Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forudsigelse af gensvulmning gennem spatiotemporal kontrol af siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55803
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Summary

Vi præsenterer en ny metode, der bruger fotobesvarende blokcopolymerer til mere effektiv spatiotemporal styring af gentympning uden påviselige off-target-effekter. Endvidere kan ændringer i genekspression forudsiges ved anvendelse af straightforward siRNA frigivelsesassays og simpel kinetisk modellering.

Abstract

Nye materialer og metoder er nødvendige for bedre at kontrollere bindingen vs. frigivelse af nukleinsyrer til en lang række anvendelser, som kræver præcis regulering af genaktivitet. Navnlig ville nye stimuli-responsive materialer med forbedret spatiotemporal kontrol over genekspression åbne for oversættelige platforme i lægemiddelforskning og regenerativ medicinteknologi. Desuden ville en forøget evne til at styre nukleinsyrefrigivelse basis muliggøre udviklingen af strømlinede metoder til at forudsige Nanobærer virkningsfuldhed a priori, hvilket fører til fremskyndet screening af leveringsvehikler. Her præsenterer vi en protokol til forudsigelse af genlyddningseffektivitet og opnåelse af spatiotemporal kontrol over genekspression gennem et modulært fotoresvarende nanocarrier-system. Lille interfererende RNA (siRNA) komplekseres med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxy) -2-nitrobenzylmethacrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tilRm stabile nanocarriers, der kan styres med lys for at lette afstemning, on / off siRNA release. Vi skitserer to komplementære analyser, der anvender fluorescenskorrelationsspektroskopi og gelelektroforese til den nøjagtige kvantificering af siRNA-frigivelse fra opløsninger, der efterligner intracellulære miljøer. Oplysninger opnået fra disse assays blev inkorporeret i en simpel RNA interferens (RNAi) kinetisk model for at forudsige de dynamiske afstødningsresponser på forskellige foto-stimulusbetingelser. Til gengæld tillod disse optimerede bestrålingsbetingelser forfining af en ny protokol til spatiotemporalt styring af gentympning. Denne metode kan generere cellulære mønstre i genekspression med celle til celleopløsning og ingen påviselige off-target-effekter. Tværtimod tilbyder vores tilgang en nem at bruge metode til at forudsige dynamiske ændringer i genekspression og præcis styring af siRNA-aktivitet i rum og tid. Dette sæt assays kan let tilpasses til at teste en bred vifte af otHendes stimuli-responsive systemer for at imødegå vigtige udfordringer, der er relevante for en lang række anvendelser inden for biomedicinsk forskning og medicin.

Introduction

Små interfererende RNA'er (siRNA'er) medierer post-transkriptionelt gensilring gennem en katalytisk RNAi-vej, der er yderst specifik, kraftig og skræddersyet til stort set ethvert målgen 1 . Disse lovende egenskaber har gjort det muligt for siRNA-terapeutika at udvikle sig i humane kliniske forsøg til behandling af talrige sygdomme, herunder metastatisk melanom og hæmofili 2 , 3 . Imidlertid fortsætter betydelige leveringsproblemer, som har forhindret oversættelse 4 . Leveringskøretøjer skal især forblive stabile og beskytte siRNA'er mod ekstracellulær nedbrydning, men frigive også nyttelasten i cytoplasma 5 . Desuden kræver mange RNAi-applikationer forbedrede fremgangsmåder til regulering af gentympning i rum og tid 6 , hvilket vil reducere bivirkninger i siRNA-terapeutik 7 og muliggøre transformativ aDvances i applikationer, der spænder fra celle-mikroarrays til lægemiddelforskning 8 til modulering af celleresponser i regenerative stilladser 9 . Disse udfordringer fremhæver behovet for nye materialer og metoder til bedre at kontrollere binding mod frigivelse i siRNA nanocarrier.

En af de mest lovende strategier til styring af siRNA frigivelse og forbedring af spatiotemporal regulering er brugen af ​​stimuli-responsive materialer 10 . For eksempel er en bred vifte af biomaterialer blevet konstrueret med foranderlig nukleinsyrebindingsaffinitet som reaktion på ændret redoxpotentiale eller pH eller anvendte magnetfelter, ultralyd eller lys 11 . Selv om mange af disse systemer viser forbedret kontrol over nukleinsyreaktivitet, er anvendelsen af ​​lys som en trigger særligt fordelagtig på grund af dens øjeblikkelige tidsmæssige respons, præcis rumlig opløsning og nem afstemning 13 , 14 , 15 . Foto-responsive siRNA nanocarrier er ideelt egnet til at overvinde disse ulemper og tilvejebringe en enklere og mere robust tilgang til spatiotemporalt modulere genekspression 16 , 17 , 18 . Desværre forbliver metoder til nøjagtigt at forudsige det resulterende proteinknockdown-svar uvæsentligt.

En vigtig udfordring er, at kvantitative evalueringer af siRNA-udgivelsen erSjældne 19 , 20 , og selv når disse evalueringer udføres, er de ikke blevet koblet til analyser af siRNA / proteinomsætningsdynamik. Både mængden af ​​frigivet siRNA og dens persistens / levetid er vigtige determinanter for den resulterende gendæmpningsdynamik; En mangel på sådanne oplysninger er derfor en stor afbrydelse, der udelukker nøjagtig forudsigelse af dosisrespons i RNAi 21 . Adressering af denne udfordring ville fremskynde formuleringen af ​​de relevante struktur-funktion forhold i nanocarrier og bedre informere biomaterialedesigner 22 . Desuden ville sådanne fremgangsmåder muliggøre udvikling af mere effektive siRNA doseringsprotokoller. I et forsøg på at forstå det dynamiske lydsvarssvar har flere grupper undersøgt matematiske modeller af RNAi 23 , 24 , 25 . Disse rammer varSucces med at give indsigt i siRNA-medierede ændringer i genekspression og identificere hastighedsbegrænsende trin 26 . Imidlertid er disse modeller kun blevet anvendt til kommercielle genleveringssystemer ( fx lipofektamin og polyethylenimin (PEI)), der ikke er i stand til kontrolleret siRNA-frigivelse, og kompleksiteten af ​​modellerne har alvorligt begrænset deres anvendelighed 27 . Disse mangler fremhæver et ubehøvet behov for nye materialer, der er i stand til præcist indstillelig siRNA-frigivelse kombineret med strømlinede og nemme at bruge prædiktive kinetiske modeller.

Vores metode behandler alle disse udfordringer gennem integration af en lysfølsom nanocarrier platform med koblede metoder til at kvantificere fri siRNA og model RNAi dynamik. Specielt overvåges vores platforms præcist styrede siRNA-udgivelse 28 ved hjælp af to komplementære metoder til nøjagtigt kvantificering af indkapslede kontra uBundet siRNA. De eksperimentelle data fra disse analyser indføres i en simpel kinetisk model for at forudsige genlydningseffektiviteter a priori 29 . Endelig udnyttes nanokarrierernes on / off-natur let for at frembringe cellemønstre i genekspression med rumlig kontrol på cellelængde skalaen. Således tilvejebringer denne metode en let tilpasningsbar metode til styring og forudsigelse af gentympning i en række forskellige applikationer, der ville have gavn af spatiotemporal regulering af celleadfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Formulering af siRNA nanocarrierer

  1. Forbered separate opløsninger af siRNA og mPEG- b -P (APNBMA) med lige mængder fortyndet i 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre (HEPES) buffer ved pH 6,0.
    1. Tilsæt siRNA i en koncentration på 32 μg / ml til 20 mM HEPES-opløsning.
      BEMÆRK: siRNA var en ikke-målrettet, universel negativ kontrol sekvens; SiRNA'en kan imidlertid være designet til at målrette mod ethvert gen af ​​interesse.
    2. Opløs mPEG- b- P (APNBMA) polymererne i en 20 mM HEPES-opløsning. Tilsæt en passende mængde mPEG- b -P (APNBMA) for at gøre en 220 μg / ml opløsning, så N / P-forholdet (N, aminogrupper på mPEG- b -P (APNBMA); P, fosfatgrupper på siRNA) Er 4.
      BEMÆRK: Den syntetiske protokol for mPEG- b -P (APNBMA) polymererne er rapporteret andetsteds 30 .
  2. Tilsæt mPEG- b -P (APNBMA) -opløsningen dråbevis til en lige stor volumenE af siRNA-opløsningen, mens du forsigtigt blander på en hvirvelmaskine. Fortsæt med hvirvel i 30 s efter polymertilsætning. Inkuber prøverne i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter.

2. Måling af siRNA-frigivelse ved anvendelse af gelelektroforese

  1. Formuler nanocarriererne i overensstemmelse med trin 1.1-1.2, og skala mængderne for at rumme antallet af ønskede prøver.
  2. Bland nanocarrier med natriumdodecylsulfat (SDS).
    1. Forbered en 1 mg / ml opløsning af SDS i vand. Aliquot ud af mængden af ​​SDS-opløsning, der er nødvendig for at fremstille opløsninger med et S / P forhold (S, sulfatgrupper på SDS, P, phosphatgrupper på siRNA) på 15.
      BEMÆRK: Hvis polyplexopløsningen indeholder 1 μg siRNA, skal 13 μg SDS tilsættes for at opnå et S / P-forhold på 15.
    2. Tilsæt SDS-opløsningen til hver nanocarrieropløsning dråbevis, mens du forsigtigt blander på en hvirvelmaskine. Fortsæt til hvirvel i 30 s efter SDS-tilsætning.
  3. Kalibrere og indstil en UV laser med et 365 nm filter til en intensitet på 200 W / m. Sørg for, at lysintensiteten måles fra det sted, hvor bunden af ​​prøveopløsningen sættes.
  4. Læg nanocarrier / SDS-opløsningen i et glaskammer bestående af glasskinner, adskilt af en gummipakning.
    1. Forvask vaskeskinner i en 7: 3 (v / v) ethanol / vandopløsning i vand og tør helt. Skær et hul (~ 2 x 3 cm rektangel) i en gummipakning. Placer gummipakningen på en glasskinne.
    2. Pipetter nanocarrier / SDS-opløsningen på glasskinnen i hullet på gummipakningen. Læg et overskud af opløsning (20 μL i overskud) på glasskinnen, mens du undgår kontakt med gummipakningen.
      BEMÆRK: Visse væsker vil gå tabt i de efterfølgende trin.
    3. Placer det andet glasGlide oven på glidepakningen. For at undgå luftboblegenerering skal du først placere den ene ende af glideren ned og derefter langsomt sænke den anden ende.
    4. Fastgør binderklip til hver side af glaskammeret for at holde det lukket.
  5. Bestråle prøverne i den ønskede tidsperiode ( f.eks . 0-60 min.) Ved hjælp af UV-laseren med et 365 nm filter med en intensitet på 200 W / m. Fjern binderklip og åbner kammeret.
  6. Pipetter 25 μl af de bestrålede nanocarrier / SDS prøver i et mikrocentrifugerør. Inkuber opløsningerne i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter.
  7. Forbered en 2 vægt% agarosegel for-farvet med 0,5 μg / ml ethidiumbromid i Tris / Borat / EDTA (TBE) bufret opløsning i overensstemmelse med standardprotokollerne 31 . Forbered en påfyldningsbuffer bestående af 3: 7 (vol / vol) glycerol / vand.
  8. Tilsæt 5 μL af ladningsbufferopløsningen til 25 μl af hver nanocarrier / SDS-prøve. Inkuber prøverne i mørket påStuetemperatur i 10 min.
  9. Indlæs 30 μl af hver nanocarrier / SDS-prøve i 2% agarosegelen. Kør gelen i mørket ved 100 V i 30 minutter. Billedet gelen ved hjælp af et gel billeddannelsessystem med ethidiumbromidfiltre. Gem gelbilledfilerne, og fortsæt til trin 2.10 for kvantifikation af båndintensitet. Sørg for, at båndintensiteterne er lyse nok til klart at visualisere, men ikke for lyse, at signalerne er mættede.
  10. Kvantificer båndintensiteterne ved hjælp af offentligt tilgængelig ImageJ-software 32 .
    1. Ved hjælp af ROI-værktøjet i ImageJ bestemmer du fluorescensintensiteten af ​​de frie siRNA-bånd i hver bane ved at tegne et rektangel omkring hvert bånd. Plot intensitetenskurverne for hver bane og integrere området under kurverne ved at tegne en vandret linie hen over intensitetskurverne og klikke på sporvognen inden i de lukkede områder.
    2. Beregn den relative intensitet af hver bane ved at dividere arealet under cuRve af hver prøve ved området under kurven for siRNA-positiv kontrol (ingen mPEG- b- P (APNBMA) tilsættes og ingen SDS tilsættes). Rapportér procentdelen af ​​siRNA frigivet som normaliseret båndintensitet af hver prøve.

3. Måling af siRNA-frigivelse ved anvendelse af fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

  1. Hent siRNA mærket med en enkelt fluorofor i 5'-enden af ​​sansstrengen.
    BEMÆRK: SiRNA'en kan købes forud annealed med etiketterne konjugeret på det ønskede sted. Fluoroforen skal være fotostabil og absorbere / udsende mellem 450 og 750 nm for at undgå UV-lysdæmpning og energioverførsel med mPEG- b -P (APNBMA).
  2. Formuler nanocarriererne i overensstemmelse med trin 1.1-1.2 under anvendelse af det mærkede siRNA. Skala volumenerne for at imødekomme antallet af ønskede prøver.
  3. Inkuber opløsningerne i SDS og bestrål i den ønskede tidsperiode ifølge trin 2.2-2.6.
  4. preparAtion af FCS prøvekammer.
    1. Vask en glasskinne med en 7: 3 (v / v) ethanol / vandopløsning, og tør helt glaset med en aftørring og en luftstrøm.
    2. Fjern stykkerne papir fra et dobbeltsidet klæbemiddelafstandsstykke for at udsætte det dobbeltsidede klæbemiddelafstandsstykke. Fastgør afstandsstykket til en glasdæksel.
    3. Pipetter nanocarrier / SDS-opløsningen på dækslet i midten af ​​hullet fra klæbemiddelafstanden.
    4. Placer glasskinnen oven på dækslet. Skub på glasskinnen for at sikre, at glasskinnen og dækslet er godt fastgjort og danner en tætning.
  5. Brug et konfokalmikroskop til FCS målinger 33 . Brug en 40 x vanddypning apochromat objektiv med en numerisk blænde på 1,2. Brug den passende excitationslaserkanal (488 nm) til at indsamle mindst 30 målinger på 10 s hver pr. Prøve 34 . Sørg for, at laserintensiteten og detektorens justering forbliverDet samme for hver prøve.
    1. Foruden de eksperimentelle prøver måler man kontroller, herunder: en blindprøve uden mærket siRNA; Og en fri siRNA-prøve med mærket siRNA men ikke mPEG- b- P (APNBMA).
  6. Analyser dataene ved hjælp af FCS-specifik software. Identificer baselineantalet for hver prøve ved at bestemme den stabile tællehastighed i løbet af en tid, hvor ingen nanocarrier passerer gennem det konfokale volumen 29 .
    1. Subtrahere tællingsraten for den tomme prøve fra hver prøve-basisværdiernes tællingsrenteværdi. Normaliser de resulterende værdier til den frie siRNA-kontrol for at beregne procenten af ​​fri siRNA 35 .

4. Kinetisk modellering for at forudsige gensvidning

  1. Opret scripts i et matematisk programmeringssprog ved hjælp af det simple sæt almindelige differentialligninger for at forudsige genstansning 29.
    BEMÆRK: Scripts kan stilles til rådighed efter anmodning.
    1. Skriv sæt almindelige differentialligninger som:
      Ligning 1 (1)
      Ligning 2 (2)
      Ligning 3 (3)
      BEMÆRK: For ligninger 1-3 er udtrykkene k mRNA , k siRNA og k prot , hastighedskonstanterne for produktionen af ​​henholdsvis mRNA, siRNA og protein. Udtrykkene km, deg , ks , deg og kp , deg er hastighedskonstanterne for nedbrydningen af ​​henholdsvis mRNA, siRNA og protein. Nedbrydningshastighedskonstanter beregnes på basis af komponenthalveringstiderne, og produktionshastighedskonstanter er egnede til at sikre, at mRNA og protein steady state værdier nås i fravær oF siRNA.
      1. Bestem halveringstiden for mRNA'et og proteinet for det eller de gen (er) af interesse, enten eksperimentelt som beskrevet i reference 36 eller fra litteraturen (se diskussionen ). Bestem også fordoblingstiden for cellelinjen. Indtast disse værdier i de relevante nedbrydningshastighedsudtryk.
      2. Indstil produktionshastighedskonstanterne, således at genekspressionsniveauerne forbliver stabile ved en normaliseret værdi på 100, hvis der ikke introduceres siRNA. Indstil [siRNA] til nul og varier værdierne for k mRNA , k siRNA og k prot produktionshastighedskonstanter indtil [mRNA] og [protein] forbliver inden for 1% af den oprindelige normaliserede værdi på 100% i løbet af Simuleringen.
      3. Ved anvendelse af de relative mængder af siRNA frigivet fra de tidligere beskrevne gelelektroforese og FCS-assays som estimater, justere den oprindelige relative koncentration af siRNA i scriptet. Specifikt, varierer [siRNA] at være proportional med den relative mængde frigivet siRNA med en værdi på 100 svarende til den maksimale mængde 29 .

5. Cell Culture og In Vitro siRNA Delivery

  1. Kultur NIH / 3T3 murine embryonale fibroblaster ifølge protokollerne fra leverandøren.
    1. Væk cellerne i vækstmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin). Vedligehold cellerne ved 37 ° C i et befugtet miljø med 5% CO 2 .
  2. Sæd cellerne i behandlede plader med 6 brønde.
    1. Følg den anbefalede subculturing procedure fra leverandøren. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd cellerne i suppleret vækstmedium til en koncentration på 75.000 celler / ml.
    2. Tilsæt 2 ml celle suspension (75.000 celleS / ml) til hver brønd på 6-brøndspladen. Lad cellerne klæbe og udvinde i 24 timer i inkubatoren.
  3. Klargør cellerne til transfektion ved vask med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsætning af 1,5 ml serum- og antibiotikumfrit transfektionsmedium (se Materialetabellen ) til hver brønd.
  4. Formuler siRNA nanocarrierene ifølge trin 1.1-1.2. Tilsæt 25 μl nanocarrieropløsning indeholdende 30 pmol siRNA til hver brønd. Tryk forsigtigt mediet op og ned for at blande. Placer cellerne i inkubatoren i 3 timer.
  5. Fjern transfektionsmediet og vask hver brønd med PBS. Tilsæt 1 ml suppleret vækstmedium og læg cellerne i inkubatoren for at genvinde i 30 minutter.
  6. For at forberede cellerne til behandling med en fotostimulus, fjern de supplerede vækstmedier. Tilsæt 1 ml transfektionsmedier (uden phenolrød) til hver brønd.
    BEMÆRK: Sørg for, at transfektionsmediet ikke indeholder phenolrødt.
  7. Kalibrere og indstil en UV laser med et 365 nm filter til en intensitet på 200 W / m. Sørg for, at lysintensiteten måles fra det sted, hvor bunden af ​​cellepladen sidder.
  8. Placer cellerne på en varm plade indstillet til 37 ° C. Fjern pladeafdækningen på cellerne. Bestråle cellerne ovenover pladen i den ønskede tid (op til 20 minutter) ved hjælp af UV-laseren med et 365 nm filter ved en intensitet på 200 W m -2 .
  9. Fjern transfektionsmediet og tilsæt 2 ml suppleret vækstmedium. Placer i inkubator indtil yderligere analyse ( f.eks . 24 timer for qPCR og 48 timer for Western blotting).
    1. Mål ændringer i genekspression ved anvendelse af en række forskellige teknikker, såsom Western blotting 37 og qPCR. 38 For gener med synlige signaler, såsom GFP, brug fluorescensmikroskopi 29 .
      BEMÆRK: Disse teknikker foreslås på grund af deres brugervenlighed og nøjagtighedI kvantificering af genekspression

6. Styring af genslangning i en spatiotemporal måde

  1. Kultur, frø og transfektceller ifølge trin 5.1-5.7.
  2. Forbered en fotomask, der fuldstændig blokerer 365 nm lys og minimerer refleksioner.
    BEMÆRK: I dette tilfælde blev 10 x 10 cm stykker aluminiumsfolie og sort byggepapir brugt til at blokere lyset og reducere refleksioner. Aluminiumsfolie og byggepapir blev limet sammen for at danne en enkelt enhed.
    1. Skær / punch / maskinér den ønskede form i fotomasken. Brug for eksempel et skarpt blad og en hulpuncher til at danne et lige mønster (~ 5 cm langt) og et cirkulært mønster (~ 7 mm diameter) i henholdsvis fotomasken.
  3. Lim fotomasken til bunden af ​​6-brøndspladen med mønsteret centreret under brønden, der indeholder cellerne med den antireflekterende side ( f.eks . Sort cOpbevaringspapir) på pladen. Sørg for, at limen ikke ligger tæt på kanten (indenfor ~ 3 mm) af mønsteret.
  4. Opsæt to ringstativer ca. 25 cm fra hinanden og fastgør en platform til hver ringstand, så platformene er af samme højde. Sæt cellepladen mellem de to stativer op ved at placere pladen på toppen af ​​platformene. Sørg for, at tallerkenen er på niveau.
  5. Bestråle cellerne nedefra prøven for den ønskede (op til 20 min) under anvendelse af UV-laser med en 365 nm-filter ved en intensitet på 200 W / m2.
  6. Fjern transfektionsmediet og tilsæt 2 ml suppleret vækstmedium. Anbring i inkubatoren for at genvinde i mindst 24 timer. Billed cellerne ved hjælp af fluorescensmikroskopi som beskrevet 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter formuleringen af ​​nanocarriererne blev der udført siRNA-frigivelsesassays for at informere bestrålingsbetingelserne, som skal anvendes i in vitro- transfektionerne. Forskellige doser af lys blev påført for at bestemme procenten af ​​siRNA, der blev frigivet. Det første assay anvendte gelelektroforese til adskillelse af de frie siRNA-molekyler fra siRNA-molekylerne, der stadig er kompleksbundet / associeret med polymeren. Nanocarrier, der ikke blev behandlet med lys, forblev stabile og frigjorde ikke noget siRNA. Efterhånden som bestrålingstiden blev forøget steg fluorescensintensiteten af ​​de frie siRNA-bånd. Kvantificering af båndintensiteter ved hjælp af billedanalyseprogrammer viste, at ~ 15% af siRNA blev befriet efter 20 min lys eksponering.

Det andet siRNA-frigivelsesassay anvendte FCS til at måle procenten af ​​siRNA-molekyler, der diffunderede frit i solution. Baseline tællingshastighederne af prøverne indeholdende nanocarriererne, der ikke blev udsat for lys, var de samme som tællehastighederne for blindbufferkontrolprøven, hvilket indikerede, at der ikke var nogen fri siRNA til stede. Baseline tællerne steg, da bestrålingstiden steg. Procenten af ​​fri siRNA blev beregnet og fundet at være i overensstemmelse med målingerne opnået ved gelelektroforese. Generelt var estimaterne fra de to teknikker indenfor fejl af hinanden (p> 0,05 ved Student's t-test) og indikerede, at procentdelen af ​​frigivet siRNA ikke signifikant voksede med mere end 20 min bestråling. Det er vigtigt at bemærke, at gelelektroforese og FCS blev brugt til at kvantificere siRNA-frigivelse, fordi de er lette at bruge, relativt hurtige til at analysere og give præcise resultater.

De relative mængder af siRNA frigivet efter forskellige doser af lys blev indtastet som den oprindelige siRNEn koncentration i den kinetiske model. Som vist i figur 1A blev modellen kørt for at forudsige koncentrationerne af glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase (GAPDH) mRNA, protein og siRNA som en funktion af tiden under hver bestrålingsbetingelse. Model forudsigelserne for GAPDH protein ekspressionsniveauerne var i overensstemmelse med de eksperimentelt bestemte ekspressionsniveauer opnået gennem Western blotting ( Figur 1B ). Især blev niveauet af GAPDH-protein reduceret, da bestrålingstiden steg. Celler, der blev bestrålet i længste tid (20 min) udviste de største ændringer i genekspression fordi større mængder siRNA blev frigivet. Det er vigtigt, at celler, der ikke blev udsat for lys, udviser ingen genknockdown, hvilket indikerer, at nanocarriererne opretholdt dvalen og ikke frigjorde noget siRNA, medmindre det udløses af fotostimulus. Cytotoksicitetsanalyser viste, at NIH / 3T3-cellerneOpretholdt ≥ 90% levedygtighed efter behandling med nanocarriererne og 20 min bestråling 28 .

figur 1
Figur 1 : Kinetiske modelleringsforudsigelser versus eksperimentelt bestemte ændringer i proteinudtryk. ( A ) siRNA-frigivelsesdata opnået fra gelelektroforese blev anvendt til at modulere initialkoncentrationen af ​​siRNA i den kinetiske model. Disse grafer repræsenterer modeludgangen for celler, som modtager 20 min bestråling. ( B ) De relative mængder af siRNA fra hver bestrålingsbetingelse blev indført i den kinetiske model for at forudsige ændringer i proteinekspression. Disse forudsigelser blev sammenlignet med GAPDH protein ekspressionsniveauer opnået fra Western blotting analyser. Resultaterne vises som middelværdien ± standardafvigelsen af ​​dAta opnået fra tre uafhængige prøver. De eksperimentelle data blev genoptrykvist delvist med tilladelse fra reference 29 . Klik her for at se en større version af denne figur.

For at styre gensilring på en spatiotemporal måde blev en fotomask brugt til at begrænse specifikke cellulære populationer til foto-stimulus. Som vist i figur 2 blev GFP-ekspression i celler reguleret rumligt i et cirkulært mønster. Celler, der var beskyttet mod lyset, udviste fluorescensintensiteter, som ikke kunne skelnes fra kontrolprøver, der ikke blev behandlet med siRNA og lys. Imidlertid udviste næsten alle celler i det cirkulære mønster ingen GFP-ekspression, hvilket indikerer effektiv siRNA-frigivelse og genknockdown. Desuden gjorde brugen af ​​lys som en trigger aktiveret genekspression for at være kontrolLedet på cellelængde skalaer.

Figur 2
Figur 2 : Rumlig kontrol over genudsving. NIH / 3T3-celler blev co-transficeret med GFP pDNA-indeholdende lipoplekser og GFP-målretnings-siRNA / mPEG- b -P (APNBMA) nanocarrier. En cirkulær fotomask blev påført før bestråling med 365 nm lys i 20 minutter. Cellerne blev afbildet på et fluorescensmikroskop 48 timer efter transfektion. Den stiplede røde linje repræsenterer fotomaskens kant, og skalaen viser 1 mm. Tilpasset med tilladelse fra reference 29 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er et par trin i den metode, der er særlig kritisk. Ved formulering af nanocarriererne er rækkefølgen af ​​komponenttilsætning og blandingshastighed to vigtige parametre, der påvirker effekten 39 . Denne protokol kræver, at den kationiske komponent, mPEG- b -P (APNBMA), tilsættes til den anioniske komponent, siRNA, dråbevis under vortexing. Afhængig af det totale formuleringsvolumen tager denne blandeproces 3-6 s. For at teste om nanocarriererne blev dannet ordentligt, måles størrelsesfordelingen ved hjælp af en teknik som dynamisk lysspredning. MPEG- b -P (APNBMA) / siRNA nanocarriererne med et N / P forhold på 4 har en gennemsnitlig diameter på ~ 140 nm og polydispersitet på ~ 0,2 28 . Endvidere kan N / P-forholdet varieres for at opnå polyplexer med forskellige størrelser / stabiliteter. Et N / P-forhold på 4 blev valgt i disse undersøgelser, fordi det var det laveste forhold, som muliggjorde fuldstændig sekvestrering og eliMinering af ethidiumbromidfarvning.

En anden kritisk parameter i fremgangsmåden involverer tilsætning af SDS til nanocarrieropløsningerne i siRNA-frigivelsesassays. SDS, et anionisk overfladeaktivt stof, blev anvendt til bedre at simulere intracellulære miljøer indeholdende høje koncentrationer af lipidmembraner og polyanioner 29 , 40 . S / P-forholdet skal være tilstrækkeligt højt til at efterligne overfladen af ​​anioniske lipider, der er til stede i celler, men ikke så stor, at nanocarriererne adskilles før fotostimuleringen og yderligere analyser. En række S / P-forhold bør testes ved hjælp af gelelektroforese for at identificere den maksimale mængde SDS, der kan tilsættes uden at frigive siRNA. Denne protokol anvendte et forholdsvis højt S / P-forhold på 15.

En potentiel begrænsning af denne metode er relateret til den kinetiske modellering. Modellen kræver input af mRNA og proteinhalveringstider for genet af interesse. TurnovEr satser for gener, der har været godt undersøgt, findes i litteraturen; Disse oplysninger er dog ikke tilgængelige for alle gener. For at omgå dette problem kan halveringstider for lignende gener findes i litteraturen for at tilvejebringe estimater. Alternativt kan omsætningsraten for det specifikke gen af ​​interesse bestemmes eksperimentelt 36 . Det er også vigtigt at bemærke, at oplysninger for tusindvis af gener kan findes i kompilerede datasæt 41 .

En anden vigtig parameter i denne metode er celletype. NIH / 3T3 fibroblaster blev anvendt i disse undersøgelser som en modelcellelinie, fordi de er blevet grundigt undersøgt, lette at arbejde med og kan anvendes til en række regenerative medicinapplikationer. Protokollen kan dog anvendes til andre celletyper af interesse. Nanocarrierformuleringen må muligvis optimeres for den specifikke celletype.

Sammenfattende, denne metode enOverholder den hurtige bestemmelse af bestrålingsbetingelser for at spatiotemporalt styre siRNA-frigivelse og forudsige gen-silencing a priori . Denne metode ville let kunne tilpasses til andre fotoresvarlige nukleinsyreafgivelsessystemer. For eksempel kan mPEG- b -P (APNBMA) -polymererne modificeres ved at indstille bloklængderne og / eller funktionelle dele for at skræddersy nanokarrierernes 42 følsomme opførsel. Anvendelse af denne protokol vil bidrage til at belyse struktur-funktionsforholdene der styrer nanocarrierens stabilitet og effektivitet. Disse mekaniske indsigter kan muliggøre applikationer i regenerativ medicin, der kræver spatiotemporal kontrol over gentympning. På grund af den iboende penetrationsdybde på 365 nm lys i vandige væv er disse formuleringer også velegnede til behandling af sygdomme manifesteret på legemsoverfladen, såsom hudkræft og topiske sår.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (NIH) for økonomisk støtte gennem en institutionel udviklingspris (IDeA) under tildelingsnummer P20GM103541 samt tildelingsnummer P20GM10344615. Udtalelserne heri afspejler ikke NIH's synspunkter. Vi anerkender også Delaware Biotechnology Institute (DBI) og Delaware Economic Development Office (DEDO) for økonomisk støtte gennem Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -prisen (12A00448).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
siRNA Sigma-Aldrich SIC001 non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA) synthesized in our lab N/A photo-responsive polymer
HEPES Fisher Scientific BP310-100
sodium dodecyl sulfate  Sigma-Aldrich 436143
rubber gasket McMaster-Carr 3788T21 0.5 mL thick
UV laser  Excelitas Technologies Omnicure S2000 collimating lens and 365 nm filter used
agarose Fisher Scientific BP160-100
ethidium bromide Fisher Scientific BP1302-10
siRNA labelled with Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. custom order fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer Life Technologies S24735 double-sided adhesive
LSM 780  Carl Zeiss N/A confocal microscope
ZEN 2010 Carl Zeiss N/A FCS analysis software
MATLAB MathWorks N/A programming language
NIH/3T3 cells  ATCC ATCC CRL-1658
DMEM Mediatech 10-013-CV growth media
fetal bovine serum Mediatech 35-011-CV heat-inactivated
penicillin-streptomycin Mediatech  30-002-CI
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
Opti-MEM Life Technologies 11058021 transfection media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
  3. Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
  4. Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
  5. Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
  6. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  7. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  8. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
  9. Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
  11. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
  12. Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
  13. Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
  14. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
  17. Li, H. -J., Wang, H. -X., Sun, C. -Y., Du, J. -Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
  18. Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
  21. Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
  22. Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
  23. Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
  24. Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
  25. Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
  26. Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
  27. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
  28. Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
  29. Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
  30. Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
  31. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
  35. Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
  36. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
  39. Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
  40. Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
  41. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  42. Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).

Tags

Bioengineering udgave 125 Polyplex kinetisk modellering blokcopolymer nukleinsyrefrigivelse fluorescenskorrelationsspektroskopi cellepatrering RNAi lysfølsom
Forudsigelse af gensvulmning gennem spatiotemporal kontrol af siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greco, C. T., Epps, III, T. H.,… More

Greco, C. T., Epps, III, T. H., Sullivan, M. O. Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers. J. Vis. Exp. (125), e55803, doi:10.3791/55803 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter