Summary
ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。
Abstract
hiPSCsを使用して多数のin vitro疾患モデルが開発されているが、これらの2次元（2D）システムは、疑わしい疾患の変異を有する罹患者の基礎的な細胞構造および機能の複雑さを表さない可能性がある。従来の2次元モデルは、インビボのような構造の不完全な表現であり、脳の複雑さを適切に捕捉しない。したがって、 in vivo系で見られる細胞相互作用および機能をよりよく再現できる、より多くの3-D hiPSCベースのモデルが必要となっている。
ここでは、無血清胚様体（SFEB）に基づく未分化hiPSCからの3-D系を開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、発達中の腹側新皮質の局面を反映しており、泳動、接続性、通信およびマットのような生きた神経細胞およびインタクトな組織に不可欠な機能への研究を可能にする期間。具体的には、本発明者らのプロトコールを用いたSFEBは、カルシウムイメージング、および凍結切除なしの多電極アレイ（MEA）記録のような生理学的に関連した高含量細胞ベースのアッセイを用いて調べることができることを示す。 MEA記録の場合、我々はSFEBが長期間の培養中にスパイク活性およびネットワークレベル破裂活性の両方を増加させることを示す。このSFEBプロトコルは、早期皮質発達の局面を捕捉する3-Dモデルにおけるネットワーク形成の発展の研究のための堅牢でスケーラブルなシステムを提供する。
Introduction
私たちはこれまで、ヒト由来の多能性幹細胞（hiPSCs）由来の患者由来の3次元モデルシステムを報告しましたが、これは早期皮質ネットワーク開発のいくつかの側面を再現しています1 。この3-Dモデル、無血清胚様体（SFEB）は、以前の単純な集約hiPSCモデル2,3に向上します。仕事の成長体は、5 /単層hiPSCモデル4私達のSFEBsような3-D構造が、神経発生のおおよその態様は、一般的にインビボおよび2次元（2-D）で観察されるより前の時点で観察されたことが明らかにされています。初期の研究は、生理学的複雑性2を示さずに3次元物体の自己組織化の複雑さに焦点を当てている2 。
本明細書に記載のプロトコルは、線維芽細胞由来の未分化hiPSCおよび末梢血単核細胞（PBMC）である。これらの細胞はγ線照射マウス胚性フィーダー（MEFs）上で維持される。これらのhiPSCコロニーを、自然に分化した細胞を手動で洗浄し、酵素的に採取し、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632（ROCKi）を含有する培地中に再懸濁する。未分化hiPSCを解離および遠心分離に供してから、96ウェルの低接着V底プレートに移す。プレーティング後、前頭前野前脳ニューロン運命系統6を駆動するために、二重SMAD阻害（SB431542およびdNK193189とDickkopf1（DKK-1））を用いて神経誘導を開始する。 14日後、SFEBを6ウェルプレートの細胞培養インサートに移す。一旦移されると、丸いSFEBは、同様の細胞培養インサート1を用いて海馬の器官型スライス培養物調製物でしばしば観察されるように、局所ネットワーク接続を維持しながら、広がり始め、ss = "xref"> 7。
この形式のSFEBに基づく3Dプラットフォームの使用は、カルシウムイメージングまたは電気生理学的アッセイ（例えば、単細胞記録または多電極アレイ（MEA）などの細胞ベースの生理学的アッセイを用いて調べることができる皮質ネットワークの効率的な産生に適している。 ） 1 。 3-Dシステムは早期皮質発達のマーカーを担っているが、他の研究では、これらの3-D体は本質的に遅いヒト組織発生のペースを可能にするためにより長いインキュベーション時間を必要とすることが示されている8 。このSFEBプロトコルは、皮質の初期発生の局面を捕捉する未分化hiPSCからの3-D SFEBを首尾よく生成する。
神経学的障害におけるネットワーク異常をモデル化するためのSFEBの可能性は、このシステムの強みである。患者の組織由来のhiPSCsは、お尻になる神経系の細胞に成長することができます細胞生物学および付随する遺伝子発現に関するものである。ヒトiPS細胞は、自閉症スペクトラム障害（ASD）、統合失調症9、レット症候群10、およびアルツハイマー病11、12のような複雑な病因を有する神経障害を変化させ、個人の大きなグループの遺伝子プロファイルを確認するために使用されています。最近まで、iPSCモデルは、典型的には、分子相互作用の評価に堪能ではあるが、インビボで見られる複雑な細胞相互作用を解読するには不十分な単層調製物であった。動物モデルは、全臓器プラットフォームを再現するためのデフォルトの代替物である。これらの動物モデルは、所見の翻訳の貧弱さに悩まされ、大規模な遺伝子スクリーニング研究によって同定されたヒト遺伝子プロファイルを複製する能力が限られている。従って、iPSCからの3-Dシステムの開発は、人間に必要な複雑さの層を加える疾患モデル13、14。 3D hiPSCプラットフォームの次のステップは、細胞ベースのアッセイを用いたハイスループットスクリーニングの大規模要件に対応することです15 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.神経前駆細胞の作製
- 小分子を補充したヒトiPSC培地（材料表参照）中のγ-照射マウス胚性フィーダー（MEF）細胞層上の6ウェルプレート中の線維芽細胞およびPBMC由来のhiPSCを維持する。
注：毎日のメンテナンスは、以前に報告された手順1、16の修正版です。- 6ウェル組織培養グレードプレートの各ウェルに300μL/ウェルの推奨培地（製造業者のプロトコールに従って）に6×10 5個の MEFをプレートする。
- 48時間後、hiPSCを添加する前に、MEF培地を300μL/ウェルのhiPSC培地で1時間交換する。
- 37℃の水浴でhiPSCをすばやく解凍し、1mLのhiPSC培地をゆっくりと滴下します。 hiPSCと培地を15 mLコニカルチューブに移す。培地を加えて総容量を5 mLにする。 129xgで4分間遠心分離し、上清を吸引する1：1000濃度のROCK阻害剤を含む1mLのhiPSC培地中でペレットを静かに再懸濁する。
- MEF細胞層上に（典型的には30万細胞/ウェルで播種した）細胞懸濁液をプレートし、37℃、5％CO 2、湿度95％でインキュベートします。
- iPSC培養を光学顕微鏡を用いて密接にモニターする。 48時間後に、不均一な縁を有する培養物を除去し、嚢胞様になるまで増殖させるか、または光学顕微鏡下で黄褐色に見えるようにして自発的分化を最小化する。
注：7〜10日後、hiPSCコロニーが形成されるはずです。コロニーは、境界が明確に定められ、細胞密度が均一であり、緩やかに充填された不均一な細胞がない丸いものでなければなりません。 - 自発的に分化した細胞の培養をクリアするために、丸いhiPSCコロニーを手動で選択する。コロニーを新鮮なMEF層に置くことによってコロニーを広げる。とき文化コンフルエントとフリーズ1、16近くに7日ごとに3：1を展開します。
- 増殖および凍結細胞（バックアップ用）の後、それらが50〜75％コンフルエントに達するまでプレート上でhiPSCコロニーを増殖させる。
- 7日間のプレーティング後、軽度の酵素処理（300μLの酵素溶液で5〜10分）および穏やかな粉砕（1000μLピペットで2〜4回）を行い、神経前駆細胞分化のためのhiPSCを採取および調製する。
- 129xgで4分間細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを5mLのヒトiPSC培地に再懸濁する。 37℃で1時間、細胞懸濁液を0.1％ゼラチンコート5cm細胞培養皿に移し、MEFを除去し、hiPSC収率を最大にする。他の5cmゼラチンコートディッシュに培地（非付着細胞を含む）を移す。
- トランスファーピペットを使用して、非接着細胞を15mL遠心管に移す。 3 mL培地でプレートを静かにすすぎ、15 mLチューブに加えます。
- 129xgで4分間細胞懸濁液を遠心分離し、超遠心分離機を吸引する培地にペレットを静かに再懸濁する。自動細胞計数器を用いて細胞数を決定する。 96ウェルの低接着性のV底プレートに9,000細胞/ウェルのプレート。
- プレートを163×gで3分間遠心分離する。 37℃、湿度95％、CO 2 5％でプレートをインキュベートする。ピペットを使用して、1日おきに培地の半分を取り出し、新鮮な化学的に定義された分化培地1（DM1; 図1 ; Table of Materials）で14日間交換することにより、50％培地を交換する。
2.無血清胚様体（SFEB）誘導（ 図2 ）
- 6ウェルプレートに40μmの細胞培養インサートを置き、凝集物の添加の少なくとも1時間前に1mLのDM1培地を加える。
- 14日目に、40μlの細胞培養インサート上に200μLの幅のある先端チップを用いて20μlの培地で凝集物を移し、培地をDM2に変更する。
7、17、18から採取した器官型海馬スライス培養で使用されています。- 一つの細胞培養インサートに4-6個の凝集体を移し、凝集体の間に十分な空間を確保する。微細なピペットチップ（ 例えば、 200μLチップ）を使用して、可能な限り過剰な溶液を除去する。
注：SFEBの周りから取り除かれた溶液として、細胞培養インサート上を移動するので、SFEBを短時間妨げることは許容される。 - 37℃、湿度95％、5％CO 2で1mLのDM2で培養物を維持する。ピペットを使用して、75％媒体の3/4を取り除き、3/4の新鮮な媒体に交換することによって、1日おきに培地を交換する。例えば、750μLの培地を除去し、750μLの新鮮な培地を加える。
- 一つの細胞培養インサートに4-6個の凝集体を移し、凝集体の間に十分な空間を確保する。微細なピペットチップ（ 例えば、 200μLチップ）を使用して、可能な限り過剰な溶液を除去する。
- 培養の14日後、1日おきに、そしてさらに16日間、75％培地交換でDM3培地に切り替える。
- 30日を超えて細胞培養挿入物上のSFEBを維持するために、培地を60,90および120日間毎日交換する。
注：SFEBは直径約1,000μmまで成長し、通常100-150μmの厚さになります1 。
3. SFEB組成の決定
- 200μLの広口ピペットチップを使用して、培地をゆっくりピペッティングすることにより、インサートからSFEBを分離する。 SFEBを移送するには、広い口のピペットチップを使用してピペットの先端に軽く体を吸引します。 SFEBをピペットチップにロードした後、12ウェルプレートに静かに移し、300μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）/ウェル。
注：SFEBは12ウェルプレート中の溶液中に懸濁する。これは、固定剤、ブロッキング溶液、および抗体の完全な浸透を可能にするために重要である。染色に複数のSFEBを使用する場合、12ウェルプレートの1ウェルあたり最大10のSFEBを添加することができる。これは溶液と抗体を保存します。 - 1ウェルあたり300μLの4％パラホルムアルデヒドを含むSFEBを室温で30〜45分間固定する。固定したSFEBを300μLのPBSで2回、各洗浄で3〜5分間洗浄する。
注意：パラホルムアルデヒドを取り扱う際は、適切な個人用保護具を着用してください。
注：この研究のニワトリのTuj1でニューロンをマークする成熟、細胞タイプ等を決定するためのマーカーに対する免疫反応のためのプローブが1で使用した：追加のマーカーについて、500、表2及び参考文献1、16を参照してください。 - 0.1％Triton-X100をPBSおよび10％正常ロバ血清（ブロッキング溶液;300μl; 1ウェルあたりL）で室温で1時間インキュベートした。
- ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中の一次抗体300μLでSFEBを処理する。 4℃で一晩インキュベートする。 0.1％トリトン-Xを含む300μLのPBS中でSFEBを3回洗浄する（1回の洗浄につき3〜5分）。
- 二次抗体をブロッキング溶液で1：1000に調製する。二次抗体を用いてSFEBを室温で1時間インキュベートする。 300μLのPBSでSFEBを洗浄し、それぞれ3〜5分間3回洗浄する。
注：この段階でSFEBはイメージングの準備ができます。 - 画像を得るには、ワイドボアピペットを用いてガラススライド上にSFEBをピペットで入れる。静かな吸引を使用して、SFEB周囲の余分な溶液を除去する。
注：同様の染色条件では、複数のSFEBを同じスライドガラスに置くことができます。 - SFEB上に1滴の封入剤を加え、ガラスカバースリップを置き、軽く押して気泡がないことを確認します。マウントメディアを固めて、イメージングと定量に進みます（ステップ3.8）。
- SFEB横切って関心領域（ROI）の複数の領域を取り、参考文献1、16に記載されているように、標準的な共焦点顕微鏡で各ROIを介して最大の投影画像と合成Zスタックを用いて、細胞の定量を行います。
注：全体SFEBsは画像ベースのタイルを（詳細は参考文献1、16を参照）を用いて定量することができます。 SFEBは約100μmまで薄いので、組織内での光の散乱が最小であり、したがって、2光子顕微鏡検査の必要性はない。線維芽細胞由来のiPS細胞でこのプロトコルの以前の用途はCGEおよび前前脳運命1、16に類似していた転写アイデンティティと介在ニューロンの亜集団で複雑かつ多様な構造を明らかにしたSFEB運命マップを生成しました。
4. MEAを用いたSFEBにおける神経活動の記録
- 製造元の指示に従って12ウェルMEAプレートを調製する。
- MEAプレートを無菌条件下で滅菌H 2 Oで5分間3回洗浄して洗浄する。 75％エタノールで5分間洗浄し、次に100％エタノールで洗浄してプレートを滅菌する。
- プレートをオーブンで50°Cで4〜5時間反転させて滅菌処理を完了させます。
- 各ウェルに500μLの0.2％ポリエチレンイミン溶液（PEI）を添加し、室温で1時間インキュベートする。 PEIを吸引し、滅菌蒸留H 2 Oでウェルを4回洗浄する。フード内で一晩空気を乾燥させる。
- L15培地中のラミニンの20μL/ mL溶液を調製し、各ウェルの中央に10μLのラミニンを添加する。
注記：周囲の参照電極と接地電極を被覆しないでください。 - 培地またはラミニンの蒸発を防ぐために、周囲のリザーバに滅菌dH 2 Oを添加する。プレートを37℃で1時間インキュベートする。
- SFEB（セクション1および2を参照）を、ラミニンコーティングされたMEAプレートに、それらを静かに広口ピペットチップに吸引し、それらを移すことによって添加する。各ウェルにDM2培地200μLを添加し、37℃、湿度95％および5％CO 2で一晩インキュベートする。
- 24時間後に200μLの培地を追加し、プレートを読み取る前に37℃、湿度95％、5％CO 2で30分間回復させる。
- MEAプレートをプレートリーダー（37℃に予熱）に入れ、神経活動を記録する。関連するMEAレコーディングソフトウェアで10分間活動を記録する。詳細は、参考文献19を参照してください。
- 統計分析ソフトウェアを使用して、未処理のデータ連続ストリームおよびニューロン活動のラスタプロットを生成します19 。
注：MEA記録は、SFEBメッキの7日後に撮影されます。この研究のために、記録を10分間行い、ネットワークバースト活性を検出した漸進的なトレース、およびラスタプロットが含まれます。 SFEBはMEAプレート上で長期間維持することができ、環境的に制御された条件を用いて長期間にわたって記録することができます（ 図6 ）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本発明者らの技術を用いて増殖させたSFEBは、初期の発達中の皮質下脳室ゾーンに類似した形態学的特徴を有する組織をもたらし、広範囲のTuj1陽性ニューロンならびに神経前駆細胞（ 図3A ）が充満した。 SFEBの外層および内層には、数多くの発育中の皮質のロゼットが観察された（ 図3B ）。 SFEBの外縁は、分裂終了ニューロンを含む発達中の皮質プレートに似ている。これは、最も腹側の外側皮質層における神経前駆細胞のマーカーであるBrn2の発現によって支持される。発達中の皮質の外層で発現されるCajal-Retzius細胞またはそれらの前駆細胞であり得るリーリン陽性細胞も、SFEBにおいて観察される（ 図3C ）。このプロトコルを使用して増殖させたSFEBは、混合尾部（CGE）および内側神経節と一致するマーカーを発現するnic eminence（MGE）起源です。 CGEマーカーCouptf2およびMGEマーカーNkx2.1を発現する他の細胞を発現する細胞を培養物中で観察することができる（ 図3D ）。これは、部分的には、プロトコル中のDKK-1の使用によるものであり、これは内側の運命を増強することが示されている20 。
このプロトコールを用いて作製されたSFEBは、カルレチニンおよびカルビンジン陽性介在ニューロン（ 図4A ）ならびにVGLUT陽性興奮ニューロンおよびTbr1陽性グルタミン酸作動性神経前駆細胞（ 図4B ）の両方を生じる。平均して、我々はSFEB中の全細胞の61％がVGLUT陽性であり、43％がTbr1陽性であることを観察した（ 図4C ）。これは、同様のプロトコル21を使用する他のレポートと一致しています。さらに、SFEBは、生理的アッセイ、例えば、生細胞カルシウムイメージングより生理学的に関連した環境で神経ネットワーク機能を観察するために、Fluo-4のようなマーカー（ 図5 ）を使用した。 SFEBは長期間MEA記録に供され、皮質ネットワークレベルのバースト発生を示す（ 図6 ）。
図1：SFEBの準備の初期段階の概要。 iPSCを酵素解離を用いて収穫した後、それらを96ウェルプレートに播種し、163×gで3分間遠心分離して迅速な凝集を誘導する。 14日間のin vitro （DIV）後に、96ウェルプレートからワイドボアピペットを介して細胞培養インサート含有6ウェルプレートに細胞凝集物を移すことができる。 viをクリックしてくださいこの数字のより大きなバージョン。
図2：SFEBの成長と拡大中の中程度の変化と段階のタイムライン SFEBをインサートに移した後、インビトロで14日および28日に 2回の培地交換を行う（DIV）。これらは通常、DIV 30,60および90での実験のために収穫される。上部インセットは、このプロセスにおいて異なる段階を示す。スケールバー=1,000μm（左端）。 1000μm（DIV20）。 600μm（DIV30）。 300μm（単一のSFEB）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：一般的な形態学的特性このプロトコルを使用して成長させたSFEBsのtics。 （ A ）前駆マーカーネスチン（緑）、有糸分裂後神経マーカーTuj1（赤）および核染色（青）を発現するSFEBの典型的な外縁。 （ B ）SFEBは、外層（左画像）と内層（右）の両方に特徴的な皮質のロゼットを示す。それらは、前駆細胞マーカーおよび成熟ニューロンマーカーの両方を発現する。 （ C ）外層/皮質プレートマーカーBrn2（緑色）および発生中のCGEマーカーCouptf2（赤色）を発現するSFEBの代表的な外縁。 （ D ）このプロトコルを用いて作成されたSFEBは、Pax6（赤色）染色によって見られる腹側の新皮質構造を表し、Nxk2.1（赤色）などのいくつかのMGE起源と一致するマーカーを発現する。スケールバー=40μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：SFEBにおける主要なニューロン細胞型の画像。 （ A ）SFEBのいくつかのニューロンは、カルビンジン（緑色、左画像）およびカルレチニン（緑色、右画像）などの皮質介在ニューロンと一致するマーカーを発現する。 （ B ）SFEBは、VGLUT-1陽性グルタミン酸作動性ニューロン（赤色、左画像）およびTbr1を発現するグルタミン酸作動性前駆体（赤色、右画像）を示す。スケールバー=40μm。 （ C ）VGLUT-1またはTbr1のいずれかを発現する興奮ニューロンの典型的な収率（エラーバー= SEM）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5：ライブセルカルシウム記録</ strong>（左画像）代表的な外縁SFEBは、ニューロンのカルシウム指標であるFluo-4で治療されています。細胞は、自発的なカルシウム過渡（測定されたカラーボックス）の測定のためにマークされる。 （右側の画像）赤いボックス（上のトレース）または緑のボックス（下のトレース）でマークされた自発的カルシウム過渡状態を示す選択された細胞。スケールバー=40μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6：SFEBの複数電極アレイ記録。 （上）MEAプレートに取り付けられたSFEBの代表的な画像（スケールバー=100μm）。 （中および下）SFEBは、長期間にわたってMEAに記録され、成熟を示すことができる。 （中および下;左）3つのSFEBの広範囲のバーストマップが、1つのウェルの3つのウェル2ウェルMEAプレートでは、より暗い色は、30日目と90日目の間に増加する全体のスパイク活動がより高いことを表す（累積活動マップ）。 （中および下、右）未処理のトレース（上）および全ウェルラスタプロット（下）は、スパイクの数および時間の経過に伴うバーストの数の増加を示します。 SFEBにおけるより強力なネットワーク形成を示している。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 抗体 | 希釈 | 種 |
| ネスチン | 0.111111111 | マウス |
| Brn-2 | 0.388888889 | ウサギ |
| VGLUT1 | 0.111111111 | ウサギ |
| Pax6 | 0.25 | ウサギ |
| カルレティニン | 0.180555556 | ウサギ |
| カルビンダイン | 0.319444444 | ウサギ |
| CoupTFII | 0.180555556 | マウス |
| Nkx 2.1 | 0.180555556 | ウサギ |
| Tuj1 | 0.388888889 | チキン |
| リーリン | 0.388888889 | マウス |
| Tbr1 | 0.180555556 | チキン |
| NFH | 0.25 | マウス |
表1：本研究で使用した抗体。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本明細書に記載のプロトコルは、hiPSC供給源を、前頭皮質の初期発達段階を再現する3-D構造に区別するための条件を提供する。この手順は、電気生理学のために調べることができ、顕微鏡検査も受け入れやすい構造をもたらす。 SFEBの最終形態は、器官型脳スライス培養のものに似ており、高品質の詳細な共焦点イメージングを可能にする。このプロトコルは、線維芽細胞および末梢血単核細胞由来のhiPSCの両方からSFEBを首尾よく生成することができる。末梢血単核細胞由来hiPSCから作製されたSFEBは、線維芽細胞由来hiPSCから作製されたSFEBと類似の形態学的特徴を示す。
このプロセスは、他の3-Dスキームと同様に、小分子の細胞外手がかりを用いて細胞運命の決定を導く。これは、細胞間接触の固有の特性と組み合わされ、より現実的なネット環境を作り出します仕事の形成と神経の機能。他のレポートは、小分子の細胞外シグナルの適切な組み合わせは、中脳ドーパミン作動8、22、及び皮質介在ニューロン8、16、23などの細胞運命決定のために十分であることを示しています。しかし、3-Dシステムでは、2-D相当物5に比べ成熟の加速時間を示します。十分な時間が与えられれば、3-D培養物は成熟の増加を示した。このような性質は、SFEBのような3-Dプラットフォームの有用性を強く支持する。ライブと高品質の顕微鏡の付加的な利点は、原材料の柔軟性とともに、このプロトコルの説得力のある議論です。
さらに、このプロトコルを使用して作成されたSFEBは、他の報告された研究と多くの類似点を共有している13 、 24 。参考文献24に関して、このプロトコールおよびニューロンの生理学的検証はそれを先験している。例えば、参考文献13、24に報告された研究は、ニューロンのような皮質を導出するデュアルSMAD阻害の同様のバージョンを使用し、グルタミン酸作動性ニューロン及び前駆細胞の同様の割合（約50％）を得ました。さらに、Mariani、J 。 （文献13 ）は、このプロトコールと同様のPax6およびNestin染色を25〜30日の時点で報告している。定性的には、Brn2の染色パターンならびにGFAP陽性星状細胞の発現は、参考文献24に報告されたものと同様である。しかしながら、このプロトコールは、2つの一般的に使用されるオルガノイド方法論よりも多くの利点を有する。まず、Mariani、J 。 13日目にDlx陽性介在ニューロンの発症を報告し、免疫染色法によってのみ確認された。このプロトコールを用いて、Dlx陽性介在ニューロンは30日目に産生される。これらの介在ニューロンは、単一細胞電気生理学およびGABA 16の単細胞薬理学的適用によって機能的であることが確認された。さらに、 13の著者は、ニューロンの機能的連結性を主張しているが、染色のみを用いて決定した。このプロトコルを使用して作成されたSFEBは、ネットワークの単一電極刺激およびカルシウムイメージングに供され、発達中の皮質ネットワークが接続され、機能的であることを示している。 Pasca、 et al。 24は 、オルガノイド様構造からの記録を得るためにクライオスタットを用いて凝集体を切断する。このプロトコルを使用して作成されたSFEBは切片化を必要とせず、インサート1の間に直接記録することができる。非区画化SFEBから記録されたニューロンは、分裂後の活動電位および抑制後シナプス電位を有することが示されているG 1、16。
SFEBは、出発材料として線維芽細胞およびPBMCの両方を用いて作製することができる。 hiPSCs（例えば歯髄、包皮、尿）をもたらす他の組織タイプを使用することも可能である25、26、27、小分子のいくつかは同様の結果を達成するために変更する必要があるかもしれません。このプロトコルのために、DKK-1の使用は、腹部の運命28に向かってSFEBを推進する上で重要である。この腹側化は、部分的にCGE様起源の介在ニューロンの分化に関与している16 。 DKK-1は高価な小分子であるため、高濃度のソニックヘッジホッグを使用してこのプロトコールでDKK-1を補うことができます。しかし、DKK-1によるWnt阻害の濃度は、エンドユーザーによって経験的に決定されなければならない。さらに、XAV939、別のWntインヒビターrは、この阻害剤の使用がMGE 23と転写アイデンティティを共有する組織を生じるが、腹腔内の運命に向けての分化を促進するのに役立つ。
このプロトコールに記載されているSFEBのような3D hiPSC培養系を開発する場合、これらの構造が培養から培養まで適度な量の異種性を生じることを覚えておくことが重要です。これはiPS細胞からのニューロン分化の確率的性質に起因自発内因性自己組織29、30で得られたSFEBにおける細胞-細胞接触開始に部分的に起因しています。したがって、異質性という文脈でこの手法の有用性を解釈することは重要です。このシステムにおける異種性の影響を最小限にする方法には、多数のSFEBを作成して、それらがシステムの自然な変化を表し、厳密に各生産操作の開始時に播種された細胞数および試薬を含む。清潔なiPSCコロニーから始め、iPSC解離中の酵素解離ステップ中に最小限の粉砕を適用して細胞生存率を高めることが重要です。粉砕後の細胞生存率は、高品質で一貫したSFEBを得る上で重要な要素である。代替的なトラブルシューティングステップとして、解離後および必要であればトリパンブルーを用いて遠心分離ステップの前に生存度をチェックすることができる。 ROCKiが早期の解離および分化段階の間に適切に使用されない場合、生存能力および自発的分化に影響を及ぼし得る。一貫して高品質のSFEBを得るためには、ROCKiの使用と最初の7-10日間の50％フィード中の段階的減少が重要です。
さらに、単層調製物を用いて作製した同じ細胞株で観察されたものと3D SFEBの結果を確認するための確認工程として有用であることが多い。 Understa2つのシステムが各実験コホート内でどのように相互比較するかを特定することは、所与の疾患モデルの複雑さを理解する上で極めて有用である。最後に、SFEBを用いて、より均一な2D単層システム16でのさらなる研究のために、蛍光活性化細胞選別を用いて細胞集団を分類および精製することができる16 。
それにもかかわらず、このプロトコールを用いて作製されたSFEBは、小さな発達皮質回路を研究するのに有用である。この技術の将来的な応用には、高いコンテンツアプローチを用いた電気生理学的記録の多重化が含まれる。実際に、細胞チャンバーインサートは、96ウェルプレートフォーマットでの使用のために製造される。これらのインサートは、6穴インサートの代わりにここに記載されているSFEBプロトコルで使用できます。この方法を用いてスケーラビリティを示すためには、所与のコホート内の複数の系統およびクローンを用いてSFEBを作製する必要があり、一貫性を探すために堅牢な細胞ベースのアッセイセットでスクリーニングする必要がある薄い文化。例えば、ニューロンの数、形態、および層の発達は、96ウェルフォーマットを用いてアッセイすることができる。理想的には、細胞ベースのアッセイは、96ウェルプレートに拡張可能なMEAなどの高含量の電気生理学的アッセイと組み合わせる必要があります。
このSFEBプラットフォームは、神経疾患における早期皮質ネットワーク開発の役割を解読すること、特に遺伝学と初期の神経発達との間に相互作用が存在する可能性がある場合に、その可能性を秘めています。我々は、ラットおよびマウスの研究で示されているように、それがスライスカルチャーと同様に扱われ得ることを実証した。このシステムを用いた有用な将来の研究は、マウスの体内構造とSFEBとの間の発達的な比較解剖学および生理学を中心にすべきである。この比較データは、創薬および基礎研究のための真に翻訳システムを開発する上で非常に強力です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には競合する金銭的利益はない。
Acknowledgments
記事を校正してくれたElizabeth Benevidesに感謝します。私たちはDrsに感謝します。ジョン・ハスマンとジーン・ブラットが彼らの有益な議論とコメントのために語った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
