Summary
Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.
Abstract
Begrip van complexe biologische systemen vereist de meting, analyse en integratie van meerdere samengestelde klassen van de levende cel, gewoonlijk bepaald door transcriptomische, proteomische, metabolomische en lipidomische metingen. In dit protocol introduceren we een eenvoudige methode voor de reproduceerbare extractie van metabolieten, lipiden en eiwitten uit biologische weefsels met een enkele hoeveelheid per monster. De extractiemethode is gebaseerd op een methyl tert -butylether: methanol: water systeem voor vloeistof: vloeibare verdeling van hydrofobe en polaire metabolieten in twee niet-mengbare fasen, samen met de precipitatie van eiwitten en andere macromoleculen als een vaste pellet. Deze methode levert derhalve drie verschillende fracties van specifieke moleculaire samenstelling, die volledig compatibel zijn met gemeenschappelijke omics-technologieën zoals vloeibare chromatografie (GC) of gaschromatografie (GC) gekoppeld aan massaspectrometers. Hoewel de methode init wasIally ontwikkeld voor de analyse van verschillende plantweefselmonsters, het is gebleken volledig verenigbaar te zijn voor de extractie en analyse van biologische monsters uit systemen die zo divers zijn als algen, insecten en zoogdierweefsels en celculturen.
Introduction
Systembiologie, die zich in het midden van de vorige eeuw 1 tot stand kwam en werd geavanceerd door de grote schaalanalyse van genomische en transcriptomische datasets 2 , 3 , is ontwikkeld tot een nieuwe en onontbeerlijke aanpak voor de analyse van complexe biologische systemen 4 , 5 . Het hoofddoel van systeembiologie is om de componentinteracties en afhankelijkheden in biologische systemen te ontcijferen en de link tussen genotypes, hun realisatie, moleculaire transformaties en resulterende fenotypes te overbruggen. Bijgevolg is de integratie van uitgebreide datasets, geproduceerd door de verschillende grootschalige analytische benaderingen, namelijk genomics, transcriptomics, metabolomics, lipidomics en proteomics en hun berekeningsanalyse, een voorwaarde gekregen voor de beschrijving en het begrip van complexe biologische systemen.
Bas Uit de enorme chemische diversiteit en complexiteit van biologische componenten in elk levend systeem is de productie van grote en uitgebreide 'omics'-datasets sterk afhankelijk van de kwaliteit van de toegepaste extractiemethode 9 . Naast de kwaliteit van de extractiemethode is de economie van de methode belangrijk; Dit betekent dat het wenselijk zou zijn om zoveel moleculaire informatie te verkrijgen van zo weinig mogelijk sample-invoer. Vaak kunnen monsterhoeveelheden worden beperkt en daarom is het zeer wenselijk om gebruik te maken van een extractiemethode, die zo veel moleculaire klassen kan afleiden uit een enkele extractie van een gegeven monster. Dit betekent dat in plaats van meerdere gespecialiseerde extractiemethoden te gebruiken voor de extractie van verschillende samengestelde klassen uit verschillende monsters van hetzelfde monster van hetzelfde monster, wordt een sequentiële extractiemethode toegepast die de moleculaire bestanddelen van een enkele aliquot fractioneert in verschillende moleculaire fracties.
_content "> De gebruikelijke methode die toegepast wordt voor deze gefractieerde extractiemethoden is gebaseerd op de twee-fase lipidextractiewerkwijze van Folch et al., Ontwikkeld in 1957 10. Deze methode is gebaseerd op een chloroform: methanol / waterverdeling van polaire en hydrofobe metabolieten en was Bestemd voor het opruimen en ontcomplexen van monsters voor hoge kwaliteit lipide analyse. Met de evolutie van multi-omics systemen biologie werd de Folch methode verder, stapwijdig, verbeterd door het te gebruiken voor de monstersepartitie van eiwitten en polaire metabolieten en lipiden voor Gas- en vloeistofchromatografie gebaseerde metabolomics en lipidomics van polaire en hydrofobe verbindingen, naast proteïnes op basis van vloeistofchromatografie 11 , 12 , 13 , 14. Helaas zijn alle methoden gebaseerd op een extractiemethode op chloroform die niet alleen Leidt tot de ongewenste foRmatie van de eiwitpellet als een interfase tussen de polaire en lipidefase, maar die ook een ongewenst oplosmiddel uit een groen chemieperspectief 15 , 16 is . Echter, het oplosmiddel methyl tert -butylether (MTBE) overwint beide van deze bovengenoemde problemen en is een geschikte vervanging voor chloroform. Op basis van deze eisen hebben we besloten om een MTBE: methanol: water-extractiemethode op te stellen die voldoet aan alle voornoemde specificaties en daarom fungeert als een ideaal uitgangspunt voor uitgebreide multi-omics analyse 16 . Dit protocol leidt de gebruiker stap voor stap door middel van de eenvoudige, snelle en reproduceerbare werkstroom van het monstervoorbereiding, inclusief het oplossen van problemen die doorgaans waargenomen worden. Verder zullen we kortom voorbeeldige analytische gegevens introduceren van ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics en proteomics profileren van plantweefselmonsters. Hoewel de gegeven voorbeelden afkomstig zijn van 50 mg van een Arabidopsis thaliana bladweefselmonster , is dit protocol gebruikt voor verscheidene andere biologische monsters en weefsels, waaronder algen 17 , 18 , insecten 19 en zoogdiercellen, organen en weefsels 20 , 21 , 22 . De reikwijdte van het gepresenteerde extractieprotocol is om een duidelijke en gedetailleerde omschrijving te geven van de pre-extractie-monsterbehandeling en de extractieprocedure zelf. Hoewel we drie korte voorbeelden van analytische applicatie geven, kunnen gedetailleerde informatie over de pre- en postanalyse-gegevensverwerking worden verkregen uit onze eerdere publicaties 16 , 23 , 24 ,
Protocol
Voorzichtigheid : Methanol (MeOH) en methyl tert -butylether (MTBE), die tijdens extractie worden gebruikt, zijn ontvlambaar en kunnen bij langdurige blootstelling en / of contact irritatie van de ademhaling, oog of huid hebben. Hanteer deze alsjeblieft voorzichtig alleen in een afzuigkap en gebruik de juiste veiligheidsprocedures tijdens de extractie (laboratoriumjas, veiligheidsbril, handschoenen, enz. ). Vloeibaar stikstof en droogijs, dat in meerdere stappen van dit protocol wordt gebruikt, kan ernstige brandwonden veroorzaken bij langdurig contact met de huid. Behandel ze zorgvuldig door beschermende handschoenen en glazen te dragen. Gebruikers kunnen verschillende chemicaliën, reagentia of interne normen gebruiken voor steekproefanalyse, waarvan sommige giftig zijn. Onderzoek de relevante chemische veiligheidsinformatiebladen voor alle gebruikte materialen.
1. Inzameling en oogsten van biologische monsters
- Bereid gelabelde oogstbuisjes op.
OPMERKING: Hierbij biologische monsters in gelabelde, 2 ml, ronde bodem, veilige plaatsK microcentrifuge buizen die twee 5 mm diameter bevatten, metalen ballen voor de weefselhomogenisator. - Bereid een gevulde vloeibare stikstofdewar.
- Oog het biologische monster op en snap het weefsel in vloeibare stikstof. Voer deze stap binnen enkele seconden zo snel mogelijk uit om metabolische veranderingen te voorkomen die door wonden worden veroorzaakt.
Opmerking: Voor demonstratie doe je rozettebladeren van 30-jarige wild-type Arabidopsis thaliana (Col-0) die op de bodem worden gekweekt onder langdurige omstandigheden. - Bewaar de geoogste monsters op droogijs voor kortlopende pauzes of houd ze op -80 ° C gedurende langere perioden.
2. Malen en weefselafwijking
- Voorafkoelen de buishouders van het weefselhomogenisator in vloeibaar stikstof gedurende ten minste 10 minuten. Als een weefselhomogenisator niet beschikbaar is, gebruik dan schoon en voorgekoelde mortels en stamper.
- Neem de monsters uit de vloeibare stikstof, droogijs of -80 ° C vriezer en plaats ze in de voorgekoeldeBuishouders.
- Zet de buishouders snel in de weefselhomogenisator.
- Maal het biologische materiaal in een fijn en homogeen poeder. Gebruik 20 Hz gedurende 1 minuut voor bladeren.
Notitie; Homogenisatie tijd en snelheid kunnen afhankelijk van het weefsel worden gevarieerd, zorg ervoor dat het monster in een fijn poeder gehomogeniseerd wordt en dat dit poeder in elke stap van de homogenisatie wordt bevroren. - Neem de biologische monsters uit de buishouders en houd ze bevroren tot verdere extractie.
3. Weeg van weefsels
- Gebruik een analytische balans met voldoende precisie voor de benodigde monsterniveaus.
- Bereid een gelabelde 2 ml ronde-bodem-beveiligde microcentrifugebuis aan.
- Pre-koel de buizen en spatels in vloeibare stikstof.
- Aliquot het benodigde hoeveelheid weefsel poeder in de 2 ml safe-lock microcentrifuge tube.
Voorzichtigheid: Vermijd eventueel ontdooien van het plantenmateriaal door de tijd die w wordt genomen te minimaliserenGelijk aan de monsters. - Retourneer de aliquoted monsters onmiddellijk na het wegen naar vloeibaar stikstof.
- Teken voor elk monster het exacte gewicht in. Gebruik 10-50 mg ± 10% voor de meeste plantweefsels.
- Bewaar de gesamoteerde monsters bij -80 ° C tot verdere extractie.
4. Reagent Setup
- Gebruik een extractiemengsel van methyl tert -butylether (MTBE) / methanol (MeOH).
- Voor de bereiding van 100 ml extractie oplosmiddel, voeg 75 ml MTBE toe aan 25 ml MeOH om een mengsel van MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol) te maken.
- Voeg interne normen toe voor de postanalyse normalisatie volgens analytische behoeften. Typisch voeg 50 μl 1,2-diheptadecanoyl- sn- glycero-3-foschocholine (1 mg / ml in chloroform) toe als een interne standaard voor de UPLC-MS-gebaseerde lipide analyse, waarbij 50 μl 13 C sorbitol ( 1 mg / ml in water) als interne normen voor de GC-MS gebaseerde analyse van primairemetabolieten. Interne normen voor UPLC-MS-gebaseerde metabolietanalyse zijn 50 μL corticosteron (1 mg / ml in methanol) en 25 μl ampicilline (1 mg / ml in methanol).
- Breng het oplosmiddel over op een schone glazen fles die is gespoeld met MTBE: MeOH mengsel.
- Bewaar het extractiemengsel gedurende maximaal 1 week bij 4 ° C.
OPMERKING: Bewaar het extractiemengsel gedurende langere perioden om reproduceerbare resultaten te behouden.
- Om faseafscheiding te veroorzaken, gebruik water (H20) / methanol (MeOH).
- Voor de bereiding van 100 ml H20: MeOH, voeg 75 ml H20 aan 25 ml MeOH toe om H20: MeOH (3: 1, vol / vol) te maken.
- Breng het oplosmiddel over op een schone glazen fles die is gespoeld met H20: MeOH mengsel. Dit oplosmiddel kan gedurende enkele weken bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
5. Extractie van monsters
- Pre-afkoel de extractie mIxtuur (MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) tot -20 ° C met behulp van een vloeistofkoelsysteem of een -20 ° C vriezer.
- Verwijder de gesamoteerde monsters één voor één en voeg 1 ml van het voorgekoelde extractiemengsel toe aan elke monsterbuis. Let op: Voer deze stap snel uit door de lage viscositeit van MTBE.
- Meng onmiddellijk op een vortexmenger totdat het weefsel goed gehomogeniseerd is in het extractiemengsel.
OPMERKING: Deze stap is zeer belangrijk, aangezien het nodig is om de eiwitten te precipiteren en hun enzymatische activiteiten te inactiveren. - Incubeer alle monsters op een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 45 min bij 4 ° C.
- Soniceer de monsters gedurende 15 minuten in een ijsgekoeld sonicatiebad.
6. Fractie door fase scheiding
- Voeg 650 μl H20: MeOH (3: 1, vol / vol) aan elke monsterbuis toe.
- Meng goed door vortexing gedurende 1 minuut.
- Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 20.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
OPMERKING: Na deze stap zijn er twee niet-mengbare vloeibare fasen met een vaste pellet in de bodem van de buis.
Voorzichtigheid: Hanteer de buizen zorgvuldig om vermijden van de twee vloeibare fasen te vermijden en vermijd de neergeslagen pellet.
7. Aliquoting van polaire en hydrofobe fracties
- Breng 500 μl van het oplosmiddel van de bovenste lipide bevattende fase over in een gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
OPMERKING: De geplaatste lipide monsters kunnen direct geconcentreerd worden voor onmiddellijke UPLC-MS analyse (stap 8.1) of opgeslagen gedurende een aantal weken bij -80 ° C. - Zodra de 500 μl van het monster verwijderd zijn, verwijder de resterende lipidfase met behulp van een 200 μl pipet.
- Breng 400 μl van het oplosmiddel van de onderste fase (polaire en semi-polaire metabolieten) in een gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis. De aliquoteerde polaire monsters kunnen direct geconcentreerd worden voor onmiddellijke UPLC-MS analyse (stap 8.2) of opgeslagen voorR meerdere weken bij -80 ° C.
- Neem een extra aliquot van 200 μL om aanvullende analyses uit te voeren, bijvoorbeeld op basis van met gaschromatografie gebaseerde metabolieten zoals beschreven kostbaar 16 .
- Verwijder de rest van de waterfase door het overmaat volume te pipetteren.
- Was het verkregen eiwit, zetmeel, celwandpelletje met 500 μL methanol door het 1 minuut grondig te vortexeren.
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 4 ° C bij een snelheid van 10.000 x g .
- Voer eiwit extractie en spijsvertering (stap 11) of zetmeel / celwand analyse zoals eerder beschreven 16 .
OPMERKING: Als deze niet onmiddellijk gebruikt worden, kunnen deze pellets gedurende enkele weken bij -80 ° C worden opgeslagen.
8. Concentratie en opslag van fracties
- Verdamp het oplosmiddel uit lipide monsters (uit stap 7.1) in een vacuümconcentrator zonder verhitting (gedurende 1-2 uur) of gebruik bij voorkeur een nitrOgenstroomverdamper om oxidatieve modificaties van de lipiden te vermijden.
OPMERKING: Gedroogde monsters moeten onmiddellijk worden geanalyseerd. Voor opslag, laat monsters in MTBE-oplossing, ideaal in glazen flesjes (stap 7.1). - Verdamp het oplosmiddel uit de waterige monsters (uit stap 7.3 of 7.4) overnacht in een vacuümconcentrator zonder verwarming. OPMERKING: de gedroogde monsters kunnen voor een paar weken worden opgeslagen bij -80 ° C voor analyse.
9. Analyse van lipiden met behulp van UPLC-MS 24
- Herhaal de gedroogde lipidefracties (vanaf stap 8.1) in 400 μl acetonitril: 2-propanol (7: 3, vol / vol).
- Breng voldoende vloeistof over naar glazen flesjes en deksel stevig.
- Leg de glazen flesjes in een gekoelde autosampler (4 ° C).
- Injecteer 2 μL per monster en scheid de lipiden op een omgekeerde fase (RP) C 8 kolom die bij 60 ° C wordt gehouden, met behulp van een UPLC systeem dat rijdt met een stromingssnelheid van 400 μl / min.
- Gebruik de mobiele telefoonFasen beschreven in Tabel 1 voor de chromatografische scheiding.
- Verkrijg de massaspectra in de positieve en negatieve ioniseringsmodus door gebruik te maken van een geschikt MS-instrument dat het massaspectrum tussen 150 en 1500 m / z bedekt.
10. Analyse van polaire en semi-polaire metabolieten met behulp van UPLC-MS 25 .
- Re-suspender de polaire fase (van stap 8.2) in 200 μL UPLC-gehalte methanol: water (1: 1, vol / vol).
- Breng voldoende vloeistof over naar glazen flesjes en deksel stevig.
- Leg de glazen flesjes in een gekoelde autosampler (4 ° C).
- Spuit 2 μL uit elk monster en scheid de metabolieten op een RP C 18 kolom die bij 40 ° C wordt gehouden, waarbij een UPLC systeem wordt gebruikt dat rijdt met een stromingssnelheid van 400 μl / min.
- Gebruik de mobiele fasen voor chromatografische scheiding met de parameters in tabel 2 .
- Verkrijg volledige scan massaspectra in positieve en negatieve ionisatie modus onsEen geschikte massaspectrometer omvatten die een massa bereik tussen 50 en 1500 m / z bedekt.
11. Proteïne-extractie, spijsvertering en analyse 16
- Re-suspender de gewassen eiwit / zetmeel / celwandpellet (vanaf stap 7.8) in 200 μl van de gewenste extractiebuffer. Opmerking: wij gebruiken ureum / thioureumbuffer (5 M ureum, 2 mM thioureum, 15 mM DTT, 2% CHAPS en protease- en fosfataseremmers) 27 .
- Soniceer de monsters gedurende 10 minuten in een ijs gekoeld sonic bad.
- Incubeer monsters gedurende 30 minuten op een orbitale shaker (100 rpm) bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de opgeloste eiwitten bij 10.000 x g gedurende 5 minuten.
- Verzamel het eiwit supernatant in een nieuwe buis.
- Bepaal de eiwitconcentratie van het verzamelde supernatant 28 .
- Digest 50 μg eiwit in oplossing met een gekozen protocol. Gebruik gewoonlijk de Trypsin / Lys-C mix accordiNg aan de handleiding.
- Na de spijsvertering moet u de ontzouting van de peptiden uitvoeren voorafgaand aan massaspectrometrie met behulp van C 18- stadiumspunten en elueren van de verteerde peptiden 29 .
- Concentreer de monsters in de buurt van droogte in een vacuümconcentrator zonder verhitting.
- Herhaal de monsters in een passende laadbuffer (bijv. 5% acetonitril, 0,5% mierenzuur) en analyseer de peptidemengsels door LC-MS / MS met behulp van een massagespectrometer met hoge resolutie die is verbonden met een nano-LC-systeem.
OPMERKING: In het voorbeeldige proteomics dataset dat in dit protocol is gepresenteerd, hebben we een gradiënt gebruikt zoals beschreven in Tabel 3 . - Stel de massaspectrometer in met behulp van een top 15-strategie, waar één volledige scan (FS) gevolgd werd door maximaal 15 gegevensafhankelijke MS / MS-scans, naar de volgende parameters: De FS was in het massaspectrum van 200-2000 m / z bij Een resolutie van 70.000 met een doelwaarde van 3x10 6 ionen. Verkrijg de data-afhankelijke MS / MS scans door higher-eneRgy collisional dissociation (HCD). Stel de doelwaarden voor de MS / MS op 1e 5 ionen, met een maximale ionvullingstijd van 50 ms, een isolatievenster van 4,0 m / z, genormaliseerde botsingsenergie (NCE) van 30% en een ondervullingsverhouding van 1%. Meet de MS / MS-ionen bij een resolutie van 17.500 en de dynamische uitsluiting is ingesteld op 60 s.
Representative Results
Omvattende multifunctionele datasets zijn van onschatbare waarde voor het begrijpen van complexe biologische systemen. De strategie voor een succesvol biologisch experiment begint meestal uit een zinvol experimenteel ontwerp, experimenten opstelling en prestatie, gevolgd door steekproefverzameling, extractie, analytische dataverzameling, raw data processing, statistische data analyse, identificatie van relevante metaboliet en biologische data interpretatie Inclusief routekaart en visualisatie ( Figuur 1 ).
In het extractieprotocol dat hierin wordt geïntroduceerd, richten wij ons op de steekproefverzameling, -handeling en -xtractiestap, die worden afgebeeld in het gedetailleerde workflow overzicht in figuur 2 . Voor demonstratie werd 50 mg Arabidopsis bladweefsel geselecteerd. Dit materiaal werd geoogst, gemalen en geëxtraheerd alvorens het op drie te onderwerpenVoorbeeldige analytische UPLC-MS-platformen, die gegevens verschaffen die kunnen worden gebruikt voor gerichte en niet-gerichte lipidomische, metabolomische en proteomische analyses. De figuren 2 en 6 bevatten bovendien representatieve foto's van hoe het extractie-oplosmiddel onder normale omstandigheden moet lijken. Daarnaast worden voorbeelden van monsters die overmatige hoeveelheden geprecipiteerde macromoleculen (eiwitten en zetmeel) bevatten en monsters met ongepaste monsterhomogenisatie getoond ( Figuur 3 ). De probleemoplossing voor deze twee veel voorkomende problemen wordt kort in figuur 3 gegeven, maar wordt ook in meer detail besproken in onze vorige publicatie 16 .
In figuren 4 en 5 worden voorbeelden weergegeven van drie analytische chromatogrammen afgeleid van de lipide, de polaire / semI-polaire metabolieten en eiwitanalyses. Lipiden, die werden genomen uit de bovenste MTBE-fase ( Figuur 2 ), werden geanalyseerd door omgekeerde fase (RP) C 8 ultraprestatie-vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge resolutie massaspectrometrie. Lipiden kunnen worden verworven met behulp van positieve en negatieve MS ionisatie modi ( Figuur 4 , bovenste paneel) 16 , 24 .
Polaire en semi-polaire primaire en secundaire metabolieten werden geanalyseerd uit de polaire (water / methanol) fase ( Figuur 2 ) door omgekeerde fase (RP) C18 UPLC-MS 25 . De geïllustreerde methode, met behulp van de omgekeerde fasechromatografie, is zeer verenigbaar met de analyse van semi-polaire metabolieten (namelijk metabolieten uit plant secundair metabolisme), dat kan worden geanalyseerd met behulp van positieve en negatieve ionisatiemodi in de MS( Afbeelding 4 , onderpaneel) 16 . Meer hydrofiele metabolieten uit deze fractie (suikers, polaire aminozuren, enz.), Die geen goede retentie op het omgekeerde fase materiaal tonen, kunnen worden geanalyseerd met andere analytische werkwijzen zoals GC-MS 16 of hydrofiele interactie vloeistofchromatografie 30 .
De eiwitten, die werden opgehaald uit de vaste pellet in de bodem van de extractiebuis ( Figuur 2 ), werden in oplossing gedigereerd en geanalyseerd onder toepassing van schotpistool LC-MS ( Figuur 5 ), terwijl het protocol voor extractie van zetmeel- en celwand Materiaal kan worden verkregen uit ons eerder gepubliceerd protocol 16 .
Samenvattend, meer dan 200 lipiden, 50 geannoteerde semi-polaire metabolieten en enkele duizend proteïnenNs kan routinematig geïdentificeerd worden uit monsters van het type dat in ons voorbeeld wordt gebruikt. Bovendien vertoonde de methode grote toepasselijkheid door gebruik te maken van verschillende weefsels, organen en celcultuurmateriaal ( Figuur 6 ).
Figuur 1: Algemene werkstroom voor grootschalige niet-gerichte Omics-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Proefbereiding en extractiewerkstroom voor de analyse van lipiden, metabolieten en eiwitten uit een enkele aliquot van een biologische steekproef.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Illustratieve voorbeelden van veelal waargenomen problemen met behulp van tweefase-partitie-extractieprotocollen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Representatieve chromatogrammen van lipide- en semi-polaire metabolieten uit Arabidopsis thaliana Blad Extracten . Base peak chromatogramS van lipiden (bovenste ruit) en semi-polaire metabolieten (onderste ruit) geanalyseerd in de positieve ionisatietoestand 16 . De taartdiagrammen in de rechterbovenhoek van elk chromatogram tonen het aantal geïdentificeerde lipiden en metabolieten die zijn toegewezen aan verschillende chemische klassen. Chl, chlorofylen; DAG, diacylglyceride; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; FA, vetzuur; LysoPC, lysofosfatidylcholine; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, fosfatidylcholine; PE, fosfatidylethanolamine; PG, fosfatidylglycerol; PI, fosfatidylinositol; PS, fosfatidylserine; SP, sphingolipide; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, triacylglyceride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5
De taartdiagram in de rechterbovenhoek geeft het aantal geïdentificeerde eiwitten aan die aan verschillende biologische processen zijn toegewezen 16 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 : Representatieve extractie-voorbeelden van verschillende weefsoorten van wild-type Arabidopsis thaliana .
Alle monsters werden geëxtraheerd onder toepassing van 50 mg vers gewicht uit de aangegeven weefsels."> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| Tijd (min) | % Buffer A naar buffer B | |
| 0 tot 1 min | 45% A | Buffer A: 1% 1 M NH4-acetaat, 0,1% azijnzuur in UPLC MS-gehalte water |
| 1 tot 4 min | Lineaire gradiënt van 45% A tot 25% A | Buffer B: 1% 1 M NH4-acetaat, 0,1% azijnzuur in acetonitril / isopropanol 7: 3, (v: v) |
| 4 tot 12 min | Lineaire gradiënt van 25% A tot 11% A | Stroomsnelheid 400 μl / min |
| 12 tot 15 min | Lineaire gradiënt van 11% A tot 0% A | Injectievolume 2 μL |
| 15 tot 19,5 min | Was de kolom gedurende 4,5 min. Met 0% A | |
| Stel terug naar 45% A | ||
| 19,51 tot 24 min | Equilibreer met 45% A |
Tabel 1: Gradiëntparameters voor RP-UPLC-scheiding van lipiden. RP, omgekeerde fase. UPLC, ultra-performance vloeistofchromatografie.
| Tijd (min) | % Buffer A naar buffer B | |
| 0 tot 1 min | 99% A | Buffer A: 0,1% mierenzuur in water van UPLC-gehalte |
| 1 tot 11 min | Lineaire gradiënt van 99% A tot 60% A | Buffer B: 0,1% mierenzuur in UPLC grad acetonitril |
| 11 tot 13 min | Lineaire gradiënt van 60% A tot 30% A | Stroomsnelheid 4001; l / min |
| 13 tot 15 minuten | Lineaire gradiënt van 30% A tot 1% A | Injectievolume 2 μL |
| 15 tot 16 min | Was de kolom gedurende 1 minuut met 1% A | |
| 16 tot 17 min | Lineaire gradiënt van1% A tot 99% A | |
| 17 tot 20 min | Equilibreren gedurende 3 minuten bij 99% A |
Tabel 2: Gradiëntparameters voor RP-UPLC-scheiding van polaire en semi-polaire metabolieten. RP, omgekeerde fase. UPLC, ultra-performance vloeistofchromatografie.
| Tijd (min) | % Buffer B naar buffer A | |
| 0 tot 5 min | Lineaire gradiënt van 0 tot 10% | Buffer A: 0,1% mierenzuur in water van UPLC-gehalte |
| 5 tot 80 min | Lineaire gradiënt van 10% tot 40% | Buffer B: 0,1% mierenzuur in 60% acetonitril UPLC-gehalte |
| 80 tot 85 min | Lineaire gradiënt van 40% tot 60% | Stroomsnelheid 300 nL / min |
| 85 tot 86 min | Lineaire gradiënt van 60% tot 95% | Injectievolume 5 μl |
| 86 tot 91 min | Was de kolom gedurende 5 minuten met 95% | |
| 91 tot 92 min | Lineaire gradiënt van 95% tot 0% | |
| 93 tot 110 min | Equilibreer de kolom gedurende 17 minuten bij 0% |
Tabel 3: Gradiëntparameters voor nano-LC-scheiding van peptiden. LC, vloeistofchromatografie.
Discussion
In dit artikel beschrijven en illustreren we een eenvoudig en zeer toepasbaar extractieprotocol voor een uitgebreide lipidomische, metabolomische en proteomische analyse uit een enkelvoudig 50 mg bladmonster. De methode is eerder gebruikt in verschillende studies, die zijn gepubliceerd in diverse artikelen 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 En bewezen, naast zijn straight-forwardWorkflow en high applicability zijn robuust en reproduceerbaar.
De hier verstrekte toepassingen tonen een aantal routine methodes voor de initiële screening van een complex biologisch monster. Deze geïllustreerde grootschalige metabolomische en lipidomische datasets kunnen uitgebreide informatie geven over de brede of specifieke veranderingen in het metabolisme van het geanalyseerde biologische systeem, terwijl de gegevens verkregen uit de analyse van eiwitten inzicht geven in kwantitatieve (overvloed) en kwalitatieve (modificaties ) Veranderingen van enzymen, structurele eiwitten of transcriptiefactoren (TF's) die de cellulaire functies en machines regelen. Derhalve heeft integratieve omics-gegevens het potentieel om initiële informatie te onthullen over mogelijke veranderingen geïnduceerd door genetische of biotische en / of abiotische verstoringen van een biologisch systeem, door moleculaire veranderingen van diverse moleculen geassocieerd met specifieke metabolische pathways of cellulaire processen toe te lichten.
NatuurlijkOp het lange termijn is het voor een succesvolle systeembiologieanalyse redelijk essentieel om het aantal geanalyseerde en geannoteerde moleculaire entiteiten te maximaliseren, waardoor de monitoring van cellulaire functies en activiteiten zo volledig mogelijk is. Voor dit doel kunnen de verkregen fracties additioneel toegepast worden op diverse analytische werkwijzen, die verdere verbindingen of samengestelde klassen richten ( Figuur 4 ).
Dit gezegd hebbende moet worden vermeld dat de globale analysestrategie van de verkregen data kan worden gevolgd door twee verschillende strategieën: aan de ene kant benadrukken we de opheldering van cellulaire functies door kwantificering van bekende verbindingen. Aan de andere kant zijn veel van de gemeten metabolieten en lipiden nog niet bekend of geannoteerd. Deze, maar niet-geannoteerde samengestelde metingen bevatten ook veel zinvolle informatie, die kan worden gebruikt door statistische methoden voor classificatie of discriminatie bTussen groepen of behandelingen 20 , 21 , 22 .
Toch moeten deze onbekende verbindingen, vooral die welke relevant zijn voor de indeling of de dienstverlening als biomarkers, worden geïdentificeerd. Dit identificatieproces is helaas nogal vervelend en kan niet worden bereikt zonder aanvullende analytische metingen of strategieën 38 . Zoals blijkt uit figuur 4 is het aantal niet-geannoteerde verbindingen vrij hoog (eigenlijk de overgrote meerderheid). Niettemin, zoals hierboven vermeld, kunnen deze chromatografische pieken worden behandeld binnen de data-analyse en daarom kunnen significante getroffen entiteiten worden toegelicht en onderworpen aan verdere identificatie strategieën.
Samenvattend kunnen we concluderen dat het hierin ingevoerde protocol voorziet in verschillende voordelen voor de experimentele systeembiologie en voor klassieke statistische toepassingenaties.
Ten eerste, aangezien alle fracties uit een enkel monster worden geëxtraheerd, wordt de variatie tussen de verschillende experimentele datasets (lipiden, metabolieten, eiwitten) aanzienlijk verminderd, aangezien elke dataset afgeleid is van hetzelfde monster-monster. Dit leidt duidelijk tot de verhoogde vergelijkbaarheid van de verkregen resultaten.
Ten tweede is de methode gemakkelijk schaalbaar en maakt het daarom zeer compatibel met kleine tot grote monsterhoeveelheden. We routinematig gebruik maken van 10-100 mg weefselmonsters, maar succesvolle lipidomische studies zijn ook uitgevoerd op zo weinig als 20 Arabidopsis zaden 31 . Vooral de verenigbaarheid met kleine monsterhoeveelheden maakt deze methode van toepassing als er beperkte hoeveelheden biologische weefsels of monsters beschikbaar zijn. Toch is er, zelfs als er voldoende materiaal beschikbaar is, de methode die hier wordt gepresenteerd, het voordeel om deze monsters in een groter aantal experimentele replicaten te gebruiken in plaats van uZing ze voor verschillende extractieprocedures. Dit zorgt voor een betere en verfijnde statistische data analyse.
Ten derde, aangezien de werkwijze is gebaseerd op een vloeistof-vloeibare fractionering van polaire en niet-polaire moleculen, verschaft het in tegenstelling tot eenvoudige eenfase-extractiemethoden ( bijv. Methanol-extracties) een significante ontcomplexeringsstap in de procedure. Dit efficiënte monster-ontplooiing leidt tot een gedeeltelijke zuivering van de individuele fracties als gevolg van de scheiding van chemisch interfererende moleculen van elkaar. Bijgevolg levert het chemische scheidingsproces niet alleen een praktisch voordeel voor het systematisch aliquoteren van de geëxtraheerde monsters in verschillende chemische klassen, maar verbetert ook de individuele analytische metingen, aangezien het verontreinigende verbindingen uit de verschillende fracties verwijdert. Het is duidelijk, dat we vooral kunnen observeren dat de lipiden, die zijn verdeeld in de organische fase en die meestal een negatieve invloed hebben op de lipidenChromatografische analyse van polaire verbindingen, zal bijna volledig afwezig zijn van de polaire fractie. Hetzelfde geldt voor de analyse van de hydrofobe lipiden, die uit de polaire verbindingen worden uitgeput. Naast de zuivering van polaire en niet-polaire verbindingen uit elkaar nemen we eiwitten en andere macro-moleculen uit het monster af en verzamelen ze niet alleen een aparte fractie, die kan worden gebruikt voor eiwit-, zetmeel- en celwandanalyse 16 , maar ook Leidt tot een schonere monster binnen de individuele fracties. Dit is vooral relevant, omdat het bekend is dat de aanwezigheid van grote macromoleculen leidt tot schade of ten minste kortere levensduur van de analytische kolommen.
Ten slotte is de beschreven MTBE-extractiemethode, die gebaseerd is op het minder gevaarlijke en gunstiger chloroform-vervangingsoplosmiddel 15 , al door verschillende onderzoeken uit onze groep getoondIcability voor verschillende biologische monsters van planten 16 , algen 17 , 18 , vliegen 19 maar ook verscheidene zoogdierweefsels, organen of cellen 20 , 21 , 22 .
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
MS wordt ondersteund door een volledige PhD-beurs uit het GERLS-DAAD programma. Wij bedanken dr. Andrew Wiszniewski voor het bewijs lezen en commentaar geven op het manuscript. Wij zijn zeer dankbaar voor alle leden van het Giavalisco lab in Max-Planck Instituut voor Moleculaire Plantfysiologie, Golm, Duitsland voor hun hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Equipment | |||
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
| Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| 2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| 1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |
References
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, Suppl 11 1 (2014).
- Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
- Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
- Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
- Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
- Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
- Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
- Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
- Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
- Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
- Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).
