Summary
Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.
Abstract
HiPSC'leri kullanarak bir dizi in vitro hastalık modeli geliştirilmiş olsa da, bir sınırlama, bu iki boyutlu (2-B) sistemlerin, şüpheli hastalık varyantlarını taşıyan etkilenen bireylerin altında yatan sitolojik mimari ve fonksiyonel karmaşıklığı temsil etmeyebileceğidir. Konvansiyonel 2 boyutlu modeller in vivo benzeri yapıların eksik temsillerini tutar ve beynin karmaşıklığını yeterince yakalar. Dolayısıyla, in vivo bir sistemde görülen hücresel etkileşimleri ve işlevleri daha iyi özetleyebilen daha fazla 3-D hiPSC'ye dayalı modeller için yeni bir ihtiyaç ortaya çıkmaktadır.
Serbest embriyo gövdeye (SFEB) dayalı farklılaşmamış hiPSC'lerden 3 boyutlu bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 boyutlu model, gelişmekte olan bir ventralize neokorteksin özelliklerini yansıtır ve yaşayan sinir hücreleri ile göç, bağlantı, iletişim ve mat gibi bozulmamış dokular için ayrılmaz fonksiyonlara yönelik çalışmalara izin veriruration. Özellikle, protokolümüzü kullanan SFEB'lerin kalsiyum görüntüleme ve kriyoseksiyonsuz çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları gibi fizyolojik olarak alakalı ve içeriği yüksek hücre bazlı analizleri kullanarak sorguya çekilebileceğini gösteriyoruz. ÇÇ kayıtlarında, SFEB'lerin uzun süreli kültürde hem başak aktivitesini hem de şebeke seviyesinde patlama aktivitesini arttırdığını gösteriyoruz. Bu SFEB protokolü, erken kortikal gelişimin özelliklerini yakalayan 3 boyutlu bir modelde ağ oluşumunun geliştirilmesi çalışması için sağlam ve ölçeklenebilir bir sistem sağlar.
Introduction
Daha önce erken kortikal ağ 1 geliştirme bazı yönlerini tekrarlar hasta-türevi insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) oluşturulmuş bir 3-boyutlu bir model sistemi, bildirmişlerdir. Serumsuz bir embriyo gövdesi (SFEB) olan bu 3 boyutlu model, önceki basit toplama hiPSC modelleri 2 , 3'ü geliştirir . Işin artan vücut 5 / tek tabakalı hiPSC modelleri 4 eden SFEBs gibi 3-B yapısı, sinir gelişme yaklaşık yönleri genel olarak in vivo ve 2-boyutlu (2-D) 'de gözlenenden daha önceki bir zaman noktasında gözlemlenen açıklayıcıdır. İlk çalışmalar, fizyolojik karmaşıklığını göstermeksizin üç boyutlu cisimciklerin kendilerini organize eden karmaşıklığına odaklanmıştır 2 .
Burada açıklanan protokol, fibroblastlardan türeyen farklılaşmamış hiPSC'lerde ve Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler). Bu hücreler γ-ışınlanmış fare embriyonik besleyicilerinde (MEFler) muhafaza edilir. Bu hiPSC kolonileri kendiliğinden farklılaşmış hücrelerden manuel olarak temizlenir, enzimatik olarak hasat edilir ve Rho-Kinaz inhibitörü Y-27632 (ROCKi) içeren ortamda yeniden süspanse edilir. Farklılaşmamış hiPSC'ler 96 oyuk düşük yapışma V-alt plakalarına aktarılmadan önce ayrışma ve santrifüje tabi tutulur. Kaplama sonra sinir indüksiyon çift Smad inhibisyonu kullanılarak başlatılır (birlikte SB431542 ve LDN193189 dickkopf 1 (dkk-1)), bir ön-cephe ön beyin nöron kaderini soy 6 sürücü. 14 gün sonra, SFEB'ler 6 oyuklu bir plaka içerisinde hücre kültür eklerine aktarılır. Bir kez aktarıldıktan sonra yuvarlak SFEB'ler yayılmaya ve inceltmeye başlarken, benzer hücre kültürü ekleri kullanan hipokampal organotipik dilim kültürü preparatlarında sıklıkla gözlendiği gibi yerel ağ bağlantılarını muhafaza ederek 1 ,Ss = "xref"> 7.
Bu formatta bir SFEB tabanlı 3 boyutlu platformun kullanımı kalsiyum görüntüleme veya tek hücreli kayıtlar veya çok elektrotlu dizi (MEA) gibi elektrofizyolojik testler gibi hücre bazlı fizyolojik tahliller kullanılarak sorgulanabilecek kortikal şebekelerin etkili bir şekilde üretilmesine uygundur ) 1 . 3 boyutlu sistemler erken kortikal gelişim işaretleri ayı rağmen, diğer çalışmalar bu 3 boyutlu cisimler insan dokusu gelişimi 8'in doğal olarak daha yavaş bir hızda izin vermek için daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir göstermiştir. Bu SFEB protokolü, kortekste erken gelişim özelliklerini yakalayan farklılaşmamış hiPSC'lerden başarıyla 3-D SFEB'ler üretir.
SFEB'lerin nörolojik bozukluklarda ağ aberasyonlarını modelleme potansiyeli bu sistemin gücüdür. Hasta dokusundan türetilen hiPSC'ler, sinir sisteminin kıçına tabi olan hücrelere yetiştirilebilirHücre biyolojisine ve aynı zamanda gen ekspresyonuna ilişkindir. İnsan iPSC'leri, otizm spektrum bozukluğu (ASD), şizofreni 9 , Rett Sendromu 10 ve Alzheimer hastalığı 11 , 12 gibi karmaşık etyolojilere sahip çeşitli nörolojik bozukluklara sahip geniş birey gruplarının genetik profilini tespit etmek için kullanılmaktadır. Yakın zamana kadar, iPSC modelleri tipik olarak, moleküler etkileşimleri değerlendirmede yeterli iken , in vivo görülen karmaşık hücresel etkileşimleri deşifrelemede yetersiz kalan tek tabaka preparatlarıydı. Hayvan modelleri, tümör organı platformunun yeniden oluşturulması için varsayılan ikame olmuştur. Bu hayvan modelleri, bulguların zayıf bir şekilde çevrilmesinden dolayı rahatsızdır ve büyük genetik tarama çalışmaları ile tanımlanan insan genetik profillerini çoğaltma yeteneği sınırlıdır. Böylece, iPSC'lerden 3-B sistemlerin geliştirilmesi, insan için gerekli bir katman katma- sını katarHastalık modelleme 13 , 14 . 3D hiPSC platformları için bir sonraki adım, hücre bazlı tahliller kullanılarak yüksek verimli taramada büyük ölçekli gereksinimleri karşılamaktır 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sinirsel Öncü Hücrelerin Üretilmesi
- Küçük moleküllü eklenmiş insan iPSC ortamında γ-ışınlanmış bir fare embriyonik besleyici (MEF) hücre tabakasında 6 gözlü plakalarda fibroblastlardan ve PBMClerden türeyen hiPSC'leri muhafaza edin (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Günlük bakım, daha önce bildirilen 1 , 16 numaralı prosedürlerin değiştirilmiş bir versiyonudur.- 300 μL / iyi önerilen ortamda (üretici protokolünden sonra) 6 oyuklu bir doku kültürü sınıfı plakanın her oyuğuna 6 x 10 5 MEF tabakası yerleştirilir.
- 48 saat sonra, hiPSCleri eklemeden önce 1 saat süreyle 300 μL / well hiPSC ortamı ile MEFs ortamını değiştirin.
- HİPSC'leri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözülür ve yavaş yavaş damla damla 1 mL hiPSC ortamı ekler. HiPSC'leri ve ortamı 15 mL'lik konik bir tüp haline getirin. Toplam hacmi 5 mL'ye getirmek için orta ekleyin. 129 xg'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin, supernata'yı aspire edinNt, hafifçe 1: 1000 konsantrasyonda ROCK inhibitörü ile 1 mL hiPSC ortamda pellet askıya alınız.
- MEF hücre tabakası üzerine (tipik olarak 300,000 hücre / oyuk tohumlanmış) hücre süspansiyonu Plate ve 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde inkübe edin.
- Işık mikroskopu kullanarak iPSC kültürünü yakından izleyin. 48 saat sonra, pürüzlü kenarlara sahip kültürleri çıkarın, spontan farklılaşmayı en aza indirgemek için ışık mikroskopu altında kistik gibi görünen veya sarımsı kahverengi görünen bir materyal haline gelin.
NOT: 7-10 gün sonra hiPSC kolonileri oluşmalıdır. Koloniler açıkça tanımlanmış sınırlar ve düzgün hücre yoğunluklarıyla yuvarlak olmalı ve gevşek biçimde paketlenmiş düzensiz hücrelerden yoksun olmalıdır. - Elle kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin kültürünü temizlemek için yuvarlak hiPSC kolonileri seçin. Kolonileri taze MEF katmanlarına yerleştirerek genişletin. 1 genişletin: 3 7 günde birleşmeye yakınlaştığı kültürler ve 1, 16 dondurmak zaman.
- Genişletme ve hücreleri dondurma (yedekleme için) sonrasında,% 50 - 75 konfluence olana kadar plakalarda hiPSC kolonileri büyütün.
- Kaplamadan yedi gün sonra nöral öncül hücre farklılaşması için hiPSC'leri hasat etmek ve hazırlamak için hafif enzimatik muameleyi (300 uL enzim çözeltisi ile 5-10 dakika ve hafif öğütme (1000 ul'lik bir pipetle 2-4 kez) kullanın.
- 4 dakika boyunca 129 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve pelet 5 mL insan iPSC ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. MEF'leri ortadan kaldırmak ve hiPSC verimini en üst düzeye çıkarmak için hücre süspansiyonunu 37 ° C'de 1 saat boyunca% 0.1 jelatin kaplı 5 cm hücre kültürü çanağına aktarın. Ortamı (yapışkan olmayan hücrelerle birlikte) başka bir 5 cm jelatin kaplı çanağa aktarın.
- Yapışkan olmayan hücreleri, bir transfer pipeti kullanarak 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. 3 mL ortam ile plakaları hafifçe durulayın ve 15 mL tüpüne ekleyin.
- 4 dakika için 129 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin, süper aspiratNatant ve nazikçe pellet orta tekrar süspansiyon haline getirin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirleyin. 96-yuva düşük yapışma V-alt plakasında 9,000 hücre / çanağı plakala.
- Plakayı 3 dakika 163 xg'de santrifüjleyin. 37 ° C'de inkübe plakası,% 95 nem ve% 5 CO2. Bir pipet kullanarak, orta her yarım kaldırarak ve taze kimyasal olarak tanımlanmış ayırıcı madde 1 (DM1; Şekil 1 ; Malzeme Tablosu) ile 14 gün boyunca değiştirerek% 50 ortamı her gün değiştirin.
2. Serum Free Embriyoid Gövde (SFEB) İndüksiyonu ( Şekil 2 )
- 40 μm hücre kültür ekler 6 kuyucuklu plakalar yerleştirin ve agrega eklemeden önce en az 1 saat 1 ml DM1 orta ekleyin.
- 14. günde 40 μM hücre kültür eklerine 200 mcL geniş ağız ucuyla 20 μL ortam ile agrega aktarın ve ortamı DM2'ye değiştirin.
7 , 17 , 18 kullanılır .- 4-6 agregaları bir hücre kültürü insertine aktarın ve agregalar arasında yeterli boşluk bırakın. İnce bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla çözelti çıkarın ( örn. 200 mcL uç).
NOT: SFEB'yi, SFEB'lerin çevresinden çıkarılan çözelti olarak hücre kültürü girdisi üzerinde hareket edecekleri için kısaca rahatsız etmek kabul edilebilir. - 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO2 de DM2 1 mL kültürleri koruyun. Bir pipet kullanarak,% 75Ortamın dörtte üçünü çıkararak ve ç çeyrekte taze ortamla değiştirerek, iki günde bir öğün. Örneğin, 750 μL ortamı çıkarın ve 750 μL taze ortam ekleyin.
- 4-6 agregaları bir hücre kültürü insertine aktarın ve agregalar arasında yeterli boşluk bırakın. İnce bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla çözelti çıkarın ( örn. 200 mcL uç).
- Kültürden 14 gün sonra, her gün% 75 orta değişimli ve 16 gün daha DM3 ortamına geçin.
- Hücre kültürü ekinde SFEB'leri 30 günün ötesinde korumak için ortamı her gün 60, 90 ve 120 gün boyunca değiştirin.
NOT: SFEB'ler yaklaşık 1,000 μm çapa kadar büyür ve tipik olarak 100-150 μm kalınlıktadır 1 .
3. SFEB Bileşimini Belirleme
- 200 uL geniş ağızlı pipet ucu kullanarak orta derecede pipetleme aracı ile ekteki SFEB'leri ayırın. SFEB'leri aktarmak için, cesetleri pipet ucuna yavaşça emmek için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. SFEB'yi pipetin ucuna yükledikten sonra, hafifçe 12 oyuklu plakalara aktarın ve 300 uL fosfat tamponlu salinle yıkayın(PBS) ilave edin.
NOT: SFEB'ler, 12 oyuklu plakalarda çözeltiyle süspanse edilir. Bu, fiksatifin, bloke edici çözeltinin ve antikorların tam penetrasyonuna izin vermek için önemlidir. Boyama için birden çok SFEB kullanılıyorsa, bir 12 kuyucuğun kuyucuğuna 10 SFEB eklenebilir. Bu, çözümleri ve antikorları koruyacaktır. - SFEB'leri oda sıcaklığında 30-45 dakika süre ile% 4 paraformaldehit ile oyuk başına 300 mcL ile fikse edin. Sabit SFEB'leri 300 mcL PBS ile iki kez yıkayın, 3-5 dakika her yıkayın.
Dikkat: Paraformaldehid ile uğraşırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
NOT: Bu çalışmada nöronları işaretlemek için 1: 500'de tavuk-Tuj1 kullanılmış, ek belirteçler için Tablo 2 ve referanslar 1 , 16'ya bakınız . - PBS'de% 0.1 Triton-X100 ve% 10 normal eşek serumu (engelleme solüsyonu; 300 μ) ile geçirgen hale getirin ve bloke edinL başına) oda sıcaklığında 1 saat süreyle yıkanır.
- Bloke edici çözeltiyi çıkartın ve SFEB'leri engelleme çözeltisinde 300 μL birincil antikorlarla muamele edin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. SFEBs% 0.1 Triton-X içeren 300 uL PBS içinde yıkama (yıkama başına 3-5 dakika) yıkayın.
- Bloke edici çözeltide 1: 1000 sekonder antikorları hazırlayın. SFEB'leri ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. SFEB'leri 300 uL PBS ile yıkayın, her biri 3-5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
NOT: Bu aşamada, SFEB'ler görüntüleme için hazırlanabilir. - Görüntü için, SFEB'leri geniş gözenekli bir pipet kullanarak cam slayt üzerine pipetleyin. Nazik emme ile fazla miktarda SFEB çözeltisini çözün.
NOT: Benzer boyama koşulları için, aynı cam slaydına birden çok SFEB yerleştirilebilir. - SFEB'lere bir damla montaj aracı ekleyin, cam bir lamel yerleştirin ve hava kabarcıklarının bulunmadığından emin olmak için hafifçe bastırın. Montaj maddesinin sertleşmesine izin verin ve görüntüleme ve ölçmeye geçin (adım 3.8).
- SFEB boyunca birden fazla ilgi alanı (ROI) alarak ve referanslar 1 , 16'da açıklandığı üzere standart bir konfokal mikroskopta her bir ROI boyunca maksimum bir projeksiyon görüntüsü ile birlikte bir z-yığını kullanarak hücre kantifikasyonu uygulayın.
NOT: Tüm SFEB'ler, görüntü tabanlı fayans kullanılarak nicelendirilebilir (ayrıntılar için referans 1 , 16'ya bakın). SFEB'ler yaklaşık 100 μm'ye incelttiği için, dokuda ışığın çok az dağılması vardır ve bu nedenle 2-foton mikroskopisine gerek yoktur. Bu protokolün fibroblasttan türeyen iPSC'ler ile daha önce kullanıldığı durumlarda SFEB kaderi haritası üretildi ve SFEB kaderi haritası CGE ve ön ön beyin kaderini andıran 1 , 16 nolu transkripsiyonel kimliklerle birlikte interneuronların alt popülasyonlarıyla kompleks ve çeşitli yapı ortaya koydu .
ÇÇA'ları Kullanan SFEB'lerde Nöronal Aktivitenin Kaydedilmesi
- Üreticinin talimatlarına göre 12 oyuklu MEA plakaları hazırlayın.
- MEA plakalarını temizlemek için steril H 2 O ile aseptik koşullar altında 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Plakayı sterilize etmek için% 75 etanolle 5 dakika yıkayın ve daha sonra% 100 etanolle yıkayın.
- Sterilizasyon işlemini tamamlamak için plakayı fırında 50 ° C'de 4-5 saat pişirin.
- Her göze 500 μL% 0.2 polietilenimin çözeltisi (PEI) ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. PEI'yı aspire edin ve kuyucukları steril damıtılmış H 2 O ile 4 kez yıkayın. Havadaki kapanır hava kuruması.
- L15 ortamda bir 20 mcL / mL laminin çözeltisi hazırlayın ve her bir kuyunun merkezine 10 mcL laminin ekleyin.
NOT: Çevredeki referans ve topraklama elektrotlarını kaplamayın. - Orta veya laminin buharlaşmayı önlemek için çevre rezervuar steril dH 2 O ekleyin.Plakayı 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Laminin kaplı MEA plakalarına SFEB'leri (bkz. Bölüm 1 ve 2) geniş bir ağızdan pipet ucu içine yavaşça emerek ve aktararak ekleyin. Her bir kuyu için 200 uL DM2 ortamı ilave edin ve 37 ° C'de,% 95 nem ve% 5 CO2 ile bir gece boyunca inkübe edilir.
- 24 saat sonra ek bir 200 μL orta ekleyin ve plaka okumadan önce 37 ° C,% 95 nem,% 5 CO 2 30 dakika için kurtarmak için izin.
- Nöronal aktivite kaydetmek için MEA plakasını plaka okuyucusuna (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) yerleştirin. İlgili MEA kayıt yazılımı ile 10 dakika etkinliği kaydedin. Ayrıntılar için referans 19'a bakın.
- Ham veri üretmek - istatistiksel analiz yazılımı kullanarak sürekli akıntılar ve nöronal aktivitenin raster çizelgeleri 19 .
NOT: MEA kayıtları SFEB kaplamasından 7 gün sonra çekilir. Bu çalışma için, ağ burst aktivitesini tespit etmek için kayıtlar 10 dakika süreyle alındı;Ardışık iz ve raster araziler. SFEB'ler MEA plakalarında uzun süre muhafaza edilebilir ve çevreyle kontrol edilen koşullar kullanarak daha uzun süreler boyunca kaydedilebilir ( Şekil 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tekniğimiz kullanılarak yetiştirilen SFEB'ler, geniş Tuj1 pozitif nöronların yanı sıra sinir öncüleri ile dolu erken gelişimsel bir kortikal subventriküler bölgeye benzeyen morfolojik özelliklere sahip doku üretmiştir ( Şekil 3A ). SFEB'nin dış katmanlarında ve iç katmanlarında çok sayıda gelişmekte olan korteks rozet gözlenmiştir ( Şekil 3B ). SFEB'nin dış kenarı, postmitotik nöronlar içeren gelişmekte olan bir korteks plakasına benzemektedir. Bu, en ventralize edilen dış korteks tabakalarında nöral progenitörler için bir işaretleyici olan Brn2'nin ifadesi tarafından desteklenir. Gelişmekte olan korteksin dış katmanlarında ifade edilen Cajal-Retzius hücreleri veya progenitörleri olabilecek Reelin pozitif hücreler SFEBlerde de görülmektedir ( Şekil 3C ). Bu protokolü kullanarak yetiştirilen SFEB'ler, karma kaudal (CGE) ve medial ganglionlarla tutarlı işaretleyicileri ifade ederNic eminence (MGE) kökenli. Kültürlerde CGE işaretleyicisi Couptf2'yi ve MGE işaretleyicisi Nkx2.1'i ifade eden diğer hücreleri ifade eden hücreler gözlemlenebilir ( Şekil 3D ). Bu, kısmen protokolde medikal kaderi 20'yi arttırdığı gösterilen DKK-1 kullanımı nedeniyle olabilir.
Bu protokolü kullanarak yapılan SFEB'ler hem kalretinin hem de kalbinindin pozitif internöronları ( Şekil 4A ) hem de VGLUT pozitif eksitatör nöronlarını ve Tbr1-pozitif glutamaterjik nöral progenitörleri ( Şekil 4B ) verir. Ortalama olarak, SFEB'lerdeki toplam hücrelerin% 61'inin VGLUT pozitif olduğunu ve% 43'ünün Tbr1 pozitif olduğunu gözlemledik ( Şekil 4C ). Bu, benzer protokolleri kullanan diğer raporlarla da uyumludur 21 . Ek olarak SFEB'ler canlı hücre kalsiyum görüntülemesi gibi fizyolojik testlere tabi tutulabilirDaha fizyolojik olarak ilgili bir çevrede sinir ağı fonksiyonunu gözlemlemek için Fluo-4 gibi belirteçleri içerir ( Şekil 5 ). SFEB'ler uzun süreler boyunca MEA kayıtlarına tabi tutulabilir ve kortikal ağ seviyesinde patlama gelişimini gösterebilir ( Şekil 6 ).
Şekil 1: SFEB'lerin Hazırlanmasında Erken Adımların Tasarlanmış Şematiği. IPSC'ler bir enzimatik çözülme kullanılarak hasat edildikten sonra, 96 oyuklu plakalara plakalanır ve hızlı agregasyonu indüklemek için 3 dakika boyunca 163 xg'de santrifüje tabi tutulur. 14 günlük in vitro (DIV) hücre agregaları, 96 gözlü plakalardan, geniş çaplı pipetler vasıtasıyla 6 kuyucuklu plakalar içeren hücre kültürü insertine aktarılabilir. Vi için lütfen tıklayınız.Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 2: SFEB Büyümesi ve Genişlemesi Sırasında Ortam Değişikliklerinin ve Aşamaların Zaman Çizgisi. SFEB'ler eklere transfer edildikten sonra , in vitro 14 ve 28 günlerde iki orta değişikliğe gitmektedirler (DIV). Genellikle deneyler için DIV 30, 60 ve 90'da hasat edilirler. Üstteki yerleştirmeler bu süreçte farklı safhalar gösterir. Ölçek çubukları = 1,000 μm (en solda); 1,000 um (DIV 20); 600 um (DIV 30); 300 μm (tek SFEB). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Genel Morfolojik KarakterSFEB'lerin tikleri Bu Protokolü kullanarak yetiştirilir. ( A ) Progenitör markörü nestin (yeşil), mitotik sonrası nöral işaretleyici Tujl (kırmızı) ve nükleer lekeyi (mavi) ifade eden bir SFEB'nin tipik dış kenarı. ( B ) SFEB'ler hem dış katmanlarda (sol resim) hem de iç katmanlarda (sağda) karakteristik kortikal rozetleri göstermektedir. Hem önden hem de olgun nöronal belirteçlerini ifade eder. ( C ) Dış tabaka / korteks plakası markörü Brn2 (yeşil) ve gelişmekte olan CGE markörü Couptf2'yi (kırmızı) ifade eden bir SFEB'nin temsili bir dış kenarı. ( D ) Bu protokolü kullanarak yapılan SFEB'ler Pax6 (kırmızı) boyama ve Nxk2.1 (kırmızı) gibi bazı MGE kökeni ile tutarlı ekspres işaretleyicileri tarafından görüldüğü gibi ventralize neokortikal yapıları temsil eder. Ölçek çubuğu = 40 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: SFEB'lerde Major Nöronal Hücre Tiplerinin Görüntüleri. ( A ) SFEB'lerdeki bazı nöronlar kalbindin (yeşil, sol resim) ve kalretinin (yeşil, sağ resim) gibi kortikal internöronlarla tutarlı işaretleri ifade eder. ( B ) SFEB'ler, VGLUT-1 pozitif glutamaterjik nöronları (kırmızı, sol resim) ve Tbr1'i ifade eden glutamaterjik öncüleri (kırmızı, sağ resim) göstermektedir. Ölçek çubuğu = 40 μm. ( C ) VGLUT-1 veya Tbr1'i ifade eden eksitatör nöronların tipik verimleri (hata çubuğu = SEM). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Canlı hücre kalsiyum kayıtları. </ Strong> (Sol resim) Temsilci dış kenar SFEB, nöronal bir kalsiyum göstergesi olan Fluo-4 ile tedavi edilmiştir. Hücreler spontan kalsiyum geçişlerini (çeşitli renk kutuları) ölçmek için işaretlenmiştir. (Sağ resim) Seçilen hücreler, kırmızı kutular (üst izler) veya yeşil kutular (alt izler) ile işaretlenmiş spontan kalsiyum geçişlerini gösterir. Ölçek çubuğu = 40 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: SFEB'lerin çok elektrotlu Dizi Kayıtları. (Üst) Bir MEA plakasına eklenmiş SFEB'nin temsilci görüntüsü (Ölçek çubuğu = 100 μm). (Orta ve altta) SFEB'ler, ÇÇA'lara uzun zaman periyotları boyunca kaydedilebilir ve olgunlaşmayı gösterir. (Orta ve alt, sol) 3 SFEB'nin geniş çaplı bir patlama haritası 1 oyuklu 3 kuyunun üzerine kaplanmıştır2-kuyucuklu MEA plakası, koyu renkler 30 ve 90. gün arasında artan toplam başaklanma aktivitesini temsil eder. (Orta ve alt; insets) Kümülatif etkinlik haritası, sivrisinek yoğunluklarında ve SFTP'lerde kortikal ağlardaki sivri bölgelerde bir artış olduğunu gösterir Gün 30 ve gün 90. (Orta ve alt, sağ) Ham izler (üst) ve bütün iyi sıyrılmış alanlar (alttaki), sivri uçların sayısındaki ve zaman içindeki patlama sayılarının arttığını gösterir; SFEB'lerdeki daha güçlü ağ oluşumuna işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Antikor | seyreltme | Türler |
| Nestin | ,111111111 | Fare |
| Brn-2 | 0.388888889 | Tavşan |
| VGLUT1 | ,111111111 | Tavşan |
| Pax6 | 0.25 | Tavşan |
| kalretinin | ,180555556 | Tavşan |
| Calbindin | ,319444444 | Tavşan |
| CoupTFII | ,180555556 | Fare |
| Nkx 2.1 | ,180555556 | Tavşan |
| Tuj1 | ,388888889 | Tavuk |
| reelin | ,388888889 | Fare |
| Tbr1 | ,180555556 | Tavuk |
| NFH | 0.25 | Fare |
Tablo 1: Bu Çalışmada Kullanılan Antikorlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, bir hiPSC kaynağının frontal korteksin erken gelişim evresini yineleyen 3 boyutlu bir yapıya ayırma koşullarını sağlar. Bu prosedür, aynı zamanda mikroskopi yapılmaya elverişli olan elektrofizyoloji için sorgulanabilen yapılar üretir. SFEB'nin son morfolojisi, organotipik beyin dilim kültürlerine benzemekte ve yüksek kaliteli ayrıntılı konfokal görüntülemeye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, hem fibroblast hem de periferik-kan mononükleer hücre kaynaklı hiPSC'lerden başarıyla SFEB'ler üretebilir. Periferik kan mononükleer hücre kaynaklı hiPSC'lerden yapılan SFEB'ler, fibroblasttan türeyen hiPSC'lerden yaratılanlarla benzer morfolojik özelliklere sahiptir.
Bu süreç, diğer 3-D şemaları gibi hücre akıbeti kararlarını yönlendirmek için küçük molekül ekstraselüler ipuçlarını kullanır. Bu, hücre için daha gerçekçi bir çevre yaratan hücre-hücre temasının içsel özellikleriyle birleştirilirIş oluşumu ve nöronal fonksiyon. Diğer raporlar, küçük molekül hücre dışı sinyallerinin uygun kombinasyonunun orta beyin dopaminerjik 8 , 22 ve kortikal internöronlar 8 , 16 , 23 gibi hücre kaderi kararları için yeterli olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, 3 boyutlu sistemler 2-D eşdeğerleri 5'e kıyasla hızlandırılmış bir olgunlaşma süresine sahiptir. Yeterli zaman verildiğinde, 3 boyutlu kültürler olgunluğun arttığını gösterdi. Bu nitelikler, SFEB gibi 3 boyutlu platformların kullanışlılığı konusunda güçlü argümanlar yapar. Canlı ve yüksek kaliteli mikroskopi ile kaynak materyalin esnekliği arasındaki ek fayda, bu protokol için zorlayıcı argümanlar oluşturmaktadır.
Buna ek olarak, bu protokolü kullanarak yapılan SFEB'ler, rapor edilen diğer çalışmalarla benzerlik gösterir 13 , 24 . Referans 24 ile ilgili olarak, bu protokol ve nöronların fizyolojik geçerliliği onu önceden belirtir. Örneğin, referanslar 13 , 24'te bildirilen çalışmalar , kortikal benzeri nöronları elde etmek için çift SMAD inhibisyonunun benzer sürümlerini kullanır ve benzer bir oranda glutamaterjik nöronlar ve öncüleri (~% 50) elde etti. Ek olarak, Mariani, J. ve ark. (Referans 13 ) 25-30 günlük zaman noktalarında bu protokol olarak benzer Pax6 ve Nestin boyanmasını rapor etmiştir. Nitekim, Brn2 için boyama paterleri ve GFAP pozitif astrositlerin ekspresyonu, referans 24'de bildirilenle benzerdir. Bununla birlikte, bu protokol, yaygın olarak kullanılan iki organoid metodolojisine göre bir takım avantajlara sahiptir. Birincisi, Mariani, J. ve ark. 13 , 50. günlerde Dlx pozitif internöronların gelişimini rapor eder veSadece bağışıklık boyama yöntemleriyle sıkıştırılmıştır. Bu protokolü kullanarak, Dlx pozitif internöronlar 30. günde üretilir. Bu internöronlar, tek hücreli elektrofizyoloji ve GABA 16'nın tek hücreli farmakolojik uygulaması ile teyit edilmiştir. Ek olarak, 13 yazar, nöronların fonksiyonel bağlantısını talep eder, ancak sadece lekelenme ile belirlenmiştir. Bu protokolü kullanarak yapılan SFEB'ler, gelişmekte olan kortikal ağların bağlı ve işlevsel olduğunu göstermek için ağ tek elektrot uyarımı ve kalsiyum görüntülemeye tabi tutulmuştur. Pasca ve ark. 24 organoid benzeri yapılardan kayıtlar elde etmek için bir kriyostat kullanarak agregaları bölümlendirin. Bu protokolü kullanarak yapılan SFEB'lerin kesitlendirmeye ihtiyaç duyulmadığı ve eklerken 1 doğrudan kaydedilebileceği 1 . Kesitsiz SFEB'lerden kaydedilen nöronların, aksiyon potansiyeline sahip oldukları ve sortin sonrası sinaptik-öncesi potansiyelleri inhibe ettiği gösterilmiştirg 1, 16.
SFEB'ler hem başlangıç materyali olarak hem fibroblastlar hem de PBMC'ler kullanılarak hazırlanabilir. Benzer sonuçlar elde etmek için bazı küçük moleküllerin değiştirilmesi gerekebilecek olsa da , hiPSC'lere (örn. Diş kâğıt sünnet derisi, sünnet derisi, idrar) neden olan diğer doku tiplerini kullanmak da mümkündür 25 , 26 , 27 . Bu protokol için, DKK-1 kullanımı, SFEB'yi ventralize edilmiş bir kadere doğru sürmek için önemlidir 28 . Bu ventralization CGE benzeri kökeni 16 internöronlar ayırt edilmesi için, kısmen sorumludur. DKK-1 pahalı bir küçük moleküldür ve bu nedenle bu protokolde DKK-1'i takviye etmek için yüksek yoğunluklu sonik dikenat kullanılabilir. Bununla birlikte, DKK-1 yoluyla Wnt inhibisyonu için konsantrasyonlar ampirik olarak son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Ayrıca, XAV939, başka bir Wnt inhibitörüR, ventralize edilmiş bir kadere doğru farklılaşma göstermeye yardımcı olmak için kullanılabilir, ancak bu inhibitör kullanımı MGE 23 ile transkripsiyonel kimlikleri paylaşan doku üretecektir.
Bu protokolde tanımlanan SFEB'ler gibi 3D hiPSC kültür sistemleri geliştirirken, bu yapıların kültürden kültüre heterojen bir miktar getirdiğini akılda tutmak önemlidir. Bu, kısmen, iPSC'lerden nöronal farklılaşmanın stokastik doğasından ve SFEB'deki hücre-hücre teması başlatılmasından spontan öz organizasyona neden olan 29 , 30'dan kaynaklanmaktadır . Bu nedenle, bu tekniğin heterojenite bağlamındaki yararlılığını yorumlamak önemlidir. Bu sistemdeki heterojenliğin etkisini en aza indirme yolları, çok sayıda SFEB yaratır, böylece sistemdeki doğal varyasyonu temsil eder, konsantrasyona sıkıca bağlı olarakReaktifler ve her üretim işleminin başlangıcında tohumlanan hücre sayısı. Temiz iPSC kolonileri ile başlamak ve hücre yaşayabilirliğini artırmak için iPSC ayrılması sırasında enzimatik ayrışma aşaması esnasında minimal triturasyon uygulamak kritik önem taşır. Öğütmeden sonra hücre canlılığı, yüksek kalitede, uyumlu SFEB'lerin elde edilmesinde önemli bir faktördür. Alternatif bir giderme adımı olarak, canlılık, ayrılma sonrasında ve gerekirse tripan mavisi kullanarak santrifüj adımlarından önce kontrol edilebilir. Canlılık ve spontan farklılaşma, ROCKi'nin erken ayırma ve ayırma adımlarında düzgün şekilde kullanılmaması durumunda da etkilenebilir. ROCKi'nin kullanılması ve ilk 7-10 günde% 50 besleme sırasında kademeli olarak azalması tutarlı, yüksek kaliteli SFEB'ler için kritik öneme sahiptir.
Ayrıca, bir tek tabaka preparat kullanılarak oluşturulan aynı hücre çizgilerinde gözlemlenenlerle 3D SFEB'lerin sonuçlarını kontrol etmek için bir doğrulama adımı olarak genellikle yararlıdır. understaHer bir deneysel kohortta iki sistemin karşılaştırma şeklini belirlemek, belirli bir hastalık modelinin karmaşıklığını anlamada son derece yararlıdır. Son olarak, SFEB'ler daha homojen bir 2D monolayer sistemi 16 üzerinde daha ileri çalışmalar için fluoresan aktif hücre ayırma kullanılarak hücre popülasyonlarını sıralamak ve saflaştırmak için kullanılabilir.
Bununla birlikte, bu protokolü kullanarak yaratılan SFEBler, küçük gelişmekte olan kortikal devrelerin incelenmesi için yararlıdır. Bu tekniğin ileride uygulanması, yüksek içerikli yaklaşımlarla elektrofizyolojik kayıtların çoğullaştırılmasını içerir. Nitekim, hücre odası ek parçaları 96 gözlü plaka formatında üretilmek üzere üretilmiştir. Bu ekler, burada açıklanan SFEB protokolüyle birlikte 6 kuyulu eklerin yerine kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak ölçeklenebilirliği göstermek için, SFEB'lerin belirli bir kohortta birden çok satır ve klon kullanılarak oluşturulması gerekecek ve tutarlılığı aramak için sağlam bir hücre bazlı test setinde taranması gerekecektir.Ince kültürler. Örneğin, nöronal sayılar, morfoloji ve katman gelişimi, 96 oyuklu format kullanılarak tahlil edilebilir. İdeal olarak, hücre bazlı analizler, aynı zamanda 96 oyuklu plakalara ölçeklenebilir olan MEA gibi yüksek içerikli bir elektrofizyolojik tahlil ile kombine edilmelidir.
Bu SFEB platformu, özellikle genetik ile erken sinirsel gelişim arasında olası bir etkileşimin olduğu durumlarda, nörolojik rahatsızlıklarda erken kortikal ağ gelişim rolünü deşifre etme konusunda vaat ediyor. Sıçan ve fare çalışmalarında gösterildiği gibi bunun bir dilim kültürü gibi çok fazla tedavi edilebileceğini kanıtladık. Bu sistemi kullanan faydalı gelecek çalışmaları, fare ve SFEB'in in vivo yapıları arasındaki gelişimsel karşılaştırmalı anatomi ve fizyolojiyi temel almalıdır. Bu karşılaştırmalı veriler, uyuşturucu keşfi ve temel araştırma için gerçek bir translasyonel sistem geliştirmek için çok güçlü olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Makaleyi düzeltmek için Elizabeth Benevides'e teşekkür ediyoruz. Dr Dr teşekkür ederim. John Hussman ve Gene Blatt'ın yararlı tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
