Summary
Этот протокол описывает неинвазивным методом отбора проб ненарушенных слизистую жидкость из верхних дыхательных путей. Он может использоваться для выполнения количественная оценка в естественных условиях уровни белка посредников, таких как цитокинов и chemokines, в субъектах всех возрастов.
Abstract
Этот протокол описывает неинвазивной проб жидкости слизистую ненарушенных верхних дыхательных путей. В нем также подробно процедура извлечения до анализа иммунных посредников в жидкости элюаты для изучения сократимость актуальные иммунной подписи, без необходимости для стимуляции процедур (часто используется другими методами). Слизистую жидкость пробы на прокладке фильтровальной бумаги размещены на передней части нижней носовой раковины и влево на 2 мин поглощения. Аналитов этого eluted из фильтр-бумаги, и извлеченные на основе белков элюаты анализируются на основе electrochemiluminescence иммуноанализ, позволяя высок чувствительности количественного определения низкого и высокого уровня аналитов в том же образце. Мы измерили уровни в vivo 20 предварительно иммунной посредников, связанных с конкретными иммунной, сигнальные пути в слизистую оболочку верхних дыхательных путей, но техника не ограничивается этой конкретной группы или отбора проб. Этот метод был впервые реализован в 7-год старый детей от Копенгагена перспективных исследований об астме в когорте2000 (COPSAC2000) детство с аллергическим ринитом. После этого он использовался в продольной COPSAC2010 когорта, отобранных на 1 месяц, 2 года и 6 лет и в случаях острых респираторных симптомов. Мы успешно получены и проанализированы пробы из 620 (89%), 700 детей 1-месячного; несколько образцов были ниже предела обнаружения пробирного (сообщили как медиана (межквартильный диапазон (ИКР)). Количество образцов ниже предела обнаружения (т.е. от 0 до застывания для нижнего предела обнаружения), для каждого посредника был 29 (7,25-119,5). Эта техника позволяет количественная оценка в vivo слизистой иммунной профиля дыхательных путей от рождения, могут быть применены в продольном направлении и может быть применен к исследования о влиянии генетики и Ранняя жизнь экологического воздействия, Патофизиология, endotyping и мониторинга заболеваний органов дыхания и разработки и оценки новых терапевтических средств.
Introduction
Жидкости слизистую носа составляет жидкой частью системы верхних дыхательных путей. Он состоит из сложной матрицы посредников, производный от взаимосвязи между эпителием и иммунные клетки, которые составляют первую линию обороны против вторжения микроорганизмов. Слизистой оболочки носа легко доступны, и есть сильные функциональные и иммунологические отношения между носом и бронхов1. Этот отсек имеет особый интерес по отношению к сократимость, которые являются общими в детстве, таких как астмы и аллергического ринита, но и для ряда других респираторных заболеваний, более распространена позднее в жизни.
Здесь мы описывают реализацию метода для образца ненарушенных слизистой накладки жидкости из полости носа с помощью фильтра бумажных, неинвазивный метод, а также процедура последующего извлечения, используемый для элюировать на основе белков аналитов от фильтра документов до их количественной оценки. Этот метод может например, использоваться для получения в естественных условиях иммунные подписей здоровых людей и людей с различными заболеваниями органов дыхания. Кроме того это возможно для изучения воздействия значение для конкретного иммунной подписи и оценить, если это предсказатель или посредника позднее развития болезни.
Ранее были получены слизистую жидкость промывание носа2, который часто предшествует носовой вызов тест, где Аллерген вводится в высоких уровнях для стимулирования воспалительной реакции3,4. Однако техника промывание носа не осуществима в маленьких детей и вводит неизвестного разрежения фактор, который смешивает итоги, разбавленным посредника, которую уровнях может упасть ниже предела обнаружения пробирного5. Кроме того из-за неизвестного разрежения фактор, измеренной аналита ответов от носовой бросить вызов тесты не являются сопоставимыми между людьми, тем самым ограничивая полезность техника промывание носа в когортное установка. Наконец Аллерген задача применима только к сенсибилизированных предметам, и других проблем, таких как гистамин challenge, актуальны не физиологически, потенциально вызывая эффект потолок на посредника релиза. Эти проблемы обходятся в представленных на основе Бумага фильтровальная техника для слизистую жидкость коллекции, где отдельных секреции жидкости и аналита уровни являются единственными факторами, которые влияют разница между отдельными.
Во время процедуры извлечения аналитов этого eluted из фильтр-бумаги после добавления идентичных томов буфера для всех образцов. Это способствует аналогичные ex vivo разбавления всех образцов. Извлечения буфер на основе альбумина изотонический солевой раствор используется для извлечения шага; Он включает извлечение на основе белков посредников и стабилизирует белки ограничить денатурации во время последующего замерзания eluted белков до количественной оценки. Чтобы избежать деградации белка на этапе добычи, коктейль ингибиторов протеазы добавляется в буфер добычи.
Реализация методов, которые позволяют для количественной оценки спокойно, в естественных условиях-созданных иммунных посредников на участках слизистой имеет первостепенное значение. Во-первых слизистой сайт составляет крупнейший иммунологические орган в теле. Во-вторых носовые расположение является основной сайт воздействия переносимых по воздуху и плотно подключен к дыхательной иммунологические отсек легких1. В-третьих возможность съемки этот важный орган с неинвазивный метод открывает возможность предоставить множество информации на оси важных Микроб иммунной взаимодействия в отношении здоровья и болезни в дыхательных путях. В-четвертых существует много других возможных применений этого метода, например изучение местных иммунологические изменения в рандомизированных контролируемых испытания наркотиков и микроэлементов.
Мы изначально реализован технику в Копенгагене перспективных исследований об астме в детстве когорте2000 (COPSAC2000), где мы определили иммунной профиль слизистую жидкость в 7-год старый детей с аллергическим ринитом против здорового управления13. Впоследствии мы успешно применяется этот метод продольное когортное2010 COPSAC и иммунных профили начисленных сократимость, на 1 месяц, 2 года и 6 лет и в случаях острых респираторных симптомов. Результаты 1-месяц старый новорожденных продемонстрировали важные связи между иммунной подписи и Ранняя жизнь экологического воздействия7,8,9,10,,1112.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования были проведены в соответствии с руководящими принципами в Хельсинкской декларации. Были получены утверждения от Комитет по этике для Копенгаген (KF 01-289/96 для COPSAC2000 ) и H-B-2008-093 COPSAC2010и Датского агентства по охране данных, и письменное информированное согласие было получено от обоих родителей каждого предмета до подачи заявки.
1. Экспериментальная установка
- Используйте листами фильтровальной бумаги (волокнистый гидроксилированы полиэфирные листы, смотрите Таблицу материалов)6,7.
- Вырежьте полоски 3 x 15 мм, размер 1-месячного ребенка и L-образной формы для старших детей и взрослых (5 x 20 x 10 мм (короткие руки л)).
- Вставьте один кусок фильтровальной бумаги в каждую ноздрю младенца, с помощью щипцов. Поместите фильтр-бумаги на передней части нижней носовой раковины (примерно 1 см внутри ноздрей для новорожденных и 1,5 см для всех других возрастов).
- Место новорожденных на ложе и дать им воду сахар для комфорта.
Примечание: Для детей всех возрастов, отбор проб осуществляется наиболее легко с темой, сидя на стуле. - Для старших детей вставьте длинные руки L-образный фильтр-бумаги в каждую ноздрю.
- Место новорожденных на ложе и дать им воду сахар для комфорта.
- Примените носовой зажим вокруг ноздрей к минимуму дискомфорт и во избежание случайной потери фильтр-бумаги.
- Удалите фильтр документов через 2 мин поглощения.
- Фильтр документов в помечены трубы и немедленно заморозить их на-80 ° C.
- Запишите любые симптомы инфекции дыхательных путей, проявленная ребенка в день выборки.
- Запись любой чихание, постоянно плакала или носовое кровотечение, которое происходит в течение 2 мин выборки.
2. Количественная оценка сократимость иммунной посредников
- Принимать до 10 случайных выборок из морозильной камеры. Запишите идентификационные номера. Храните образцы на льду в течение всего процесса работы.
- После оттаивания на льду, погружайте фильтр документов (за предмет) от обе ноздри в 300 мкл свежеприготовленные буфера (см. Таблицу материалов) содержащий полный протеазы ингибитор таблетка (см. Таблицу материалы) на 25 мл буфера.
- Отрегулируйте громкость буфера в соответствии с размером бумаги фильтра.
- Используйте 300 мкл буфера для фильтрации документов размером 3 x 15 мм.
- Если только один фильтр бумага, используйте половину объем буфера (150 мкл).
- Отрегулируйте громкость буфера в соответствии с размером бумаги фильтра.
- Передавать образцы шейкере пластины (400 об/мин) для 5 минут использования таймера.
- Перевести влажные фильтр документов и аналитического буфера в Кубок ацетат целлюлозы трубки фильтра (размером пор 0,22 мкм) внутри microcentrifuge трубки (см. Таблицу материалов).
- Центрифуга на 16000 x g 5 мин в охлажденной центрифуге (при 4 ° C) для получения отфильтрованной носовой экстракт в трубе.
- Снимите Кубок и держать трубы на льду во время aliquoting носовой экстракт в скважины низким содержанием белков привязки хранения плит (см. Таблицу материалов).
- Хранить при температуре-80 ° C до анализа.
- Определение концентрации цитокинов и chemokines в носовой выдержки, с использованием мультиплексных массив высок чувствительности, на базе electrochemiluminesce системы (см. Таблицу материалов).
Примечание: Человека 10-plex TH1/TH2 цитокинов пробирного, 9-plex хемокиновых пробирного и одного plex Ил 17а, TGF-β1 и TSLP были выполнены здесь.- Для анализов Инкубируйте носовой выдержки на ночь при 4 ° C. Проводить измерения как на стандартных производитель протокола (см. Таблицу материалов).
Примечание: Immunoassays (см. Таблицу материалы) обычно имеют высокий динамический диапазон для измерений в диапазоне от 1 & 10 000 пг/мл, но для некоторых анализов, это может быть 100 000 пг/мл. Это означает, что все примеры могут работать на же разрежения, таким образом ограничивая влияние разнородных разведений в здоровые и больные темы, равно как и в случае других подобных иммуноанализа. Нижний предел обнаружения для всех цитокинов был 1 пг/мл или меньше и для chemokines, он составлял 1 & 50 пг/мл. TSLP обнаружен не был в 98% образцов в возрасте 1 месяца.
- Для анализов Инкубируйте носовой выдержки на ночь при 4 ° C. Проводить измерения как на стандартных производитель протокола (см. Таблицу материалов).
3. Статистика
- Журнал преобразование данных до анализа для получения нормально распределенных остаточные уровни цитокина и хемокиновых.
- Если образцы анализируются в более чем одной партии, исправьте цитокинов и хемокиновых данные для экстракторах центрирования на лог трансформированных данных.
- Включить общее среднее и анти логарифмического преобразования для получения данных в оригинальной единицах измерения.
Примечание: Для каждого набора сделали анализы, рассмотрите возможность настройки переменных, которые влияют на уровень цитокинов и chemokines. Это может быть материнской воздействий (например, потребление алкоголя и Курение во время беременности), грудное вскармливание, неблагоприятные события во время выборки, братьев и сестер, животные в доме, и т.д.
- Включить общее среднее и анти логарифмического преобразования для получения данных в оригинальной единицах измерения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С техникой, представленные здесь мы смогли определить в vivo верхний сократимость слизистой иммунной профиля в детей в возрасте от 1 месяца возраста, которое не было сделано ранее в кратчайшие сроки. Мы отмечает, что наличие конкретных сократимость бактерий и picornaviruses7,11, а также другие pre и перинатального воздействия, были отражены в иммунной профиль сократимость новорожденных. Кроме того мы использовали эти данные иммунной профиля дыхательных путей для изучения механизма действия судебного разбирательства рандомизированных микроэлементов высок дозы витамина d. Эти результаты подчеркивают действенность и полезность слизистую жидкость техники как метод неинвазивной выборки для количественной оценки последующих в vivo сократимость иммунной посредников.
Стоит рассмотреть перед реализацией метода являются следующие моменты: для того чтобы измерить цитокинов в матрице жидкости слизистую, важно использовать методологии на основе высокой чувствительности иммуноферментного анализа, например, предоставляемой electrochemiluminescence протоколы. Использование энзим соединенный иммуноанализа может привести к вывод в индикации поглощения. Кроме того хотя существует тесная взаимосвязь между носом и бронхов, измерение иммунной профиля в верхних дыхательных путях по-прежнему является ограничением. Выборка была исполнена в верхней части слоя слизистой оболочки; Таким образом мы ожидаем, что жидкость главным образом представляет композицию слоя геля, а не соль. Мы не мера слизистая слой маркеры, чтобы подтвердить это, что является ограничением. Индивидуальные вариации в носовой секреции жидкости в теории может влиять на обнаруженные уровни цитокинов и chemokines. Однако мы смогли определить четкие и разной иммунологической фенотипы в ответ на различные воздействия7,8,9,10,11,12, указав, что между отдельными вариации в носовой секреции динамика не может быть серьезным препятствием для этой техники. При выполнении метода, важно выполнять все процедуры при низких температурах (лед охлаждением), чтобы избежать деградации белков во время обработки. Деградации белка могут быть дополнительно уменьшены, добавив ингибиторы протеазы рекомендуемый белка в буфер экстракции белка.
Тем не менее сила этой техники, что это неинвазивный и легко выполнять, позволяя продольной оценки иммунного подписи слизистых оболочек дыхательных путей от периода новорожденности и далее. Такая информация потенциально могут предоставить знания о как местные авиалинии иммунной системы созревает и развивается в детстве и в зрелом возрасте. Кроме того метод отбора проб производится спокойно и in vivo -соответствующие, неразбавленное способом, который включено обнаружение иммунной посредников, которые были бы обнаружить с техникой промывание носа, где коэффициент разбавления неизвестного уменьшает действительность выводы13. Мы использовали синтетический, волокнистая, гидроксилированы полиэстер среды, которая является коммерчески доступных (см. Таблицу материалы) и предназначен для сбора, хранения и конъюгата релиз. Материал гидрофильные, с низкой биомолекулярных привязки, и образцы, содержащие белок являются стабильными во время хранения при температуре-80 ° C. Материал является высоко впитывающим, и поверхности волокна были изменены для улучшения смачиваемости воды.
В исследовании COPSAC2010 мы выбрали группу 21 цитокинов и chemokines, которые были выбраны заранее представлять основные фенотипические пути иммунной системы локально действуя в дыхательных путях. Только один из этих посредников, TSLP, не было обнаружено в возрасте одного месяца.
Важные приложения будущего будет собирать слизистую жидкость из нижних дыхательных путей (например, с помощью метода Бронхоскопическое microsampling) для оценки ниже сократимость иммунологии. Бронхоскопические microsampling это новая процедура для Бронхоскопическое диагностики, способный собирать местные бронхиальной эпителиальной выстилки жидкости; Он использует ножнах полиэфирного волокна зонд14. При достижении дистальных дыхательных путей, зонд выталкивается из кончик оболочка поглощать бронхиального эпителия жидкость, присутствующая в просвете бронхов. Бронхоскопические microsampling был использован в острый респираторный дистресс-синдром14,,1516 и17хроническая обструктивная болезнь легких. Однако при астме, существующих проблема заключается, что зонд может вызвать кровотечение из-за болезни индуцированной эпителиальных хрупкость и увеличение васкуляризации. Применение метода слизистую жидкость к процедуре Бронхоскопическое microsampling может иметь важные клинические последствия в отношении нашего понимания патофизиологии, а также мониторинг, лечения и прогнозирования результатов нескольких острых и хронических заболеваний легких у детей и взрослых.
Все виды посредников теоретически может быть измерена с помощью платформы мультиплекс иммуноанализа коммерческой системы, используемые здесь (см. Таблицу материалов). Платформа позволяет высок чувствительности и точного количественного определения любого посредника, для которой можно получить пару моноклональных антител, применимых к развитию иммуноферментного анализа. Эта платформа также приносит с высокой точностью и меньше чувствительность к pH, температуры и вязкости вариации в жидкостях для анализа.
В будущем исследования, он будет иметь большое значение для расширения текущей панели иммунных посредников для измерения, например: антимикробных пептидов; Общая и конкретных IgA; острая фаза реактивы, такие как C - реактивного белка; липидные посредники, например простагландинов; и неврологических посредников, таких как мозг нейротрофического фактора (BDNF). Это может предоставить более подробное представление природы слизистой реагирования системы на сайте тела с обширной бортовых экспозиции. Предложенных посредниками могут либо быть измерены посредством целевых количественных иммуноанализа высок чувствительности, такие как в текущей настройке, или целевые или нецелевые ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопия - или жидкий хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS)-на основе методов метаболомики. Последний подход уже выполнена в некоторой степени с методом конденсата выдыхаемого воздуха, который имеет некоторые методологические недостатки в отношении выборки биожидкостей18 , которые не являются очевидными для жидкости техника слизистую.
Продольных выборки от периода новорожденности в зрелом возрасте, как в когорте2010 COPSAC, будет значительно увеличить наше понимание основных иммунологических факторов предшествующего или действуя параллельно с заболеваниями дыхательных путей, таких как астмы и аллергии. Такие выводы могут иметь важное значение для развития Роман терапии против конкретных заболеваний endotypes и исследование микроэлементов и наркотиков механизмы действий в рандомизированных клинических испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют не потенциал, предполагаемых или реальных интересов относительно содержания этой рукописи. Финансирующие учреждения не имеют какую-либо роль в разработке и проведении исследования; сбор, управление и интерпретации данных; или подготовка, обзор и утверждение рукописи. Ни одна фармацевтическая компания был вовлечен в исследования.
Acknowledgments
Мы выражаем нашу признательность за их поддержку и приверженность детям и семьям COPSAC2010 когортное исследование. Мы признаем и ценим уникальный усилия COPSAC исследовательской команды и техническую помощь от техник Лизбет Буус Rosholm, технический университет Дании, для измерения цитокинов и chemokines.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
