Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55803
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

Summary

We presenteren een nieuwe methode die foto-responsieve blokcopolymeren gebruikt voor efficiëntere spatiotemporale controle van gen-stilzetting zonder detecteerbare off-target effecten. Bovendien kunnen veranderingen in genuitdrukking voorspeld worden door middel van straightforward siRNA release analyses en eenvoudige kinetische modellering.

Abstract

Nieuwe materialen en methoden zijn nodig om de binding beter te beheersen tegen nucleïnezuren vrij voor een breed scala aan toepassingen die de nauwkeurige regulering van de genactiviteit vereisen. In het bijzonder zouden nieuwe stimuli-responsieve materialen met verbeterde spatiotemporale controle over genexpressie transplanteerbare platforms in drug ontdekking en regeneratieve geneeskunde technologieën ontgrendelen. Bovendien zou een verbeterd vermogen om het nucleïnezuur uit materialen controle van de ontwikkeling van gestroomlijnde behandelingswijzen Nanodrager werkzaamheid voorspellen a priori leidt tot versnelde screening van bestelwagens. Hierin presenteren we een protocol voor het voorspellen van genstartingsefficiënties en het bereiken van spatiotemporale controle over genuitdrukking door middel van een modulair fotoresponsief nanocarrier systeem. Kleine interfererende RNA (siRNA) wordt gecomplexeerd met mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxy) -2-nitrobenzylmethacrylaat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymeren omRm stabiele nanocarriers die met licht kunnen worden gecontroleerd om afstembare, on / off siRNA release te vergemakkelijken. We beschrijven twee complementaire analyses die fluorescentiecorrelatie spectroscopie en gelelektroforese gebruiken voor de nauwkeurige kwantificering van siRNA-vrijlating uit oplossingen die intracellulaire omgevingen nabootsen. Informatie verkregen uit deze analyses werd geïncorporeerd in een simpel RNA interferentie (RNAi) kinetisch model om de dynamische silencing responsen te voorspellen op verschillende foto-stimulusomstandigheden. Op zijn beurt hebben deze geoptimaliseerde bestralingsomstandigheden het mogelijk gemaakt om een ​​nieuw protocol te vergemakkelijken voor het spatiotemporaal regelen van gensturing. Deze methode kan cellulaire patronen genereren in gen expressie met cel-naar-cel resolutie en geen detecteerbare off-target effecten. Samenvattend biedt onze aanpak een makkelijk te gebruiken methode voor het voorspellen van dynamische veranderingen in genuitdrukking en nauwkeurige controle van siRNA-activiteit in ruimte en tijd. Deze reeks assays kunnen gemakkelijk aangepast worden om een ​​grote verscheidenheid van ot te testenHaar stimuli-responsieve systemen om belangrijke uitdagingen aan te pakken die betrekking hebben op een groot aantal toepassingen in biomedisch onderzoek en medicijnen.

Introduction

Kleine interfererende RNA's (siRNAs) bemiddelen na transcriptie gen door middel van een katalytische RNAi-weg die zeer specifiek, krachtig en afwisselend is voor vrijwel elk doelgen 1 . Deze veelbelovende eigenschappen hebben de werking van siRNA-therapeutica in menselijke klinische proeven mogelijk gemaakt voor de behandeling van talrijke aandoeningen, waaronder metastatisch melanoom en hemofilie 2 , 3 . Er bestaan ​​echter belangrijke leveringsproblemen die de vertaling hebben belemmerd 4 . In het bijzonder moeten leveringsvoertuigen stabiel blijven en siRNAs beschermen tegen extracellulaire afbraak, maar ook de lading in de cytoplasma 5 vrijlaten. Bovendien vereisen veel RNAi-toepassingen verbeterde methoden voor het regelen van gensweergave in ruimte en tijd 6 , die bijwerkingen in siRNA-therapeutica 7 zullen verminderen en transformatieve aDvances in toepassingen variërend van celmicroarrays voor geneesmiddelontdekking 8 tot modulatie van celreacties in regeneratieve steigers 9 . Deze uitdagingen wijzen op de behoefte aan nieuwe materialen en methoden om de binding tegen vs. vrijgave in siRNA nanocarriers beter te beheersen.

Een van de meest veelbelovende strategieën voor het regelen van siRNA-vrijlating en het verbeteren van spatiotemporale regulering is het gebruik van stimuli-responsieve materialen 10 . Bijvoorbeeld, een grote verscheidenheid aan biomaterialen zijn ontworpen met veranderbare nucleïnezuurbindingsaffiniteit in reactie op veranderd redoxpotentiaal of pH, of toegepaste magnetische velden, echografie of licht 11 . Hoewel veel van deze systemen verbeterde controle tonen op nucleïnezuuractiviteit, is het gebruik van licht als een trigger bijzonder gunstig door zijn onmiddellijke temporele respons, nauwkeurige ruimtelijke resolutie en gemak van afstelbaarheid 13 , 14 , 15 . Foto-responsieve siRNA nanocarriers zijn ideaal om deze nadelen te overwinnen en bieden een eenvoudiger en robuuste aanpak om de genuitdrukking 16 , 17 , 18 op een spatiotemporale wijze te moduleren. Helaas blijven methoden om het resulterende eiwit-knockdown-reactie nauwkeurig voor te stellen, onduidelijk.

Een belangrijke uitdaging is dat kwantitatieve evaluaties van siRNA release zijnZeldzaam 19 , 20 , en zelfs wanneer deze evaluaties worden uitgevoerd, zijn ze niet gekoppeld aan analyses van de dynamiek van siRNA / eiwitomvang. Zowel de hoeveelheid siRNA vrijgegeven als zijn persistentie / levensduur zijn belangrijke determinanten van de resulterende gendempingsdynamiek; Derhalve is een gebrek aan dergelijke informatie een belangrijke ontkoppeling die precieze nauwkeurige voorspelling van dosisrespons in RNAi 21 voorkomt. Aanpakken van deze uitdaging zou de formulering van de passende structuur-functie relaties in nanocarriers en beter biomaterialen ontwerpen 22 versnellen. Bovendien zouden dergelijke benaderingen de ontwikkeling van effectievere siRNA-doseringsprotocollen mogelijk maken. In een poging om de dynamische stilzettingsrespons te begrijpen, hebben verschillende groepen wiskundige modellen van RNAi 23 , 24 , 25 onderzocht. Deze kaders warenSuccesvol in het verstrekken van inzichten in siRNA-gemedieerde veranderingen in genuitdrukking en het identificeren van snelheidsbeperkende stappen 26 . Deze modellen zijn echter alleen toegepast op commerciële genleveringssystemen ( bijvoorbeeld lipofectamine en polyethylenimine (PEI)) die niet in staat zijn de gecontroleerde siRNA-vrijlating te verzekeren, en de complexiteit van de modellen heeft hun nut 27 ernstig beperkt. Deze tekortkomingen wijzen op een onvervulde behoefte aan nieuwe materialen die in staat zijn om nauwkeurig afstelbare siRNA-vrijlating gecombineerd met gestroomlijnd en makkelijk te gebruiken voorspellende kinetische modellen.

Onze methode behandelt al deze uitdagingen door de integratie van een lichtgevoelig nanocarrier platform met gekoppelde methoden om de gratis siRNA- en model RNAi-dynamiek te kwantificeren. In het bijzonder wordt de nauwkeurig gecontroleerde siRNA-versie 28 van ons platform gecontroleerd door twee complementaire methoden voor het nauwkeurig kwantificeren van ingekapseld vs. unGebonden siRNA. De experimentele gegevens uit deze analyses worden ingevoerd in een simpel kinetisch model om de efficiëntie van de genen te voorspellen a priori 29 . Tenslotte wordt de on / off-aard van de nanocarrieren gemakkelijk uitgebuit om celpatronen te genereren in de gen expressie met ruimtelijke controle op de cellulaire lengte schaal. Zo biedt deze methode een gemakkelijk aan te passen methode voor het beheersen en voorspellen van gensweergave in een verscheidenheid aan toepassingen die zouden profiteren van spatiotemporale regulering van celgedrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Formulering van siRNA nanocarriers

  1. Bereid afzonderlijke oplossingen van siRNA en mPEG- b -P (APNBMA) op met gelijke volumes verdund in 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) buffer bij pH 6,0.
    1. Voeg siRNA toe bij een concentratie van 32 μg / ml tot 20 mM HEPES-oplossing.
      OPMERKING: Het siRNA was een niet-gerichte, universele negatieve controle sequentie; De siRNA kan echter worden ontworpen om elk gen van belang te richten.
    2. MPEG- b -P (APNBMA) polymeren oplossen in een 20 mM HEPES-oplossing. Voeg een passende hoeveelheid mPEG- b -P (APNBMA) toe om een ​​220 μg / ml oplossing te maken zodat de N / P-verhouding (N, aminegroepen op mPEG- b -P (APNBMA), P-, fosfaatgroepen op siRNA) Is 4.
      OPMERKING: Het synthetische protocol voor de mPEG- b -P (APNBMA) polymeren wordt elders 30 vermeld .
  2. Voeg de mPEG- b -P (APNBMA) -oplossing druppelsgewijs toe aan een gelijke hoeveelheidE van de siRNA-oplossing, terwijl u zachtjes op een vortex-machine mengt. Ga door tot 30-vortex gedurende 30 seconden. Incubeer de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

2. Meten van siRNA Release Met Gel Elektroforese

  1. Formuleer de nanocarriers volgens stappen 1.1-1.2 en schaal de volumes om het aantal gewenste monsters in te nemen.
  2. Meng de nanocarrier met natriumdodecylsulfaat (SDS).
    1. Bereid een 1 mg / ml oplossing van SDS in water. Deel de hoeveelheid SDS-oplossing die nodig is om oplossingen te produceren met een S / P-verhouding (S, sulfatengroepen op SDS, P, fosfaatgroepen op siRNA) van 15.
      OPMERKING: Als de polyplexoplossing 1 μg siRNA bevat, moet 13 μg SDS worden toegevoegd om een ​​S / P-verhouding van 15 te bereiken.
    2. Voeg de SDS-oplossing druppelsgewijs toe aan elke nanocarrieroplossing terwijl u zachtjes op een draaikolk mengt. Ga na 30 tot 30 werveling na SDS-toevoeging.
  3. Kalibreren en installeer een UV-laser met een 365 nm filter tot een intensiteit van 200 W / m. Zorg ervoor dat de lichtintensiteit wordt gemeten op de plaats waar de bodem van de monsteroplossing zit.
  4. Laad de nanocarrier / SDS oplossing in een glazen kamer, bestaande uit glazen glijbanen gescheiden door een rubberen pakking.
    1. Voorwasfilters in een 7: 3 (v / v) ethanol / wateroplossing in water en droog volledig. Knip een gat (~ 2 x 3 cm rechthoek) in een rubberen afdichting. Plaats de rubberen afdichting op een glazen glijbaan.
    2. Pipetteer de nanocarrier / SDS oplossing op de glazen glijbaan in het gat van de rubberen afdichting. Loop een overtollige oplossing (20 μL in overschot) op de glazen glijbaan terwijl u contact met de rubberen afdichting vermijdt.
      OPMERKING: Sommige vloeistoffen zullen verloren gaan tijdens de volgende stappen.
    3. Plaats het tweede glasGlijd bovenop de dia-pakking. Om luchtbellen generatie te vermijden, plaats het ene uiteinde van de dia eerst en laat het andere einde langzaam zakken.
    4. Bevestig de binderclips aan elke kant van de glazen kamer om deze te houden.
  5. Bestral de monsters voor de gewenste tijdsduur ( bijv . 0-60 min) met behulp van de UV laser met een 365 nm filter met een intensiteit van 200 W / m. Verwijder de binderclips en open de kamer.
  6. Pipette 25 μL van de bestraalde nanocarrier / SDS monsters in een microcentrifugebuis. Incubeer de oplossingen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  7. Bereid een 2 gew.% Agarosegel voorverfd met 0,5 μg / ml ethidiumbromide in Tris / Borate / EDTA (TBE) gebufferde oplossing volgens standaardprotocollen 31 . Bereid een laadbuffer op die bestaat uit 3: 7 (v / v) glycerol / water.
  8. Voeg 5 μl van de laadbufferoplossing toe aan 25 μl van elk monster van nanocarrier / SDS. Incubeer de monsters in het donker bijKamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  9. Loop 30 μl van elk nanocarrier / SDS monster in de 2% agarosegel. Loop de gel in het donker bij 100 V gedurende 30 minuten. Afbeelding van de gel met behulp van een gelafbeelding systeem met ethidiumbromide filters. Sla de gelafbeeldingsbestanden op en ga verder naar stap 2.10 voor bandintensiteitskwantificatie. Zorg ervoor dat de bandintensiteiten helder genoeg zijn om duidelijk zichtbaar te maken maar niet te helder dat de signalen verzadigd zijn.
  10. Bepaal de bandintensiteiten met behulp van openbaar beschikbare ImageJ-software 32 .
    1. Met behulp van het ROI-instrument van ImageJ bepaalt u de fluorescentie-intensiteit van de vrije siRNA-banden in elke baan door een rechthoek rond elke band te tekenen. Bepaal de intensiteitskurven van elke baan en integreer het gebied onder de krommen door een horizontale lijn over de intensiteitskurven te tekenen en de tracerstaaf in de bijgevoegde gebieden te klikken.
    2. Bereken de relatieve intensiteit van elke baan door het gebied onder de cu te verdelenRve van elk monster door het gebied onder de curve van de siRNA positieve controle (geen mPEG- b -P (APNBMA) toegevoegd en geen SDS toegevoegd). Meld het percentage siRNA dat wordt vrijgegeven als de genormaliseerde bandintensiteit van elk monster.

3. Meten van siRNA Release Met Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

  1. Verkrijg siRNA gemerkt met een enkele fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de sense streng.
    OPMERKING: De siRNA kan vooraf worden aangekocht met de labels die op de gewenste locatie zijn geconjugeerd. De fluorofoor moet fotostabiel zijn en absorberen / emitteren tussen 450 en 750 nm om UV-lichtstopping en energieoverdracht met mPEG- b -P (APNBMA) te vermijden.
  2. Formuleer de nanocarriers volgens stappen 1.1-1.2 onder gebruikmaking van het gelabelde siRNA. Schaal de volumes om het aantal gewenste monsters in te vullen.
  3. Incubeer de oplossingen in SDS en irradiateer voor de gewenste tijdsduur volgens stappen 2.2-2.6.
  4. VoorbereiAtion van FCS monster kamer.
    1. Was een glazen glijbaan met een 7: 3 (v / v) ethanol / wateroplossing en droog het glas volledig met behulp van een veeg en een luchtstroom.
    2. Verwijder de stukken papier uit een dubbelzijdige kleefruimte om de dubbelzijdige kleefafstand te openen. Bevestig de spacer op een glazen deklip.
    3. Pipet de nanocarrier / SDS-oplossing op de afdekplaat in het midden van het gat van de kleefruimte.
    4. Plaats de glazen glijbaan bovenop de deklaag. Druk op de glazen glijbaan om ervoor te zorgen dat de glazen glijbaan en de deksel goed bevestigd zijn en een afdichting vormen.
  5. Gebruik een confocale microscoop voor FCS-metingen 33 . Gebruik een 40x waterdempende apochromat objectief met een numerieke diafragma van 1,2. Gebruik het desbetreffende excitatie laser kanaal (488 nm) om minstens 30 metingen van 10 s per monster 34 te verzamelen . Zorg ervoor dat de laserintensiteit en detector uitlijning blijvenHetzelfde voor elk monster.
    1. Naast de experimentele monsters meet de controles, waaronder: een blanco monster zonder gemerkt siRNA; En een gratis siRNA monster met gelabelde siRNA maar geen mPEG- b -P (APNBMA).
  6. Analyseer de gegevens met behulp van FCS-specifieke software. Identificeer de baseline telling snelheid van elk monster door het vaststellen van de stabiele tellernelheid gedurende een tijd wanneer geen nanocarriers door het confocale volume 29 passeren.
    1. Trek de tellerfrequentie van het blanco monster af van elke waarde van de basiswaarde van de steekproef. Normaliseer de resulterende waarden naar de vrije siRNA controle om het percentage vrije siRNA 35 te berekenen.

4. Kinetische Modellering om Gene Silencing te voorspellen

  1. Maak scripts in een wiskundige programmeertaal door gebruik te maken van de eenvoudige set van gewone differentiaalvergelijkingen om gensweergave 2 te voorspellen9.
    OPMERKING: Scripts kunnen op aanvraag ter beschikking worden gesteld.
    1. Schrijf de set van gewone differentiaalvergelijkingen als:
      Vergelijking 1 (1)
      Vergelijking 2 (2)
      Vergelijking 3 (3)
      OPMERKING: Voor vergelijkingen 1-3 zijn de termen k mRNA , k siRNA en k prot de snelheidskonstanten voor respectievelijk de productie van mRNA, siRNA en eiwit. De termen km, deg , ks , deg en kp , deg zijn de snelheidskonstanten voor respectievelijk de afbraak van mRNA, siRNA en respectievelijk eiwit. Degradation rate constants worden berekend aan de hand van de halveringstijden van de componenten, en productie-constante constante zijn geschikt om te waarborgen dat de mRNA en eiwit steady state waarden zijn bereikt in afwezigheid oF siRNA.
      1. Bepaal de halfwaardetijd van het mRNA en het eiwit voor het gen (en) van belang, ofwel experimenteel zoals beschreven in referentie 36 of uit de literatuur (zie de discussie ). Bepaal ook de verdubbelingstijd voor de cellijn. Voer deze waarden in de juiste afdruksnelheidsuitdrukkingen in.
      2. Stel de productie-snelheid constanten zodanig in dat de genuitdrukkingsniveaus stabiel blijven tegen een genormaliseerde waarde van 100 indien er geen siRNA wordt geïntroduceerd. Specifiek, stel [siRNA] op nul en verander de waarden van het k mRNA , k siRNA en k prot productie snelheid constanten tot [mRNA] en [eiwit] binnen 1% van de initiële genormaliseerde waarde van 100% blijven gedurende de duur van De simulatie.
      3. Met behulp van de relatieve hoeveelheden siRNA die vrijkomen uit de eerder beschreven gelelektroforese en FCS-assays als schattingen, pas de initiële relatieve concentratie van siRNA in het script aan. Specifiek, varieer [siRNA] evenredig zijn aan de relatieve hoeveelheid vrijgegeven siRNA, met een waarde van 100 die overeenkomt met de maximale hoeveelheid 29 .

5. Celcultuur en In Vitro siRNA Levering

  1. Cultuur NIH / 3T3 murine embryonale fibroblasten volgens de protocollen van de leverancier.
    1. Groei de cellen in groeimedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runder serum en 1% penicilline streptomycine). Bewaar de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving met 5% CO 2 .
  2. Zaad de cellen in behandelde platen met 6 putjes.
    1. Volg de aanbevolen subculturing procedure van de leverancier. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Verdun de cellen in aangevulde groeimedia tot een concentratie van 75.000 cellen / ml.
    2. Voeg 2 ml cel suspensie (75.000 celS / ml) aan elke putje van de 6-putjesplaat. Laat de cellen 24 uur in de incubator hangen en herstellen.
  3. Bereid de cellen voor transfectie door te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 1,5 ml serum- en antibiotica-vrij transfectiemedium (zie de tabel van materialen ) toe aan elke put.
  4. Formuleer de siRNA nanocarriers volgens stappen 1.1-1.2. Voeg 25 μL nanocarrier oplossing die 30 pmol siRNA bevat aan elke put. Zet de media voorzichtig op en neer om te mengen. Plaats de cellen in de incubator gedurende 3 uur.
  5. Verwijder het transfectiemedium en wasser elke put met PBS. Voeg 1 ml aangevulde groei media toe en plaats de cellen in de incubator om gedurende 30 minuten te herstellen.
  6. Om de cellen voor behandeling met een foto-stimulus te bereiden, verwijder de aangevulde groeimedia. Voeg 1 ml transfectiemedia (zonder fenolrood) toe aan elke put.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de transfectiemedia niet fenol rood bevat.
  7. Kalibreren en installeer een UV-laser met een 365 nm filter tot een intensiteit van 200 W / m. Zorg ervoor dat de lichtintensiteit wordt gemeten van de plaats waar de bodem van de celplaat zit.
  8. Plaats de cellen op een kookplaat op 37 ° C. Verwijder de plaatdeksel van de cellen. Bestral de cellen van boven de plaat voor de gewenste tijd (tot 20 minuten) door gebruik te maken van de UV-laser met een 365 nm filter bij een intensiteit van 200 W m -2 .
  9. Verwijder de transfectie media en voeg 2 ml aangevulde groei media toe. Plaats in incubator tot verdere analyse ( bijv . 24 uur voor qPCR en 48 uur voor Western blotting).
    1. Meet veranderingen in genuitdrukking met behulp van een verscheidenheid aan technieken zoals Western blotting 37 en qPCR. 38 Voor genen met zichtbare signalen, zoals GFP, gebruik fluorescentiemicroscopie 29 .
      OPMERKING: Deze technieken worden voorgesteld door hun gebruiksgemak en nauwkeurigheidBij het kwantificeren van genuitdrukking

6. Besturing van genen in een Spatiotemporale Manier

  1. Cultuur, zaad en transfectiecellen volgens stappen 5.1-5.7.
  2. Bereid een fotomasker dat 365 nm licht helemaal blokkeert en reflecties minimaliseert.
    OPMERKING: in dit geval werden 10 x 10 cm aluminiumfolie en zwart bouwpapier gebruikt om het licht te blokkeren en respectievelijk de reflecties te verminderen. De aluminiumfolie en het bouwpapier werden gelijmd om een ​​enkele eenheid te vormen.
    1. Knip / punch / machine de gewenste vorm in de fotomasker. Gebruik bijvoorbeeld een scherp mes en een gatpuncher om een ​​rechte lijnpatroon (~ 5 cm lang) en een cirkelvormige patroon (~ 7 mm diameter) in respectievelijk fotomask te vormen.
  3. Plak de fotomasker aan de onderkant van de 6-putjesplaat met het patroon dat onder de put ligt, die de cellen bevat met de anti-reflecterende kant ( bijvoorbeeld zwart cOpbouwpapier) naar de plaat gericht. Zorg ervoor dat de lijm niet dicht bij de rand (binnen ~ 3 mm) van het patroon wordt geplaatst.
  4. Stel twee ringstandjes ongeveer 25 cm uit elkaar en bevestig een platform aan elke ringstand zodat de platforms van gelijke hoogte zijn. Schuif de celplaat tussen de twee standen door de plaat bovenop de platforms te rusten. Zorg ervoor dat de plaat gelijk is.
  5. Bestral de cellen van onder het monster voor de gewenste tijd (tot 20 minuten) door gebruik te maken van de UV laser met een 365 nm filter met een intensiteit van 200 W / m 2 .
  6. Verwijder de transfectie media en voeg 2 ml aangevulde groei media toe. Plaats in de incubator om gedurende ten minste 24 uur te herstellen. Afbeelding van de cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie zoals beschreven 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na de formulering van de nanocarrieren werden siRNA release analyses uitgevoerd om de bestralingsomstandigheden te informeren die gebruikt zouden worden in de in vitro transfecties. Verschillende doseringen van licht werden toegepast om het percentage van siRNA te bepalen dat werd vrijgegeven. In de eerste analyse werd gelelektroforese gebruikt om de vrije siRNA moleculen te scheiden van de siRNA moleculen die nog steeds gecomplexeerd / geassocieerd met het polymeer. Nanocarriers die niet met licht werden behandeld bleven stabiel en liet geen siRNA vrij. Naarmate de duur van de bestralingstijd toeneemt, is de fluorescentie-intensiteit van de vrije siRNA-bands verhoogd. Kwantificering van de bandintensiteiten met behulp van beeldanalysesoftware demonstreerde dat ~ 15% van het siRNA werd bevrijd na 20 minuten lichtbelichting.

De tweede siRNA release test gebruikte FCS om het percentage siRNA moleculen te meten die vrij in diffusie verspreidenution. De baseline tellingen van de monsters die de nanocarrieren bevatten die niet aan licht werden blootgesteld, waren hetzelfde als de tellingen van het blanco buffer controle monster, wat aangeeft dat er geen gratis siRNA aanwezig was. De baseline tellen kwamen toen de bestralingstijd nam toe. Het percentage vrije siRNA werd berekend en bleek in overeenstemming te zijn met de metingen verkregen uit gelelektroforese. Over het algemeen waren de schattingen van de twee technieken binnen de fout van elkaar (p> 0,05 door de student's t-test) en bleek dat het percentage uitgesteld siRNA niet significant toenam met meer dan 20 minuten bestraling. Het is belangrijk om op te merken dat gelelektroforese en FCS werden gebruikt om de siRNA-vrijgave te kwantificeren, omdat ze makkelijk te gebruiken zijn, relatief snel analyseren en nauwkeurige resultaten leveren.

De relatieve hoeveelheden siRNA vrijgegeven na verschillende doseringen van licht werden ingevoerd als de initiële siRNEen concentratie in het kinetische model. Zoals getoond in Figuur 1A , werd het model uitgevoerd om de concentraties glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) mRNA, eiwit en siRNA te voorspellen als een functie van de tijd onder elke bestralingsconditie. De modelvoorspellingen voor de GAPDH-eiwituitdrukkingsniveaus waren in overeenstemming met de experimenteel bepaald expressieniveaus verkregen door Western blotting ( Figuur 1B ). In het bijzonder daalde het niveau van GAPDH-eiwit afgenomen als de bestralingstijd nam toe. Cellen die gedurende de langste periode (20 min) bestraald werden, vertoonden de grootste veranderingen in genuitdrukking omdat grotere hoeveelheden siRNA werden vrijgegeven. Belangrijk is dat cellen die niet aan licht blootgesteld werden, geen genverschuiving vertoonden, wat aangeeft dat de nanocarrieren dormancy handhaafden en geen siRNA vrijgegeven, tenzij geactiveerd door de fotostimulus. Cytotoxiciteitsbepalingen aangetoond dat de NIH / 3T3-cellenBehouden ≥ 90% levensvatbaarheid na behandeling met nanocarriers en 20 min bestraling 28 .

Figuur 1
Figuur 1 : Kinetische Modellering Voorspellingen vs Experimenteel Bepaalde Wijzigingen In Proteïne Expressie. ( A ) siRNA-vrijgegeven data verkregen uit gelelektroforese werden gebruikt om de initiële concentratie van siRNA in het kinetische model te moduleren. Deze grafieken vertegenwoordigen de modeluitvoer voor cellen die 20 minuten bestraling ontvangen. ( B ) De relatieve hoeveelheden siRNA uit elke bestralingsconditie werden ingevoerd in het kinetische model om veranderingen in eiwituitdrukking te voorspellen. Deze voorspellingen werden vergeleken met GAPDH eiwit expressie niveaus verkregen uit Western blotting analyses. Resultaten worden weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking van dAta verkregen uit drie onafhankelijke monsters. De experimentele gegevens werden gedeeltelijk herdrukt met toestemming van referentie 29 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de gensturing op een spatiotemporale wijze te controleren, werd een fotomask gebruikt om specifieke cellulaire populaties te beperken tot de fotostimulus. Zoals getoond in Figuur 2 , werd GFP expressie in cellen ruimtelijk gecontroleerd in een cirkelvormig patroon. Cellen die beschermd waren tegen het licht, vertoonden fluorescentie-intensiteiten die niet onderscheiden waren van controlemonsters die niet werden behandeld met siRNA en licht. Echter, bijna alle cellen in het cirkelvormige patroon vertoonden geen GFP expressie, wat een efficiënte siRNA release en gen knockdown aangeeft. Bovendien heeft het gebruik van licht als trigger geactiveerde genexpressie om controle te krijgenGeleid op cellulaire lengte schalen.

Figuur 2
Figuur 2 : Ruimtelijke controle over genslamming. NIH / 3T3-cellen werden gecotransfecteerd met GFP pDNA-bevattende lipoplexen en GFP-targetende siRNA / mPEG- b -P (APNBMA) nanocarriers. Een cirkelvormig fotomasker werd voorafgaand aan bestraling toegediend met 365 nm licht gedurende 20 minuten. De cellen werden afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop 48 uur na transfectie. De gestippelde rode lijn vertegenwoordigt de rand van het fotomasker, en de schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Aangepast met toestemming van referentie 29 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn een paar stappen in de methode die bijzonder kritisch zijn. Bij de formulering van de nanocarrieren zijn de volgorde van componenttoevoeging en mengsnelheid twee belangrijke parameters die effectiviteit beïnvloeden 39 . Dit protocol vereist dat de kationische component, mPEG- b -P (APNBMA), op druppelsgewijze wijze wordt toegevoegd aan het anionische bestanddeel, siRNA tijdens het vortexeren. Afhankelijk van het totale formuleringsvolume duurt dit mengproces 3-6 s. Om te testen of de nanocarriers goed werden gevormd, meet de grootteverdeling met behulp van een techniek zoals dynamische lichtverspreiding. De mPEG- b -P (APNBMA) / siRNA nanocarriers met een N / P-verhouding van 4 hebben een gemiddelde diameter van ~ 140 nm en polydispersiteit van ~ 0,2 28 . Bovendien kan de N / P verhouding worden gevarieerd om polyplexen te verkrijgen met verschillende maten / stabiliteiten. Een N / P verhouding van 4 werd gekozen in deze studies omdat het de laagste verhouding was die volledige sequestratie en eli mogelijk maakteMinering van ethidiumbromide kleuring.

Een andere kritische parameter in de werkwijze omvat het toevoegen van SDS aan de nanocarrier oplossingen in de siRNA release analyses. SDS, een anionische oppervlakteactieve stof, werd gebruikt om intracellulaire omgevingen beter te simuleren met hoge concentraties lipide membranen en polyanionen 29 , 40 . De S / P-verhouding moet voldoende hoog zijn om de overvloed aan anionische lipiden die aanwezig zijn in cellen te mimmen, maar niet zo groot dat de nanocarriers zich voor de fotostimulatie en verdere analyses demonteren. Een reeks S / P-verhoudingen moet worden getest met behulp van gelelektroforese om de maximale hoeveelheid SDS te identificeren die kan worden toegevoegd zonder dat siRNA vrijkomt. Dit protocol gebruikte een relatief hoge S / P verhouding van 15.

Een mogelijke beperking van deze methode is gerelateerd aan de kinetische modellering. Het model vereist de invoer van mRNA en eiwithalfwaardetijd van het gen van belang. TurnovEr zijn tarieven voor genen die goed bestudeerd zijn in de literatuur; Deze informatie is echter mogelijk niet beschikbaar voor alle genen. Om dit probleem te omzeilen, kunnen de halveringstijden van soortgelijke genen in de literatuur worden gevonden om schattingen te verstrekken. Als alternatief kunnen de omzetcijfers voor het specifieke gen van belang worden experimenteel bepaald 36 . Het is ook belangrijk om op te merken dat informatie voor duizenden genen kan worden gevonden in gecompileerde datasets 41 .

Een andere belangrijke parameter in deze methode is celtype. NIH / 3T3 fibroblasten werden in deze studies gebruikt als modelcellijn omdat ze uitgebreid bestudeerd zijn, makkelijk mee te werken zijn en van toepassing zijn op een aantal regeneratieve medicijntoepassingen. Het protocol kan echter toegepast worden op andere celtypen van belangstelling. De formulering van nanocarrier moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor het specifieke celtype.

Samenvattend, deze methode enStaat voor de snelle bepaling van bestralingsomstandigheden om de siRNA-vrijgave op een tijdelijke wijze te beheersen en voorafgaand aan het genen van de genen te voorspellen. Deze werkwijze zou gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere foto-responsieve nucleïnezuurafgifte systemen. Bijvoorbeeld kunnen de mPEG- b (APNBMA) polymeren worden gemodificeerd door de bloklengten en / of functionele delen te stemmen om het fotogevoelige gedrag van de nanocarriers 42 aan te passen . Het gebruik van dit protocol zou helpen om de structuur-functie relaties te bepalen die de stabiliteit en werkzaamheid van nanocarrier beïnvloeden. Deze mechanistische inzichten kunnen toepassingen in regeneratieve medicijnen mogelijk maken die spatiotemporale controle vereisen over het genen van de genen. Bovendien, door de inherente penetratiediepte van 365 nm licht in waterige weefsels, zijn deze formuleringen goed geschikt voor de behandeling van ziekten die op het lichaamsoppervlak worden gemanifesteerd, zoals huidkanker en topische wonden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedanken het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (NIH) voor financiële steun via een Institutions Development Award (IDeA) onder subsidienummer P20GM103541 en subsidie ​​nummer P20GM10344615. De uitspraken hierin weerspiegelen niet de standpunten van de NIH. We erkennen ook het Delaware Biotechnology Institute (DBI) en het Delaware Economic Development Office (DEDO) voor financiële ondersteuning via het Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) award (12A00448).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
siRNA Sigma-Aldrich SIC001 non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA) synthesized in our lab N/A photo-responsive polymer
HEPES Fisher Scientific BP310-100
sodium dodecyl sulfate  Sigma-Aldrich 436143
rubber gasket McMaster-Carr 3788T21 0.5 mL thick
UV laser  Excelitas Technologies Omnicure S2000 collimating lens and 365 nm filter used
agarose Fisher Scientific BP160-100
ethidium bromide Fisher Scientific BP1302-10
siRNA labelled with Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. custom order fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer Life Technologies S24735 double-sided adhesive
LSM 780  Carl Zeiss N/A confocal microscope
ZEN 2010 Carl Zeiss N/A FCS analysis software
MATLAB MathWorks N/A programming language
NIH/3T3 cells  ATCC ATCC CRL-1658
DMEM Mediatech 10-013-CV growth media
fetal bovine serum Mediatech 35-011-CV heat-inactivated
penicillin-streptomycin Mediatech  30-002-CI
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
Opti-MEM Life Technologies 11058021 transfection media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
  3. Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
  4. Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
  5. Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
  6. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  7. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  8. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
  9. Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
  11. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
  12. Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
  13. Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
  14. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
  17. Li, H. -J., Wang, H. -X., Sun, C. -Y., Du, J. -Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
  18. Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
  21. Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
  22. Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
  23. Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
  24. Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
  25. Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
  26. Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
  27. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
  28. Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
  29. Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
  30. Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
  31. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
  35. Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
  36. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
  39. Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
  40. Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
  41. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  42. Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).

Tags

Bioengineering Probleem 125 Polyplex Kinetische Modellering Blokcopolymeer Nucleïnezuurvrijstelling Fluorescentie Correlatie-spectroscopie Celtyping RNAi lichtgevoelig
Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greco, C. T., Epps, III, T. H.,… More

Greco, C. T., Epps, III, T. H., Sullivan, M. O. Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers. J. Vis. Exp. (125), e55803, doi:10.3791/55803 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter