לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר דגימה לא פולשנית של דרכי הנשימה העליונות ללא הפרעה של שורות mucosal נוזל. זה גם פרטי ההליך החילוץ השתמשו לפני הניתוח של מתווכים חיסוניים בתוך נוזל eluates לצורך המחקר של דרכי הנשימה אקטואלי המערכת החיסונית החתימה, ללא צורך נהלים גירוי (משמש לעתים קרובות על ידי טכניקות אחרות). הנוזל שורות mucosal נדגמים רצועת נייר סינון הממוקמת בחלקו הקדמי של נחותים turbinate ושמאלה למשך 2 דקות הספיגה. Analytes הם eluted מהעיתון מסנן, eluates חלבון מבוססת שחולצו הם נותחו על ידי חומרים מבוסס electrochemiluminescence, המאפשר כימות רגישות גבוהה של level נמוך וגבוה analytes במדגם זהה. מדדנו את רמות ויוו 20 מתווכים חיסוניים שנבחרו מראש הקשורים ספציפית החיסונית איתות המסלולים ב רירית דרכי הנשימה העליונות, אבל הטכניקה אינה מוגבלת זה לוח ספציפי או דגימה באתר. השיטה יושמה לראשונה אצל ילדים בת 7-ממחקרים פוטנציאליים קופנהגן על אסטמה במדגם₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) ילדות עם קדחת השחת. הוא שימש לאחר מכן במדגם האורך COPSAC₂₀₁₀ לידה, שנדגמו 1 חודש, 2 שנים ולאחר 6 שנים של גיל ועל מופעים של תסמינים נשימתיים חריפה. אנחנו בהצלחה שהושג וניתח דגימות 620 (89%) של 700 ילדים בן חודש 1; כמה דוגמאות היו מתחת לגבול זיהוי assay (המדווח החציון (הבין-הרביעון טווח (IQR)). מספר דוגמאות מתחת לגבול זיהוי (כלומר מ-0 עד כדי להגדיר עבור הגבול התחתון של זיהוי) עבור כל מתווך היה 29 (7.25-119.5). טכניקה זו מאפשרת כימות של vivo בתוך דרכי הנשימה הרירית המערכת החיסונית הפרופיל מלידה, יכול להיות מיושם longitudinally, שניתן להחיל על מחקרים על ההשפעה של גנטיקה, חשיפות סביבתיות-ונערותו פתופיזיולוגיה, endotyping, ניטור של מחלות נשימה, ועל פיתוח והערכה של הריפוי.

Introduction

הנוזל שורות mucosal של האף מפצה את החלק הנוזלי של מערכת הנשימה העליונה. זה מורכב של מטריצה מורכבת של מגשרים נגזר הגומלין בין האפיתל תאים חיסוניים המרכיבות את השורה הראשונה של הגנה מפני פולשים מיקרואורגניזמים. רירית האף הינו נגיש בקלות, ויש קשר פונקציונלי ו חזק בין האף של הסמפונות¹. את התא הוא בעל עניין מיוחד ביחס למחלות דרכי הנשימה נפוצות בילדות, כגון אסטמה, קדחת השחת, אלא גם למגוון הפרעות נשימה אחרות נפוץ יותר מאוחר יותר בחיים.

כאן, אנו מתארים יישום שיטה מדגם ללא הפרעה הרירית רירית נוזל מתוך חלל האף באמצעות טכניקה המבוססת על נייר סינון, לא פולשנית, וכן הליך מיצוי הבאים, נהגה elute חלבון מבוססת analytes מהעיתונים סינון לפני כימות שלהם. טכניקה זו, לדוגמה, ניתן להשיג ויוו המערכת החיסונית חתימות של אנשים בריאים וגם אנשים עם מחלות נשימה שונות. יתר על כן, קיימת אפשרות לבחון חשיפות חשיבות עבור חתימה המערכת החיסונית ספציפיים וכן להעריך אם זה כמנבא או מתווך של התפתחות המחלה מאוחר יותר.

שורות mucosal נוזל שהושגו בעבר על ידי שטיפה של חלל האף², אשר לעיתים קרובות לפניו מבחן אתגר האף, איפה אלרגן הוא הציג ברמות גבוהות כדי לעורר תגובה דלקתית של,^3,4. עם זאת, טכניקת שטיפה של חלל האף הוא לא ריאלי אצל ילדים צעירים, מציגה גורם לדילול לא ידוע, אשר מבלבל את התוצאות, מתווך מדולל רמות יכול ליפול מתחת לגבול זיהוי של assay⁵. יתר על כן, בשל הגורם דילול לא ידוע, התגובות analyte נמדד מתוך הבדיקות אתגר האף אינן דומות בין אנשים, וכך להגביל את התועלת של טכניקת שטיפה של חלל האף במדגם הגדרת. לבסוף האתגר אלרגן ישימה רק במקצועות sensitized, אתגרים אחרים, כגון האתגר היסטמין, אינן רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, ובכך לגרום השפעה התקרה על שחרור המתווך. בעיות אלה הם עקפו בטכניקת מבוססי-נייר סינון הציג אוסף נוזלים שורות mucosal, איפה בודדים הפרשת נוזלים ורמות analyte הגורמים היחידים המשפיעים השונות הבין-אישי.

במהלך ההליך החילוץ, analytes הן eluted מהעיתון מסנן לאחר התוספת של אמצעי אחסון זהים המאגר כדי כל הדגימות. זה מעדיף דומה שמחוץ דילול של כל הדגימות. מאגר החילוץ של אלבומין מבוססי תמיסת מלח מול משמש עבור השלב החילוץ; זה מאפשר הפקת מבוססי חלבונים מתווכים ומייצב חלבונים כדי להגביל דנטורציה במהלך ההקפאה עוקבות של חלבונים eluted לפני כמת. כדי למנוע השפלה חלבון במהלך שלב החילוץ, קוקטייל של מעכבי פרוטאז נוסף למאגר החילוץ.

היישום של טכניקות המאפשרות כימות של הפרעה, ויוו-מתווכים חיסוניים שנוצר באתרי הרירית הוא בעל חשיבות עליונה. ראשית, האתר הרירית מפצה אימונולוגי האיבר הגדול ביותר בגוף. שנית, המיקום האף הוא אתר ראשי של חשיפה לאוויר, קשורה באופן הדוק תא אימונולוגי הנשימה של הריאות¹. שלישית, האפשרות של מדידות איבר חשוב זה עם שיטה לא פולשנית פותחת את האפשרות לספק שפע של מידע על ציר חשוב חיידק-החיסון אינטראקציה ביחס מחלה את דרכי הנשימה ובריאות. רביעית, יש הרבה יישומים אפשריים אחרים של טכניקה זו, כגון לימוד שינויים המקומיות אימונולוגי בניסויים אקראי, מבוקר של סמים, יסודות קורט.

אנחנו בתחילה ליישם את הטכניקה מחקרים פוטנציאליים קופנהגן על אסטמה במדגם₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) ילדות, שבו קבענו את הפרופיל החיסונית של נוזל שורות mucosal בת 7 ילדים עם דלקת אלרגית לעומת פקדים בריא¹³. לאחר מכן, אנחנו הוחלו בהצלחה טכניקה זו האורך COPSAC₂₀₁₀ עוקבה ופרופילים דרכי הנשימה המוערך המערכת החיסונית 1 חודש, 2 שנים ולאחר 6 שנים של גיל ועל מופעים של תסמינים נשימתיים חריפה. תוצאות neonates בן חודש 1 הראו אגודות חשוב בין החתימה מערכת החיסון לבין חשיפה סביבתית מוקדמת-חיים^{7,8,9,10,11,12}.

Protocol

המחקרים נערכו בהתאם לעקרונות המנחים הצהרת הלסינקי. התקבלו האישורים של ועדת האתיקה קופנהגן (KF 01-289/96 COPSAC₂₀₀₀ ) ו- H-B-2008-093 COPSAC₂₀₁₀, הסוכנות להגנת נתונים דנית, בכתב הסכמה מדעת הושג משני ההורים של כל נושא לפני ההרשמה.

1. הגדרת הניסוי

1. השתמש גיליונות של נייר סינון (סיבי פוליאסטר hydroxylated גליונות, ראה את הטבלה של חומרים)^6,7.
   1. לגזור רצועות 3 x 15 מ"מ גודל עבור ילד בן חודש 1, צורת L מבוגרים לילדים ומבוגרים (5 x 20 x 10 מ מ (הזרוע הקצרה של בחיצים)).
2. להוסיף חתיכת נייר סינון לנחיר אחד של התינוק באמצעות מלקחיים. מניחים נייר הסינון בחלק הקדמי של נחותים turbinate (כ 1 ס מ בתוך הנחיר עבור neonates ו- 1.5 ס מ לכל הגילאים אחרים).
   1. במקום neonates על מיטה ולתת להם סוכר לנוחות.
      הערה: לילדים בכל הגילאים אחרים, שהדגימה מבוצעת בקלות הרבה ביותר בנושא ישובה על כיסא.
   2. ילדים בוגרים, להוסיף הזרוע הארוכה של נייר הסינון בצורת L לנחיר אחד.
3. החל מסרטון האף נחיריו של כדי למזער את אי הנוחות, כדי להימנע מאובדן מקרי של נייר הסינון.
4. הסר את הניירות המסנן לאחר 2 דקות של ספיגת.
5. למקם את הניירות מסנן צינורות שכותרתו ולהקפיא אותן באופן מיידי ב- 80 ° c
6. רשום של תסמינים של זיהום דרכי הנשימה שמוצג על ידי הילד ביום של הדגימה.
7. לתעד את כל התעטשות, בכי מתמשך או epistaxis המתרחשת במהלך 2 דקות של הדגימה.

2. כימות של דרכי הנשימה החיסון-מתווכים

1. סעו עד 10 מדגמים רנדומליים במקפיא. להקליט את מספרי הזיהוי. שומרים את הדגימות על קרח בכל תהליך העבודה.
2. לאחר מפשיר על קרח, לטבול את הניירות מסנן (לכל נושא) מהנחיריים שני 300 µL של טריות מאגר (ראה הטבלה של חומרים) המכיל פרוטאז מלאה מעכב טבליה אחת (ראה את הטבלה של חומרים) לכל 25 מ של המאגר.
   1. להתאים את עוצמת הקול של מאגר לפי גודל נייר הסינון.
      1. השתמש µL 300 מאגר עבור מסנן המסמכים 3 x 15 מ"מ גודל.
      2. אם רק אחד נייר סינון זמין, השתמש חצי מאגר אמצעי האחסון (150 µL).
3. העברת הדגימות מטרף צלחת (400 סל ד) עבור 5 דק שימוש שעון עצר.
4. העברת מאגר assay והמסמכים מסנן לח לתוך הכוס של מסנן צינור אצטט תאית (0.22 µm גודל הנקבוביות) ממוקם בתוך microcentrifuge צינור (ראה את הטבלה של חומרים).
5. צנטריפוגה-16,000 g x עבור 5 דקות ומפרידה מקורר (ב 4 ° C) כדי להשיג תמצית האף מסוננים בצינור.
6. להסיר את הגביע ולשמור הצינורות על קרח בזמן aliquoting את תמצית האף לתוך הבארות של דל חלבון מחייב אחסון צלחות (ראה את הטבלה של חומרים).
7. לאחסן ב- 80 ° C עד הניתוח.
8. לקבוע את ריכוזי ציטוקינים נוגדנים בתמציות האף באמצעות מערכת רגישות גבוהה, המבוססים על electrochemiluminesce מערך מרובבת (ראה את הטבלה של חומרים).
   הערה: אדם 10-פלקס T_H1/T_Hציטוקינים 2 assay, 9-פלקס כימוקין assay, יחיד-פלקס IL-17A, TGF-β1 ואת TSLP בוצעו כאן.
   1. עבור מבחני, דגירה תמציות באף בן לילה ב 4 º C. לנהל את המידות כמו לאדם רגיל היצרן פרוטוקול (ראה את הטבלה של חומרים).
      הערה: immunoassays (ראה טבלה של חומרים) בדרך כלל יש טווח דינמי גבוה למדידה הנעים בין 1 & 10,000 pg/mL, אבל עבור כמה מבחני, זה יכול להיות 100,000 pg/mL. משמעות הדבר היא שלא ניתן להפעיל כל דוגמאות-דילול אותו, ובכך יגביל את ההשפעה של דילולים שונים במקצועות בריאים וחולים, כמו במקרה של immunoassays דומים אחרים. הגבול התחתון של זיהוי עבור כל ציטוקינים היה 1 pg/mL או פחות, ובשביל נוגדנים, זה נע בין 1 & 50 pg/mL. TSLP לזיהוי ב- 98% של דגימות לא היה באותו חודש של גיל.

3. נתונים סטטיסטיים

1. הנתונים לפני ניתוח כדי לקבל תמלוגים בדרך כלל מבוזרת של רמות ציטוקינים ו כימוקין יומן-שינוי צורה.
2. אם הדגימות מנותחים אצווה אחד או יותר, לתקן את הנתונים ציטוקינים ו כימוקין למרכוז batch-wise על נתוני יומן-טרנספורמציה.
   1. לשלב אומר הכוללת וטרנספורמציה אנטי-יומן כדי לקבל נתונים ביחידות המידה המקורית.
      הערה: עבור כל ערכה של ניתוחים עשית, שקול לכוונן משתנים המשפיעים על רמת ציטוקינים נוגדנים. זה יכול להיות השפעות אימהי (למשל, צריכת אלכוהול ועישון במהלך ההריון), הנקה, אירועים קשים במהלך דגימה, אחים, לבעלי-חיים הבית, וכו

Discussion

עם הטכניקה המובאת כאן, הצלחנו לקבוע את ויוו דרכי הנשימה העליונה הרירית פרופיל החיסונית אצל ילדים מוקדם ככל חודש של גיל, אשר לא נעשה בעבר. . הבחנו שהנוכחות של חיידקים מסוימים את דרכי הנשימה, picornaviruses^7,11, כמו גם אחרים טרום, חשיפות הלידה, היו שיקוף בפרופיל המערכת החיסונית דרכי הנשימה neonates. יתר על כן, נהגנו נתוני הפרופיל החיסונית אלה דרכי הנשימה ללמוד את מנגנון הפעולה של משפט אקראי micronutrient של ויטמין d במינון גבוה תוצאות אלו מדגישים את תוקפו ואת התועלת של הטכניקה נוזלים שורות mucosal כמו טכניקה דגימה לא פולשנית עבור הבאים ויוו כימות של מתווכים חיסוניים דרכי הנשימה.

הנקודות הבאות ששווים לפני יישום השיטה: כדי למדוד ציטוקינים במטריצת שורות mucosal נוזלים, חשוב להשתמש מתכלה גבוהה-רגישות מבוססי מתודולוגיות, כמו זה המסופק באמצעות פרוטוקולים electrochemiluminescence. השימוש immunoassays מקושרים-אנזים יכול להוביל מסקנה במדידה ספיגת. יתר על כן, למרות שיש קשר חזק בין האף הסמפונות, המדידה של הפרופיל החיסונית את דרכי הנשימה העליונות הוא עדיין מגבלה. דגימה בוצעה על החלק העליון של השכבה הרירית; לכן, אנו מצפים כי הנוזל בעיקר מייצג את ההרכב של שכבת ג'ל, לא השכבה סול. אנחנו לא למדוד שכבה ריריות סמנים כדי לאמת את זה, זו מגבלה. בודדים בווריאציות האף הפרשת נוזלים עשויים בתיאוריה להשפיע הרמות שאותרו של ציטוקינים ו נוגדנים. עם זאת, הצלחנו לזהות משתנים וברורה פנוטיפים אימונולוגי בתגובה חשיפות שונות^{7,8,9,10,11,12}, המציין כי הבין-אישית בווריאציות הפרשת האף דינמיקה לא ייתכן מכשול גדול עבור טכניקה זו. תוך כדי ביצוע הטכניקה, חשוב לבצע את כל ההליכים בטמפרטורות נמוכות (מקורר קרח) כדי למנוע השפלה חלבון במהלך העיבוד. השפלה חלבון יכול להיות מופחת עוד יותר על-ידי הוספה של מעכבי פרוטאז חלבון מומלצים למאגר מיצוי חלבונים.

למרות זאת, הכוח של טכניקה זו היא שזה לא פולשנית ולא קל לביצוע, הפעלת הערכות האורך של דרכי הנשימה הרירית החתימה המערכת החיסונית מהתקופה neonatal ו ואילך. מידע כזה יכול לספק פוטנציאל הידע על איך המערכת החיסונית המקומית דרכי הנשימה מבשיל ומפתחת לאורך כל הילדות לבגרות. יתר על כן, הטכניקה הדגימה מתבצעת ללא הפרעה, בתוך vivo -באופן רלוונטי, לא מדולל, שאיפשר את הגילוי של מתווכים חיסוניים זה היה לגילוי עם טכניקה שטיפה של חלל האף, שבו גורם לא ידוע דילול מפחית את תוקפו של ממצאים¹³. השתמשנו מדיום סינתטי, סיבית, hydroxylated-פוליאסטר זמינים מסחרית (ראה הטבלה של חומרים) והוא מיועד עבור מדגם איסוף, אחסון, ושחרור תרכיב. החומר הוא הידרופיליות, עם קשירה נמוכה למערכות ביולוגיות, דגימות המכילים חלבונים יציבים במהלך האחסון ב- 80 ° c החומר סופג מאוד, משטחים סיבים שונו כדי לשפר את המים wettability.

במחקר₂₀₁₀ COPSAC, בחרנו פאנל של 21 ציטוקינים, נוגדנים אשר נבחרו מראש כדי לייצג מסלולים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר העיקריים של המערכת החיסונית מתנהג באופן מקומי את דרכי הנשימה. היחידה של אלה מגשרים, גישור, TSLP, איננה לזיהוי ב חודש אחד של גיל.

יישום חשוב לעתיד יהיה לאסוף שורות mucosal נוזל מן הנשימה התחתונה (למשל, על-ידי שימוש בטכניקה bronchoscopic microsampling) כדי להעריך את דרכי הנשימה התחתונה אימונולוגיה. Bronchoscopic microsampling זה הליך חדש לאבחון bronchoscopic, יכולת איסוף נוזל מקומי הסמפונות האפיתל המצפים; הוא מנצל בדיקה בנדן סיבי פוליאסטר¹⁴. כאשר דרכי הנשימה דיסטלי נגישים, החללית הוא דחף החוצה הקצה נדן כדי לספוג את הנוזל אפיתל הסמפונות נוכח לומן הסמפונות. Bronchoscopic microsampling כבר בשימוש תסמונת מצוקה נשימתית חריפה^14,15,16 ומחלת ריאות חסימתית כרונית¹⁷. אולם, באסטמה, בעיה קיימת היא כי המכשיר עלולה לגרום דימום עקב מחלה-induced השבריריות אפיתל, vascularization מוגבר. החלת טכניקת נוזלים שורות mucosal ההליך bronchoscopic microsampling עשויות להיות השלכות חשובים קלינית ביחס להבנת הפתופיזיולוגיה, וכן ניטור, בטיפול של חיזוי התוצאה של מספר אקוטי וכרוני ריאתי מחלות אצל ילדים ומבוגרים.

כל סוגי מגשרים תיאורטית ניתן למדוד באמצעות פלטפורמת מתכלה מולטיפלקס של מערכת מסחרי המשמש כאן (ראה את הטבלה של חומרים). הפלטפורמה מאפשרת כימות רגישות גבוהה ומדויקת של כל מתווך אשר ניתן להשיג זוג של נוגדנים חד-שבטיים החלים התפתחות מתכלה. פלטפורמה זו גם מביאה עמה ברמת דיוק גבוהה, פחות רגישות וריאציות pH, טמפרטורה, צמיגות נוזלים כדי להיות מנותח.

בעתיד מחקרים, שיהיה בעל ערך רב להרחיב את הפאנל הנוכחי של מתווכים חיסוניים למדידה, לדוגמה: פפטידים מיקרוביאלית; איגה הכולל וספציפיות; המגיבים שלב חריפה, כגון חלבון מגיב C; מגשרים השומנים, כגון פרוסטגלנדינים; מגשרים נוירולוגיות, כגון neurotrophic המוח-derived factor (BDNF). זה יכול לספק תצוגה מפורטת יותר של מהות מערכת התגובה הרירית באתר הגוף עם חשיפה נרחבת באוויר. המתווכים המוצע עשוי גם ניתן למדוד באמצעות יישוב immunoassays רגישות גבוהה כמותית, כגון הכיוונון הנוכחי, או על ידי יישוב או untargeted תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה - או כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS)-מבוסס גליקומיקס טכניקות. הגישה השנייה כבר יושם במידה מסוימת בשיטת העיבוי והבל הפה, שבו יש מספר חסרונות מתודולוגיים ביחס הדוגמאות של biofluid¹⁸ שאינם לכאורה שורות mucosal הטכניקה נוזלים.

האורך דגימה מן התקופה neonatal לבגרות, כפי שבוצע במדגם₂₀₁₀ COPSAC, יגדל באופן ניכר את ההבנה שלנו של גורמים אימונולוגי בבסיס הקודם או מתנהג/ת עם מחלות דרכי הנשימה כגון אסטמה או אלרגיה. ממצאים כאלה עשוי להיות חשוב להתפתחות של הריפוי מיקוד endotypes מחלות ספציפיות וכדי החקירה של micronutrient, סמים מנגנוני הפעולה אקראי ניסויים קליניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrous hydroxylatedpolyester sheets	Accuwik Ultra	SPR0730	Filter paper
Milliplex Assay Buffer	Millipore	L-AB	Buffer
Low-protein binding storage plates	Thermo Scientific	CLS8161	Plates
Protease Inhibitor	Roche	11873580001	complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Reader of multi-spot plates	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
Assays	Mesoscale		Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com