Summary
Här rapporterar vi ett protokoll för att utveckla ett tredimensionellt (3-D) system från humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som kallas serumfri embryoidkropp (SFEB). Denna 3-D-modell kan användas som en organotypisk skivkultur för att modellera mänsklig kortikal utveckling och för fysiologisk utfrågning av utveckling av neurala kretsar.
Abstract
Även om ett antal in vitro- sjukdomsmodeller har utvecklats med hjälp av hiPSC, är en begränsning att dessa tvådimensionella (2-D) system inte representerar den underliggande cytoarkitektural och funktionella komplexiteten hos de drabbade individerna som bär misstänkta sjukdomsvarianter. Konventionella 2-D-modeller förblir ofullständiga representationer av in vivo- liknande strukturer och tar inte tillfredsställande in hjärnans komplexitet. Således finns det ett växande behov av fler 3-D hiPSC-baserade modeller som bättre kan rekapitulera de cellulära interaktionerna och funktionerna som ses i ett in vivo- system.
Här rapporterar vi ett protokoll för att utveckla ett 3-D-system från odifferentierade hiPSCs baserat på serumfri embryoidkroppen (SFEB). Denna 3-D-modell speglar aspekter av en utvecklande ventraliserad neocortex och möjliggör studier av funktioner som är integrerade i levande neurala celler och intakt vävnad, såsom migration, anslutning, kommunikation och mattauration. Specifikt visar vi att SFEB: erna som använder vårt protokoll kan ifrågasättas med hjälp av fysiologiskt relevanta och höghaltiga cellbaserade analyser, såsom kalciumavbildning, och MEA-inspelningar med flera elektroder utan kryosektion. När det gäller MEA-inspelningar visar vi att SFEB ökar både spikaktivitet och nätverksbristningsaktivitet under långsiktig odling. Detta SFEB-protokoll tillhandahåller ett robust och skalbart system för studier av utveckling av nätverksbildning i en 3-D-modell som fångar in aspekter av tidig kortikal utveckling.
Introduction
Vi har tidigare rapporterat ett 3-D-modellsystem, genererat av patient-härledda humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som rekapitulerar vissa aspekter av tidig kortisk nätverksutveckling 1 . Denna 3-D-modell, en serumfri embryoidkropp (SFEB), förbättras vid tidigare enkla aggregering av hiPSC-modellerna 2 , 3 . En växande arbetsgrupp avslöjar att 3-D-strukturer som våra SFEB, ungefärliga aspekter av neural utveckling som vanligen observerades in vivo och vid en tidigare tidpunkt än observerad i 2-D-dimensionella (2-D) / monolag-hiPSC-modellerna 4 , 5 . Initiala studier har fokuserats på den självorganiserande komplexiteten hos 3-D-kroppar utan att demonstrera deras fysiologiska komplexitet 2 .
Protokollet som beskrivits här har använts på odifferentierade hiPSCs härledda från fibroblaster och Perifera blodmononukleära celler (PBMC). Dessa celler bibehålls på y-bestrålade musembryonmatare (MEF). Dessa hiPSC-kolonier rengörs manuellt av spontant differentierade celler, skördas enzymatiskt och resuspenderas i medium innehållande Rho-Kinase-hämmare Y-27632 (ROCKi). Ockifferentierade hiPSCs utsätts för dissociation och centrifugering innan de överförs till 96-brunnars låghäftande V-bottenplattor. Efter plätering initieras neuralt induktion med användning av dubbel SMAD-inhibering (SB431542 och LDN193189 tillsammans med dickkopf 1 (DKK-1)) för att driva en främre-frontal-förebyggande neuronal-ödetlinje 6 . Efter 14 dagar överförs SFEB: erna till cellodlingsinsatser i en 6-brunnsplatta. När de överförts börjar de runda SFEB-spridningarna spridas och tunna samtidigt som de upprätthåller lokala nätverksanslutningar, vilket ofta observeras i hippocampala organotypa skivkulturförberedelser med användning av liknande cellodlingsinsatser 1 ,Ss = "xref"> 7.
Användningen av en SFEB-baserad 3-D-plattform i detta format är mottaglig för effektiv produktion av kortikala nätverk som kan ifrågasättas med användning av cellbaserade fysiologiska analyser såsom kalciumbildnings-eller elektrofysiologiska analyser såsom enkla cellinspelningar eller multiselektrodsuppsättning (MEA ) 1 . Trots att 3-D-system har markörer för tidig kortikal utveckling har andra studier visat att dessa 3-D-kroppar kan kräva längre inkubationstider för att möjliggöra den i sig långsammare utvecklingen av mänsklig vävnad 8 . Detta SFEB-protokoll genererar framgångsrikt 3-D SFEB från odefinierade hiPSCs som fångar aspekter av den tidiga utvecklingen av cortexen.
SFEB: s potential att modellera nätverksavvikelser i neurologiska störningar är en styrka i detta system. HiPSCs härledda från patientvävnad kan odlas till celler i nervsystemet som är föremål för rövAys relaterade till cellbiologi såväl som samtidig genuttryck. Humana iPSCs används för att fastställa den genetiska profilen hos stora grupper av individer med varierande neurologiska störningar med komplexa etiologier, såsom autismspektrumstörning (ASD), schizofreni 9 , Rett syndrom 10 och Alzheimers sjukdom 11 , 12 . Fram till nyligen var iPSC-modeller typiskt monoskiktpreparat som, trots att de var skickliga vid utvärdering av molekylära interaktioner, var otillräckliga vid dechifiering av de komplexa cellulära interaktionerna som ses in vivo . Djurmodeller har varit standardutbytet för att återskapa hela orgelplattformen. Dessa djurmodeller plågas av dålig översättning av fynd och har begränsad förmåga att replikera mänskliga genetiska profiler identifierade genom stora genetiska screeningsstudier. Således lägger utvecklingen av 3-D-system från iPSCs ett behov av komplexitet i människanSjukdomsmodellering 13 , 14 . Nästa steg för 3D-hiPSC-plattformar är att tillgodose de stora skalkraven för hög genomströmningsskärmning med användning av cellbaserade analyser 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av neurala progenitorceller
- Håll hiPSCs härledda från fibroblaster och PBMC i plattor med 6 brunnar på ett y-bestrålat musfosterfoder (MEF) cellskikt i humant iPSC-medium kompletterat med små molekyler (se materialtabellen).
OBS! Dagligt underhåll är en modifierad version av tidigare rapporterade procedurer 1 , 16 .- Plattan 6 x 10 5 MEFs på varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingskvalitet platta i 300 | il / brunn rekommenderas medium (efter tillverkarens protokoll).
- Efter 48 timmar byter du MEF-medium med 300 μl / brunns hiPSC-medium i 1 h före tillsats av hiPSCs.
- Torka snabbt hiPSCs i ett 37 ° C vattenbad och tillsätt långsamt 1 mL hiPSC medium. Överför hiPSC och medium till ett 15 ml koniskt rör. Lägg till medium för att få den totala volymen till 5 ml. Centrifugera i 4 min vid 129 xg, aspirera supernatenNt, suspendera försiktigt pelleten i 1 ml hiPSC-medium med ROCK-hämmare vid 1: 1000 koncentration.
- Plattan cellsuspensionen (typiskt såddes vid 300.000 celler / brunn) på MEF cellskiktet och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet.
- Övervaka iPSC-kulturen noggrant med hjälp av ett ljusmikroskop. Efter 48 h avlägsna kulturer som har ojämna kanter, vuxit för att bli cystiskliknande eller verkar gulbrun under ljusmikroskopet för att minimera spontan differentiering.
OBS: Efter 7 - 10 dagar ska hiPSC kolonier bildas. Kolonier bör vara runda, med tydligt definierade gränser och enhetliga celldensiteter, och saknar löst packade ojämna celler. - Välj manuellt runda hiPSC kolonier för att rensa odlingen av spontant differentierade celler. Utvid kolonierna genom att placera dem på färska MEF-lager. Expand 1: 3 var 7: e dag när kulturer nära sammanflöde och frys 1 , 16 .
- Efter expansion och frysning av celler (för säkerhetskopiering), odla hiPSC-kolonier på plattor tills de når 50-75% sammanflöde.
- Sju dagar efterplätering, använd mild mild enzymatisk behandling (5-10 min med 300 μL enzymlösning) och försiktig triturering (2-4 gånger med 1000 μL pipett) för att skörda och förbereda hiPSCs för neural prekursorcellsdifferentiering.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 129 xg i 4 min, aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 5 ml humant iPSC-medium. Överför cellsuspensionen till en 0,1% gelatinbelagd 5 cm cellodlingsskål i 1 h vid 37 ° C för att eliminera MEF och maximera hiPSC-utbytet. Överför mediet (med icke-vidhäftande celler) till en annan 5 cm gelatinbelagd maträtt.
- Överför de icke-vidhäftande cellerna till ett 15 ml centrifugrör med hjälp av en överföringspipett. Skölj försiktigt skivorna med 3 ml medium och tillsätt det till 15 ml röret.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 129 xg i 4 min, aspirera superenNatant och försiktigt resuspendera pelleten i medium. Bestäm celltalet med hjälp av en automatiserad cellräknare. Placera 9000 celler / brunn i en 96-brunns låghäftande V-bottenplatta.
- Centrifugera plattan vid 163 xg under 3 minuter. Inkubera plattan vid 37 ° C, 95% fuktighet och 5% CO2. Använd en pipett, byt 50% medium varannan dag genom att avlägsna hälften av mediet och ersätta det med färskt kemiskt definierat differentieringsmedium 1 (DM1, Figur 1 , Materialtabell) i 14 dagar.
2. Induktion av serumfri embryoidkropp (SFEB) ( Figur 2 )
- Placera 40 μm cellodlingsinsatser i 6-brunnsplattor och sätt 1 ml DM1-medium åtminstone 1 h före tillsats av aggregat.
- På dag 14 överför aggregaten med 20 pl medium genom att använda en 200 μl bred munspets på 40 μm cellodlingsinsatser och byt mediet till DM2.
7 , 17 , 18 .- Överför 4-6 aggregat till ett cellodlingsinsats och tillåta tillräckligt utrymme mellan aggregaten. Ta bort så mycket överskottslösning som möjligt med en fin pipettspets (t ex 200 μl spets).
OBS! Det är acceptabelt att störa SFEB kort eftersom de kommer att flytta på cellodlingsinsatsen eftersom lösningen i avlägsnas från runt SFEB: erna. - Bibehålla kulturerna i 1 ml DM2 vid 37 ° C, 95% fuktighet och 5% CO2. Använd en pipett, byt 75%Medium varannan dag genom att ta bort tre fjärdedelar av mediet och ersätta med tre fjärdedelar färskt medium. Ta till exempel bort 750 μl medium och tillsätt 750 μL färskt medium.
- Överför 4-6 aggregat till ett cellodlingsinsats och tillåta tillräckligt utrymme mellan aggregaten. Ta bort så mycket överskottslösning som möjligt med en fin pipettspets (t ex 200 μl spets).
- Efter 14 dygn av kultur, byt till DM3 medium med 75% medium förändring varannan dag och för ytterligare 16 dagar.
- För att behålla SFEB: erna på cellodlingsinsatser efter 30 dagar byter mediet varannan dag i 60, 90 och 120 dagar.
OBS: SFEB: erna kommer att växa till ca 1000 μm i diameter och är vanligtvis 100-150 μm tjocka 1 .
3. Bestämning av SFEB-sammansättning
- Lossa SFEB: erna från insatsen genom försiktigt pipetteringsmedium med en 200 μl bred munpipettspets. För att överföra SFEB: erna, använd ett brett munspipettips för att försiktigt suga in kropparna i pipettspetsen. Efter inmatning av SFEB i pipettspetsen, överföres försiktigt till plattor med 12 brunnar och tvättas med 300 ul fosfatbuffrad saltlösning(PBS) per brunn.
OBS: SFEB sätts i lösning i 12-brunnsplattorna. Detta är viktigt för att tillåta fullständig penetrering av fixativet, blockeringslösningen och antikroppar. Om flera SFEB används för färgning, kan upp till 10 SFEB läggas per brunn i en 12-brunnsplatta. Detta kommer att spara lösningar och antikroppar. - Fixa SFEB med 300 μL per brunn 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur i 30-45 min. Tvätta fixa SFEB två gånger med 300 μL PBS, 3-5 min varje tvätt.
Varning: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av paraformaldehyd.
ANMÄRKNING: Probe för immunreaktivitet för markörer för bestämning av mognad, celltyp etc. För märkning av neuroner i denna studie användes kyckling-Tuj1 vid 1: 500, för ytterligare markörer se tabell 2 och referenser 1 , 16 . - Permeabilisera och blockera med 0,1% Triton-X100 i PBS och 10% normalt åsnor (blockerande lösning; 300 μl; L per brunn) i 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort blockeringslösningen och behandla SFEB med 300 μL primära antikroppar i blockeringslösning. Inkubera vid 4 ° C över natten. Tvätta SFEBs tre gånger (3-5 min per tvätt) i 300 pi PBS innehållande 0,1% Triton-X.
- Förbered sekundära antikroppar 1: 1000 i blockeringslösning. Inkubera SFEB i 1 timme vid rumstemperatur med sekundära antikroppar. Tvätta SFEB med 300 μL PBS, 3 gånger i 3-5 min vardera.
OBS! I detta skede kan SFEBs förberedas för bildbehandling. - För bild, pipettera SFEB på en glasskiva med en pipett med bredborrning. Ta bort överflödig lösning runt SFEB med mild sugning.
OBS! För liknande färgningsförhållanden kan flera SFEB placeras på samma glasskiva. - Lägg till en droppe monteringsmedium på SFEB: erna, sätt i ett glasskyddsslip och tryck försiktigt så att det inte finns några luftbubblor. Låt monteringsmediet härdas och fortsätt till bildbehandling och kvantifiering (steg 3.8).
- Utför cellkvantifiering genom att ta flera intressanta regioner (ROI) över SFEB och använda en z-stack kombinerad med en maximal projektionsbild genom varje ROI på ett standard konfokalmikroskop som beskrivs i referenser 1 , 16 .
OBS! Hela SFEB kan kvantifieras med bildbaserad kakel (se referenser 1 , 16 för detaljer). Eftersom SFEB: erna är tunna till ungefär 100 μm, är det minimal spridning av ljus i vävnaden och därmed finns det inget behov av 2-fotonmikroskopi. Tidigare användningar av detta protokoll med fibroblast-härledda iPSCs producerade en SFEB ödet kart som avslöjade komplex och varierande struktur med subpopulations av interneurons med transkriptionella identiteter som liknade CGE och främre förlossningsfetter 1 , 16.
4. Inspelning av neuronal aktivitet i SFEB Användning av MEA
- Förbered 12-brunns MEA-plattor enligt tillverkarens instruktioner.
- Tvätta MEA plattorna 3 gånger under 5 minuter med sterilt H2O under aseptiska betingelser för att rengöra. Tvätta i 5 minuter med 75% etanol och sedan med 100% etanol för att sterilisera plattan.
- Baka plattan inverterad i en ugn i 4-5 h vid 50 ° C för att slutföra steriliseringsprocessen.
- Tillsätt 500 μL 0,2% polyetyleniminlösning (PEI) till varje brunn och inkubera 1 h vid rumstemperatur. Aspirera PEI och tvätta brunnarna 4x med sterilt destillerat H2O Lufttorka i huven över natten.
- Förbered en 20 μL / ml lösning av laminin i L15-medium och tillsätt 10 μL laminin till mitten av varje brunn.
OBS: Belägg inte de omgivande referens- och jordningselektroderna. - Tillsätt steril dH 2 O till omgivande reservoarer att förhindra medium eller laminin avdunstning.Inkubera plattan i 1 timme vid 37 ° C.
- Lägg till SFEB (se avsnitt 1 och 2) på lamininbelagda MEA-plattorna genom att försiktigt suga dem in i en bred munpipettspets och överföra dem. Lägga 200 mikroliter DM2-medium till varje brunn och inkubera över natten vid 37 ° C, 95% fuktighet och 5% CO2.
- Lägga till ytterligare 200 mikroliter medium efter 24 h och låter det återhämta sig under 30 min vid 37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO 2 innan avläsning av plattan.
- Placera MEA-plattan i plattläsaren (förvärmd till 37 ° C) för att registrera neuronaktivitet. Spela in aktivitet i 10 minuter med tillhörande MEA inspelningsprogram. Se referens 19 för detaljer.
- Generera råa data-kontinuerliga flöden och raster-plottar av neuronaktivitet med hjälp av statistisk analysprogramvara 19 .
OBS! MEA inspelningar tas 7 dagar efter SFEB-plätering. För denna studie togs inspelningar i 10 minuter för att detektera nätverksbristningsaktivitet, conTinuous trace och raster plots. SFEB kan bibehållas långsiktigt på MEA-plattor och kan registreras över längre tidsperioder med användning av miljöstyrda förhållanden ( Figur 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SFEBs odlade med hjälp av vår teknik gav vävnad med morfologiska egenskaper som liknar en tidigt utvecklad cortikal subventrikulär zon fylld med omfattande Tuj1-positiva neuroner, såväl som neurala progenitorer ( Figur 3A ). Många utvecklande kortikala rosetter observerades i de yttre skikten och inre skikten av SFEB ( Figur 3B ). SFEB: s yttre kant liknar en utvecklande kortikalplatta som innehåller postmitotiska neuroner. Detta stöds av uttrycket av Brn2, en markör för neurala progenitorer i de mest ventraliserade yttre kortikala skikten. Reelin-positiva celler som kan vara Cajal-Retzius-celler eller deras föregångare, vilka uttrycks i de yttre skikten i den utvecklande cortexen observeras även i SFEB ( figur 3C ). SFEB-odlingar som odlas med användning av detta protokoll uttryckta markörer i överensstämmelse med en blandad caudal (CGE) och medial ganglioNic eminence (MGE) ursprung. Celler som uttrycker CGE-markören Couptf2 och andra celler som uttrycker MGE-markör Nkx2.1 kan observeras i kulturerna ( Figur 3D ). Detta kan delvis bero på användningen av DKK-1 i protokollet, vilket har visat sig öka mediala förluster 20 .
SFEB: er som framställs med användning av detta protokoll ger både kalretinin- och kalbindin-positiva internuroner ( Figur 4A ) liksom VGLUT-positiva excitatoriska neuroner och Tbr1-positiva glutamatergiska neurala progenitorer ( Figur 4B ). I genomsnitt har vi observerat att 61% av de totala cellerna i SFEB är VGLUT positiva och 43% är Tbr1-positiva ( Figur 4C ). Detta överensstämmer med andra rapporter med liknande protokoll 21 . Dessutom kan SFEB: er föremål för fysiologiska analyser såsom användning av levande celler av kalciumMarkörer som Fluo-4, för att observera neurala nätverksfunktionen i en mer fysiologiskt relevant miljö ( Figur 5 ). SFEB kan utsättas för MEA-inspelningar under långa perioder och visa utveckling av kortisk nätverksbristning ( Figur 6 ).
Figur 1: Schematisk redogör för de första stegen vid förberedelser av SFEB. Efter att iPSC har skördats med hjälp av en enzymatisk dissociation pläteras de i 96-brunnsplattor och centrifugeras vid 163 xg under 3 minuter för att inducera snabb aggregering. Efter 14 dagar in vitro (DIV) kan cellaggregat överföras från 96-brunnsplattor via brettborrpipetter på 6-brunnsplattor med cellodlingsinsats. Vänligen klicka här till viEw en större version av denna figur.
Figur 2: Tidslinje för mellanliggande förändringar och faser under SFEB-tillväxt och expansion. Efter att SFEB har överförts till insatser, de undergår två medianändringar vid 14 och 28 dagar in vitro (DIV). De skördas vanligtvis för experiment vid DIV 30, 60 och 90. Övre insatser visar olika faser i denna process. Skalstänger = 1000 μm (längst till vänster); 1000 μm (DIV 20); 600 | im (DIV 30); 300 μm (singel SFEB). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Allmän morfologisk karaktärTics av SFEBs odlas med hjälp av detta protokoll. ( A ) Typisk ytterkant av en SFEB som uttrycker progenitormarköret nestin (grön), den postmittotiska neurala markören Tuj1 (röd) och den nukleära fläcken (blå). ( B ) SFEB visar karaktäristiska kortikala rosetter i både ytterskikten (vänster bild) och inre skikt (höger). De uttrycker både progenitor och mogna neuronmarkörer. ( C ) En representativ ytterkant av en SFEB som uttrycker den yttre skiktet / kortikalplattmarkören Brn2 (grön) och den utvecklande CGE-markören Couptf2 (röd). ( D ) SFEB: er som tillverkats med användning av detta protokoll representerar ventraliserade neokortiska strukturer, såsom ses av Pax6 (röda) färgnings- och uttrycksmarkörer som överensstämmer med vissa MGE-ursprung, såsom Nxk2.1 (röd). Skala bar = 40 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bilder av större neuronala celltyper i SFEB. ( A ) Några neuroner i SFEB uttrycker markörer som överensstämmer med kortikala inreuroner, såsom kalbindin (grön, vänster bild) och kalretinin (grön, höger bild). ( B ) SFEB: er visar VGLUT-1 positiva glutamatergiska neuroner (röd, vänster bild) och glutamatergiska stamfödare som uttrycker Tbr1 (röd, höger bild). Skala bar = 40 μm. ( C ) Typiska utbyten av excitatoriska neuroner som uttrycker antingen VGLUT-1 eller Tbr1 (felstång = SEM). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Levande cellkalciuminspelningar. </ Strong> (Vänster bild) Representativ ytterkant SFEB behandlad med Fluo-4, en neuronal kalciumindikator. Cellerna är märkta för mätning av spontana kalciumtransienter (olika färglådor). (Höger bild) Valda celler som visar spontana kalciumtransienter märkta med röda lådor (övre spår) eller gröna lådor (lägre spår). Skala bar = 40 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Multi-elektrode Array-inspelningar av SFEB. (Top) Representativ bild av SFEB kopplad till en MEA-platta (Skala bar = 100 μm). (Mitten och botten) SFEB kan registreras på MEA under långa perioder och visa mognad. (Mitten och botten; vänster) En brett bristkarta av 3 SFEB-pläterade på 3 brunnar av en 12-brunns MEA-plattan, mörkare färger representerar högre övergripande spikaktivitet som ökar mellan dag 30 och dag 90. (Mellan och botten, insatser) Kumulativ aktivitetsmapp visar en ökning av spetsdensiteten och spikesintervallet inom kortikala nätverk i SFEBs mellan Dag 30 och dag 90. (mitten och botten, höger) råa spår (övre) och helbrunns rasterplottor (lägre) visar en ökning av antalet spikar och antalet brister över tiden; Vilket tyder på en starkare nätverksbildning i SFEB. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antikropp | Utspädning | Arter |
| nestin | 0,111111111 | Mus |
| Brn-2 | 0,388888.889 | Kanin |
| VGLUT1 | 0,111111111 | Kanin |
| Pax6 | 0,25 | Kanin |
| Calretinin | 0,180555556 | Kanin |
| kalbindin | 0,319444444 | Kanin |
| CoupTFII | 0,180555556 | Mus |
| Nkx 2.1 | 0,180555556 | Kanin |
| Tuj1 | 0,388888889 | Kyckling |
| Reelin | 0,388888889 | Mus |
| Tbr1 | 0,180555556 | Kyckling |
| NFH | 0,25 | Mus |
Tabell 1: Antikroppar som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillhandahåller förutsättningarna för differentiering av en hiPSC-källa till en 3-D-struktur som rekapitulerar ett tidigt utvecklingsstadium av den främre cortexen. Detta förfarande ger strukturer som kan ifrågasättas för elektrofysiologi samtidigt som de är mottagliga för mikroskopi. SFEB: s sista morfologi liknar den för organotypiska hjärnskivkulturer och möjliggör högkvalitativ detaljerad konfokalbildning. Detta protokoll kan framgångsrikt generera SFEBer från både fibroblast och perifert blodmononukleära cell-härledda hiPSCs. SFEB: er framställda från mononukleära cell-härledda hiPSCs från perifert blod uppvisar liknande morfologiska egenskaper som de som skapats av fibroblast-härledda hiPSCs.
Denna process, som andra 3-D-system, använder småcellulära extracellulära signaler för att styra beslut om celldöd. Detta kombineras med de inbyggda egenskaperna hos cell-till-cellkontakt, vilket skapar en mer realistisk miljö för nätetArbetsbildning och neuronfunktion. Andra rapporter har visat att den lämpliga kombinationen av de extracellulära signalerna med små molekyler är tillräcklig för sådana cellfasbeslut som dopaminerga 8 , 22 och kortikala inreuroner 8 , 16 , 23 i mitten. 3-D-system uppvisar emellertid en accelererad mognadstid jämfört med 2-D ekvivalenter 5 . När de har fått tillräcklig tid har 3-D-kulturerna visat ökad mognad. Sådana egenskaper gör starka argument för användbarheten av 3-D-plattformarna som SFEB. Den extra fördelen med levande och högkvalitativ mikroskopi, tillsammans med flexibiliteten i källmaterialet, ger övertygande argument för detta protokoll.
Dessutom, SFEBs som görs med detta protokoll delar ett antal likheter med andra rapporterade studier 13 , 24 . Med hänvisning till referens 24 inför detta protokoll och den fysiologiska validering av neuronerna. Exempelvis använder de studier som rapporterats i referenser 13 , 24 , liknande versioner av dubbel SMAD-inhibering för att härleda kortikala liknande neuroner och erhöll en liknande andel av glutamatergiska neuroner och progenitorer (~ 50%). Dessutom har Mariani, J. et al. (Referens 13 ) rapporterar liknande Pax6- och Nestin-färgning som detta protokoll vid 25-30 dagars tidpunkter. Kvalitativt är färgningsmönstren för Brn2 liksom uttrycket av GFAP-positiva astrocyter liknande det som rapporteras i referens 24 . Detta protokoll har emellertid ett antal fördelar jämfört med de två vanligen använda organo-metoden. Först Mariani, J. et al. 13 rapporterar utvecklingen av Dlx-positiva internuroner på dag 50 och conFörstärkts endast genom immunförfärande metoder. Med användning av detta protokoll producerar Dlx-positiva internuroner vid dag 30. Dessa interneuroner bekräftades som funktionella genom encellselektrofi-sologi och enkelcellsfarmakologisk tillämpning av GABA 16 . Dessutom hävdar författarna till 13 funktionell anslutning av neuroner, men det bestämdes endast med användning av färgning. SFEB: er som gjorts med användning av detta protokoll har utsatts för nätverks-en-elektrodstimulering och kalciumbildning för att visa att utvecklande kortikala nätverk är anslutna och funktionella. Pasca et al. 24 sektionen aggregaten använder en kryostat för att erhålla inspelningar från organoidliknande strukturer. SFEB: er som görs med detta protokoll behöver inte sektioneras och kan spelas in direkt i inlägg 1 . Neuroner registrerade från icke-sektionerade SFEB har visat sig ha potentialpotentialer och hämmande postsynaptiska potentialer efter sortinG 1 , 16 .
SFEB kan framställas med användning av både fibroblaster och PBMC som utgångsmaterial. Det är också möjligt att använda andra vävnadstyper som resulterar i hiPSCs (t ex tandmassa, förhud, urin) 25 , 26 , 27 , även om några av de små molekylerna kan behöva ändras för att uppnå liknande resultat. För detta protokoll är användningen av DKK-1 viktig vid körning av SFEB mot ett ventraliserat öde 28 . Denna ventralisering är delvis ansvarig för differentieringen av interneuroner med CGE-liknande ursprung 16 . DKK-1 är en dyr liten molekyl och sålunda kan höga koncentrationer av sonisk igelkott användas för att komplettera DKK-1 i detta protokoll. Koncentrationerna för Wnt-inhibering via DKK-1 måste emellertid bestämmas empiriskt av slutanvändaren. Dessutom XAV939, en annan Wnt inhibitoR, kan användas för att hjälpa till att driva differentiering mot ett ventraliserat öde, även om användningen av denna inhibitor kommer att ge vävnad som delar transkriptionella identiteter med MGE 23 .
När man utvecklar 3D hiPSC-kultursystem som de SFEB som beskrivs i detta protokoll är det viktigt att komma ihåg att dessa strukturer ger en måttlig mängd heterogenitet från kultur till kultur. Detta beror delvis på den stokastiska karaktären av neuronal differentiering från iPSCs och på grund av cellcellskontaktinitiering i SFEB vilket resulterar i spontan inneboende självorganisation 29 , 30 . Därför är det viktigt att tolka användbarheten av denna teknik i samband med heterogenitet. Sätt att minimera inverkan av heterogenitet i detta system innefattar att skapa ett stort antal SFEB så att de representerar naturlig variation i systemet, strängt vidhäftar koncentrationen avReagens och antalet celler sådda i början av varje produktionslöpning. Det är kritiskt att börja med rena iPSC-kolonier och att applicera minimal triturering under det enzymatiska dissociationsteget under iPSC-dissociation för att öka cellleabiliteten. Celllabilitet efter triturering är en viktig faktor för att få högkvalitativa, konsekventa SFEB. Som ett alternativt felsökningssteg kan viabiliteten kontrolleras efter dissociationen och före centrifugeringsstegen med hjälp av trypanblå, om det behövs. Livskraft och spontan differentiering kan också påverkas om ROCKi inte används korrekt under de tidiga dissociations- och differentieringsstegen. Användningen av ROCKi och dess stegvisa minskning under 50% -matningarna under de första 7-10 dagarna är avgörande för konsekventa, högkvalitativa SFEB.
Dessutom är det ofta användbart som ett valideringssteg för att kontrollera resultat i 3D SFEB med de som observeras i samma cellinjer som skapats med ett monolagspreparat. UnderstaNding hur de två systemen överensstämmer inom varje experiment kohort är extremt användbar för att förstå komplexiteten hos en given sjukdomsmodell. Slutligen kan SFEB: er användas för att sortera och rena cellpopulationer med användning av fluorescerande aktiverad cellsortering för vidare studier i ett mer homogent 2D monoskikt system 16 .
Ändå är SFEBer skapade med hjälp av detta protokoll användbara för att studera små utvecklande kortikala kretsar. Framtida tillämpningar av denna teknik innefattar multiplexing elektrofysiologiska inspelningar med höghaltiga tillvägagångssätt. I själva verket tillverkas cellkammarinsatser för användning i 96-brunnsplattformat. Dessa insatser kan användas med SFEB-protokollet som beskrivs här i stället för 6-brunnsinsatserna. För att visa skalbarhet med denna metod måste SFEBs skapas med flera linjer och kloner inom en given kohort och måste screenas över en uppsättning robusta cellbaserade analyser för att leta efter konsistens wiTunna kulturer. Exempelvis kan neurontal, morfologi och skiktutvecklings kan analyseras med användning av ett 96-brunnsformat. Ideellt sett bör cellbaserade analyser kombineras med en höghaltig elektrofysiologisk analys, såsom MEA, som också kan skalas till plattor med 96 brunnar.
Denna SFEB-plattform har ett löfte om att dechiffrera rollen för tidig kortisk nätverksutveckling vid neurologiska störningar, särskilt i fall där det finns en möjlig interaktion mellan genetik och tidig neural utveckling. Vi har visat att det kan behandlas mycket som en skivkultur som visas i rått- och musstudier. Användbara framtida studier som använder detta system borde koncentrera sig på utvecklingskomparativ anatomi och fysiologi mellan in vivo strukturer av mus och SFEB. Denna jämförande data skulle vara mycket kraftfull för att utveckla ett verkligt translationssystem för läkemedelsupptäckt och grundforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Elizabeth Benevides för korrekturläsning av artikeln. Vi tackar Drs. John Hussman och Gene Blatt för deras hjälpsamma diskussioner och kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
