Summary
Ici, nous rapportons un protocole pour développer un système tridimensionnel (3-D) à partir de cellules souches induites par l'homme-pluripotent (hiPSC) appelé le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D peut être utilisé comme une culture de tranche organotypique pour modéliser le développement cortical humain et pour l'interrogation physiologique des circuits neuronaux en développement.
Abstract
Bien qu'un certain nombre de modèles de maladies in vitro aient été développés à l'aide de HiPSC, une limitation est que ces systèmes bidimensionnels (2-D) peuvent ne pas représenter la complexité cytoarchitecturale et fonctionnelle sous-jacente des personnes concernées portant des variants présumés de la maladie. Les modèles 2-D classiques restent des représentations incomplètes des structures semblables à celles de l' in vivo et ne captent pas adéquatement la complexité du cerveau. Ainsi, il existe un besoin émergent de plus de modèles 3-D hiPSC qui peuvent mieux récapituler les interactions et les fonctions cellulaires observées dans un système in vivo .
Nous rapportons ici un protocole pour développer un système 3-D à partir de hiPSC non indifférenciés basé sur le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D reflète les aspects d'un néocortex ventralisé en développement et permet des études sur des fonctions intégrées aux cellules neuronales vivantes et aux tissus intacts tels que la migration, la connectivité, la communication et le matelasUration. Plus précisément, nous démontrons que les SFEB utilisant notre protocole peuvent être interrogés à l'aide de tests basés sur des cellules physiologiquement pertinents et à haute teneur, tels que l'imagerie au calcium et les enregistrements multi-électrodes (AMA) sans cryotypie. Dans le cas des enregistrements MEA, nous démontrons que les SFEB augmentent l'activité de pointe et l'activité d'éclatement au niveau du réseau pendant la culture à long terme. Ce protocole SFEB fournit un système robuste et évolutif pour l'étude du développement de la formation de réseau dans un modèle 3-D qui capte des aspects du développement corticale précoce.
Introduction
Nous avons déjà signalé un système modèle 3-D, généré à partir de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC), qui récapitule certains aspects du développement initial du réseau cortical 1 . Ce modèle 3-D, un corps embryoïde sans sérum (SFEB), améliore l'agrégation simple précédente hiPSC models 2 , 3 . Un travail croissant révèle que les structures en 3-D, comme nos SFEB, ont des aspects approximatifs du développement neuronal communément observés in vivo et à un point de temps antérieur à ceux observés dans les modèles 2 , 5 (2-D) / monocouches hiPSC. Les études initiales ont porté sur la complexité auto-organisée des corps en 3-D sans démontrer leur complexité physiologique 2 .
Le protocole décrit ici a été utilisé sur des hiPSC indifférenciés dérivés de fibroblastes et Cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Ces cellules sont maintenues sur des alimentateurs embryonnaires de souris irradiés par γ (MEF). Ces colonies hiPSC sont nettoyées manuellement de cellules spontanément différenciées, récoltées enzymatiquement et remises en suspension dans un milieu contenant l'inhibiteur de Rho-kinase Y-27632 (ROCKi). Les hiPSC indifférenciés sont soumis à la dissociation et à la centrifugation avant d'être transférés dans des plaques à fond de V à faible adhérence à 96 puits. Après le placage, l'induction neurale est initiée à l'aide d'une double inhibition de SMAD (SB431542 et LDN193189 avec dickkopf 1 (DKK-1)) pour conduire une lignée de front neuronal avant-cerveau avant antérieur 6 . Après 14 jours, les SFEB sont transférés dans des plaquettes de culture cellulaire dans une assiette à 6 puits. Une fois transféré, les SFEB rondes commencent à se propager et minces, tout en maintenant les connexions au réseau local, comme cela est souvent observé dans les préparations de culture en tranche organotypique de l'hippocampe en utilisant des inserts de culture cellulaire similaires 1 ,Ss = "xref"> 7.
L'utilisation d'une plate-forme 3D basée sur SFEB dans ce format est susceptible de produire efficacement des réseaux corticaux qui peuvent être interrogés à l'aide de tests physiologiques à base de cellules tels que l'imagerie au calcium ou des analyses électrophysiologiques telles que les enregistrements cellulaires simples ou les ensembles multi-électrodes (MEA ) 1 . Bien que les systèmes 3-D portent les marqueurs du développement corticale précoce, d'autres études ont montré que ces corps 3-D peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longs pour permettre le rythme intrinsèquement plus lent du développement des tissus humains 8 . Ce protocole SFEB génère avec succès des SFEB 3-D à partir de hiPSC indifférenciés qui capte des aspects du développement précoce du cortex.
Le potentiel des SFEB pour modéliser les aberrations du réseau dans les troubles neurologiques est une force de ce système. Les hiPSC dérivés du tissu patient peuvent être transformés en cellules du système nerveux qui sont sujettes à un culAys concernant la biologie cellulaire ainsi que l'expression concomitante des gènes. IPSCs humaines sont utilisées pour déterminer le profil génétique de grands groupes de personnes avec divers troubles neurologiques d'étiologies complexes tels que les troubles du spectre autistique (ASD), la schizophrénie 9, le syndrome de Rett 10, et la maladie d'Alzheimer 11, 12. Jusqu'à récemment, les modèles iPSC étaient généralement des préparations monocouches qui, tout en maîtrisant l'évaluation des interactions moléculaires, étaient insuffisantes pour déchiffrer les interactions cellulaires complexes observées in vivo . Les modèles animaux ont été le substitut par défaut pour recréer la plate-forme entière d'organe. Ces modèles animaux sont en proie à une mauvaise traduction des résultats et ont une capacité limitée à reproduire les profils génétiques humains identifiés par de grandes études de dépistage génétique. Ainsi, le développement de systèmes 3-D à partir d'iPSCs ajoute une couche de complexité nécessaire en humainModélisation de la maladie 13 , 14 . La prochaine étape pour les plates-formes 3D HiPSC est de répondre aux exigences à grande échelle du dépistage à haut débit en utilisant des analyses à base de cellules 15 .
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Protocol
1. Génération de cellules progénitrices neuronales
- Maintenir les hiPSC dérivés de fibroblastes et de PBMC dans des plaques à 6 puits sur une couche de cellules d'alimentation embryonnaire de souris irradiée par γ (MEF) dans un milieu iPSC humain complété par de petites molécules (voir la Table des matériaux).
REMARQUE: La maintenance quotidienne est une version modifiée des procédures 1 , 16 précédemment rapportées.- Placer 6 x 10 5 MEF sur chaque puits d'une plaque de culture de culture de tissu de 6 puits en 300 μL / bien recommandé (suivant le protocole du fabricant).
- Après 48 heures, remplacer le milieu MEF par un milieu hiPSC 300 μL / puit pendant 1 h avant d'ajouter les hiPSC.
- Décomposer rapidement les hiPSC dans un bain d'eau à 37 ° C et ajouter lentement 1 mL de milieu hiPSC à goutte à goutte. Transférer les hiPSC et le tube conique à 15 mL. Ajouter un milieu pour porter le volume total à 5 mL. Centrifuger pendant 4 min à 129 xg, aspirer les supernataNt, relâchez doucement la pastille dans un milieu HiPSC de 1 mL avec un inhibiteur de ROCK à 1: 1 000 de concentration.
- Placer la suspension cellulaire (typiquement ensemencée à 300 000 cellules / puits) sur la couche de cellules MEF et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 , 95% d'humidité.
- Surveillez la culture iPSC en utilisant étroitement un microscope optique. Après 48 h, enlever les cultures qui ont des bords inégaux, ont grandi pour devenir cystiques ou semblent brun jaunâtre sous microscope optique pour minimiser la différenciation spontanée.
REMARQUE: Après 7 à 10 jours, les colonies hiPSC devraient se former. Les colonies devraient être rondes, avec des frontières clairement définies et des densités cellulaires uniformes, et dépourvues de cellules non uniformes peu emballées. - Sélectionnez manuellement les colonies hiPSC rondes pour éliminer la culture de cellules différenciées spontanément. Développez les colonies en les plaçant sur des couches MEF fraîches. Développer 1: 3 tous les 7 jours lorsque les cultures proches de la confluence et de congeler 1 , 16 .
- Après l'expansion et la congélation des cellules (pour la sauvegarde), cultiver les colonies hiPSC sur les plaques jusqu'à atteindre 50 à 75% de confluence.
- Sept jours de post-plaquage, utilisez un traitement enzymatique léger (5-10 min avec 300 μL de solution enzymatique) et une trituration douce (2-4 fois avec une pipette de 1000 μl) pour récolter et préparer des hiPSC pour la différenciation des cellules précurseurs neuronales.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 129 xg pendant 4 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de milieu iPSC humain. Transférer la suspension cellulaire dans un plat de culture de cellules de 5 cm revêtu de gélatine à 0,1% pendant 1 h à 37 ° C pour éliminer les MEF et pour maximiser le rendement hiPSC. Transférer le milieu (avec des cellules non adhérentes) à un autre plat revêtu de gélatine de 5 cm.
- Transférer les cellules non adhérentes dans un tube centrifuge de 15 mL en utilisant une pipette de transfert. Rincer doucement les plaques avec 3 mL de milieu et l'ajouter au tube de 15 mL.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 129 xg pendant 4 min, aspirer le superEt de ressusciter doucement la pastille dans le milieu. Déterminer le nombre de cellules à l'aide d'un compteur de cellules automatisé. Placer 9 000 cellules / puits dans une plaque à fond de V à faible adhérence à 96 puits.
- Centrifuger la plaque à 163 xg pendant 3 min. Incuber la plaque à 37 ° C, 95% d'humidité et 5% de CO 2 . En utilisant une pipette, changez 50% de moyenne tous les deux jours en enlevant la moitié du milieu et en la remplaçant par un milieu différenciateur chimique défini 1 (DM1, Figure 1 , Tableau des matériaux) pendant 14 jours.
2. Induction du corps d'embryéroïde sans sérum (SFEB) ( Figure 2 )
- Placer des inserts de culture cellulaire de 40 μm dans des plaques à 6 puits et ajouter 1 mL de milieu DM1 au moins 1 h avant l'addition d'agrégats.
- Le jour 14, transférez les agrégats avec un milieu de 20 μL en utilisant une pointe de bouche large de 200 μl sur des inserts de culture cellulaire de 40 μm et changez le milieu en DM2.
7 , 17 , 18 .- Transférer les agrégats 4-6 dans un insert de culture cellulaire et permettre un espace adéquat entre les agrégats. Retirez autant de solution excédentaire que possible à l'aide d'une pointe de pipette fine ( p . Ex . Pointe de 200 μL).
REMARQUE: Il est acceptable de déranger brièvement le SFEB car ils se déplacent sur l'insert de culture cellulaire en tant que solution éliminée des SFEB. - Maintenir les cultures dans 1 mL de DM2 à 37 ° C, 95% d'humidité et 5% de CO 2 . À l'aide d'une pipette, changez 75%Moyen tous les deux jours en enlevant les trois quarts du milieu et en remplaçant par trois quarts de milieu frais. Par exemple, enlever 750 μL de milieu et ajouter 750 μL de milieu frais.
- Transférer les agrégats 4-6 dans un insert de culture cellulaire et permettre un espace adéquat entre les agrégats. Retirez autant de solution excédentaire que possible à l'aide d'une pointe de pipette fine ( p . Ex . Pointe de 200 μL).
- Après 14 jours de culture, passer au milieu DM3 avec un changement moyen de 75% tous les deux jours et pendant 16 jours supplémentaires.
- Pour maintenir les SFEB sur les inserts de culture cellulaire au-delà de 30 jours, changez le support tous les deux jours pendant 60, 90 et 120 jours.
NOTE: Les SFEB atteindront environ 1000 μm de diamètre et sont généralement de 100-150 μm d'épaisseur 1 .
3. Détermination de la composition de SFEB
- Détachez les SFEB de l'insert par un fluide de pipetage doux à l'aide d'une pointe de pipette à bouche large de 200 μl. Pour transférer les SFEB, utilisez une pointe de pipette à bouche large pour aspirer doucement les corps dans la pointe de la pipette. Après avoir chargé SFEB dans la pointe de la pipette, transférer doucement dans des plaques à 12 puits et laver avec 300 μL de solution salée tamponnée au phosphate(PBS) par puits.
REMARQUE: Les SFEB seront suspendus en solution dans les plaques à 12 puits. Ceci est important pour permettre une pénétration complète du fixateur, de la solution de blocage et des anticorps. Si vous utilisez des SFEB multiples pour la coloration, jusqu'à 10 SFEB peuvent être ajoutés par puits d'une plaque de 12 puits. Cela consistera à conserver des solutions et des anticorps. - Fixez les SFEB avec 300 μL par puits 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Laver les SFEB fixes deux fois avec 300 μL de PBS, 3-5 minutes chaque lavage.
Attention: Portez un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation du paraformaldéhyde.
REMARQUE: Probe d'immunoréactivité aux marqueurs pour déterminer la maturité, le type de cellule, etc. Pour marquer les neurones dans cette étude, le poulet-Tuj1 a été utilisé à 1: 500, pour les marqueurs supplémentaires, voir le tableau 2 et les références 1 , 16 . - Perméabiliser et bloquer avec 0,1% de Triton-X100 dans du PBS et 10% de sérum d'âne normal (solution de blocage, 300 μ, L par puits) pendant 1 h à température ambiante.
- Supprimer la solution de blocage et traiter les SFEB avec 300 μL d'anticorps primaires dans la solution de blocage. Incuber à 4 ° C pendant la nuit. Les SFEB de lavage sont trois fois (3-5 min par lavage) dans 300 μL de PBS contenant 0,1% de Triton-X.
- Préparez les anticorps secondaires 1: 1000 dans la solution de blocage. Incuber les SFEB pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps secondaires. Wash SFEB avec 300 μL de PBS, 3 fois pendant 3-5 minutes chacun.
REMARQUE: À ce stade, les SFEB peuvent être préparés pour l'imagerie. - Pour l'image, faites pipeter des SFEB sur une glissière en verre à l'aide d'une pipette à grand diamètre. Retirer la solution excédentaire autour du SFEB en utilisant une aspiration douce.
REMARQUE: pour des conditions de coloration similaires, plusieurs SFEB peuvent être placés sur la même diapositive en verre. - Ajouter une goutte de support sur les SFEB, placer une lamelle de verre et appuyer doucement pour s'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air. Laisser durcir le support de montage et procéder à l'imagerie et à la quantification (étape 3.8).
- Effectuer la quantification des cellules en prenant plusieurs régions d'intérêt (ROI) à travers le SFEB et en utilisant une pile z combinée avec une image de projection maximale à travers chaque ROI sur un microscope confocal standard comme décrit dans les références 1 , 16 .
REMARQUE: les SFEB entiers peuvent être quantifiés à l'aide d'un carrelage basé sur l'image (voir les références 1 , 16 pour plus de détails). Étant donné que les SFEB sont minces à environ 100 μm, il y a une diffusion minimale de lumière dans le tissu et donc il n'y a pas besoin de microscopie à 2 photons. Les utilisations antérieures de ce protocole avec des iPSC basés sur les fibroblastes ont produit une carte de destinée de SFEB qui a révélé une structure complexe et diversifiée avec des sous-populations d'interneurones ayant des identités transcriptionnelles ressemblant à des cérébrales et des fêtes avant-cerveau avant 1 , 16.
4. Enregistrement de l'activité neuronale dans les SFEB à l'aide de MEA
- Préparer des plaques MEA de 12 puits selon les instructions du fabricant.
- Laver les plaques MEA 3 fois pendant 5 minutes avec H 2 O stérile dans des conditions aseptiques pour nettoyer. Laver pendant 5 minutes avec de l'éthanol à 75% puis avec de l'éthanol à 100% pour stériliser la plaque.
- Cuire la plaque inversée dans un four pendant 4-5 h à 50 ° C pour compléter le processus de stérilisation.
- Ajouter 500 μL de solution de polyéthylèneimine 0,2% (PEI) à chaque puits et incuber 1 h à température ambiante. Aspirer l'Île-du-Prince-Édouard et laver les puits 4x avec de l'H 2 O distillé stérile. Faire sécher à l'air dans la hotte pendant la nuit.
- Préparez une solution de laminine de 20 μL / mL en milieu L15 et ajoutez 10 μL de laminine au centre de chaque puits.
REMARQUE: Ne pas enduire les électrodes de référence et de mise à la terre environnantes. - Ajouter du dH 2 O stérile aux réservoirs environnants pour éviter l'évaporation moyenne ou à la laminine.Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C.
- Ajouter les SFEB (voir les sections 1 et 2) aux plaques MEA revêtues de laminine en les aspirant doucement dans une pointe de pipette à bouche large et les transférer. Ajouter 200 μL de milieu DM2 à chaque puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C, 95% d'humidité et 5% de CO 2 .
- Ajouter un milieu supplémentaire de 200 μL après 24 h et lui permettre de récupérer pendant 30 min à 37 ° C, 95% d'humidité, 5% de CO 2 avant de lire la plaque.
- Placez la plaque MEA dans le lecteur de plaque (préchauffé à 37 ° C) pour enregistrer l'activité neuronale. Enregistrez l'activité pendant 10 min avec le logiciel d'enregistrement MEA associé. Voir la référence 19 pour plus de détails.
- Générer des données brutes - des flux continus et des parcelles raster de l'activité neuronale à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique 19 .
REMARQUE: les enregistrements MEA sont pris 7 jours après le placage SFEB. Pour cette étude, des enregistrements ont été effectués pendant 10 minutes pour détecter l'activité de rafale du réseau,Trace continue et traces rares. Les SFEB peuvent être maintenus à long terme sur des plaques MEA et peuvent être enregistrés sur des périodes plus longues en utilisant des conditions environnementales ( figure 6 ).
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Representative Results
Les SFEB cultivés à l'aide de notre technique ont produit des tissus présentant des caractéristiques morphologiques qui ressemblent à une zone subventriculaire corticale de développement précoce remplie de neurones Tuj1-positifs étendus, ainsi que de progéniteurs neuronaux ( Figure 3A ). De nombreuses rosettes corticales en développement ont été observées dans les couches externes et les couches internes du SFEB ( figure 3B ). Le bord extérieur du SFEB ressemble à une plaque corticale en développement contenant des neurones postmitotiques. Ceci est soutenu par l'expression de Brn2, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux dans les couches corticales extérieures les plus ventriculées. Les cellules positives de Reelin qui peuvent être des cellules Cajal-Retzius ou leurs progéniteurs, exprimées dans les couches externes du cortex en développement, sont également observées dans les SFEB ( figure 3C ). Les SFEB cultivés à l'aide de ce protocole sont des marqueurs express compatibles avec un ganglion mixte caudal (CGE) et médianOrigine de l'éminence (MGE). Les cellules qui expriment le marqueur CGEtf2 et d'autres cellules exprimant le marqueur MGE Nkx2.1 peuvent être observées dans les cultures ( Figure 3D ). Cela peut être en partie dû à l'utilisation de DKK-1 dans le protocole, ce qui a montré qu'il améliorait les destinées intermédiaires 20 .
Les SFEB fabriqués à l'aide de ce protocole donnent à la fois des interneurones positives à la calrétinine et à la calbindine ( Figure 4A ), ainsi que les neurones excitateurs positifs VGLUT et les progéniteurs neuronaux glutamatérgiques Tbr1 positifs ( Figure 4B ). En moyenne, nous avons observé que 61% des cellules totales dans les SFEB sont VGLUT positives et 43% sont Tbr1 positives ( Figure 4C ). Ceci est conforme à d'autres rapports utilisant des protocoles similaires 21 . En outre, les SFEB peuvent être soumis à des analyses physiologiques telles que l'imagerie au calcium des cellules vivantes en utilisantDes marqueurs tels que Fluo-4, afin d'observer la fonction du réseau neuronal dans un environnement plus physiologiquement pertinent ( figure 5 ). Les SFEB peuvent être soumis à des enregistrements MEA pendant de longues périodes et montrer le développement de l'éclatement cortical du réseau ( Figure 6 ).
Figure 1: Schéma décrivant les premières étapes de la préparation des SFEB. Après que les iPSC ont été récoltées à l'aide d'une dissociation enzymatique, elles sont plaquées dans des plaques à 96 puits et centrifugées à 163 xg pendant 3 minutes pour induire une agrégation rapide. Après 14 jours, les agrégats de cellules in vitro (DIV) peuvent être transférés à partir de plaques à 96 puits par des pipettes à large orifice sur des plaques de 6 puits contenant des plaques de culture cellulaire. Cliquez ici pour voirUne version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Ligne de temps des changements et des phases moyennes pendant la croissance et l'expansion de SFEB. Après que les SFEB ont été transférés dans les inserts, ils ont deux changements moyens à 14 et 28 jours in vitro (DIV). Ils sont généralement récoltés pour des expériences au DIV 30, 60 et 90. Les inserts supérieurs montrent différentes phases dans ce processus. Barres d'échelle = 1000 μm (extrême gauche); 1000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (SFEB unique). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: caractères morphologiques générauxLes tics de SFEB ont grandi en utilisant ce protocole. ( A ) Bord externe typique d'un SFEB exprimant le marqueur progenitor nestin (vert), le marqueur neuronal post-mitotique Tuj1 (rouge) et la tache nucléaire (bleu). ( B ) Les SFEB montrent des rosettes corticales caractéristiques dans les couches externes (image de gauche) et les couches internes (à droite). Ils expriment des marqueurs neuronaux progéniteurs et matures. ( C ) Un bord extérieur représentatif d'un SFEB exprimant le marqueur de plaque externe / plaque corticale Brn2 (vert) et le marqueur de CGE de développement Couptf2 (rouge). ( D ) Les SFEB réalisées à l'aide de ce protocole représentent des structures néocorticales ventriculées telles que vues par la coloration Pax6 (rouge) et les marqueurs express compatibles avec certaines origines MGE telles que Nxk2.1 (rouge). Barre d'échelle = 40 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Images des principaux types de cellules neuronales dans les SFEB. ( A ) Certains neurones dans les SFEB expriment des marqueurs compatibles avec les interneurones corticales telles que la calbindine (image verte, gauche) et la calrétinine (vert, image de droite). ( B ) Les SFEB montrent des neurones glutamatérgiques positifs VGLUT-1 (image rouge, gauche) et des progéniteurs glutamatérgiques exprimant Tbr1 (rouge, image de droite). Barre d'échelle = 40 μm. ( C ) Rendements typiques de neurones excitateurs exprimant VGLUT-1 ou Tbr1 (barre d'erreur = SEM). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: enregistrements de calcium de cellules vivantes. </ Strong> (image de gauche) Le SFEB de bord extérieur représentatif traité avec Fluo-4, un indicateur de calcium neuronal. Les cellules sont marquées pour la mesure des transitoires de calcium spontanés (boîtes de couleurs assorties). (Image droite) Cellules sélectionnées démontrant des transitoires de calcium spontanés marqués par des boîtes rouges (traces supérieures) ou des boîtes vertes (traces inférieures). Barre d'échelle = 40 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Enregistrements de matrice à électrodes multiples de SFEB. (Haut) Image représentative de SFEB attachée à une plaque MEA (Barre d'échelle = 100 μm). (Moyen et inférieur) Les SFEB peuvent être enregistrés sur des MEA sur de longues périodes et montrer la maturation. (Moyen et bas, à gauche) Une carte éclatée bien large de 3 SFEB plaquée sur 3 puits d'un 1Plaque MEA à 2 puits, les couleurs plus sombres représentent une activité de pointe globale qui augmente entre le jour 30 et le jour 90. (Moyenne et inférieure); la carte d'activité cumulée montre une augmentation de la densité des pointes et de la zone des pointes dans les réseaux corticaux dans les SFEB entre Le jour 30 et le jour 90. (Moyen et inférieur, à droite) Les traces brutes (supérieures) et les parcelles rondes entières (inférieures) montrent une augmentation du nombre de pointes et du nombre de rafales dans le temps; Indiquant une formation de réseau plus forte dans les SFEB. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Anticorps | Dilution | Espèce |
| Nestin | 0.111111111 | Souris |
| Brn-2 | 0,388888889 | lapin |
| VGLUT1 | 0.111111111 | lapin |
| Pax6 | 0,25 | lapin |
| Calretinin | 0.180555556 | lapin |
| Calbindin | 0,319444444 | lapin |
| CoupTFII | 0.180555556 | Souris |
| Nkx 2.1 | 0.180555556 | lapin |
| Tuj1 | 0.388888889 | poulet |
| Reelin | 0.388888889 | Souris |
| Tbr1 | 0.180555556 | poulet |
| NFH | 0,25 | Souris |
Tableau 1: Anticorps utilisés dans cette étude.
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Discussion
Le protocole décrit ici fournit les conditions pour différencier une source hiPSC en une structure 3-D qui récapitule un stade de développement précoce du cortex frontal. Cette procédure donne des structures qui peuvent être interrogées pour l'électrophysiologie tout en étant susceptibles de microscopie. La morphologie finale du SFEB ressemble à celle des cultures de tranches de cerveau organotypiques et permet une imagerie confocale détaillée de haute qualité. Ce protocole peut générer des SFEB à la fois à partir de hiPSC à haute teneur en fibroblastes et à cellules mononucléaires. Les SFEB fabriqués à partir de cellules hiérarchisées à base de cellules mononucléaires du sang périphérique présentent des caractéristiques morphologiques similaires à celles créées à partir de hiPSC dérivés de fibroblastes.
Ce processus, comme d'autres schémas en 3-D, utilise des indices extracellulaires de petites molécules pour guider les décisions sur le sort des cellules. Ceci est combiné avec les propriétés intrinsèques du contact cellulaire à cellulaire, ce qui crée un environnement plus réaliste pour le réseauLa formation du travail et la fonction neuronale. D'autres rapports ont montré que la combinaison appropriée des signaux extracellulaires de la petite molécule est suffisante pour de telles décisions du devenir cellulaire, telles que le dopaminergique 8 , 22 et les interneurones corticales 8 , 16 , 23 . Cependant, les systèmes 3-D présentent un temps de maturation accéléré par rapport aux équivalents 2-D 5 . Lorsque le temps est suffisant, les cultures 3-D ont montré une maturité accrue. De telles qualités font de solides arguments pour l'utilité des plates-formes 3D comme le SFEB. L'avantage supplémentaire de la microscopie en direct et de haute qualité, ainsi que la flexibilité du matériau source, font des arguments convaincants pour ce protocole.
En outre, les SFEB réalisés à l'aide de ce protocole partagent un certain nombre de similitudes avec d'autres études rapportées 13 , 24 . En ce qui concerne la référence 24 , ce protocole et la validation physiologique des neurones le précisent. Par exemple, les études rapportées dans les références 13 , 24 , utilisent des versions similaires de l'inhibition du double SMAD pour dériver des neurones corticaux et ont obtenu une proportion similaire de neurones glutamatérgiques et de progéniteurs (~ 50%). De plus, Mariani, J. et al. (Référence 13 ) indiquent des colorations similaires de Pax6 et Nestin comme protocole à un point de 25 à 30 jours. Qualitativement, les modèles de coloration pour Brn2 ainsi que l'expression d'astrocytes positifs au GFAP sont similaires à ceux rapportés dans la référence 24 . Cependant, ce protocole présente plusieurs avantages par rapport aux deux méthodologies organoïdes couramment utilisées. D'abord, Mariani, J. et al. 13 rapportent le développement des interneurones positifs Dlx au jour 50 et conRésistant uniquement aux méthodes d'immunocoloration. En utilisant ce protocole, les interneurones Dlx positifs sont produites au jour 30. Ces interneurones ont été confirmées comme fonctionnelles par une électrophysiologie monocellulaire et une application pharmacologique à une seule cellule de GABA 16 . En outre, les auteurs de 13 revendiquent une connectivité fonctionnelle des neurones, mais ils ont été déterminés uniquement en utilisant des colorants. Les SFEB fabriqués à l'aide de ce protocole ont été soumis à une stimulation d'une seule électrode et à une imagerie en calcium pour montrer que les réseaux corticaux en développement sont connectés et fonctionnels. Pasca, et al. 24 sectionz les agrégats à l'aide d'un cryostat pour obtenir des enregistrements à partir de structures organo-similaires. Les SFEB fabriqués à l'aide de ce protocole n'ont pas besoin de sectionnement et peuvent être enregistrés directement dans les inserts 1 . Les neurones enregistrés à partir de SFEB non sectionnés ont montré des potentiels d'action et des potentiels post-synaptiques inhibiteurs après triageG 1 , 16 .
Les SFEB peuvent être fabriqués en utilisant à la fois des fibroblastes et des PBMC comme matière de départ. Il est également possible d'utiliser d'autres types de tissus qui résultent en hiPSC (p. Ex. Pulpe dentaire, prépuce, urine) 25 , 26 , 27 , bien que certaines des petites molécules devront peut-être être modifiées pour obtenir des résultats similaires. Pour ce protocole, l'utilisation de DKK-1 est importante pour conduire le SFEB vers un devenir ventriculé 28 . Cette ventralisation est partiellement responsable de la différenciation des interneurones avec des origines CGE 16 . Le DKK-1 est une petite molécule coûteuse et, par conséquent, des concentrations élevées de hérisson sonique peuvent être utilisées pour compléter le DKK-1 dans ce protocole. Cependant, les concentrations pour l'inhibition de Wnt via DKK-1 doivent être déterminées empiriquement par l'utilisateur final. En outre, XAV939, un autre inhibiteur de WntR, peut être utilisé pour aider à diriger la différenciation vers un destin ventré, bien que l'utilisation de cet inhibiteur produise un tissu qui partage les identités transcriptionnelles avec le MGE 23 .
Lors de l'élaboration de systèmes de culture HiPSC 3D comme les SFEB décrits dans ce protocole, il est important de garder à l'esprit que ces structures produisent une quantité modérée d'hétérogénéité entre culture et culture. Cela est en partie dû à la nature stochastique de la différenciation neuronale des iPSC et à l'initiation du contact cellule-cellule dans le SFEB, ce qui entraîne une auto-organisation intrinsèque spontanée 29 , 30 . Par conséquent, il est important d'interpréter l'utilité de cette technique dans le contexte de l'hétérogénéité. Les moyens de minimiser l'impact de l'hétérogénéité dans ce système incluent, créant un grand nombre de SFEB de sorte qu'ils représentent des variations naturelles dans le système, adhérant strictement à la concentration deLes réactifs et le nombre de cellules ensemencées au début de chaque essai de production. Il est essentiel de commencer par des colonies iPSC propres et d'appliquer une trituration minimale pendant la phase de dissociation enzymatique lors de la dissociation iPSC pour augmenter la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire après la trituration est un facteur important pour obtenir des SFEB cohérents et de haute qualité. Comme étape de dépannage alternative, la viabilité peut être vérifiée après la dissociation et avant les étapes de centrifugation en utilisant du bleu trypan, si nécessaire. La viabilité et la différenciation spontanée peuvent également être affectées si ROCKi n'est pas utilisé correctement pendant les premières étapes de dissociation et de différenciation. L'utilisation de ROCKi et sa diminution par étapes pendant les flux de 50% au cours des 7 à 10 premiers jours est essentielle pour des SFEB cohérents et de haute qualité.
En outre, il est souvent utile comme étape de validation pour vérifier les résultats dans les SFEB 3D avec ceux observés dans les mêmes lignes cellulaires créées en utilisant une préparation monocouche. UnderstaLa façon dont les deux systèmes de comparaison croisée au sein de chaque cohorte expérimentale est extrêmement utile pour comprendre la complexité d'un modèle de maladie donné. Enfin, les SFEB peuvent être utilisés pour trier et purifier les populations de cellules en utilisant un tri cellulaire activé par fluorescence pour une étude approfondie dans un système monocouche 2D plus homogène 16 .
Néanmoins, les SFEB créés à l'aide de ce protocole sont utiles pour l'étude de petits circuits corticaux en développement. Les applications futures de cette technique impliquent la multiplexation des enregistrements électrophysiologiques avec des approches à fort contenu. En effet, les inserts de chambre à cellules sont fabriqués pour une utilisation dans un format de plaque à 96 puits. Ces inserts peuvent être utilisés avec le protocole SFEB décrit ici à la place des inserts à 6 puits. Afin de montrer l'évolutivité à l'aide de cette méthode, les SFEB devront être créés en utilisant plusieurs lignes et clones dans une cohorte donnée et devront être sélectionnés dans un ensemble de tests basés sur des cellules robustes pour rechercher la cohérenceCultures minces. Par exemple, les nombres neuronaux, la morphologie et le développement de la couche peuvent être analysés à l'aide d'un format à 96 puits. Idéalement, les analyses basées sur les cellules devraient être combinées avec un dosage électrophysiologique à haute teneur tel que le MEA, qui est également évolutif aux plaques à 96 puits.
Cette plate-forme SFEB a promis de déchiffrer le rôle du développement précoce du réseau cortical dans les troubles neurologiques, en particulier dans les cas où il existe une interaction possible entre la génétique et le développement neurologique précoce. Nous avons démontré qu'il peut être traité comme une culture en tranche, comme le montrent les études sur le rat et la souris. Des études futures utiles utilisant ce système devraient se concentrer sur l'anatomie et la physiologie comparatives de développement entre les structures in vivo de la souris et le SFEB. Ces données comparatives seraient très puissantes pour développer un système véritablement translationnel pour la découverte de médicaments et la recherche fondamentale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Elizabeth Benevides d'avoir révisé l'article. Nous remercions les Drs. John Hussman et Gene Blatt pour leurs discussions et commentaires utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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