Summary
Det här protokollet beskriver en icke-invasiv teknik för provtagning av ostörd slemhinna slemhinnan vätska från de övre luftvägarna. Det kan användas för att utföra kvantifiering av i vivo nivåer av proteinet mediatorer, såsom cytokiner och chemokiner, hos patienter i alla åldrar.
Abstract
Det här protokollet beskriver icke-invasiv provtagning av ostörd övre luftvägarna slemhinna slemhinnan vätska. Det också Detaljer den extraktionsmetod som används före analysen av immun medlare i vätska eluat för studien av luftvägarna aktuell immun signaturen, utan behov av stimulering förfaranden (används ofta av andra tekniker). Slemhinna slemhinnan vätskan samplas på en remsa av filtrerpapper placeras på den främre delen av underlägsen Concha och vänster för 2 min av absorption. Analyter elueras från filtrerpapper och de extraherade proteinbaserade eluat analyseras av en elektrokemiluminescens-baserad immunoassay, möjliggör hög känslighet kvantifiering av låg - och hög - nivå analyter i samma prov. Vi mätte i vivo nivåerna av 20 förvalda immun medlare relaterade till specifika immunförsvaret signalering utbildningsavsnitt i slemhinnan i övre luftvägarna, men tekniken är inte begränsad till specifika panel eller provtagningsplatsen. Tekniken genomfördes först i 7-åriga barn från Köpenhamn prospektiva studier på astma i barndomen2000 (COPSAC2000) kohorten med allergisk rinit. Det användes därefter i den längsgående COPSAC2010 födelsekohorten, provtas vid 1 månad, 2 år och 6 år och instanser av akuta respiratoriska symtom. Vi framgångsrikt erhållits och analyseras prover från 620 (89%) av 700 1-månad-gammal barn; några prover var under detektionsgränsen assay (redovisas som medianen (mellan kvartil rad (IQR)). Antalet prover under detektionsgränsen (dvs från 0 till börvärdet för de lägre detektionsgräns) för varje medlare var 29 (7,25-119,5). Denna teknik möjliggör kvantifiering av i vivo luftvägarna slemhinne immunsystemet profilen från födseln, kan tillämpas längdriktningen och kan tillämpas på studier om effekten av genetik och uppväxt miljöexponeringar, patofysiologi, endotyping och övervakning av sjukdomar i andningsorganen, samt utveckling och utvärdering av nya behandlingar.
Introduction
Slemhinna slemhinnan vätska i näsan gör upp den flytande delen av övre-luftvägarna systemet. Den består av en komplex matris av mediatorer som härrör från samspelet mellan epitelet och de immunceller som utgör den första försvarslinjen mot invaderande mikroorganismer. Nässlemhinnan är lättillgängligt, och det finns en stark funktionellt och immunologiskt relation mellan näsan och luftrören1. Kupén är av särskilt intresse i förhållande till luftvägssjukdomar som är vanliga i barndomen, såsom astma och allergisk rinit, men också en rad andra luftvägsproblem vanligare senare i livet.
Här, beskriver vi genomförandet av en metod för att provet ostört slemhinnor foder vätska från näshålan använder en filterpapper-baserad, icke-invasiv teknik, samt en efterföljande extraktionsförfarande, används för att eluera proteinbaserade analyter från filter papper före deras kvantifiering. Denna teknik kan exempelvis användas för att hämta i vivo immun signaturer av både friska individer och individer med olika luftvägssjukdomar. Dessutom är det möjligt att undersöka exponeringar av betydelse för en specifik immun signatur och utvärdera om det är en prediktor eller medlare av senare sjukdomsutvecklingen.
Slemhinna slemhinnan vätska har tidigare erhållits av nasal lavage2, som föregås ofta av en nasal utmaning test, där ett allergen introduceras i höga nivåer för att stimulera ett inflammatoriskt svar3,4. Dock nasal lavage tekniken är inte möjlig hos små barn och introducerar en okänd utspädningsfaktorn, vilket förvirrar utfallen som utspädd medlare nivåer kan falla under detektionsgränsen av assay5. Dessutom på grund av okända utspädningsfaktorn är uppmätta analyten svaren från de nasala utmaning testerna inte jämförbara mellan individer, vilket begränsar användbarheten av nasal lavage tekniken i en kohort inställning. Slutligen, allergen utmaning gäller endast hos sensibiliserade individer och andra utmaningar, såsom histamin utmaningen, är inte fysiologiskt relevanta, vilket kan orsaka en tak effekt på medlaren release. Dessa problem kringgås i presenteras filterpapper-baserade tekniken för slemhinna slemhinnan vätskeansamling, där enskilda utsöndringen av vätska och analyt nivåer är de enda faktorer som påverkar Inter-individuella varians.
Under förfarandet för utvinning elueras analyter från filtrerpapper efter tillsats av identiska volymer av buffert att alla prover. Detta gynnar liknande ex vivo -utspädning av alla prover. En extraktion buffert av albumin-baserade isotonisk saltlösning används för extraktion steg; Det möjliggör utvinning av proteinbaserade medlare och stabiliserar proteiner för att begränsa denaturering under påföljande frysning av eluerade proteiner före kvantifiering. För att undvika proteinnedbrytning under fasen extraktion, läggs en cocktail av proteashämmare till utvinning bufferten.
Genomförandet av tekniker som möjliggör kvantifiering av ostört, in-vivo-genererade immun medlare på slemhinnor platser är av yttersta vikt. Först, webbplatsen slemhinnor utgör den största immunologiska orgeln i kroppen. Andra, nasal platsen är den primära platsen för luftburen exponering och är ordentligt ansluten till respiratorisk immunologiska facket av lungorna1. Tredje, öppnar möjligheten att kartlägga detta viktiga organ med en icke-invasiv teknik möjlighet att tillhandahålla en uppsjö av information på den viktiga mikrob-immun interaktion axeln i förhållande till hälsa och sjukdom i luftvägarna. För det fjärde finns det många andra möjliga tillämpningar av denna teknik, till exempel studera lokala immunologiska förändringar i randomiserade, kontrollerade prövningar av läkemedel och mikronäringsämnen.
Vi genomfört initialt tekniken i Köpenhamn prospektiva studier på astma i barndomen2000 (COPSAC2000) kohorten, där vi bestämde immun profilen av slemhinna slemhinnan vätska i 7-åriga barn med allergisk rinit jämfört med friska kontroller13. Därefter, tillämpas vi framgångsrikt denna teknik på längsgående COPSAC2010 kohort och bedömda luftvägarna immun profiler på 1 månad, 2 år och 6 år och instanser av akuta respiratoriska symtom. Resultat från de 1-månad-gammal nyfödda har visat viktiga föreningar mellan immun signatur och uppväxt miljöexponering7,8,9,10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studierna genomfördes i enlighet med de vägledande principerna i Helsingforsdeklarationen. Godkännanden från etikkommittén för Köpenhamn (KF 01-289/96 för COPSAC2000 ) och H-B-2008-093 för COPSAC2010och danska dataskyddsverket erhölls, och skriftligt informerat samtycke erhölls från båda föräldrarna för varje ämne innan registrering.
1. experimentellt ställa in
- Använda ark filtrerpapper (fibrösa hydroxylerade-polyester lakan, se Tabell för material)6,7.
- Klipp ut remsor 3 x 15 mm i storlek för ett 1-månad-gammal barn och en L-form för äldre barn och vuxna (5 x 20 x 10 mm (kort arm av L)).
- Infoga en bit av filterpapper i vardera näsborre hos ett spädbarn med pincett. Placera filterpappret på den främre delen av underlägsen Concha (ca 1 cm innanför näsborren för nyfödda och 1,5 cm för alla andra åldrar).
- Placera nyfödda på en säng och ge dem sockervatten för komfort.
Obs: För barn i alla andra åldrar, provtagning utförs enklast med ämnet sittande på en stol. - För äldre barn, infoga den långa armen av det L-formade filterpappret i vardera näsborre.
- Placera nyfödda på en säng och ge dem sockervatten för komfort.
- Applicera ett näsa klipp runt näsborrarna att minimera obehag och undvika oavsiktlig förlust av pappersfiltret.
- Ta bort filter tidningarna efter 2 min av absorption.
- Placera filtrerpapper i märkta rör och frysa dem omedelbart vid-80 ° C.
- Anteckna eventuella symtom på luftvägarna infektion visas av barnet på dagen för provtagning.
- Registrera alla nysningar, ihållande gråt, eller näsblod som uppstår under de 2 min för provtagning.
2. kvantifiering av luftvägarna immun-medlare
- Ta upp till 10 slumpmässiga prover från frysen. Registrera identifikationsnummer. Hålla proverna på is under hela arbetsprocessen.
- Efter upptining på is, fördjupa filtrerpapper (per ämne) från båda näsborrarna i 300 µL av nylagade buffert (se Tabell för material) som innehåller en komplett proteas hämmare tablett (se Tabell för material) per 25 mL buffert.
- Justera volymen för buffert enligt storleken på pappersfiltret.
- Använd 300 µL buffert för filtrerpapper 3 x 15 mm i storlek.
- Om endast ett filterpapper är tillgänglig, Använd hälften buffert volymen (150 µL).
- Justera volymen för buffert enligt storleken på pappersfiltret.
- Överföra proverna till en tallrik shaker (400 rpm) för 5 min. Använd en timer.
- Överföra fuktig filtrerpapper och analysbuffert i koppen av cellulosaacetat tube filter (0,22 µm porstorlek) placeras i en mikrocentrifug rör (se Tabell för material).
- Centrifugera vid 16 000 x g i 5 min i en kyld centrifug (vid 4 ° C) för att få filtrerade nasal extraktet i röret.
- Ta bort koppen och hålla rören på is medan alikvotering nasal extraktet i brunnar av låg-protein bindande lagring plattor (se Tabell för material).
- Förvaras vid-80 ° C fram till analys.
- Bestämma koncentrationerna av cytokiner och chemokiner i nasal extrakt med en hög känslighet, electrochemiluminesce-baserade multiplexade array system (se Tabell för material).
Obs: En mänsklig 10-plex TH1/TH2 cytokin assay, 9-plex chemokine assay, och single-plex IL-17A, TGF-β1 och TSLP utfördes här.- För analyserna, inkubera nasal extrakten över natten vid 4 ° C. Utföra mätningarna som per standard tillverkaren protokoll (se Tabell för material).
Obs: Immunanalyser (se Tabell för material) har oftast ett stort dynamiskt omfång för mätning mellan 1 & 10 000 pg/mL, men för vissa analyser, det kan vara 100 000 pg/mL. Detta innebär att alla prover kan köras med samma utspädning, vilket begränsar påverkan av olika spädningar i friska och sjuka individer, vilket är fallet i andra liknande immunoanalyser. Den lägre detektionsgräns för alla cytokiner var 1 pg/mL eller mindre, och för chemokiner, det varierade mellan 1 & 50 pg/mL. TSLP var inte detekterbar i 98% av proven vid 1 månads ålder.
- För analyserna, inkubera nasal extrakten över natten vid 4 ° C. Utföra mätningarna som per standard tillverkaren protokoll (se Tabell för material).
3. statistik
- Log-transform data före analys att erhålla normalfördelade residualer cytokin och chemokine nivåer.
- Om proverna analyseras i mer än ett parti, korrigera cytokin och chemokine data för batch-wise centrering på logg-omvandlad data.
- Införliva det totala medelvärdet och anti log omvandling att erhålla data i de ursprungliga måttenheterna.
För varje uppsättning analyser gjort, Överväg att justera variabler som påverkar graden av cytokiner och chemokiner. Detta kan vara moderns påverkan (t.ex., alkoholkonsumtion och rökning under graviditeten), amning, biverkningar under provtagning, syskon, husdjur i den hem, etc.en
- Införliva det totala medelvärdet och anti log omvandling att erhålla data i de ursprungliga måttenheterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den teknik som presenteras här, kunde vi bestämma i vivo övre-luftvägarna slemhinnor immun profilen hos barn från så tidigt som 1 månad gammal, vilket inte har gjorts tidigare. Vi observerade att förekomsten av specifika luftvägarna bakterier och picornaviruses7,11, samt andra pre och perinatal exponeringar, var speglas i luftvägarna immun profilen för nyfödda. Dessutom använt vi dessa luftvägarna immun profildata för att studera verkningsmekanismen av en randomiserad mikronäringsämnen prövning av hög dos d-vitamin. Dessa resultat understryker giltigheten och nyttan av slemhinnor foder flytande tekniken som en icke-invasiv provtagningsteknik för efterföljande i vivo kvantifiering av luftvägarna immun medlare.
Följande punkter är värt att överväga innan metodimplementering: för att mäta cytokiner i matrisen slemhinnor foder flytande, är det viktigt att använda hög-känslighet-baserad immunoassay metoder, till exempel som tillhandahålls av elektrokemiluminescens protokoll. Användning av enzymkopplad immunanalyser kan leda till inferens i absorbans avläsning. Dessutom, även om det finns ett starkt samband mellan näsan och luftrören, mätning av immun profil i de övre luftvägarna är fortfarande en begränsning. Provtagning utfördes på den övre delen av det slemhinnor skiktet; Därför förväntar vi oss att vätskan främst representerar sammansättningen av gel lagret, inte sol lagret. Vi inte mäta slemhinnor skikt markörer för att bekräfta detta, vilket är en begränsning. Individuella variationer i flytande snuva kan teoretiskt påverka detekterade nivåerna av cytokiner och chemokiner. Vi har dock kunna identifiera tydliga och varierande immunologiska fenotyper som svar på olika exponeringar7,8,9,10,11,12, som visar att Inter-individuella variationer i nasal sekretion dynamics inte kan vara ett stort hinder för denna teknik. Medan du utför tekniken, är det viktigt att utföra alla procedurer vid låga temperaturer (iskylda) att undvika proteinnedbrytning under bearbetningen. Proteinnedbrytning kan minskas ytterligare genom att lägga till de rekommenderade protein-proteashämmare protein utvinning bufferten.
Dock är styrkan i denna teknik att det är icke-invasiv och lätt att utföra, aktivera längsgående bedömningar av slemhinnor luftvägarna immun signaturen från nyföddhetsperioden och framåt. Sådan information kan potentiellt ge kunskap om hur lokala luftvägarna immunsystemet mognar och utvecklas under hela barndomen och in i vuxenlivet. Dessutom provtagningsteknik utförs ostört och på ett in vivo -outspädd, relevanta sätt, som aktiverat upptäckt av immun medlare som skulle ha varit omöjlig att upptäcka med nasal lavage teknik, där en okänd utspädningsfaktorn minskar giltigheten av resultaten13. Vi använde en syntetisk, fibrösa, hydroxylerade-polyester medium som är kommersiellt tillgängliga (se Tabell av material) och är utformad för provtagning, lagring och konjugat release. Materialet är hydrofil, med låg Biomolekylär bindande och proteinhaltiga prover är stabila under lagring vid-80 ° C. Materialet är högabsorberande, och fiber ytorna har ändrats för att förbättra vatten Vätbarheten.
I studien COPSAC2010 valde vi en panel av 21 cytokiner och chemokiner som valdes en priori att representera stora fenotypiska vägar av immunsystemet agera lokalt i luftvägarna. Endast en av dessa medlare, TSLP, var inte kan upptäckas vid en månads ålder.
En viktig framtida tillämpning skulle vara att samla slemhinna slemhinnan vätska från de nedersta luftvägarna (t.ex. genom att använda Bronkoskopiska microsampling tekniken) att bedöma nedre-luftvägarna immunologi. Bronkoskopiska microsampling är ett nytt förfarande för Bronkoskopiska diagnos, kan samla in lokala bronkial epitelial foder vätska; Det använder en mantlad polyesterfiber sond14. När de distala luftvägarna nås, skjuts sonden ur skidan tipset att absorbera bronkial epitelial vätskan i bronkial lumen. Bronkoskopiska microsampling har använts i akut respiratoriskt distressyndrom14,15,16 och kronisk obstruktiv lungsjukdom17. Vid astma är dock ett befintligt problem att sonden kan orsaka blödning på grund av sjukdom-inducerad epitelial bräcklighet och ökad vascularization. Tillämpa slemhinnor foder flytande tekniken det Bronkoskopiska microsampling förfarandet kunde ha klinisk betydelse i förhållande till vår förståelse av patofysiologin, samt övervakning, behandla och förutsäga resultatet av flera akuta och kroniska lungsjukdomar hos både barn och vuxna.
Alla typer av medlare kan teoretiskt mätas med hjälp av multiplex immunoassay plattform av det kommersiella systemet används här (se Tabell för material). Plattformen tillåter hög känslighet och exakt kvantifiering av någon medlare som ett par av monoklonala antikroppar för utvecklingen av en immunoassay kan erhållas. Denna plattform för också med sig hög precision och mindre känslighet för pH, temperatur och viskositet variationer i vätskorna som skall analyseras.
I framtida studier, det skulle vara av stort värde att expandera den aktuella panelen i immun medlare till mätning av, till exempel: antimikrobiella peptider; Total och specifik IgA; akut-fas reaktanterna, såsom C - reaktivt protein; lipid medlare, såsom prostaglandiner; och neurologiska medlare, såsom hjärnan som härrör neurotrofa faktorn (BDNF). Detta kan ge en mer detaljerad vy av naturen av slemhinnor svar systemet på en kropp webbplats med omfattande luftburen exponering. De föreslagna medlarna kan antingen mätas med hjälp av riktad kvantitativ hög känslighet immunanalyser, såsom i den nuvarande setup eller genom riktade eller oriktade kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi- eller Liquid Chromatography-masspektrometri (LC-MS)-baserad metabolomik tekniker. Den senare metoden har redan implementerats i viss utsträckning med utandningsluften kondens metod, som har vissa metodologiska nackdelar med avseende på provtagning av de kroppsvätskemetabolomik18 som inte är uppenbara för slemhinnor foder flytande teknik.
Längsgående provtagning från nyföddhetsperioden till vuxenlivet, kommer att som utförs i COPSAC2010 kohorten, kraftigt öka vår förståelse av underliggande immunologiska faktorer föregår eller agerar samtidigt med luftvägssjukdomar som astma och allergier. Sådana fynd kan vara viktigt att utvecklingen av romanen therapeutics inriktning viss sjukdom endotypes och utredning av mikronäringsämnen och drog verkningsmekanismer i randomiserade kliniska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författarna förklarar någon potentiell, upplevda eller verkliga intressekonflikt angående innehållet i detta manuskript. Finansiärerna hade inte någon roll i utformningen och genomförandet av studien; insamling, hantering och tolkning av data; eller den förberedelse, granskning och godkännande av manuskriptet. Ingen läkemedelsföretag var inblandad i studien.
Acknowledgments
Vi uttrycker vår tacksamhet till barn och familjer av den COPSAC2010 kohortstudie för alla deras stöd och engagemang. Vi erkänner och uppskattar COPSAC forskargruppen och teknisk hjälp från tekniker Lisbeth Buus Rosholm, Danmarks tekniska universitet, för mätning av cytokiner och chemokiner unika insatser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
