Summary
Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema tridimensional (3-D) de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (HiPSCs) llamado cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional puede ser utilizado como un cultivo de corte organotípico para modelar el desarrollo cortical humano y para la interrogación fisiológica del desarrollo de circuitos neuronales.
Abstract
Aunque una serie de modelos de enfermedades in vitro se han desarrollado utilizando hiPSCs, una limitación es que estos sistemas bidimensionales (2-D) pueden no representar la subyacente cytoarchitectural y complejidad funcional de los individuos afectados portadores de las variantes de enfermedad sospechosos. Modelos convencionales 2-D siguen siendo incompletas representaciones de in vivo- como las estructuras y no captar adecuadamente la complejidad del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de más modelos basados en HiPSC 3-D que puedan recapitular mejor las interacciones y funciones celulares vistas en un sistema in vivo .
Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema 3-D de hiPSC indiferenciados basados en el cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional refleja aspectos de un neocórtex ventralizado en desarrollo y permite estudiar las funciones integrales de las células neurales vivas y el tejido intacto tales como la migración, la conectividad, la comunicación y la alfombraCión. Específicamente, demostramos que los SFEBs que usan nuestro protocolo pueden ser interrogados utilizando ensayos basados en células fisiológicamente relevantes y de alto contenido como imágenes de calcio y registros de múltiples electrodos (MEA) sin criosección. En el caso de las grabaciones de MEA, demostramos que los SFEBs aumentan tanto la actividad de pico como la actividad de ruptura a nivel de la red durante el cultivo a largo plazo. Este protocolo SFEB proporciona un sistema robusto y escalable para el estudio del desarrollo de la formación de redes en un modelo tridimensional que captura aspectos del desarrollo cortical temprano.
Introduction
Hemos informado anteriormente de un sistema modelo 3D, generado a partir de pacientes derivados de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs) que recapitula algunos aspectos de la primera red cortical desarrollo 1 . Este modelo tridimensional, un cuerpo embrionario libre de suero (SFEB), mejora los modelos hiPSC anteriores de agregación simple 2 , 3 . Un creciente cuerpo de trabajo está revelando que las estructuras tridimensionales como nuestro SFEBs, los aspectos aproximados de desarrollo neural comúnmente observados in vivo y en un momento anterior de lo observado en 2-dimensional (2-D) / monolayer hiPSC modelos [ 4 , 5] . Los estudios iniciales se han centrado en la complejidad autoorganizada de los cuerpos tridimensionales sin demostrar su complejidad fisiológica 2 .
El protocolo descrito aquí se ha utilizado en los hiPSC indiferenciados derivados de fibroblastos y Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Estas células se mantienen en alimentadores embrionarios de ratón irradiados con γ (MEFs). Estas colonias hiPSC se limpian manualmente de células espontáneamente diferenciadas, se cosechan enzimáticamente y se resuspenden en medio que contiene el inhibidor de la Rho-quinasa Y-27632 (ROCKi). Los hiPSC indiferenciados se someten a disociación y centrifugación antes de ser transferidos a placas de fondo en V de baja adherencia de 96 pocillos. Después de la galjanoplastia, la inducción neural se inicia usando la inhibición SMAD dual (SB431542 y LDN193189 junto con dickkopf 1 (DKK-1)) para conducir un linaje neuronal-fado forebrain anterior-frontal 6 . Después de 14 días, los SFEB se transfieren a insertos de cultivo celular en una placa de 6 pocillos. Una vez transferidos, los SFEBs redondos comienzan a esparcirse y adelgazarse, manteniendo al mismo tiempo conexiones de red local como se observa a menudo en preparaciones de cultivo de corte organotípico del hipocampo usando insertos de cultivo de células similares 1 ,Ss = "xref"> 7.
El uso de una plataforma tridimensional basada en SFEB en este formato es susceptible a la producción eficiente de redes corticales que pueden ser interrogadas usando ensayos fisiológicos basados en células tales como imágenes de calcio o ensayos electrofisiológicos tales como grabaciones de célula única o matriz de múltiples electrodos (MEA ) 1 . Aunque los sistemas tridimensionales llevan los marcadores de desarrollo cortical temprano, otros estudios han demostrado que estos cuerpos 3-D pueden requerir tiempos de incubación más largos para permitir el ritmo inherentemente más lento de desarrollo de tejidos humanos 8 . Este protocolo SFEB genera con éxito los SFEB 3-D de los hiPSC indiferenciados que capturan aspectos del desarrollo temprano de la corteza.
El potencial de los SFEBs para modelar aberraciones de red en trastornos neurológicos es una fuerza de este sistema. Los hiPSCs derivados del tejido del paciente pueden crecer en células del sistema nervioso que están sujetas a culoAys relacionados con la biología celular, así como la expresión génica concomitante. Las iPSC humanas se utilizan para determinar el perfil genético de grandes grupos de individuos con diferentes trastornos neurológicos con etiologías complejas como el trastorno del espectro autista (TEA), la esquizofrenia 9 , el síndrome de Rett 10 y la enfermedad de Alzheimer 11 , 12 . Hasta hace poco, los modelos iPSC eran típicamente preparaciones monocapa que, aunque eran competentes en la evaluación de interacciones moleculares, eran inadecuadas para descifrar las interacciones celulares complejas vistas in vivo . Los modelos animales han sido el sustituto por defecto para recrear la plataforma de órgano entero. Estos modelos animales están plagados de mala traducción de los hallazgos y tienen una capacidad limitada para replicar los perfiles genéticos humanos identificados por grandes estudios de cribado genético. Por lo tanto, el desarrollo de sistemas 3-D de iPSCs añade una capa necesaria de complejidad en humanosModelación de enfermedades 13 , 14 . El siguiente paso para las plataformas 3D hiPSC es acomodar los requerimientos a gran escala de la detección de alto rendimiento mediante ensayos basados en células 15 .
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Protocol
1. Generación de células progenitoras neurales
- Mantener los hiPSCs derivados de fibroblastos y PBMCs en placas de 6 pocillos en una capa celular de alimentador embrionario de ratón (MEF) irradiada con γ en medio iPSC humano suplementado con moléculas pequeñas (véase la Tabla de Materiales).
NOTA: El mantenimiento diario es una versión modificada de los procedimientos anteriores 1 , 16 .- Placa 6 x 10 5 MEFs en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos en un medio recomendado de 300 μl / pocillo (siguiendo el protocolo del fabricante).
- Después de 48 h, sustituir MEFs medio con 300 μ l / well hiPSC medio durante 1 h antes de añadir hiPSCs.
- Destilar rápidamente los hiPSCs en un baño de agua a 37 ° C y añadir lentamente 1 ml de medio hiPSC gota a gota. Transfiera los hiPSCs y el medio a un tubo cónico de 15 mL. Añadir medio para llevar el volumen total a 5 ml. Centrifugar durante 4 min a 129 xg, aspirar la supernataNt, vuelva a suspender suavemente el gránulo en 1 mL de medio hiPSC con inhibidor de ROCK a una concentración de 1: 1.000.
- Se plancha la suspensión celular (típicamente sembrada a 300.000 células / pocillo) sobre la capa celular MEF e incuba a 37ºC, 5% CO 2 , 95% de humedad.
- Monitoree la cultura del iPSC de cerca usando un microscopio de luz. Después de 48 h, eliminar los cultivos que tienen bordes irregulares, han crecido hasta convertirse en quística-like o aparecen marrón amarillento bajo el microscopio de luz para minimizar la diferenciación espontánea.
NOTA: Después de 7 a 10 días, las colonias hiPSC deben formarse. Las colonias deben ser redondas, con bordes claramente definidos y densidades celulares uniformes, y carentes de células no uniformes unidas flojamente. - Seleccionar manualmente las colonias rondas hiPSC para eliminar el cultivo de células diferenciadas espontáneamente. Expanda las colonias colocándolas en capas MEF frescas. Expandir 1: 3 cada 7 días cuando culturas cerca confluencia y congelación 1 , 16 .
- Después de la expansión y congelación de las células (para la copia de seguridad), crecer las colonias hiPSC en las placas hasta llegar a 50 - 75% de confluencia.
- Siete días después de la aplicación, utilizar un tratamiento enzimático suave (5-10 minutos con 300 μl de solución enzimática) y una trituración suave (2-4 veces con una pipeta de 1000 μl) para cosechar y preparar hiPSCs para la diferenciación neuronal de células precursoras.
- Centrifugar la suspensión celular a 129 xg durante 4 min, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 mL de medio iPSC humano. Transferir la suspensión celular a un plato de cultivo celular de 5 cm de gelatina revestida al 0,1% durante 1 h a 37ºC para eliminar los MEF y maximizar el rendimiento de hiPSC. Transferir el medio (con células no adherentes) a otro plato recubierto con gelatina de 5 cm.
- Transferir las células no adherentes a un tubo de centrífuga de 15 ml usando una pipeta de transferencia. Enjuague suavemente las placas con 3 ml de medio y agregue al tubo de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 129 xg durante 4 min, aspirar el superNatura y resuspenda suavemente el gránulo en medio. Determine el recuento de células utilizando un contador de celdas automatizado. Placa de 9.000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos de baja adherencia en forma de V.
- Centrifugar la placa a 163 xg durante 3 min. Incubar la placa a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO 2 . Usando una pipeta, cambie 50% de medio cada dos días eliminando la mitad del medio y reemplazándolo con medio de diferenciación químicamente definido 1 (DM1, Tabla 1 ) durante 14 días.
2. Inducción del cuerpo embrionario sin suero (SFEB) ( Figura 2 )
- Colocar insertos de cultivo celular de 40 mu m en placas de 6 pocillos y añadir 1 ml de medio DM1 al menos 1 h antes de la adición de agregados.
- El día 14, se transfieren los agregados con 20 μl de medio usando una punta de boca de 200 μl de anchura sobre insertos de cultivo celular de 40 μm y se cambia el medio a DM2.
- Transferir 4-6 agregados a un inserto de cultivo celular y permitir un espacio adecuado entre los agregados. Retire la mayor cantidad posible de solución en exceso utilizando una punta de pipeta fina ( por ejemplo, 200 μl de punta).
NOTA: Es aceptable perturbar brevemente el SFEB ya que se moverán sobre el inserto de cultivo celular como la solución eliminada de alrededor de los SFEB. - Mantener los cultivos en 1 mL de DM2 a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO 2 . Utilizando una pipeta, cambie el 75%Medio cada dos días eliminando tres cuartos del medio y reemplazándolo por tres cuartos de medio fresco. Por ejemplo, eliminar 750 μL de medio y agregar 750 μl de medio fresco.
- Transferir 4-6 agregados a un inserto de cultivo celular y permitir un espacio adecuado entre los agregados. Retire la mayor cantidad posible de solución en exceso utilizando una punta de pipeta fina ( por ejemplo, 200 μl de punta).
- Después de 14 días de cultivo, cambie al medio DM3 con 75% de cambio medio cada dos días y durante otros 16 días.
- Para mantener los SFEBs en insertos de cultivo celular más allá de 30 días, cambie el medio cada dos días durante 60, 90 y 120 días.
NOTA: Los SFEBs crecerán hasta aproximadamente 1.000 μm de diámetro y son típicamente de 100-150 μm de grosor 1 .
3. Determinación de la composición del SFEB
- Separar los SFEBs de la inserción suavemente pipeteando el medio con una punta de pipeta 200 μL boca ancha. Para transferir los SFEB, use una punta de pipeta de boca ancha para succionar suavemente los cuerpos en la punta de la pipeta. Después de cargar SFEB en la punta de la pipeta, transferir suavemente a placas de 12 pocillos y lavar con 300 μl de solución salina tamponada con fosfato(PBS) por pocillo.
NOTA: Los SFEBs se suspenderán en solución en las placas de 12 pocillos. Esto es importante para permitir la penetración completa del fijador, la solución de bloqueo y los anticuerpos. Si se usan múltiples SFEB para tinción, se pueden agregar hasta 10 SFEB por pocillo de una placa de 12 pocillos. Esto conservará soluciones y anticuerpos. - Fijar SFEBs con 300 μL por pocillo de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30-45 min. Lavar dos veces SFEBs fijo con 300 μL de PBS, 3-5 min cada lavado.
Precaución: Use equipo protector personal adecuado cuando maneje paraformaldehído.
Para identificar las neuronas en este estudio, se usó pollo-Tuj1 a 1: 500, para marcadores adicionales, véase la Tabla 2 y las referencias 1 , 16 . - Permeabilizar y bloquear con 0,1% de Triton-X100 en PBS y 10% de suero de burro normal (solución de bloqueo, 300 μ; L por pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Eliminar la solución de bloqueo y tratar SFEBs con 300 μ l de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo. Incubar a 4 ° C durante la noche. Lavar los SFEB tres veces (3-5 minutos por lavado) en 300 μL de PBS que contiene 0,1% de Triton-X.
- Preparar anticuerpos secundarios 1: 1000 en solución de bloqueo. Incubar SFEBs durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios. Lavar los SFEB con 300 μl de PBS, 3 veces durante 3-5 min cada uno.
NOTA: En esta etapa pueden prepararse SFEBs para imágenes. - Para la imagen, pipetee SFEBs en una diapositiva de vidrio usando una pipeta de diámetro ancho. Retire el exceso de solución alrededor del SFEB con succión suave.
NOTA: Para condiciones de tinción similares, se pueden colocar varios SFEB en el mismo portaobjetos de vidrio. - Añadir una gota de medio de montaje en el SFEBs, coloque un cubreobjetos de vidrio, y presione suavemente para asegurarse de que no hay burbujas de aire. Dejar que el medio de montaje se endurezca y proceder a la obtención de imágenes y la cuantificación (paso 3.8).
- Realice la cuantificación de células tomando varias regiones de interés (ROI) a través del SFEB y utilizando una pila z combinada con una imagen de proyección máxima a través de cada ROI en un microscopio confocal estándar como se describe en las referencias 1 , 16 .
NOTA: Los SFEBs completos se pueden cuantificar mediante mosaicos basados en imágenes (véanse las referencias 1 , 16 para más detalles). Debido a que los SFEB se adelgazan a aproximadamente 100 μm, existe una dispersión mínima de luz en el tejido y, por lo tanto, no hay necesidad de microscopía de 2 fotones. Anterior usos de este protocolo con fibroblastos derivados de iPSCs producido un SFEB destino mapa que reveló estructura compleja y diversa con subpoblaciones de interneurones con identidades transcripcionales que se asemejaba a CGE y forebrain anterior destino 1 , 16.
4. Registro de actividad neuronal en SFEBs Uso de AMAs
- Prepare placas MEA de 12 pocillos según las instrucciones del fabricante.
- Lavar las placas de MEA 3 veces durante 5 min con H 2 O estéril en condiciones asépticas para limpiar. Lavar durante 5 minutos con etanol al 75% y luego con etanol al 100% para esterilizar la placa.
- Hornear la placa invertida en un horno durante 4-5 h a 50 ° C para completar el proceso de esterilización.
- Añadir 500 μl de solución de polietilenimina al 0,2% (PEI) a cada pocillo e incubar 1 h a temperatura ambiente. Aspirar PEI y lavar los pocillos 4x con agua destilada H 2 O. Aire seco estéril en la campana durante una noche.
- Preparar una solución de 20 μL / mL de laminina en medio L15 y añadir 10 μL de laminina al centro de cada pocillo.
NOTA: No cubra los electrodos de referencia y de tierra circundantes. - Añadir dH 2 O estéril a los depósitos circundantes para evitar la evaporación del medio o laminina.Incubar la placa durante 1 h a 37 ° C.
- Añada los SFEBs (ver secciones 1 y 2) a las placas de MEA recubiertas con laminina suzándolas suavemente en una punta de pipeta de boca ancha y transfiéralas. Añadir 200 μl de medio DM2 a cada pocillo e incubar durante la noche a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO 2 .
- Añadir 200 μl de medio adicional después de 24 h y dejar que se recupere durante 30 min a 37 ° C, 95% de humedad, 5% de CO 2 antes de leer la placa.
- Colocar la placa MEA en el lector de placas (precalentado a 37 ° C) para registrar la actividad neuronal. Registre la actividad durante 10 minutos con el software de grabación MEA asociado. Véase la referencia 19 para más detalles.
- Generar datos crudos - flujos continuos y tramas raster de actividad neuronal utilizando software de análisis estadístico 19 .
NOTA: Las grabaciones MEA se toman 7 días después del recubrimiento SFEB. Para este estudio, las grabaciones se tomaron durante 10 minutos para detectar la actividad de ráfaga de red, conRastreo continuo y parcelas raster. Los SFEBs pueden mantenerse a largo plazo en placas MEA y pueden ser registrados durante periodos de tiempo más largos usando condiciones ambientalmente controladas ( Figura 6 ).
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Representative Results
Los SFEB cultivados usando nuestra técnica dieron tejido con características morfológicas que se asemejan a una zona subventricular cortical precoz repleta de extensas neuronas Tuj1 positivas, así como progenitores neurales ( Figura 3A ). Se observaron numerosas rosetas corticales en desarrollo en las capas externas y capas internas del SFEB ( Figura 3B ). El borde exterior del SFEB se asemeja a una placa cortical en desarrollo que contiene neuronas postmitoticas. Esto es apoyado por la expresión de Brn2, un marcador para progenitores neurales en las capas corticales externas más ventralizadas. También se observan células positivas a Reelin que pueden ser células Cajal-Retzius o sus progenitores, que se expresan en las capas externas de la corteza en desarrollo en SFEB ( Figura 3C ). Los SFEB cultivados usando este protocolo expresan marcadores consistentes con un caudal mixto (CGE) y un ganglio medial(MGE). Las células que expresan el marcador CGE Couptf2 y otras células que expresan MGE marcador Nkx2.1 se puede observar en los cultivos ( Figura 3D ). Esto puede ser en parte debido al uso de DKK-1 en el protocolo, que se ha demostrado para mejorar medial fates [ 20] .
Los SFEB realizados usando este protocolo producen interneuronas positivas a calretinina y calbindina ( Figura 4A ), así como neuronas excitadoras positivas a VGLUT y progenitores neuronales glutamatérgicos Tbr1 positivos ( Figura 4B ). En promedio, hemos observado que el 61% de las células totales en SFEBs son positivos VGLUT y 43% son Tbr1-positivos ( Figura 4C ]. Esto es coherente con otros informes que utilizan protocolos similares [ 21] . Además, los SFEB pueden someterse a ensayos fisiológicos tales como la formación de imágenes de calcio de células vivas usandoMarcadores como Fluo-4, con el fin de observar la función de la red neuronal en un entorno más fisiológicamente relevante ( Figura 5 ]. Los SFEB pueden someterse a grabaciones MEA durante largos períodos de tiempo y mostrar el desarrollo de la ruptura cortical a nivel de la red ( Figura 6 ).
Figura 1: Esquema que resume los primeros pasos en la preparación de SFEBs. Después de que las iPSC se cosecharon usando una disociación enzimática, se sembraron en placas de 96 pocillos y se centrifugaron a 163 xg durante 3 minutos para inducir una rápida agregación. Después de 14 días se pueden transferir agregados de células in vitro (DIV) a partir de placas de 96 pocillos a través de pipetas de gran calibre sobre placas de 6 pocillos que contienen inserto de cultivo celular. Haga clic aquí para verEw una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Línea temporal de cambios y fases medias durante el crecimiento y la expansión del SFEB. Después de que los SFEB se han transferido a los insertos, pasan dos cambios medios a los 14 y 28 días in vitro (DIV). Se recogen típicamente para experimentos en DIV 30, 60 y 90. Las inserciones superiores muestran fases diferentes en este proceso. Barras de escala = 1.000 μm (extremo izquierdo); 1.000 mu m (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (SFEB simple). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Características morfológicas generalesTicos de SFEBs crecido usando este protocolo. ( A ) Borde externo típico de un SFEB que expresa el marcador progenitor nestin (verde), el marcador neural post-mitótico Tuj1 (rojo) y la mancha nuclear (azul). ( B ) Los SFEB muestran rosetones corticales característicos tanto en las capas externas (imagen izquierda) como en las capas internas (derecha). Expresan marcadores neuronales progenitor y maduro. ( C ) Un borde externo representativo de un SFEB que expresa el marcador de la capa externa / placa cortical Brn2 (verde) y el marcador CGE en desarrollo Couptf2 (rojo). ( D ) Los SFEB realizados utilizando este protocolo representan estructuras neocorticales ventralizadas según se observa mediante tinción de Pax6 (rojo) y expresan marcadores consistentes con algunos orígenes de MGE tales como Nxk2.1 (rojo). Barra de escala = 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de los principales tipos de células neuronales en SFEBs. ( A ) Algunas neuronas en SFEBs expresan marcadores consistentes con interneuronas corticales tales como calbindina (verde, imagen izquierda) y calretinina (verde, imagen derecha). ( B ) Los SFEBs muestran neuronas glutamatérgicas positivas a VGLUT-1 (rojo, imagen izquierda) y progenitores glutamatérgicos que expresan Tbr1 (imagen roja, derecha). Barra de escala = 40 μm. ( C ) Rendimientos típicos de neuronas excitadoras que expresan VGLUT-1 o Tbr1 (barra de error = SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Grabaciones de calcio de células vivas </ Strong> (Imagen izquierda) Borde exterior representativo SFEB tratado con Fluo-4, un indicador de calcio neuronal. Las células están marcadas para la medición de transitorios espontáneos de calcio (cajas de colores surtidos). (Imagen derecha) Células seleccionadas que demuestran transitorios espontáneos de calcio marcados por cajas rojas (trazas superiores) o cajas verdes (trazas inferiores). Barra de escala = 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Grabaciones de conjuntos de electrodos múltiples de SFEB. (Superior) Imagen representativa de SFEB unida a una placa MEA (Barra de escala = 100 μm). (Medio e inferior) Los SFEB pueden registrarse en los MEA durante largos períodos de tiempo y mostrar la maduración. (Medio y abajo, izquierda) Un mapa de ráfaga bien-ancho de 3 SFEBs plateado en 3 pozos de un 1La placa de MEA de 2 pocillos, los colores más oscuros, representan una actividad de pico global más alta que aumenta entre el día 30 y el día 90. El mapa de actividad acumulativo muestra un aumento en la densidad de picos y el área de picos dentro de las redes corticales en SFEBs entre El día 30 y el día 90. Las trazas crudas (superior) y las tramas raster de todo el pozo (inferior) muestran un aumento en el número de picos y el número de ráfagas en el tiempo; Indicativo de una mayor formación de redes en SFEBs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo | Dilución | Especies |
| Nestin | 0.111111111 | Ratón |
| Brn-2 | 0,388888889 | Conejo |
| VGLUT1 | 0.111111111 | Conejo |
| Pax6 | 0,25 | Conejo |
| Calretinina | 0.180555556 | Conejo |
| Calbindin | 0,319444444 | Conejo |
| CoupTFII | 0.180555556 | Ratón |
| Nkx 2.1 | 0.180555556 | Conejo |
| Tuj1 | 0.388888889 | Pollo |
| Reelin | 0.388888889 | Ratón |
| Tbr1 | 0.180555556 | Pollo |
| NFH | 0,25 | Ratón |
Tabla 1: Anticuerpos usados en este estudio.
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Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona las condiciones para diferenciar una fuente hiPSC en una estructura tridimensional que recapitula una etapa temprana de desarrollo de la corteza frontal. Este procedimiento produce estructuras que pueden ser interrogadas para electrofisiología, al tiempo que son susceptibles de microscopía. La morfología final del SFEB se asemeja a la de los cultivos organotípicos del corte cerebral y permite una imagen confocal detallada de alta calidad. Este protocolo puede generar con éxito SFEBs de fibroblastos y sangre periférica mononuclear derivados de células HiPSCs. Los SFEB obtenidos a partir de células HiPSC mononucleares derivadas de células periféricas presentan características morfológicas similares a las creadas a partir de los hiPSC derivados de fibroblastos.
Este proceso, al igual que otros esquemas tridimensionales, utiliza pequeñas moléculas extracelulares para guiar las decisiones de destino celular. Esto se combina con las propiedades intrínsecas del contacto célula a célula, lo que crea un entorno más realista para la redFormación laboral y función neuronal. Otros informes han demostrado que la combinación apropiada de las señales extracelulares de molécula pequeña es suficiente para tales decisiones de destino celular como midbrain dopaminérgico 8 , 22 , e interneuronas corticales [ 8 , 16 , 23] . Sin embargo, los sistemas 3-D muestran un tiempo de maduración acelerado en comparación con los equivalentes 2-D 5 . Cuando se les da tiempo suficiente, los cultivos 3-D han mostrado mayor madurez. Tales cualidades hacen fuertes argumentos para la utilidad de las plataformas 3-D como el SFEB. El beneficio adicional de la microscopía en vivo y de alta calidad, junto con la flexibilidad del material de origen, hacen argumentos convincentes para este protocolo.
Además, los SFEB realizados utilizando este protocolo comparten una serie de similitudes con otros estudios publicados 13 , 24 . Con respecto a la referencia 24 , este protocolo y la validación fisiológica de las neuronas lo preceden. Por ejemplo, los estudios reportados en las referencias 13 , 24 , usan versiones similares de inhibición SMAD doble para derivar neuronas corticales y obtuvieron una proporción similar de neuronas y progenitores glutamatérgicos (~ 50%). Además, Mariani, J. et al. (Referencia 13 ) informan de tinción similar de Pax6 y Nestin como este protocolo en un tiempo de 25-30 puntos. Cualitativamente, los patrones de tinción para Brn2 así como la expresión de astrocitos positivos para GFAP son similares a los reportados en la referencia 24 . Sin embargo, este protocolo tiene una serie de ventajas sobre las dos metodologías de organoides de uso común. En primer lugar, Mariani, J. et al. 13 informan el desarrollo de interneuronas positivas a Dlx al día 50 y conSólo mediante métodos de inmunotinción. Utilizando este protocolo, las interneuronas positivas para Dlx se producen al día 30. Estas interneuronas se confirmaron como funcionales mediante electrofisiología de una sola célula y aplicación farmacológica monocelular de GABA [ 16] . Además, los autores de 13 afirman que la conectividad funcional de las neuronas, pero se determinó sólo mediante tinción. SFEBs hechas utilizando este protocolo han sido sometidos a la red de electrodo único de estimulación y de imágenes de calcio para mostrar que el desarrollo de las redes corticales están conectados y funcionales. Pasca, et al. 24 sección de los agregados utilizando un criostato para obtener grabaciones de organoid-como estructuras. Los SFEB realizados usando este protocolo no necesitan corte y pueden ser grabados directamente mientras están en los insertos 1 . Se ha demostrado que las neuronas registradas de los SFEB no seccionados tienen potenciales de acción y potenciales posin sinápticos inhibidores después de la tri- ninaG 1 , 16 .
Los SFEB pueden hacerse usando tanto fibroblastos como PBMCs como material de partida. También es posible utilizar otros tipos de tejidos que resultan en HiPcs (por ejemplo, pulpa dental, prepucio, orina) 25 , 26 , 27 , aunque algunas de las moléculas pequeñas pueden necesitar ser alteradas para lograr resultados similares. Para este protocolo, el uso de DKK-1 es importante en la conducción de la SFEB hacia un destino ventralizado [ 28] . Esta ventralización es parcialmente responsable de la diferenciación de interneuronas con CGE-como orígenes [ 16] . DKK-1 es una molécula pequeña costosa y por lo tanto altas concentraciones de hedgehog sónico se puede utilizar para complementar DKK-1 en este protocolo. Sin embargo, las concentraciones para la inhibición de Wnt vía DKK-1 deben ser determinadas empíricamente por el usuario final. Además, XAV939, otro inhibidor de WntR, puede utilizarse para ayudar a conducir la diferenciación hacia un destino ventralizado, aunque el uso de este inhibidor producirá tejido que comparte identidades transcripcionales con el MGE 23 .
Cuando se desarrollan sistemas de cultivo hiPSC 3D como los SFEBs descritos en este protocolo, es importante tener en cuenta que estas estructuras producen una cantidad moderada de heterogeneidad de cultura a cultura. Esto es parcialmente debido a la naturaleza estocástica de la diferenciación neuronal de iPSCs y debido a la iniciación de contacto célula-célula en el SFEB resultando en la auto-organización espontánea intrínseca [ 29 , 30] . Por lo tanto, es importante interpretar la utilidad de esta técnica en el contexto de la heterogeneidad. Las formas de minimizar el impacto de la heterogeneidad en este sistema incluyen, crear un gran número de SFEBs para que representen una variación natural en el sistema, adhiriéndose estrictamente a la concentración deReactivos y el número de células sembradas al comienzo de cada ciclo de producción. Es crítico comenzar con colonias limpias de iPSC y aplicar una trituración mínima durante la etapa de disociación enzimática durante la disociación de iPSC para aumentar la viabilidad celular. La viabilidad celular después de la trituración es un factor importante para obtener SFEBs de alta calidad y consistentes. Como paso alternativo de solución de problemas, la viabilidad se puede comprobar después de la disociación y antes de las etapas de centrifugación usando azul tripán, si es necesario. La viabilidad y la diferenciación espontánea también pueden verse afectadas si ROCKi no se utiliza adecuadamente durante los primeros pasos de disociación y diferenciación. El uso de ROCKi y su disminución gradual durante el 50% de los piensos durante los primeros 7-10 días es crítico para los SFEB consistentes y de alta calidad.
Además, a menudo es útil como un paso de validación para comprobar los resultados en 3D SFEBs con los observados en las mismas líneas celulares creadas utilizando una preparación monocapa. EntenderY cómo los dos sistemas comparan en cada cohorte experimental es extremadamente útil para entender la complejidad de un modelo de enfermedad dado. Por último, SFEBs pueden ser utilizados para clasificar y purificar las poblaciones celulares utilizando fluorescente de células activadas de clasificación para su posterior estudio en un más homogéneo 2D monocapa sistema [ 16] .
Sin embargo, los SFEB creados utilizando este protocolo son útiles para estudiar pequeños circuitos corticales en desarrollo. Las aplicaciones futuras de esta técnica implican multiplexar grabaciones electrofisiológicas con enfoques de alto contenido. De hecho, los insertos de cámara de célula se fabrican para su uso en formato de placa de 96 pocillos. Estas inserciones se pueden usar con el protocolo SFEB descrito aquí en lugar de las inserciones de 6 pocillos. Con el fin de mostrar la escalabilidad utilizando este método, SFEBs tendrá que ser creado utilizando múltiples líneas y clones dentro de una cohorte dado y tendrá que ser examinado a través de un conjunto de ensayos robustos basados en células para buscar la coherencia wiDelgados. Por ejemplo, los números neuronales, la morfología y el desarrollo de capas pueden ser ensayados usando un formato de 96 pocillos. Idealmente, los ensayos basados en células deben combinarse con un ensayo electrofisiológico de alto contenido como el MEA, que también es escalable a placas de 96 pocillos.
Esta plataforma SFEB tiene la promesa de descifrar el papel del desarrollo de la red cortical temprana en los trastornos neurológicos, particularmente en los casos en que existe una posible interacción entre la genética y el desarrollo neural temprano. Hemos demostrado que puede ser tratado como un cultivo de rebanada como se muestra en ratones y ratones estudios. Los estudios futuros útiles que usan este sistema deben centrarse en la anatomía y la fisiología comparativas del desarrollo entre las estructuras in vivo del ratón y el SFEB. Estos datos comparativos serían muy poderosos en el desarrollo de un sistema verdaderamente translacional para el descubrimiento de fármacos y la investigación básica.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Elizabeth Benevides por corregir el artículo. Damos las gracias a los Dres. John Hussman y Gene Blatt por sus útiles discusiones y comentarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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