Summary
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.
Abstract
Questo protocollo descrive campionamento non invadente di liquido di rivestimento mucoso delle vie respiratorie superiore indisturbato. E ' anche in dettaglio la procedura di estrazione utilizzata prima dell'analisi di mediatori immuni in eluati fluidi per lo studio della firma immuni topica delle vie aeree, senza la necessità di procedure di stimolazione (spesso utilizzato da altre tecniche). Il liquido di rivestimento mucoso viene campionato su una striscia di carta da filtro posizionato sulla parte anteriore del inferior turbinate e sinistro per 2 min di assorbimento. Analiti vengono eluiti dalla carta da filtro, e gli eluati di base di proteine estratti vengono analizzati da un immunoassay elettrochemiluminescenza-based, che consente per la quantificazione di alto-sensibilità di analiti a basso e alto livello nello stesso campione. Abbiamo misurato i livelli in vivo di 20 mediatori immuni preselezionati legate alla specifica immunitario vie nella mucosa delle vie respiratorie superiore di segnalazione, ma la tecnica non è limitata a quel pannello specifico o il sito di campionamento. La tecnica innanzitutto è stata implementata nei bambini di 7-year-old da studi prospettivi Copenaghen sull'asma nella coorte di2000 (COPSAC2000) di infanzia con rinite allergica. Da allora in poi è stato usato nella coorte di nascita2010 COPSAC longitudinale, provata a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Abbiamo correttamente acquisiti e analizzati campioni da 620 (89%) di 700 1-mese-vecchi bambini; alcuni campioni erano sotto il limite di rilevamento del test (segnalato come la mediana (Inter-Quartile Range (IQR)). Il numero di campioni di sotto del limite di rilevazione (cioè da 0 al set point per il limite inferiore di rilevamento) per ogni Mediatore era 29 (7,25-119.5). Questa tecnica consente la quantificazione del profilo di in vivo delle vie respiratorie mucose immuni dalla nascita, può essere applicata longitudinalmente e può essere applicata agli studi sull'effetto di genetica e le esposizioni ambientali di presto-vita, patofisiologia, endotyping e il monitoraggio di malattie respiratorie, sviluppo e valutazione di nuove terapie.
Introduction
Il liquido di rivestimento mucoso del naso costituisce la parte liquida del sistema della superiore-via aerea. Si compone di una matrice complessa di mediatori derivati dall'interazione tra l'epitelio e cellule immunitarie che compongono la prima linea di difesa contro l'invasione di microrganismi. La mucosa nasale è facilmente accessibile, e c'è una forte relazione funzionale ed immunologica tra il naso e bronchi1. Questo comparto è di particolare interesse in relazione a malattie delle vie respiratorie che sono comuni nell'infanzia, come l'asma e la rinite allergica, ma anche a una serie di altri disturbi respiratori più prevalente più tardi nella vita.
Qui, descriviamo l'implementazione di un metodo a campione indisturbato mucoso rivestimento liquido dalla cavità nasale usando una tecnica non invasiva basata su carta da filtro, così come una procedura di estrazione successiva, utilizzato per eluire basati su proteine analiti dalla carta da filtro prima della loro quantificazione. Questa tecnica, ad esempio, consente di ottenere in vivo immuni firme di individui sani e di individui con le varie malattie respiratorie. Inoltre, è possibile esaminare le esposizioni di importanza per una firma immune specifica e valutare se è un preannunciatore o mediatore di sviluppo successivo di malattia.
Liquido di rivestimento mucoso è stata ottenuta in precedenza da lavaggio nasale2, che è spesso preceduto da una prova nasale di sfida, dove un allergene è stato introdotto in alti livelli di stimolare una risposta infiammatoria3,4. Tuttavia, la tecnica di lavaggio nasale non è fattibile nei bambini piccoli e introduce un fattore di diluizione sconosciuto, che confonde gli esiti, come mediatore diluito livelli possono scendere sotto il limite di rilevamento del test5. Inoltre, a causa del fattore di diluizione sconosciuto, le risposte di analita misurato dal test di provocazione nasale non sono comparabili tra individui, limitando così l'utilità della tecnica del lavaggio nasale in una coorte di impostazione. Infine, la sfida dell'allergene è applicabile solo in soggetti sensibilizzati, e altre sfide, come la sfida di istamina, non sono fisiologicamente rilevanti, potenzialmente causando un effetto soffitto sul rilascio del Mediatore. Questi problemi vengono eluse la tecnica basata su carta da filtro presentato per accumulazione fluida rivestimento mucoso, dove i singola secrezione di fluidi e i suoi livelli analitici sono gli unici fattori che influenzano la varianza inter-individuale.
Durante la procedura di estrazione, analiti vengono eluiti dai giornali filtro dopo l'aggiunta di volumi identici del buffer per tutti i campioni. Questo favorisce la diluizione simile ex vivo di tutti i campioni. Un tampone di estrazione di soluzione salina isotonica basata su albumina viene utilizzata per la fase di estrazione; consente l'estrazione dei mediatori a base di proteine e stabilizza le proteine per limitare la denaturazione durante il successivo congelamento delle proteine eluite prima della quantificazione. Per evitare la degradazione della proteina durante la fase di estrazione, viene aggiunto un cocktail di inibitori della proteasi per il tampone di estrazione.
L'attuazione di tecniche che consentono per la quantificazione del indisturbati, in vivo-generati mediatori immuni alle mucose siti è della massima importanza. In primo luogo, il sito della mucosa costituisce il più grande organo immunologico nel corpo. In secondo luogo, la posizione nasale è il sito primario di esposizione dispersa nell'aria ed è strettamente collegata al vano respiratorie immunologico del polmoni1. In terzo luogo, la possibilità di rilievo di questo importante organo con una tecnica non invasiva apre la possibilità di fornire una pletora di informazioni sull'asse di interazione di microbo-immunitario importante in materia di salute e malattia delle vie aeree. In quarto luogo, ci sono molte altre possibili applicazioni di questa tecnica, come studiare le alterazioni immunologiche locali in randomizzato, studi controllati di farmaci e micronutrienti.
Inizialmente abbiamo implementato la tecnica in studi prospettivi Copenaghen sull'asma nella coorte di infanzia2000 (COPSAC2000), dove abbiamo determinato il profilo immunitario del rivestimento mucoso fluido nel 7-anno-vecchi bambini con rinite allergica rispetto a controlli sani13. Successivamente, abbiamo applicato con successo questa tecnica al gruppo di2010 COPSAC longitudinale e profili immuni valutati delle vie respiratorie a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Risultati dai neonati 1-mese-vecchio hanno dimostrato importanti associazioni tra la firma immune e l'esposizione ambientale di presto-vita7,8,9,10,11,12.
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Protocol
Gli studi sono stati condotti in conformità con i principi della dichiarazione di Helsinki. Sono state ottenute le approvazioni dal comitato etico per Copenhagen (KF 01-289/96 per COPSAC2000 ) e H-B-2008-093 per COPSAC2010e l'Agenzia danese per la protezione dei dati e consenso informato è stato ottenuto da entrambi i genitori di ogni soggetto prima dell'iscrizione.
1. organizzazione sperimentale
- Utilizzare fogli di carta da filtro (fibrosi idrossilati-poliestere fogli, vedere la Tabella materiali)6,7.
- Tagliare le strisce 3 x 15 mm di dimensione per un 1 mese-vecchio bambino e a forma di L per ragazzi ed adulti (5 x 20 x 10 mm (braccio corto della L)).
- Inserire un pezzo di carta da filtro in ciascuna narice di un infante usando il forcipe. Posizionare il filtro di carta sulla parte anteriore del Turbinato inferiore (circa 1 cm dentro la narice per neonati e 1,5 cm per tutte le altre età).
- Posizionare neonati su un letto e dare loro acqua e zucchero per il comfort.
Nota: Per i bambini di tutte le altre età, il campionamento viene eseguito più facilmente con il soggetto seduto su una sedia. - Per bambini più grandi, è necessario inserire il braccio lungo della carta da filtro a forma di L in ogni narice.
- Posizionare neonati su un letto e dare loro acqua e zucchero per il comfort.
- Applicare una clip naso intorno alle narici per ridurre al minimo il disagio e per evitare la perdita accidentale della carta da filtro.
- Rimuovere la carta da filtro dopo 2 min di assorbimento.
- Posizionare la carta da filtro in provette e congelarli immediatamente a-80 ° C.
- Prendere nota di qualsiasi sintomo di infezione delle vie respiratorie indicati dal bambino il giorno del campionamento.
- Registrare qualsiasi starnuto, pianto persistente o epistassi che si verifica durante i 2 min di campionamento.
2. quantificazione delle vie respiratorie immunitario-mediatori
- Prendere fino a 10 campioni casuali dal freezer. Registrare i numeri di identificazione. Mantenere i campioni sul ghiaccio durante l'intero processo di lavoro.
- Dopo lo scongelamento sul ghiaccio, immergere la carta da filtro (per soggetto) da entrambe le narici a 300 µ l di preparati tampone contenente una compressa da inibitore della proteasi completa (Vedi la Tabella materiali) (Vedi la Tabella materiali) per 25 mL di buffer.
- Regolare il volume di tampone secondo il formato della carta da filtro.
- Utilizzare 300 µ l di tampone per filtri di carta 3 x 15 millimetri nel formato.
- Se solo una carta da filtro è disponibile, utilizzare la metà del volume di tampone (150 µ l).
- Regolare il volume di tampone secondo il formato della carta da filtro.
- Trasferire i campioni di un agitatore per piastre (400 giri/min) per 5 min, uso un timer.
- Trasferire i filtri di carta umidi e tampone del saggio nella tazza di un filtro di tubo di acetato di cellulosa (dimensione dei pori di 0.22 µm) collocato all'interno di una microcentrifuga tubo (vedere la Tabella materiali).
- Centrifugare a 16.000 x g per 5 min in una centrifuga refrigerata (a 4 ° C) per ottenere Estratto filtrato nasale nel tubo.
- Rimuovere la Coppa e mantenere i tubi sul ghiaccio mentre aliquotare l'Estratto nasale nei pozzetti di piastre di deposito associazione basso contenuto proteico (Vedi la Tabella materiali).
- Conservare a-80 ° C fino all'analisi.
- Determinare le concentrazioni di citochine e chemochine negli estratti nasali utilizzando un sistema ad alta sensibilità, electrochemiluminesce-based array multiplex (Vedi la Tabella materiali).
Nota: Un'analisi di umano 10-plex TH1/TH2 cytokine, 9-plex chemokine analisi e IL singolo-plex-17A, TGF-β1 e TSLP sono stati eseguiti qui.- Per i dosaggi, Incubare gli estratti nasali durante la notte a 4 ° C. Condurre le misurazioni per il costruttore standard protocollo (Vedi la Tabella materiali).
Nota: I test immunologici (Vedi la Tabella materiali) in genere hanno un'alta gamma dinamica per misurazione compreso tra il 1 & 10.000 pg/mL, ma per alcuni test, può essere 100.000 pg/mL. Ciò significa che tutti i campioni possono essere eseguiti con la stessa diluizione, limitando così l'influenza delle diluizioni dissimili in soggetti sani e malati, come è il caso in altri simili test immunologici. Il limite inferiore di rilevamento per tutte le citochine era 1 pg/mL o meno e per chemochine, esso ha variato fra 1 & 50 pg/mL. TSLP non era rilevabile nel 98% dei campioni a 1 mese di età.
- Per i dosaggi, Incubare gli estratti nasali durante la notte a 4 ° C. Condurre le misurazioni per il costruttore standard protocollo (Vedi la Tabella materiali).
3. statistiche
- Registro-trasformare i dati prima dell'analisi per ottenere distribuiti normalmente residui dei livelli di citochine e chemochine.
- Se i campioni sono analizzati in più di un batch, correggere i dati di citochine e chemochine per centraggio per singoli batch sui dati registro-ha trasformato.
- Incorporare la media complessiva e la trasformazione di anti-registro per ottenere i dati nelle unità di misura originale.
Nota: Per ogni serie di analisi fatto, si consiglia di regolare le variabili che influiscono sul livello di citochine e chemochine. Questo potrebbe essere influenze materne (ad esempio, il consumo di alcol e fumo durante la gravidanza), l'allattamento al seno, gli eventi avversi durante il campionamento, fratelli, animali domestici nella casa, ecc.
- Incorporare la media complessiva e la trasformazione di anti-registro per ottenere i dati nelle unità di misura originale.
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Discussion
Con la tecnica presentata qui, siamo stati in grado di determinare l'in vivo della superiore-via aerea mucoso profilo immunitario nei bambini da più presto 1 mese di età, che non è stato fatto in precedenza. Abbiamo osservato che la presenza di batteri specifici delle vie respiratorie e picornavirus7,11, così come altri pre e perinatale esposizioni, sono state rispecchiate nel profilo immunitario delle vie respiratorie dei neonati. Inoltre, abbiamo usato questi dati di profilo immunitario delle vie respiratorie per studiare il meccanismo di azione di un trial randomizzato del micronutriente della alto-dose della vitamina d. Questi risultati sottolineano la validità e l'utilità della tecnica fluida del rivestimento mucoso come una tecnica di campionamento non invasivo per la quantificazione di successive in vivo di mediatori immuni delle vie respiratorie.
I seguenti punti sono da prendere in considerazione prima di implementazione del metodo: al fine di misurare le citochine nella matrice fluido rivestimento mucoso, è importante utilizzare metodologie basate su alta-sensibilità immunoassay, come quello fornito da protocolli di elettrochemiluminescenza. L'uso dell'enzima-ha collegato l'analisi immunologica può portare a inferenza nella lettura di assorbanza. Inoltre, anche se c'è una forte relazione tra il naso e bronchi, la misurazione del profilo immunitario nelle vie aeree superiori è ancora una limitazione. Campionamento è stato effettuato sulla parte superiore dello strato mucoso; quindi, ci aspettiamo che il fluido rappresenta principalmente la composizione dello strato di gel, non il livello di sol. Non misuriamo il marcatori livello mucoso a conferma di ciò, che è una limitazione. Variazioni individuali nella secrezione fluida nasale possono influenzare, in teoria, i rilevati livelli di citochine e chemochine. Tuttavia, siamo stati in grado di identificare chiari e diversi fenotipi immunologici in risposta a diverse esposizioni7,8,9,10,11,12, che indica che variazioni inter-individuali nella dinamica di secrezione nasale non possono essere un ostacolo importante per questa tecnica. Mentre si esegue la tecnica, è importante eseguire tutte le procedure a basse temperature (raffreddato a ghiaccio) per evitare la degradazione della proteina durante l'elaborazione. Degradazione della proteina può essere ulteriormente ridotto aggiungendo gli inibitori di proteasi giornaliera raccomandata per il tampone di estrazione di proteine.
Tuttavia, la forza di questa tecnica è che è non invasivo e facile da eseguire, consentendo la valutazione longitudinale della firma immune della mucosa delle vie respiratorie dal periodo neonatale in poi. Tali informazioni potrebbero potenzialmente fornire conoscenza su come il sistema immunitario locale delle vie aeree matura e si sviluppa per tutta l'infanzia e nell'età adulta. Inoltre, la tecnica di campionamento viene eseguita indisturbati e in un modo in vivo -rilevanti, non diluito, che abilitato il rilevamento di mediatori immuni che sarebbe stato non rilevabili con la tecnica di lavaggio nasale, dove un fattore di diluizione sconosciuto riduce la validità dei risultati13. Abbiamo usato un mezzo idrossilati-poliestere, sintetico e fibroso che è commercialmente disponibili (Vedi la Tabella materiali) ed è progettato per la raccolta del campione, deposito e rilascio coniugato. Il materiale è idrofilo, con associazione basso biomolecolare, e campioni proteici sono stabili durante la conservazione a-80 ° C. Il materiale è altamente assorbente, e le superfici di fibra sono state modificate per migliorare la bagnabilità di acqua.
Nello studio COPSAC2010 , abbiamo selezionato un gruppo di 21 citochine e chemochine che sono stati scelti aprioristicamente per rappresentare vie importanti fenotipiche del sistema immunitario che agiscono localmente nelle vie aeree. Solo uno di questi mediatori, TSLP, non era rilevabile in un mese di età.
Un'importante applicazione futura sarebbe quello di raccogliere il liquido di rivestimento mucoso dalle vie aeree inferiori (ad esempio, utilizzando la tecnica di microcampionamento bronchoscopic) per valutare immunologia inferiore-delle vie aeree. Microcampionamento bronchoscopic è una nuova procedura per la diagnosi broncoscopica, in grado di raccogliere il fluido di rivestimento epiteliale bronchiale locale; utilizza una fibra di poliestere con guaina sonda14. Quando si raggiungono le vie aeree distali, la sonda viene spinto fuori la punta della guaina per assorbire il liquido epiteliale bronchiale presente nel lume bronchiale. Microcampionamento bronchoscopic è stato utilizzato nella sindrome da distress respiratorio14,15,16 e17di malattia polmonare ostruttiva cronica. Tuttavia, nell'asma, un problema attuale è che la sonda può causare sanguinamento a causa di malattia-indotta fragilità epiteliale e maggiore vascolarizzazione. Applicando la tecnica del fluido di rivestimento mucoso alla procedura bronchoscopic Microcampionamento potrebbe avere importanti implicazioni cliniche in relazione alla nostra comprensione della patofisiologia, così come per il monitoraggio, il trattamento e prevedere il risultato di parecchie malattie polmonari acute e croniche in bambini ed in adulti.
Tutti i tipi di mediatori possono teoricamente essere misurati utilizzando la piattaforma di immunoassay multisala del sistema commerciale usato qui (Vedi la Tabella materiali). La piattaforma consente la quantificazione di alto-sensibilità e precisa di qualsiasi mediatore per cui una coppia di anticorpi monoclonali applicabili allo sviluppo di un test immunologico può essere ottenuta. Questa piattaforma porta con sé anche ad alta precisione e minore sensibilità alle variazioni di pH, temperatura e viscosità nei fluidi per essere analizzati.
In futuro gli studi, sarebbe di grande valore per espandere il pannello corrente di mediatori immuni alla misura di, ad esempio: peptidi antimicrobici; IgA totale e specifici; proteine di fase acuta, come la proteina C - reattiva; mediatori lipidici, quali le prostaglandine; e mediatori neurologici, quali fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF). Questo potrebbe fornire una visione più dettagliata della natura del sistema risposta mucosale in un sito di corpo con un'ampia esposizione dispersa nell'aria. I mediatori suggeriti possono sia essere misurati per mezzo di mirati quantitativi immunoassays di alto-sensibilità, come nella configurazione attuale, o da mirati o non mirati spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) - o spettrometria della cromatografia-massa liquida (LC-MS)-basato su tecniche di metabolomica. Quest'ultimo approccio è già stata realizzata in una certa misura con il metodo di condensa del respiro esalato, che ha alcuni inconvenienti metodologiche per quanto riguarda il campionamento del biofluid18 che non sono evidenti per la tecnica fluida del rivestimento mucoso.
Campionamento longitudinale dal periodo neonatale all'età adulta, interpretato nella coorte2010 COPSAC, aumenterà notevolmente la nostra comprensione di sottostanti fattori immunologici che precede o che agiscono in concomitanza con malattie delle vie respiratorie come l'asma e le allergie. Tali risultati possono essere importanti per lo sviluppo di approcci terapeutici specifici di malattia endotypes di targeting e all'indagine del micronutriente e meccanismi di droga di azione in studi randomizzati clinici.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi potenziale, percepita o reale per quanto riguarda il contenuto di questo manoscritto. Le agenzie di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nell'ideazione e la conduzione dello studio; la raccolta, la gestione e l'interpretazione dei dati; o la preparazione, revisione e approvazione del manoscritto. Nessuna azienda farmaceutica è stato coinvolta nello studio.
Acknowledgments
Esprimiamo la nostra gratitudine per i bambini e le famiglie dello studio di coorte COPSAC2010 per tutto il loro sostegno e impegno. Riconosciamo e apprezzare gli sforzi unici della squadra di ricerca COPSAC e l'aiuto tecnico da tecnico Lisbeth Buus Rosholm, Technical University of Denmark, per la misurazione di citochine e chemochine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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