Summary
여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.
Abstract
많은 in vitro 질병 모델이 hiPSCs를 사용하여 개발되었지만, 한 가지 제한점은 이러한 2 차원 (2-D) 시스템이 의심되는 질병 변이를 가진 감염된 개인의 기본 세포질 및 기능적 복잡성을 나타내지 않을 수 있다는 것입니다. 기존의 2D 모델은 생체 내 유사 구조의 불완전한 표현으로 남아 있으며 뇌의 복잡성을 적절히 포착하지 못합니다. 따라서, 생체 내 시스템 에서 보이는 세포 상호 작용 및 기능을보다 잘 나타낼 수있는 3-D hiPSC- 기반 모델에 대한 필요성이 대두되고있다.
여기서는 무 혈청 배아 체 (SFEB)에 기초한 미분화 된 hiPSCs로부터 3-D 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고한다. 이 3-D 모델은 발달중인 신피질의 양상을 반영하고, 이동하는 신경 세포 및 이동성, 연결성, 통신 및 매트와 같은 손상되지 않은 조직에 필수적인 기능에 대한 연구를 허용합니다uration. 특히 우리는 우리의 프로토콜을 사용하는 SFEB가 칼슘 이미징과 같은 생리 학적으로 관련성이 높은 고농축 세포 기반 분석법 및 cryosectioning없는 다중 전극 배열 (MEA) 기록을 사용하여 조사 될 수 있음을 입증합니다. MEA 기록의 경우, 우리는 SFEB가 장기간 배양하는 동안 스파이크 활동과 네트워크 수준 파열 활동을 증가 시킨다는 것을 입증합니다. 이 SFEB 프로토콜은 초기 대뇌 피질 발달의 양상을 포착하는 3-D 모델에서 네트워크 형성을 개발하는 연구를위한 견고하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다.
Introduction
우리는 이전에 초기 대뇌 피질의 네트워크 개발 1의 일부 측면을 되풀이되었습니다 환자 유래 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 생성 된 3-D 모델 시스템을보고했다. 혈청없는 배아 체 (SFEB) 인이 3-D 모델은 이전의 단순 응집 hiPSC 모델 2 , 3을 향상시킵니다. 우리의 SFEB와 같은 3D 구조가 2 차원 (2-D) / 단일 층 hiPSC 모델 4 , 5 에서 관찰 된 것보다 더 일찍 생체 내 에서 관찰 된 신경 발달의 대략적인 양상을 드러내고있다. 초기 연구는 생리 학적 복잡성을 입증하지 않고 3 차원 신체의 자기 조직화 복잡성에 초점을 두었습니다 2 .
여기에 설명 된 프로토콜은 섬유 아세포에서 유래 undifferentiated hiPSCs에 사용되었습니다 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC). 이 세포는 γ 선발 마우스 배아 기 (MEFs)에서 유지됩니다. 이러한 hiPSC 콜로니를 자발적으로 분화 된 세포에서 수동으로 세척하고, 효소 적으로 수확하고, Rho 키나제 억제제 Y-27632 (ROCKi)를 함유하는 배지에 재현 탁한다. 미분화 hiPSC는 96 웰 저 접착 V 바닥 플레이트로 옮기기 전에 해리 및 원심 분리를 거친다. 도금 후, 앞쪽 전두엽의 뇌신경 - 운명 계통 6 을 구동하기 위해 이중 SMAD 억제 (dickkopf 1 (DKK-1)와 함께 SB431542 및 LDN193189)를 사용하여 신경 유도를 개시한다. 14 일 후, SFEB는 6- 웰 플레이트의 세포 배양 삽입물로 옮겨진다. 전달 된 라운드 SFEBs는 유사한 세포 배양 삽입물 1 , 2 , 3을 사용하여 해마 기관 체적 슬라이스 배양 조제 물에서 종종 관찰되는 바와 같이 국부적 인 네트워크 연결을 유지하면서 퍼지고 얇아지기 시작한다 .ss = "xref"> 7.
이 형식의 SFEB 기반 3-D 플랫폼의 사용은 단일 세포 기록 또는 다중 전극 배열 (MEA)과 같은 칼슘 이미징 또는 전기 생리 학적 분석과 같은 세포 기반 생리 학적 분석을 사용하여 조사 할 수있는 대뇌 피질 네트워크의 효율적 생산에 적합합니다 ) 1 . 3-D 시스템이 초기 피질 발달 지표를 지니고 있지만, 다른 연구들에 의하면 이러한 3-D 몸체는 본질적으로 인간 조직 발달 속도가 느려지도록 더 긴 배양 시간을 필요로 할 수 있습니다 8 . 이 SFEB 프로토콜은 피질의 초기 발달 양상을 파악하는 미분화 된 hiPSC로부터 3 차원 SFEB를 성공적으로 생성합니다.
SFEB가 신경계 장애에서 네트워크 수차를 모델링 할 수있는 가능성은이 시스템의 강점입니다. 환자 조직으로부터 유래 된 hiPSCs는 엉덩이에 영향을받는 신경계의 세포로 성장할 수있다세포 생물학뿐만 아니라 수반되는 유전자 발현과 관련이있다. 인간 iPSCs은 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD), 정신 분열증 9 레트 증후군 (10), 및 알츠하이머 병 (11), (12) 복소 병인으로 신경계 장애를 변화와 개인의 큰 그룹의 유전 적 프로파일을 확인하기 위해 사용되고있다. 최근까지 iPSC 모델은 전형적으로 분자 상호 작용을 평가하는 데 능숙한 반면 생체 내에서 관찰 되는 복잡한 세포 상호 작용을 해독하는 데는 부적합한 단일 층 준비물이었습니다. 동물 모델은 전체 기관 플랫폼을 재생성하기위한 기본 대체품이었습니다. 이 동물 모델은 결과의 빈약 한 번역에 의해 괴롭혀지고, 대규모 유전 스크리닝 연구에 의해 확인 된 인간 유전 프로파일을 복제하는 능력이 제한되어있다. 따라서, iPSC로부터 3-D 시스템을 개발하면 인간에게 필요한 복잡성 계층이 추가됩니다질병 모델링 13 , 14 . 3D hiPSC 플랫폼 다음 단계는 세포 기반 분석법을 이용하여 스크리닝 15 처리량의 큰 규모의 요구 사항을 수용하기위한 것이다.
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Protocol
1. 신경 전구 세포의 생성
- 저분자가 보충 된 인간 iPSC 배지에서 γ- 조사 마우스 배아 피더 (MEF) 세포층상의 6 웰 플레이트에서 섬유 아세포 및 PBMC로부터 유래 된 hiPSC를 유지한다 (물질 표 참조).
참고 : 매일 유지 보수는 이전에보고 절차 (1), (16)의 수정 된 버전입니다.- 플레이트 300 μL / 잘 권장 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)에 6 잘 조직 문화 등급 플레이트의 각 우물에 플레이트 6 X 10 5 MEFs.
- 48 시간 후, hiPSCs를 첨가하기 전에 MEFs 배지를 300μL / 웰 hiPSC 배지로 1 시간 동안 대체한다.
- 37 ° C 수조에서 hiPSC를 빠르게 녹이고 천천히 1 mL의 hiPSC 배지를 적가한다. hiPSCs와 매체를 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다. 총 부피가 5 mL가되도록 매체를 넣으십시오. 129 X에서 4 분 동안 원심 분리기, supernata을 대기음1 : 1,000 농도에서 ROCK 억제제가있는 1 mL hiPSC 배지에서 펠렛을 부드럽게 재현 탁하십시오.
- 플레이트를 세포 현탁액 (일반적으로 300,000 세포 / 잘시) MEF 세포 레이어와 37 ° C, 5 % CO 2 , 95 %의 습도에서 품어.
- 광학 현미경을 사용하여 iPSC 배양을 면밀히 모니터링하십시오. 48 시간 후, 가장자리가 고르지 않은 배양 물을 제거하고, 광학 현미경 하에서 낭성과 같은 형태 또는 황갈색의 형태로 자라서 자발적 분화를 최소화한다.
참고 : 7-10 일 후, hiPSC 콜로니가 형성되어야합니다. 식민지는 경계가 명확하고 세포 밀도가 균일해야하며 둥근 모양이어야하며 느슨하게 포장 된 불균일 한 세포가 없어야합니다. - 자발적으로 분화 된 세포의 문화를 취소 라운드 hiPSC의 식민지를 수동으로 선택합니다. 새 MEF 층에 식민지를 놓습니다. 콩쿠리 근처에있는 배양액이 얼어 붙을 때마다 1 : 3 간격으로 펼쳐보십시오 ( 1 , 16) .
- 확장 및 냉동 세포 (백업을위한) 후 50-75 % 합류에 도달 할 때까지 플레이트에 hiPSC 식민지를 자랍니다.
- 7 일 후 도금 후, 신경 전구 세포 분화를위한 hiPSCs를 수확하고 준비하기 위해 온화한 효소 처리 (효소 용액 300 μL로 5-10 분) 및 부드러운 분쇄 (1,000 μL 피펫으로 2-4 회)를 사용하십시오.
- 세포 현탁액을 129 xg에서 4 분간 원심 분리하고, 상층 액을 흡인하고, 5 mL 인간 iPSC 배지에서 펠렛을 재현 탁한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 0.1 % 젤라틴 코팅 5cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 옮기고 MEFs를 제거하고 hiPSC 수율을 최대화합니다. 다른 5cm 젤라틴 코팅 접시로 매체 (비 부착 세포)를 전송하십시오.
- 전송 피펫을 사용하여 15 ML 원심 분리기 튜브에 비 접착 세포를 전송합니다. 부드럽게 3 ML 매체와 플레이트를 씻어 15 ML 튜브에 추가하십시오.
- 4 분 동안 129 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기, 대기음을 대기음원심 분리하고 부드럽게 매체에 펠렛을 resuspend. 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하십시오. 96- 웰 저 밀착 V- 바닥 플레이트에 9,000 세포 / 웰 플레이트.
- 플레이트를 163 xg에서 3 분간 원심 분리하십시오. 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 플레이트를 품어. 피펫을 사용하여 배지의 절반을 제거하고이를 화학적으로 정의 된 새로운 분화 배지 1 (DM1; Figure 1 ; Table of Materials) 로 14 일 동안 대체하여 매일 50 % 배지를 교환하십시오.
2. 무 혈청 배아 체 (SFEB) 유도 ( 그림 2 )
- 6 잘 접시에 삽입 40 μm의 세포 배양 삽입 및 집계의 추가 적어도 1 시간 전에 1 ML DM1 매체를 추가합니다.
- 14 일째, 40 μm의 세포 배양 삽입물에 200 μL 넓은 입 끝을 사용하여 20 μL 배지로 응집체를 옮기고 배지를 DM2로 바꿉니다.
7 , 17 , 18 에서 촬영 organotypic hippocampal 슬라이스 문화와 함께 사용됩니다.- 하나의 세포 배양 삽입물에 4-6 개의 응집체를 옮기고 응집체 사이에 충분한 공간을 확보하십시오. 미세 피펫 팁 ( 예 : 200 μL 팁)을 사용하여 최대한 많은 과량의 용액을 제거하십시오.
참고 : SFEB 주위에서 제거 된 용액으로 세포 배양 삽입물을 움직일 때 SFEB를 잠시 방해하는 것은 허용됩니다. - 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 DM2 1 ML에서 문화를 유지. 피펫을 사용하여 75 %매체의 3/4을 제거하고 4 분의 3의 새로운 매체로 교체하여 격일로 배지. 예를 들어, 750 μL의 배지를 제거하고 750 μL의 새로운 배지를 첨가하십시오.
- 하나의 세포 배양 삽입물에 4-6 개의 응집체를 옮기고 응집체 사이에 충분한 공간을 확보하십시오. 미세 피펫 팁 ( 예 : 200 μL 팁)을 사용하여 최대한 많은 과량의 용액을 제거하십시오.
- 문화의 14 일 후, 다른 하루와 다른 16 일 동안 75 % 매체 변화와 DM3 매체로 전환합니다.
- 30 일이 넘는 세포 배양 삽입물에 SFEB를 유지하려면 60, 90 및 120 일 동안 배지를 매일 교체하십시오.
참고 : SFEB는 직경이 약 1,000 μm까지 성장하며 일반적으로 100-150 μm 두께입니다 1 .
3. SFEB 구성 결정
- 200 μL 와이드 입 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 매체를 pipetting하여 삽입에서 SFEBs를 분리하십시오. SFEB를 옮기려면 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 몸체를 피펫 팁으로 부드럽게 흡입하십시오. SFEB를 pipet tip에 넣은 후 부드럽게 12-well plates에 옮기고 300μL phosphate buffered saline(PBS)로 1 웰당.
참고 : SFEB는 12- 웰 플레이트에서 용액으로 현탁 될 것이다. 고정액, 블로킹 용액 및 항체를 완전히 침투시키는 것이 중요합니다. 얼룩을지게하기 위해 여러 개의 SFEB를 사용하는 경우, 12 개의 웰 플레이트에 최대 10 개의 SFEB를 추가 할 수 있습니다. 이렇게하면 용액과 항체가 보존됩니다. - 30 ~ 45 분 동안 상온에서 4 % 파라 포름 알데히드 당 300 μL로 SFEB를 고정시킨다. 300μL PBS로 고정 SFEB를 두 번 씻고 3-5 분마다 씻으십시오.
주의 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
참고 : 표 2 참조 1, 16를 참조하십시오 추가 마커, 500 : 닭 Tuj1 1에서 사용 된이 연구에서 신경 세포를 마킹 성숙, 세포 유형 등을 결정하기 위해 마커로 면역 반응에 대한 조사. - 0.1 % Triton-X100 (PBS 및 10 % 정상적인 당나라 세럼) (blocking solution; 300 μL)로 실온에서 1 시간 동안 처리 하였다.
- 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 1 차 항체 300 μL로 SFEB를 처리하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 0.1 % 트리톤 X를 함유 한 300 μL PBS로 SFEB를 세 번 세척 (3-5 분 / 세척)하십시오.
- 2 차 항체를 블로킹 용액에 1 : 1000으로 준비한다. 2 차 항체와 실온에서 1 시간 SFEBs를 품어. SFEB를 300 μL PBS로 3 ~ 5 분씩 각각 씻으십시오.
참고 :이 단계에서 SFEB는 이미징을 준비 할 수 있습니다. - 이미지하려면, 와이드 보어 피펫을 사용하여 슬라이드 슬라이드에 피펫 SFEBs. 부드러운 흡입을 사용하여 SFEB 주변의 과도한 용액을 제거하십시오.
참고 : 유사한 염색 조건의 경우 여러 SFEB를 동일한 유리 슬라이드에 둘 수 있습니다. - SFEB에 장착 매체 한 방울을 넣고 유리 커버 슬립을 놓고 가볍게 눌러 기포가 없는지 확인하십시오. 장착 매체를 굳히고 이미징 및 부량 화 (단계 3.8)로 진행하십시오.
- 표준 공 촛점 현미경 (standard confocal microscope)에서 각 ROI를 통해 최대 투영 이미지와 결합 된 z- 스택을 사용하여 SFEB에서 여러 관심 영역 (ROI)을 가져 와서 참고 1 , 16에 설명 된대로 세포 정량화를 수행하십시오.
참고 : 전체 SFEB는 이미지 기반 타일링을 사용하여 정량화 할 수 있습니다 (자세한 내용은 참조 1 , 16 참조). SFEB가 약 100 μm로 얇기 때문에 조직에 빛의 산란이 최소화되므로 2- 광자 현미경 검사가 필요하지 않습니다. 섬유 아세포 유래 iPSCs 프로토콜이 이전 사용은 CGE 및 전방 전뇌 운명 1 16 닮은 전사 정체성의 interneurons의 개체군과 복잡하고 다양한 구조를 드러냈다 SFEB 운명 맵을 생성.
4. MEAs를 사용하여 SFEBs의 연결 활동을 기록
- 제조 업체의 지침에 따라 12 잘 MEA 플레이트를 준비합니다.
- 무균 조건 하에서 2 O 깨끗하게 멸균 H 5 분간 MEA 플레이트를 3 회 반복한다. 75 % 에탄올로 5 분간 씻은 다음 100 % 에탄올로 세척하여 플레이트를 멸균하십시오.
- 50 ° C에서 4 ~ 5 시간 동안 오븐에서 접시를 거꾸로 굽혀 살균 과정을 완료하십시오.
- 각 우물에 500 μL 0.2 % polyethyleneimine 솔루션 (PEI)을 추가하고 실온에서 1 시간 품어. PEI를 대기음으로 멸균 증류수 H 2 O로 4 번 씻으십시오.
- L15 배지에 laminin 20 μL / ML 솔루션을 준비하고 각 우물의 중심에 10 μL laminin를 추가합니다.
참고 : 주변 참조 및 접지 전극을 코팅하지 마십시오. - 매체 또는 라미닌 증발을 방지하기 위해 주변 저수지에 멸균 dH 2 O를 추가하십시오.37 ° C에서 1 시간 동안 플레이트를 품어 라.
- 부드럽게 그들을 넓은 입 피펫 팁으로 흡입하여 그들을 전송하여 laminin 코팅 MEA 플레이트에 SFEBs (섹션 1 및 2 참조)를 추가하고 그들을 전송합니다. 각 우물에 200 μL DM2 매체를 추가하고 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 밤새 품어.
- 24 시간 후에 추가로 200 μL 매체를 추가하고, 플레이트를 읽기 전에 37 ° C, 95 % 습도, 5 % CO 2에서 30 분 동안 회복 할 수있다.
- MEA 플레이트를 플레이트 판독기 (37 ° C로 예열 됨)에 놓아서 연결 활동을 기록하십시오. 관련 MEA 레코딩 소프트웨어로 10 분 동안 활동을 기록하십시오. 자세한 내용은 참조 19 를 참조하십시오.
- 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터 - 연속 스트림 및 연결 활동의 래스터 도표를 생성합니다 19 .
참고 : MEA 녹음은 SFEB 도금 7 일 후 촬영됩니다. 이 연구에서는 네트워크 버스트 활동을 감지하기 위해 10 분 동안 녹화를 수행했으며,뾰족한 자취 및 래스터 플롯이 있습니다. SFEB는 MEA 플레이트에서 장기간 유지 될 수 있으며 환경 적으로 통제 된 조건을 사용하여 장기간에 걸쳐 기록 될 수 있습니다 ( 그림 6 ).
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Representative Results
우리의 기술을 사용하여 성장한 SFEBs는 초기 Tuj1 양성 뉴런뿐만 아니라 신경 progenitors ( 그림 3A ) 가득한 초기 개발 피질 subventricular 영역을 닮은 형태학 특성과 조직을 굴복. SFEB ( 그림 3B )의 바깥 쪽 층과 내부 층에는 수 많은 발육 피질 로제가 관찰되었습니다. SFEB의 바깥 쪽 가장자리는 퇴행 후 뉴런을 포함하는 발달중인 피질 판과 유사합니다. 이것은 Brn2의 발현에 의해 뒷받침됩니다. Brn2는 대부분의 복근 외피층에서 신경 전구 세포의 마커입니다. 개발 피질의 바깥층에서 발현되는 Cajal-Retzius 세포 또는 그 전구 세포 인 Reelin 양성 세포도 SFEB에서 관찰됩니다 ( 그림 3C ). 이 프로토콜을 사용하여 성장한 SFEB는 혼합 꼬리 (CGE) 및 내측 신경절과 일치하는 표지자를 표현합니다nic eminence (MGE) 기원. CGE 마커 Couptf2 및 MGE 마커 Nkx2.1을 발현하는 다른 세포를 발현하는 세포가 배양 물에서 관찰 될 수있다 ( 도 3D ). 이것은 부분적으로 프로토콜에서 DKK-1의 사용으로 인한 것일 수 있으며 이는 내측의 운명을 향상시키는 것으로 나타났습니다 20 .
이 프로토콜을 사용하여 만든 SFEB는 calretinin 및 calbindin 양성 interneurons ( 그림 4A )뿐만 아니라 VGLUT 긍정적 인 흥분성 뉴런과 Tbr1 긍정적 인 glutamatergic 신경 progenitors ( 그림 4B ) 모두를 제공합니다. 평균적으로 우리는 SFEB의 전체 세포 중 61 %가 VGLUT 양성이고 43 %가 Tbr1 양성임을 관찰했습니다 ( 그림 4C ). 이것은 유사한 프로토콜을 사용하는 다른 보고서와도 일치합니다 21 . 또한, SFEB는 생체 내 칼슘 이미징 (생체 내 칼슘 이미징)보다 생리적으로 관련된 환경에서 신경망 기능을 관찰하기 위해 Fluo-4와 같은 마커를 사용합니다 ( 그림 5 ). SFEBs는 오랜 시간 동안 MEA 녹음을받을 수 있으며 피질 네트워크 수준 파열의 발달을 보여줍니다 ( 그림 6 ).
그림 1 : SFEB 준비의 초기 단계 개요. iPSCs가 효소 해리를 사용하여 수확 한 후, 96- 웰 플레이트에 플레이 팅하고 163 xg에서 3 분간 원심 분리하여 빠른 응집을 유도한다. 14 일 동안 체외 (DIV) 세포 응집체를 96 웰 플레이트에서 와이드 보어 피펫을 통해 세포 배양 인서트 - 함유 6- 웰 플레이트 상으로 옮길 수있다. vi를 클릭하십시오.이 그림의 큰 버전.
그림 2 : SFEB 성장 및 확장 동안의 중간 변화 및 단계의 시간 - 선. SFEB가 삽입물로 옮겨 진 후에, 체외 에서 14 일과 28 일 에 2 회의 중간 변화가 일어난다 (DIV). 그들은 일반적으로 DIV 30, 60 및 90에서 실험을 위해 수확됩니다. 상단 삽입은이 과정에서 다른 단계를 보여줍니다. 스케일 바 = 1,000 μm (맨 왼쪽); 1,000 ㎛ (DIV 20); 600 ㎛ (DIV 30); 300 ㎛ (단일 SFEB). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 일반적인 형태 학적 특성이 의정서를 사용하여 성장한 SFEBs의 tics. ( A ) 선조 마커 네스틴 (녹색), 사후 유사 분열 신경 마커 Tuj1 (적색) 및 핵 염색 (파란색)을 나타내는 SFEB의 전형적인 외부 가장자리. ( B ) SFEB는 바깥 쪽 레이어 (왼쪽 이미지)와 안쪽 레이어 (오른쪽) 모두에서 특징적인 피질의 장미를 나타낸다. 그들은 전구 모성과 성숙한 신경 마커 모두를 표현합니다. ( C ) 바깥 쪽 레이어 / 피질 플레이트 마커 Brn2 (녹색)과 개발 CGE 마커 Couptf2 (적색)를 표현 SFEB의 대표적인 외부 가장자리. ( D )이 프로토콜을 사용하여 만든 SFEBs는 Pax6 (적색) 얼룩으로 보이는 ventralized 신피질 구조를 대표하고 Nxk2.1 (적색)과 같은 일부 MGE 기원과 일치하는 표현 마커. 스케일 바 = 40 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : SFEBs에서 주요 연결 세포 유형의 이미지. ( A ) SFEB의 일부 뉴런은 calbindin (녹색, 왼쪽 이미지) 및 calretinin (녹색, 오른쪽 이미지)과 같은 피질 간질과 일치하는 마커를 표현합니다. ( B ) SFEBs는 VGLUT - 1 긍정적 인 glutamatergic 뉴런 (빨간색, 왼쪽 이미지)와 Tbr1 (빨간색, 오른쪽 이미지)를 표현 glutamatergic progenitors를 보여줍니다. 스케일 바 = 40 μm. ( C ) VGLUT - 1 또는 Tbr1 중 하나를 표현하는 흥분성 뉴런의 전형적인 수율 (오차 막대 = SEM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 라이브 셀 칼슘 녹음 </ strong> (왼쪽 이미지) 대표적인 외부 가장자리 SFEB는 연결자 칼슘 지시기 Fluo-4로 치료되었습니다. 세포는 자발적인 칼슘 과도 전류 (모듬 된 컬러 박스) 측정 용으로 표시됩니다. (오른쪽 이미지) 빨간색 박스 (상단 트레이스) 또는 녹색 박스 (하단 트레이스)로 표시된 자발적인 칼슘 과도 전류를 보여주는 선택된 세포. 스케일 바 = 40 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : SFEB의 다중 전극 어레이 기록. (맨 위) MEA 플레이트에 부착 된 SFEB의 대표 이미지 (스케일 막대 = 100 μm). (중간 및 하단) SFEB는 장기간에 걸쳐 MEA에 기록 될 수 있으며 성숙을 나타냅니다. (중간 및 하단; 왼쪽) 3 개의 SFEBs를 1 개의 3 개의 웰에 도금 한 넓은 파열지도2-well MEA plate에서 어두운 색은 30 일에서 90 일 사이에 증가하는 전반적인 스파이크 활동을 나타냅니다. (중간 및 아래쪽; insets) 누적 활동 맵은 SFEB의 피질 네트워크 내 스파이크 밀도 및 스파이크 영역의 증가를 보여줍니다. 30 일 및 90 일. (중간 및 아래쪽, 오른쪽) 원시 흔적 (위쪽) 및 전체 - 잘 래스터 그림 (아래쪽)은 스파이크 수와 시간에 따른 파열 수를 증가시킵니다. SFEBs의 강력한 네트워크 형성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항독소 | 노동 희석 | 종 |
| 네스틴 | 0.111111111 | 쥐 |
| Brn-2 | 0.388888889 | 토끼 |
| VGLUT1 | 0.111111111 | 토끼 |
| Pax6 | 0.25 | 토끼 |
| 칼레 티닌 | 0.180555556 | 토끼 |
| 칼빈딘 | 0.319444444 | 토끼 |
| CoupTFII | 0.180555556 | 쥐 |
| Nkx 2.1 | 0.180555556 | 토끼 |
| Tuj1 | 0.388888889 | 치킨 |
| Reelin | 0.388888889 | 쥐 |
| Tbr1 | 0.180555556 | 치킨 |
| NFH | 0.25 | 쥐 |
표 1 :이 연구에서 사용 된 항체.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 hiPSC 소스를 정면 피질의 초기 발달 단계를 반복하는 3 차원 구조로 차별화하기위한 조건을 제공합니다. 이 절차는 전기 생리학에 대해 조사 할 수있는 구조를 만들어내는 동시에 현미경 검사를 받아 들일 수 있습니다. SFEB의 최종 형태는 organotypic 두뇌 슬라이스 문화의 그것과 유사하고 고품질의 상세한 공 촛점 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 fibroblast 및 말초 혈액 mononuclear 세포 파생 hiPSCs에서 SFEBs를 성공적으로 생성 할 수 있습니다. 말초 혈액 단핵 세포 유래 hiPSC로 제조 된 SFEB는 섬유 아세포 유래 hiPSC로부터 생성 된 SFEB와 유사한 형태 학적 특성을 나타낸다.
이 과정은 다른 3-D 체계와 마찬가지로 소분자 세포 외 신호를 사용하여 세포 운명 결정을 유도합니다. 이것은 셀 - 셀 접촉의 본질적인 속성과 결합되어 더 현실적인 넷 환경을 만듭니다작업 형성과의 연결 기능. 다른보고에 따르면 소뇌의 세포 외 신호의 적절한 조합은 중뇌 도파민 성 8 , 22 , 피질 간질 8 , 16 , 23 과 같은 세포 운명 결정에 충분하다. 그러나, 3-D 시스템은 2-D의 5 당량에 비하여 가속 숙성 시간을 나타낸다. 적절한 시간이 주어지면 3-D 문화는 성숙도가 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 특성은 SFEB와 같은 3-D 플랫폼의 유용성에 대한 강력한 주장을 제시합니다. 라이브 및 고품질 현미경의 추가 장점은 소스 자료의 유연성과 함께이 프로토콜에 대한 매력적인 논증을 만듭니다.
또한,이 프로토콜을 사용하여 만들어진 SFEBs는 다른보고 된 연구들과 많은 유사점을 가지고 있습니다 13 , 24 번 . 참고 문헌 24 와 관련하여,이 프로토콜과 뉴런의 생리 학적 타당성 확인은 그것보다 우선합니다. 예를 들어, 참고 문헌 13 , 24 에보고 된 연구는 비슷한 버전의 이중 SMAD 억제를 사용하여 피질 유사 뉴런을 유도하고 비슷한 비율의 글루탐산 신경 세포와 전구 세포 (~ 50 %)를 얻었습니다. 또한, 마리아니, J. 등 알. (참고 문헌 13 )은 25-30 일 시점에서이 프로토콜과 유사한 Pax6 및 Nestin 염색을보고합니다. 양적으로, Brn2의 염색 패턴과 GFAP 양성 성상 교세포의 발현 양상은 참고 문헌 24 에서보고 된 것과 유사하다. 그러나,이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 두 가지 organoid 방법론보다 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, Mariani, J. et al. 13 일째에 Dlx 양성 뉴론의 발병을보고하고면역 염색법으로 만 확인되었다. 이 프로토콜을 사용하여 Dlx 양성 interneurons은 30 일에 생산됩니다. 이러한 interneurons는 단일 세포 electrophysiology 및 GABA 16 단일 세포 약리학 응용 프로그램에 의해 기능으로 확인되었습니다. 또한 13 명의 저자는 뉴런의 기능적 연결성을 주장하지만 염색법을 사용하여 만 결정했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 만든 SFEB는 네트워크 단일 전극 자극 및 칼슘 이미징을 통해 대뇌 피질 네트워크가 연결되어 기능적임을 보여줍니다. Pasca, et al. 24 는 organoid-like 구조로부터 기록을 얻기 위해 저온 저장 장치를 사용하여 응집체를 절단한다. 이 프로토콜을 사용하여 만들어진 SFEB는 절편을 필요로하지 않으며 삽입물 1 에 직접 기록 할 수 있습니다. 섹션 화되지 않은 SFEB에서 기록 된 뉴런은 분열 후 활동 전위와 억제 시냅스 후 잠재력을 갖는 것으로 나타났습니다1 g, 16.
SFEB는 출발 물질로서 섬유 아세포 및 PBMC 모두를 사용하여 제조 될 수있다. 유사한 결과를 얻기 위해 작은 분자의 일부를 변경해야 할지도 모르지만 hiPSC (예 : 치아 펄프, 포피, 소변) 25 , 26 , 27 을 초래하는 다른 조직 유형을 사용할 수도 있습니다. 이 프로토콜의 경우 DKK-1을 사용하면 SFEB를 정찰 된 운명 28 으로 몰아 넣는 데 중요합니다. 이 ventralization는 CGE 같은 기원 (16)의 interneurons의 분화에 부분적으로 책임이있다. DKK-1은 값 비싼 작은 분자이므로이 프로토콜에서 DKK-1을 보충하는 데 고농축 음파 고슴도치를 사용할 수 있습니다. 그러나 DKK-1을 통한 Wnt 억제 농도는 최종 사용자가 경험적으로 결정해야합니다. 또한, XAV939, 또 다른 Wnt inhibitor은이 억제제의 사용이 MGE 23 과 전사 동일성을 공유하는 조직을 산출 할지라도, 정체 된 운명으로의 차별화를 돕는 데 사용될 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명 된 SFEB와 같은 3D hiPSC 배양 시스템을 개발할 때, 이러한 구조가 배양에서 문화로 이질성의 중간 정도를 생성한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 이는 iPSCs에서 신경 세포의 분화 확률 적 특성으로 인해 자연 고유의 자기 조직화 (29), (30)의 결과로 SFEB에서 세포 - 세포 접촉 개시에 부분적이다. 그러므로, 이질성의 맥락에서이 기법의 유용성을 해석하는 것이 중요하다. 이 시스템에서 이질성의 영향을 최소화하는 방법에는 많은 수의 SFEB를 생성하여 시스템의 자연스런 변화를 나타낼 수 있습니다.시약 및 각 생산 작업이 시작될 때 시드하는 세포의 수. 청결한 iPSC 콜로니로 시작하고 iPSC 해리 동안 효소 해리 단계에서 세포 생존력을 증가시키기 위해 최소한의 분쇄를 적용하는 것이 중요합니다. 분쇄 후 세포 생존 능력은 고품질의 일관된 SFEB를 얻는 데 중요한 요소입니다. 대체 문제 해결 단계로, 생존력은 해리 후 및 필요할 경우 트리 판 블루를 사용하여 원심 분리 단계 전에 점검 할 수 있습니다. 생존력과 자발적 분화는 ROCKi가 초기 해리 및 분화 단계에서 적절하게 사용되지 않으면 영향을받을 수 있습니다. ROCKi의 사용과 처음 7-10 일 동안의 50 % 사료 공급 단계에서의 단계적 감소는 일관되고 높은 품질의 SFEB를 위해 매우 중요합니다.
또한 단일 층 준비를 사용하여 생성 된 동일한 세포주에서 관찰 된 결과와 함께 3D SFEB의 결과를 확인하는 검증 단계로서 종종 유용합니다. 언더 스타각 실험군 내에서 두 시스템이 교차 비교하는 방식은 주어진 질병 모델의 복잡성을 이해하는 데 매우 유용합니다. 마지막으로, SFEBs는보다 균일 한 2D 단층 시스템 16 에서의 추가 연구를 위해 형광 활성화 된 세포 분류를 사용하여 세포 집단을 분류하고 정제하는데 사용될 수있다.
그럼에도 불구하고이 프로토콜을 사용하여 생성 된 SFEB는 작은 발달 피질 회로를 연구하는 데 유용합니다. 이 기술의 향후 적용에는 고감도 접근법을 사용하여 전기 생리 학적 녹음을 다중화하는 것이 포함됩니다. 사실, 세포 챔버 삽입물은 96 웰 플레이트 형식으로 사용하기 위해 제조됩니다. 이 인서트는 6-well 인서트 대신 여기에 설명 된 SFEB 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 확장 성을 보이기 위해서는 주어진 코호트 내에서 여러 줄과 클론을 사용하여 SFEB를 생성해야하며 일관성을 찾기 위해 강력한 세포 기반 분석 세트를 통해 스크린해야합니다얇은 문화. 예를 들어, 뉴런 수, 형태학 및 층 발달은 96-well 형식을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 이상적으로 세포 기반 분석은 MEA와 같은 고 함량 전기 생리 학적 분석과 결합해야하며 96 웰 플레이트까지 확장 할 수 있습니다.
이 SFEB 플랫폼은 특히 유전학과 초기 신경 발달 사이에 가능한 상호 작용이있는 경우 신경학 장애에서 초기 피질 네트워크 개발의 역할을 해독하는 데 기여할 것으로 기대됩니다. 우리는 랫트 및 마우스 연구에서 보여지는 것과 같이 슬라이스 배양과 유사하게 취급 될 수 있음을 입증했습니다. 이 시스템을 이용한 미래의 유용한 연구는 마우스의 생체 내 구조와 SFEB 사이의 발달 비교 해부학 및 생리학을 중심으로해야합니다. 이 비교 데이터는 신약 개발 및 기초 연구를위한 진정한 번역 시스템을 개발하는 데 매우 효과적입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
기사를 교정 해 주신 Elizabeth Benevides에게 감사드립니다. 우리는 Drs. John Hussman과 Gene Blatt가 도움이되는 토론과 의견을 전했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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