% di cambio medio ogni altro giorno e per altri 16 giorni.
- Per mantenere gli SFEB sugli inserti della coltura cellulare oltre 30 giorni, modificare il mezzo ogni altro giorno per 60, 90 e 120 giorni.
NOTA: Le SFEB cresceranno a circa 1.000 μm di diametro e sono tipicamente 100-150 μm di spessore 1 .
3. Determinazione della composizione SFEB
- Staccare le SFEB dall'inserto facendo pipettare delicatamente il mezzo utilizzando una punta pipetta a bocca larga da 200 μL. Per trasferire i SFEB, utilizzare una punta di pipetta largo per aspirazione delicatamente ai corpi nella punta del pipetta. Dopo aver caricato SFEB nella punta del pipetta, trasferire delicatamente su piatti da 12 pozzetti e lavare con 300 μL salina fosfata tamponata(PBS) per pozzetto.
NOTA: SFEBs saranno sospesi in soluzione nelle piastre a 12 pozzetti. Questo è importante per consentire la penetrazione completa del fissativo, della soluzione di blocco e degli anticorpi. Se si utilizzano più SFEB per la colorazione, fino a 10 SFEB possono essere aggiunti per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Ciò conserverà soluzioni e anticorpi. - Fissare SFEB con 300 μL per pozzetto 4% di paraformaldeide a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Lavare SFEB fisso due volte con 300 μL di PBS, 3-5 minuti ogni lavaggio.
Attenzione: Indossare dispositivi di protezione appropriati per la manipolazione della paraformaldeide.
NOTA: Sonda per l'immunoreattività ai marcatori per determinare la maturità, il tipo di cellule ecc. Per la marcatura dei neuroni in questo studio il pollo-Tuj1 è stato utilizzato a 1: 500, per marcatori aggiuntivi vedere la Tabella 2 e le referenze 1 , 16 . - Permeabilizzare e bloccare con 0,1% di Triton-X100 in PBS e 10% di siero normale di asina (soluzione di blocco; 300 μ; L per pozzetto) per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di blocco e trattare SFEB con 300 μL di anticorpi primari nella soluzione di blocco. Incubare a 4 ° C per una notte. Lavare tre volte SFEB (3-5 minuti per lavaggio) in 300 μL di PBS contenente 0,1% di Triton-X.
- Preparare gli anticorpi secondari 1: 1000 nella soluzione di blocco. Incubare SFEB per 1 h a temperatura ambiente con anticorpi secondari. Lavare SFEB con 300 μl PBS, 3 volte per 3-5 minuti ciascuno.
NOTA: in questa fase i SFEB possono essere preparati per l'imaging. - Per l'immagine, pipettare SFEB su una lastra di vetro usando una pipetta largo-bore. Rimuovere la soluzione in eccesso attorno all'SFEB usando una aspirazione dolce.
NOTA: per condizioni simili di colorazione, possono essere posizionati più SFEB sulla stessa vetrata. - Aggiungere una goccia di supporto di montaggio sugli SFEB, posizionare una copertura in vetro e premere delicatamente per assicurare che non ci siano bolle d'aria. Lasciare che il supporto di montaggio si indurisca e proceda all'immagine e alla quantificazione (passo 3.8).
- Eseguire la quantificazione delle cellule prendendo più regioni di interesse (ROI) attraverso il SFEB e utilizzando una z-stack combinata con un'immagine di proiezione massima per ogni ROI su un microscopio confocale standard come descritto nei riferimenti 1 , 16 .
NOTA: SFEB interi possono essere quantificati utilizzando piastrelle a base di immagini (vedere i riferimenti 1 , 16 per i dettagli). Poiché i SFEB sono sottili a circa 100 μm, c'è una minima dispersione di luce nel tessuto e quindi non c'è bisogno di microscopia a 2 fotoni. Gli usi precedenti di questo protocollo con iPSC derivanti da fibroblasti hanno prodotto una mappa del destino SFEB che ha rivelato una struttura complessa e diversificata con sottopopolazioni di interneuroni con identità trascrizionali che somigliavano a CGE e ai predatori anteriori 1 , 16.
4. Registrazione dell'attività neuronale in SFEB utilizzando MEAs
- Preparare le piastre MEA a 12 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.
- Lavare le piastre MEA 3 volte per 5 min con H 2 O sterile in condizioni asettiche da pulire. Lavare per 5 min con etanolo al 75% e poi con 100% etanolo per sterilizzare la piastra.
- Cuocere la piastra invertita in forno per 4-5 h a 50 ° C per completare il processo di sterilizzazione.
- Aggiungere a ciascun pozzetto 500 μL di soluzione di polietilenimina (PEI) di 0,2% e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Aspirare PEI e lavare i pozzetti 4x con H 2 O distillato sterile. Asciugare l'aria nel cappuccio durante la notte.
- Preparare una soluzione di laminina da 20 μL / mL in mezzo L15 e aggiungere 10 μL di laminina al centro di ogni pozzetto.
NOTA: Non rivestire gli elettrodi di riferimento e di messa a terra circostanti. - Aggiungere dH 2 O sterile ai serbatoi circostanti per evitare l'evaporazione medio o laminina.Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C.
- Aggiungere le SFEB (vedere paragrafi 1 e 2) alle piastre MEA rivestite con laminina, facendole delicatamente immergetele in una punta della pipetta a larga bocca e trasferirle. Aggiungere a ciascun pozzetto 200 μL di media DM2 e incubare per una notte a 37 ° C, umidità del 95% e 5% CO 2 .
- Aggiungere un ulteriore 200 μl di mezzo dopo 24 h e lasciarlo recuperare per 30 minuti a 37 ° C, umidità del 95%, 5% CO 2 prima di leggere la piastra.
- Posizionare la piastra MEA nel lettore piastra (preriscaldata a 37 ° C) per registrare l'attività neuronale. Attività di registrazione per 10 minuti con il software di registrazione MEA associato. Vedere il riferimento 19 per i dettagli.
- Generare flussi continui e dati ristretti di dati di attività neuronale utilizzando il software di analisi statistica 19 .
NOTA: Le registrazioni MEA sono prese 7 giorni dopo la placcatura SFEB. Per questo studio, le registrazioni sono state prese per 10 minuti per rilevare l'attività di rottura della rete, conTracce tinuose e trame raster. Le SFEB possono essere mantenute a lungo termine sulle piastre MEA e possono essere registrate per lunghi periodi di tempo con condizioni ambientali controllate ( Figura 6 ).
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Representative Results
Le SFEB coltivate usando la nostra tecnica hanno prodotto il tessuto con caratteristiche morfologiche che assomigliano a una zona subventricolare corticale presto sviluppata con lunghi neuroni Tuj1 positivi e progenitori neurali ( Figura 3A ). Numerose rosette corticali sviluppate sono state osservate negli strati esterni e negli strati interni del SFEB ( Figura 3B ). Il bordo esterno del SFEB assomiglia a una piastra corticale in espansione contenente neuroni postmitotici. Questo è supportato dall'espressione di Brn2, un marcatore per i progenitori neurali negli strati corticali più ventralizzati esterni. Le cellule positive Reelin che possono essere le cellule Cajal-Retzius oi loro progenitori, che sono espresse negli strati esterni della corteccia in sviluppo, sono osservati anche negli SFEB ( Figura 3C ). SFEB coltivate utilizzando questo protocollo esprimono marcatori coerenti con una miscela caudale (CGE) e un mediale ganglioNic eminence (MGE). Le cellule che esprimono il marker CGE Couptf2 e altre cellule che esprimono marcatore MGE Nkx2.1 possono essere osservate nelle culture ( Figura 3D ). Ciò può essere dovuto in parte all'uso di DKK-1 nel protocollo, che è stato dimostrato di migliorare i destini mediali 20 .
I SFEB ottenuti utilizzando questo protocollo producono sia interneuroni calretinici e calbindin positivi ( Figura 4A ), sia i neuroni eccitatori positivi VGLUT e progenitori neuronici glutamatergici Tbr1-positivi ( Figura 4B ). In media, abbiamo osservato che il 61% delle cellule totali in SFEB è VGLUT positivo e il 43% è Tbr1-positivo ( Figura 4C ). Ciò è coerente con altri rapporti che utilizzano protocolli analoghi 21 . Inoltre, SFEBs possono essere sottoposti a saggi fisiologici come ad esempio l'utilizzo di immagini a calcio a cellule viveMarcatori come Fluo-4, per osservare la funzione della rete neurale in un ambiente più fisiologicamente rilevante ( Figura 5 ). Gli SFEB possono essere sottoposti a registrazioni MEA per lunghi periodi di tempo e mostrano lo sviluppo di scoppio corticale a livello di rete ( Figura 6 ).
Figura 1: Schema che descrive le fasi iniziali nel preparare SFEB. Dopo che iPSCs sono state raccolte usando una dissociazione enzimatica, vengono placcate in piastre a 96 pozzetti e centrifugate a 163 xg per 3 minuti per indurre una rapida aggregazione. Dopo 14 giorni di in vitro (DIV) gli aggregati cellulari possono essere trasferiti da piatti da 96 pozzetti tramite pipette a largo bobine su piastre a 6 pozzetti con inserto per coltura di cellule. Fare clic qui per vedere viÈ una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Linea temporale delle variazioni e delle fasi medie durante la crescita e l'espansione di SFEB. Dopo che gli SFEB sono stati trasferiti agli inserti, essi subiscono due cambi di media a 14 e 28 giorni in vitro (DIV). Sono tipicamente raccolti per esperimenti a DIV 30, 60 e 90. Le insetti superiori mostrano diverse fasi in questo processo. Barre di scala = 1000 μm (lontana sinistra); 1.000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (singolo SFEB). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratteri generali morfologiciTICS di SFEB Grown con questo Protocollo. ( A ) Il bordo esterno tipico di un SFEB che esprime il marker progenitor nestin (verde), il marcatore neuron post-mitotico Tuj1 (rosso) e la macchia nucleare (blu). ( B ) SFEB mostrano caratteristiche rosette corticali in entrambi gli strati esterni (immagine sinistra) e strati interni (a destra). Esprimono entrambi i marcatori neuronali progenitrici e maturi. ( C ) Un bordo esterno rappresentativo di un SFEB che esprime il segnalatore Brn2 (verde) dello strato esterno / corticale e il marker CGE di sviluppo Couptf2 (rosso). ( D ) Le SFEB fatte usando questo protocollo rappresentano strutture neocorticali ventralizzate, come osservate dai coloranti Pax6 (rossi) e marcatori espressi coerenti con alcune origini MGE come Nxk2.1 (rosso). Barra di scala = 40 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini di tipi di cellule neuronali maggiori in SFEB. ( A ) Alcuni neuroni in SFEB esprimono marcatori coerenti con interneuridi corticali come calbindina (verde, immagine sinistra) e calretinina (verde, immagine destra). ( B ) SFEB mostrano i neuroni glutamatergici positivi VGLUT-1 (immagine rossa, sinistra) e progenitori glutamatergici che esprimono Tbr1 (immagine rossa e destra). Barra di scala = 40 μm. ( C ) rese tipiche di neuroni eccitatori che esprimono sia VGLUT-1 che Tbr1 (bar di errore = SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Registrazioni di calcio a cellule staminali. </ Strong> (Immagine a sinistra) SFEB bordo esterno rappresentativo trattato con Fluo-4, indicatore di calcio neuronale. Le cellule sono marcate per la misura di transitori di calcio spontanei (scatole a colori assortiti). (Immagine a destra) Celle selezionate che dimostrano transitori di calcio spontanei contrassegnati da scatole rosse (tracce superiori) o scatole verdi (tracce inferiori). Barra di scala = 40 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Registrazioni di array multi-elettrodi di SFEB. (Top) Immagine rappresentativa di SFEB attaccata ad una piastra MEA (barra di scala = 100 μm). (Medio e Basso) SFEBs possono essere registrati su MEA per lunghi periodi di tempo e mostrano maturazione. (Medio e fondo, a sinistra) Una mappa di 3 ampie aree SFEB placcate su 3 pozzi di un 1La piastra MEA a 2 pozzetti, i colori più scuri rappresentano un'attività di spike complessiva più elevata che aumenta tra il giorno 30 e il giorno 90. (Medio e basso; insetti) La mappa di attività cumulativa mostra un aumento della densità di picco e l'area di picchi all'interno delle reti corticali in SFEB tra Il giorno 30 e il giorno 90. (Medio e basso, a destra) Le tracce grezze (superiori) e le trame rassicuranti intere (in basso) mostrano un aumento del numero di picchi e il numero di esplosioni nel tempo; Indicativo di una formazione di rete più forte in SFEB. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Anticorpo | Diluizione | Specie |
| Nestin | ,111,111111 millions | Topo |
| Brn-2 | 0,388888.889 | coniglio |
| VGLUT1 | ,111,111111 millions | coniglio |
| Pax6 | 0.25 | coniglio |
| Calretinin | ,180,555556 millions | coniglio |
| calbindin | ,319,444444 millions | coniglio |
| CoupTFII | ,180,555556 millions | Topo |
| Nkx 2.1 | ,180,555556 millions | coniglio |
| TUJ1 | ,388,888889 millions | pollo |
| Avvolgere | ,388,888889 millions | Topo |
| Tbr1 | ,180,555556 millions | pollo |
| NFH | 0.25 | Topo |
Tabella 1: Anticorpi utilizzati in questo studio.
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Discussion
Il protocollo descritto qui fornisce le condizioni per differenziare una sorgente di hiPSC in una struttura a 3-D che ricapitola una fase iniziale dello sviluppo della corteccia frontale. Questa procedura consente di ottenere strutture che possono essere interrogate per l'elettrofisiologia pur essendo inoltre idonee alla microscopia. La morfologia finale del SFEB è simile a quella delle culture organiche di fetta di cervello e consente un'immagine confocale dettagliata di alta qualità. Questo protocollo può generare con successo SFEB da hiPSC derivate da cellule mononucleate di fibroblasti e di periferiche. Le SFEB di hiPSC derivate da cellule mononucleate del sangue periferico presentano caratteristiche morfologiche simili a quelle create da hiPSC derivate da fibroblasti.
Questo processo, come altri schemi 3D, utilizza piccole molecole di segnali extracellulari per guidare le decisioni del destino cellulare. Questo è combinato con le proprietà intrinseche del contatto cellulare a cellule, che creano un ambiente più realistico per la reteFormazione del lavoro e funzione neuronale. Altre relazioni hanno dimostrato che la combinazione appropriata dei segnali extracellulari di piccole molecole è sufficiente per le decisioni di tali cellule come il midbrain dopaminergico 8 , 22 e gli interneuroni corticali 8 , 16 , 23 . Tuttavia, i sistemi 3-D hanno un tempo di maturazione accelerato rispetto agli equivalenti 2-D 5 . Quando date un tempo adeguato, le colture 3-D hanno mostrato una maggiore maturità. Tali qualità fanno degli argomenti forti per l'utilità delle piattaforme 3-D come l'SFEB. Il vantaggio aggiunto di microscopia dal vivo e di alta qualità, insieme alla flessibilità del materiale di origine, fanno argomenti imponenti per questo protocollo.
Inoltre, gli SFEB effettuati utilizzando questo protocollo condividono una serie di somiglianze con altri studi riportati 13 , 24 . Con riferimento al riferimento 24 , questo protocollo e la convalida fisiologica dei neuroni lo predispongono. Ad esempio, gli studi riportati nei riferimenti 13 , 24 , utilizzano versioni analoghe di inibizione doppia SMAD per derivare i neuroni corticali e hanno ottenuto una proporzione simile di neuroni glutamatergici e progenitori (~ 50%). Inoltre, Mariani, J. et al. (Riferimento 13 ) riportano simile colorazione Pax6 e Nestin come questo protocollo in un tempo di 25-30 giorni. Qualitativamente, i modelli di colorazione per Brn2 e l'espressione di astrociti positivi GFAP sono simili a quelli riportati nel riferimento 24 . Tuttavia, questo protocollo ha un certo numero di vantaggi rispetto alle due metodologie organoide comunemente usate. In primo luogo, Mariani, J. et al. 13 riportano lo sviluppo di interneuroni positivi Dlx al giorno 50 e conConsolidata solo con metodi di immunostaining. Utilizzando questo protocollo, gli interneuroni positivi di Dlx sono prodotti al giorno 30. Questi interneuroni sono stati confermati come funzionali mediante l'elettrofisiologia delle singole cellule e l'applicazione farmacologica singola di GABA 16 . Inoltre, gli autori di 13 affermano la connettività funzionale dei neuroni, ma è stata determinata solo usando la colorazione. Gli SFEB realizzati utilizzando questo protocollo sono stati sottoposti a stimolazione di singoli elettrodi di rete e immagini di calcio per dimostrare che le reti corticali in sviluppo sono collegate e funzionali. Pasca, et al. 24 le aggregazioni usando un criostato per ottenere registrazioni dalle strutture simili a organoide. I SFEB effettuati utilizzando questo protocollo non hanno bisogno di taglio e possono essere registrati direttamente negli inserti 1 . I neuroni registrati da SFEB non-sezionati hanno dimostrato di avere potenziali d'azione e potenziali post-sinaptici inibitori dopo il sortingG 1 , 16 .
SFEB può essere ottenuto utilizzando sia fibroblasti che PBMC come materiale di partenza. È anche possibile utilizzare altri tipi di tessuto che producono hiPSCs (es. Pasta dentale, prepuzio, urina) 25 , 26 , 27 , anche se alcune delle piccole molecole potrebbero essere necessarie per essere modificate per ottenere risultati simili. Per questo protocollo, l'uso di DKK-1 è importante per guidare l'SFEB verso un destino ventralizzato 28 . Questa ventralizzazione è parzialmente responsabile della differenziazione degli interneuroni con origini CGE 16 . DKK-1 è una piccola molecola costosa e quindi elevate concentrazioni di ricci soniche possono essere utilizzate per integrare DKK-1 in questo protocollo. Tuttavia, le concentrazioni per l'inibizione Wnt tramite DKK-1 devono essere determinate empiricamente dall'utente finale. Inoltre, XAV939, un altro Wnt inibizioneR, può essere usato per aiutare a differenziare l'unità verso un destino ventralizzato, anche se l'uso di questo inibitore produrrà il tessuto che condivide identità trascrizionali con il MGE 23 .
Nello sviluppo di sistemi di coltura 3D di hiPSC come gli SFEB descritti in questo protocollo, è importante tenere presente che queste strutture producono una moderata quantità di eterogeneità dalla cultura alla cultura. Ciò è parzialmente dovuto alla natura stocastica della differenziazione neuronale da iPSC e a causa dell'iniziazione dei contatti a cellule-cellule nel SFEB con conseguente autocontrollo spontaneo intrinseco 29 , 30 . Pertanto, è importante interpretare l'utilità di questa tecnica nel contesto dell'eterogeneità. I modi per ridurre al minimo l'impatto dell'eterogeneità in questo sistema includono, creando un gran numero di SFEB in modo da rappresentare una variazione naturale nel sistema, aderendo strettamente alla concentrazione diReagenti e il numero di cellule seminate all'inizio di ogni ciclo produttivo. È fondamentale iniziare con colonie iPSC pulite e applicare una triturazione minima durante la fase di dissociazione enzimatica durante la dissociazione iPSC per aumentare la vitalità cellulare. La vitalità delle cellule dopo la triturazione è un fattore importante per ottenere SFEB di alta qualità e coerenti. Come alternativa alla risoluzione dei problemi, la vitalità può essere verificata dopo la dissociazione e, prima della fase di centrifugazione, utilizzando il blu di trypan, se necessario. Anche la stabilità e la differenziazione spontanea possono essere influenzati se il ROCKi non viene utilizzato correttamente durante le fasi iniziali di dissociazione e differenziazione. L'utilizzo di ROCKi e la sua diminuzione graduale durante i feed del 50% nei primi 7-10 giorni è fondamentale per SFEB costanti e di alta qualità.
Inoltre, è spesso utile come passo di convalida per controllare i risultati in SFEB 3D con quelli osservati nelle stesse linee cellulari create utilizzando una preparazione monolayer. UnderstaConsiderando come i due sistemi si confrontano in ogni coorte sperimentale è estremamente utile per comprendere la complessità di un determinato modello di malattia. Infine, SFEBs possono essere utilizzate per ordinare e purificare le popolazioni di cellule utilizzando l'ordinamento delle cellule attivate fluorescenti per ulteriori studi in un sistema monolayer 2D più omogeneo 16 .
Tuttavia, i SFEB creati utilizzando questo protocollo sono utili per studiare piccoli circuiti corticali in via di sviluppo. Le applicazioni future di questa tecnica implicano la multiplex delle registrazioni elettrofisiologiche con approcci ad alto contenuto. Infatti, gli inserti della camera cella sono fabbricati per l'uso in un formato a piastra a 96 pozzetti. Questi inserti possono essere usati con il protocollo SFEB qui descritto al posto degli inserti a 6 pozzetti. Per dimostrare la scalabilità con questo metodo, gli SFEB dovranno essere creati utilizzando più righe e cloni all'interno di una data coorte e dovranno essere sottoposti a una serie di solidi test basati su cellule per cercare la coerenza con wiCulture sottili. Ad esempio, i numeri neuronali, la morfologia e lo sviluppo del livello possono essere analizzati utilizzando un formato a 96 pozzetti. Idealmente, i test a base cellulare dovrebbero essere combinati con un test elettrofisiologico ad alto contenuto come la MEA, che è anche scalabile a piastre a 96 pozzetti.
Questa piattaforma SFEB ha promesso di decifrare il ruolo dello sviluppo della rete corticale precoce nei disturbi neurologici, in particolare nei casi in cui vi sia una possibile interazione tra la genetica e lo sviluppo neuronale precoce. Abbiamo dimostrato che può essere trattato molto simile a una cultura di fetta come mostrato negli studi di ratto e mouse. Studi futuri utili utilizzando questo sistema dovrebbero concentrarsi sull'anatomia e la fisiologia comparativa dello sviluppo tra le strutture in vivo del mouse e l'SFEB. Questi dati comparativi sarebbero molto potenti nello sviluppo di un sistema veramente traslatorio per la scoperta di droga e per la ricerca di base.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Elizabeth Benevides per approfondire l'articolo. Ringraziamo i dottori. John Hussman e Gene Blatt per le loro discussioni e commenti utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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