Summary
이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜 설명 그대로 상부 기도 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링을 합니다. 그것은 또한 기도 국 소 면역 서명, 자극 절차 (종종 다른 기술에서 사용)에 대 한 필요 없이 연구에 대 한 유체 있다 면역 중재자의 분석 전에 사용 추출 절차를 자세히 설명 합니다. 점 막 내벽 액체 필터 종이의 스트립에 샘플링 비와 흡수의 2 분 왼쪽 열 등의 앞쪽 부분에 배치. Analytes는 eluted 필터 논문에서 그리고 추출 된 단백질 기반 있다 동일한 샘플에 낮은 및 높은 레벨 analytes의 높은 감도 정량화에 대 한 수는 electrochemiluminescence 기반 immunoassay에 의해 분석 된다. 상부 기도 점 막에 통로 신호 하는 특정 면역에 관련 된 20 미리 면역 중재자의 비보에 레벨 측정 하지만 기술은 그 특정 패널 또는 샘플링 사이트에 국한 되지 않습니다. 기술은 처음 알레르기 비 염으로 어린 시절2000 (COPSAC2000) 일대에 7 세 어린이 천식에 코펜하겐 예비 연구에서 구현 되었습니다. 그것은 그 후 경도 COPSAC2010 출생 코 호트, 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년에와에서 급성 호흡기 증상의 경우에에서 사용 되었다. 우리는 성공적으로 얻은 및 700 1 개월 어린이의 620 (89%)에서 샘플을 분석; (중간값 (간 사분 위 수 범위 (IQR))로 보고 분석 결과 검출 한계 아래 몇 가지 샘플 했다 합니다. 각 중재자에 대 한 검출 한계 (즉, 0에서 탐지의 낮은 제한 세트 포인트를) 아래에 샘플의 번호 29 (7.25-119.5) 이었다. 이 기술은 수 에 비보 기도 점 막 면역 프로 파일의 출생에서 정량화, 경도, 적용 될 수 있다 그리고 유전학 및 초기 생활 환경 노출, 이상, endotyping, 및 호흡기 질환, 그리고 개발 및 새로운 치료제의 평가의 효과 대 한 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
코의 점 막 내벽 액체 위 기도 시스템의 액체 부분을 게. 복잡 한 매트릭스 상피와 미생물 침입에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 구성 하는 면역 세포 사이 상호 작용에서 파생 하는 중재자의 그것에 의하여 이루어져 있다. 비 강 점 막이 쉽게 접근할 수 있는, 그리고 코와 기관지1사이의 강력한 기능과 면역 관계 있다. 이 구획은 어린 시절에, 인생에서 나중에 더 널리 다른 호흡기 질환의 범위 뿐만 아니라 천식과 알레르기 비 염 등 일반적인 기도 질병에 관하여 특별 한 관심의 이다.
여기, 우리는 샘플 그대로 점 막 비 강에서 액체를 안 감 후속 추출 절차 뿐 아니라 필터 종이, 비 침 투 적인 기법을 사용 하 여, 하는 데 사용 그들의 정량화 하기 전에 필터 논문에서 단백질 기반 analytes elute 메서드의 구현을 설명 합니다. 이 기술은 예를 들어 vivo에서 모두 건강 한 개인과 다양 한 호흡기 질환과 개인의 면역 시그니처를 사용할 수 있습니다. 또한, 특정 면역 서명에 대 한 중요성의 노출을 확인 하 고 예측 또는 중재자 나중 질병 개발의 경우 평가를 가능 하다.
점 막 내벽 액체 이전 코 게2는 종종 앞 코 도전 테스트는 알레르기 염증 반응을3,4자극을 높은 수준에서 소개 된다에 의해 획득 되었습니다 했다. 그러나, 코 게 기술은 어린 아이에서 가능 하지 않습니다 하 고 수준 분석 결과5의 검출 한계 보다 낮을 수 있습니다 희석된 중재자로 서, 결과 혼동 한다 한 알 수 없는 희석 요소를 소개 합니다. 또한,이 알 수 없는 희석 요인 때문 코 도전 테스트에서 측정 된 실정이 응답 설정 일대에 코 게 기술의 유용성을 제한 함으로써 개인 간의 비교 되지 않습니다. 마지막으로, 알레르기 도전만 민감하게 과목에 적용 이며 히 스타 민 도전 등 기타 문제는 순수, 잠재적으로 중재자 릴리스에 천장 효과 일으키는. 이러한 문제는 어디 체액과 분석 수준을 개별 분 비 간 개별 분산에 영향을 주는 유일한 요소는 점 막 내벽 유체 컬렉션에 대 한 표시 필터 종이 기반 기술에서 피할.
추출 프로시저 동안 analytes는 eluted 필터 논문에서 버퍼의 동일한 볼륨의 추가 후 모든 샘플. 이 모든 샘플의 비슷한 비보 전 희석 하시 더군요. 알 부 민-기반 isotonic 소금 솔루션의 추출 버퍼 추출 단계;에 사용 그것은 단백질 기반 중재자의 추출 가능 하 게 하 고 단백질 제한 이후 동결 중 정량화 이전 eluted 단백질의 변성을 안정 시킨다. 추출 단계 단백질 저하를 방지 하려면 protease 억제제의 칵테일 추출 버퍼에 추가 됩니다.
그대로, vivo에서정량화를 허용 하는 기술의 구현-점 막 사이트에서 생성 된 면역 중재자는 최대 중요성 이다. 첫째, 점 막 사이트는 신체에서 가장 큰 면역 기관 최대 수 있습니다. 둘째, 코 위치 공중 노출의 주 사이트 이며1폐 호흡기 면역 구획에 밀접 하 게 연결 된. 셋째, 비 침 투 적인 기법으로이 중요 한 장기를 측량의 가능성 건강과 질병 기도에 관하여 중요 한 미생물 면역 상호 작용 축에 과다 한 정보를 제공 하는 가능성을 엽니다. 넷째, 약물과 미 량 영양소의 무작위로 고르 곤, 통제 된 실험에서 로컬 면역학 변경 공부 등이 기술의 다른 많은 가능한 응용 프로그램 있다.
우리 처음 우리 7 세 어린이 건강 한 컨트롤13대 알레르기 비 염으로 점 막 내벽 액체의 면역 프로필을 결정 하는 어린 시절2000 (COPSAC2000) 일대에에 코펜하겐 예비 연구에의 기술 구현. 그 후, 우리가 성공적으로 적용이 기술을 경도 COPSAC2010 코 호트 및 평가 기도 면역 프로필에 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년 및 급성 호흡기 증상의 인스턴스. 1 개월 된 신생아 결과 면역 서명 및 초기 생활 환경 노출7,8,9,10,,1112사이 중요 한 연결을 설명 했다.
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Protocol
헬싱키의 선언의 원칙에 따라 연구 했다. 코펜하겐 (KF 01-289/96 COPSAC2000 )와 H B-2008-093 COPSAC2010및 덴마크어 데이터 보호 기관에 대 한 윤리 위원회에서 승인, 확인 하 고 등록 하기 전에 각 과목의 두 부모 로부터 서 면된 동의 얻어.
1. 실험 설치
- 필터 종이 시트를 사용 하 여 (섬유 hydroxylated 폴리에스터 시트 참조 테이블의 재료)6,7.
- 나이가 어린이 성인 (5 x 20 x 10 m m (L의 짧은 팔))에 대 한 스트립 3 x 15 m m 1 개월 된 아이 대 한 크기와 L-모양에 잘라.
- 집게를 사용 하 여 유아의 각 콧구멍에 필터 종이의 한 조각을 삽입 합니다. 열 등 한 비 (신생아에 대 한 콧구멍 및 다른 모든 연령대에 1.5 cm 대략 1 cm)의 앞쪽 부분에 필터 종이 놓습니다.
- 신생아를 침대에 놓고 그들에 게 편안 함을 위해 설탕 물.
참고: 다른 모든 연령대의 어린이 위한 샘플링 수행 됩니다 가장 쉽게의 자에 앉아 주제. - 더 오래 된 아이 들에 대 한 각 콧구멍에 L 모양 필터 종이의 긴 팔을 삽입 합니다.
- 신생아를 침대에 놓고 그들에 게 편안 함을 위해 설탕 물.
- 불편을 최소화 하 고 필터 종이의 실수로 손실을 방지 하기 위해 콧구멍 주위 코 클립을 적용 합니다.
- 흡수의 2 분 후 필터 종이 제거 합니다.
- 레이블이 지정 된 튜브에 필터 종이 놓고-80 ° c.에 즉시 그들을 멈추게합니다
- 샘플링의 날에는 아이 의해 표시 된 기도 감염의 증상의 기록을 합니다.
- 어떤, 재채기, 지속적인 울고, 또는 샘플링의 2 분 동안 발생 하는 비 출혈을 기록 합니다.
2입니다. 기도 면역-중재자의 정량화
- 냉동 실에서 10 무작위로 샘플을 가져가 라. Id 번호를 기록 합니다. 전체 작업 과정에서 얼음에 샘플을 유지.
- 얼음에 녹고 후 담가 (주제) 당 필터 종이 양쪽 콧구멍에서 300 µ L 갓의 버퍼 ( 재료의 표참조) 포함 한 완전 한 protease 억제제 태블릿 ( 재료의 표참조) 버퍼의 25 mL 당.
- 필터 종이의 크기에 따라 버퍼의 볼륨을 조정 합니다.
- 버퍼의 300 µ L를 사용 하 여 필터 용지 크기에서 3 x 15 m m에 대 한.
- 하나의 필터 종이 사용할 수 있는 경우에 절반 버퍼 볼륨 (150 µ L)을 사용 합니다.
- 필터 종이의 크기에 따라 버퍼의 볼륨을 조정 합니다.
- 타이머를 5 분 사용에 대 한 접시 통 (400 rpm)에 샘플을 전송.
- 전송 촉촉한 필터 서류 및 분석 결과 버퍼는 microcentrifuge 배치는 셀 루 로스 아세테이트 튜브 필터 (0.22 μ m 기 공 크기)의 컵으로 튜브 ( 재료의 표참조).
- 필터링 된 코 추출 튜브를 5 분 (4 ° C)에서 냉각된 원심 분리기에서 16000 x g에서 원심.
- 컵을 제거 하 고 낮은 단백질 바인딩 스토리지 접시 ( 테이블의 자료를 참조)의 우물에 비 추출 물 aliquoting 동안 얼음에 튜브를 유지.
- 분석까지-80 ° C에 저장 합니다.
- Cytokines와 높은 감도, electrochemiluminesce 기반 다중화 어레이 시스템을 사용 하 여 비 강 추출 물에 발산의 농도 결정 ( 재료의 표참조).
참고: 인간의 10-플렉스 TH1/TH2 cytokine 분석 결과, 9-플렉스 chemokine 분석 결과, 및 단일-플렉스 IL-17A, TGF-β1, 및 TSLP 수행 했다 여기.- 분석, 대 한 코 추출 물 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 ( 재료의 표참조) 프로토콜 표준 제조 업체 당으로 측정을 수행 합니다.
참고:는 immunoassays 1 사이 배열 하는 측정에 대 한 높은 동적 범위는 일반적으로 ( 테이블의 자료를 참조) & 10000 pg/mL, 일부 분석에 대 한 100000 pg/mL 될 수 있습니다. 즉, 같은 희석, 따라서 건강 하 고 병에 걸린 주제에 서로 다른 희석의 영향을 제한 하는 다른 유사한 immunoassays에서 경우에서 모든 샘플을 실행할 수 있습니다. 모든 cytokines에 대 한 검색의 하한값 1 pg/mL 또는 1 사이 배열, 그리고 발산, & 50 pg/mL. TSLP 나이의 1 달에서 샘플의 98%에서 감지 되지 않았습니다.
- 분석, 대 한 코 추출 물 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 ( 재료의 표참조) 프로토콜 표준 제조 업체 당으로 측정을 수행 합니다.
3입니다. 통계
- 로그 변환 cytokine 및 chemokine 레벨의 일반적으로 분산된 오차를 분석 하기 전에 데이터입니다.
- 샘플 하나 이상의 일괄 처리에서 분석 되는 경우 batch-wise 로그 변환 데이터 중심으로 대 한 cytokine 및 chemokine 데이터를 수정 합니다.
- 전체 평균 및 안티 로그 변환 원래 측정 단위로 데이터를 통합 합니다.
참고: 분석 완료의 모든 집합에 대 한 cytokines 및 발산의 수준에 영향을 주는 변수를 조절 보십시오. 이 샘플링, 형제, 가정, 등등 있는 애완 동물 중 모성 영향 (예를 들어, 알코올 소비와 흡연 임신 중), 모유 수 유, 불리 한 이벤트 수 있습니다.
- 전체 평균 및 안티 로그 변환 원래 측정 단위로 데이터를 통합 합니다.
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Discussion
여기에 제시 된 기술로, vivo에서 위 기도 점 막 면역 프로필 1 개월 이전 완료 하지 않은 나이 일찍부터 어린이 확인할 수 있었습니다. 우리는 신생아의 기도 면역 프로필에 특정 기도 박테리아의 그 존재와 感7,11, 뿐 아니라 다른 전과 perinatal 노출, 미러 했다 관찰 했다. 또한, 우리는 높은 복용량 비타민 d의 무작위 미 량 재판의 행동의 메커니즘을 연구를 이러한 기도 면역 프로필 데이터 사용 이러한 결과 유효성과 기도 면역 중재자의 후속 vivo에서 정량화에 대 한 비 침 투 적인 샘플링 기법으로 점 막 내벽 유체 기술의 유틸리티를 밑줄.
다음 방법 구현 하기 전에 고려 가치가 있다: 점 막 내벽 액체 매트릭스에서 cytokines를 측정 하기 위해 electrochemiluminescence 프로토콜에 의해 제공 하는 등 높은 감도-기반 immunoassay 방법론을 사용 하는 것이 중요 하다. 효소 연결 된 immunoassays 사용 하 여 흡 광도 판독에서 유추 될 수 있습니다. 또한, 코와 기관지 사이 강한 관계가 있지만 위 기도에 면역 프로 파일 측정 여전히 한계입니다. 샘플링; 점 막 층의 상부에서 수행 되었다 따라서, 우리는 액체 주로 젤 레이어, 솔 레이어 하지의 구성을 나타내는 것을 기대 합니다. 우리 하이 제한 점액 레이어 마커를 측정 하지 않았다. 비 강 유체 분 비에서 개별 유사 수 있습니다 이론 영향 cytokines와 발산의 감지 수준. 그러나, 우리 수 있다 명확 하 고 다양 한 면역학 고기 다른 노출7,,89,10,11,12에 대 한 응답을 식별 하기 위해 나타내는 간 개별 변화 비 강 분 비 역학에이 기술에 대 한 주요 장애물이 되지 않을 수 있습니다. 기술을 수행 하는 동안 그것은 낮은 온도 (얼음 냉각)을 처리 하는 동안 단백질 저하를 피하기 위해에서 모든 절차를 수행 하는 것이 중요. 단백질 저하 권장된 단백질 protease 억제제 단백질 추출 버퍼에 추가 하 여 더욱 줄어들 수 있다.
그럼에도 불구 하 고,이 기술은 강도 그것은 하기 쉽고 수행, 비 침 투 적인 기도 점 막 면역 서명 신생아 기간에서 및 앞으로의 경도 평가 있습니다. 이러한 정보에 어떻게 로컬 기도 면역 체계가 성숙 어린 시절 내내 고 성인으로 잠재적으로 지식을 제공할 수 있습니다. 또한, 샘플링 기법 그대로 수행 하 고 in vivo-관련, undiluted 방식으로,를 사용 했을 코 게 기술을 감지 희석 알 수 없는 요소가 발견13의 타당성을 감소 면역 중재자의 검출. 우리 샘플 수집, 저장, 및 어원이 릴리스 상용 ( 재료의 표참조)를 설계 합성, 섬유, 폴리에스터 hydroxylated 매체 사용. 자료 낮은 바이오 바인딩으로 친수성 이며 단백질이 포함 된 샘플 안정-80 ° c.에 보관 시 물자는 높게 흡수 성, 그리고 섬유 표면 물 습윤을 향상 시키기 위해 수정 되었습니다.
COPSAC2010 연구에서 우리는 21 cytokines, 선험적으로 기도에 로컬 행동 면역 시스템의 주요 phenotypical 경로 표현 하기 위해 선정 됐다 발산의 패널을 선택. 이러한 중재자, TSLP, 단 하나 나이의 1 달에서 감지 되지 않았습니다.
낮은 기도 (예를 들어, bronchoscopic microsampling 기술을 사용 하 여)에서 점 막 내벽 액체를 수집 하는 것이 중요 한 미래의 응용 프로그램 낮은 기도 면역학을 평가 하기 위해. Bronchoscopic microsampling bronchoscopic 진단, 로컬 기관지 상피 안 대기 액체; 수집의 능력에 대 한 새로운 절차는 그것은 넣어진된 폴리에스터 섬유 조사14를 이용 한다. 원심 항공에 도달 하면, 조사 칼 집 끝에서 기관지 루멘에 기관지 상피 액체 흡수에 밀어넣기됩니다. Bronchoscopic microsampling는 급성 호흡 곤란 증후군14,,1516 와17만성 폐쇄성 폐 질환 사용 되었습니다. 그러나, 천식,는 기존 문제는 프로브 상피 취약성 질병 유발 및 증가 vascularization 출혈을 일으킬 수 있습니다. Bronchoscopic microsampling 절차에 점 막 내벽 유체 기술을 적용 하는 것은 중요 한 임상 암시 우리의 이해에 관하여 이상의 뿐만 아니라 감시, 치료, 그리고 어린이 성인 모두에서 여러 가지 급성과 만성 폐 질병의 결과 예측 가질 수 있습니다.
모든 유형의 중재자 이론적으로 측정 될 수 있다 여기에서 사용 하는 상용 시스템의 다중 immunoassay 플랫폼을 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 플랫폼 높은 감도 정확한 정량화는 어떤 중재자의 단일 클론 항 체는 immunoassay의 개발에 적용 한 켤레를 얻을 수 있습니다. 이 플랫폼은 또한 함께 제공 높은 정밀도 및 분석할 체액의 pH, 온도 및 점도 변화에 덜 감도.
미래 연구, 그것은 가치가 있을 것 이라고 큰 측정, 예를 들면 면역 중재자의 현재 패널 확장: 항균 성 펩 티 드; 총과 특정이; C-반응성 단백질; 같은 심각한 단계 반응, prostaglandins; 같은 지질 중재자 그리고 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 같은 신경 중재자. 이 광범위 한 공중 노출 시체 사이트에서 점 막 응답 시스템의 특성의 더 상세한 보기를 제공할 수 있습니다. 제안 된 중재자도 측정할 수 있습니다 타겟된 양적 고감도 immunoassays에 의하여와 같은 현재 설치 또는 타겟 또는 타겟이 불분명 한 핵 자기 공명 (NMR) 분광학-또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS LC)-대사체학 기법을 기반으로. 후자의 접근은 이미 단점이 몇 가지 방법론 biofluid18 의 샘플링에 대해 점 막 내벽 유체 기술에 대 한 분명 하지 않은 exhaled 호흡 응축 메서드를 어느 정도 구현 되었습니다.
성인,으로 신생아 기간에서 경도 샘플링 COPSAC2010 일대에 수행 크게 기본 면역 요소 앞 또는 천식과 알레르기 같은 기도 질환과 수반 행동의 우리의 이해를 증가할 것 이다. 이러한 연구 결과 특정 질병 endotypes을 대상으로 새로운 치료제의 개발 하 고 미 량의 수사에 중요 한 될 수 있으며 약물 메커니즘에서 행동의 무작위 임상 시험.
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Disclosures
모든 저자는 아무 잠재적인, 인식, 또는 진짜 상충이이 원고 내용에 관한 선언합니다. 자금 지원 기관 설계 및 연구;의 행위에 어떤 역할을 없 었 어 요 수집, 관리, 및 해석 데이터; 나는 준비 검토을 원고의 승인. 제약 회사는 연구에 참여 했다.
Acknowledgments
우리는 어린이 가족 COPSAC2010 코 호트 연구의 그들의 지원 및 헌신에 대 한 우리의 감사를 표현 한다. 우리는 인정 하 고 COPSAC 연구 팀과 cytokines와 발산의 측정 기술자 Lisbeth Buus Rosholm, 덴마크의 기술 대학에서에서 기술 도움의 독특한 노력을 주셔서 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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