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Neuroscience

सीखने और मेमोरी का एक उपाय के रूप में ड्रोसोफिला कोर्टशिप कंडीशनिंग

Published: June 5, 2017 doi: 10.3791/55808

Summary

इस प्रोटोकॉल में ड्रॉसोफिला सीखने और मेमोरी परख का वर्णन किया गया है जिसे प्रणोदन कंडीशनिंग कहा जाता है। यह क्लासिक परख एक गैर-ग्रहणशील महिला द्वारा यौन अस्वीकृति के बाद पुरुष प्रेमी व्यवहार को कम करने पर आधारित है। व्यवहारिक प्लास्टिक की इस प्राकृतिक रूप का इस्तेमाल सीखने, अल्पकालिक स्मृति और दीर्घकालिक स्मृति परीक्षण के लिए किया जा सकता है।

Abstract

फोल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर जैसे मॉडल जीवों में सरल व्यवहारिक assays के उपयोग के माध्यम से सीखने और स्मृति अंतर्निहित आणविक तंत्र में कई अंतर्दृष्टि को स्पष्ट किया गया है। मानव संज्ञानात्मक विकार, जैसे कि बौद्धिक विकलांगता (आईडी) और आत्मकेंद्रित के साथ जुड़े जीन में उत्परिवर्तन से उत्पन्न संज्ञानात्मक घाटे के मूलभूत न्यूरोबोलॉजी को समझने के लिए ड्रोसोफिला उपयोगी है। यह काम ड्रॉसोफिला में एक क्लासिक प्रतिमान का उपयोग करके प्रशिक्षण सीखने और मेमोरी के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है जिसे प्रणोदन कंडीशनिंग के रूप में जाना जाता है। पुरुष आसानी से पहचाने जाने योग्य व्यवहारों की एक विशिष्ट पद्धति का उपयोग करते हुए न्यायालय की महिलाएं मंगाते हैं परिष्कृत मादाएं संभोग के लिए ग्रहणशील नहीं होती हैं और पुरुष के संभोग प्रयासों को अस्वीकार कर देगी। इस अस्वीकृति के जवाब में पुरुष मर्द उनके प्रेमी व्यवहार को कम करते हैं। प्रेमालाप व्यवहार में इस सीखा कमी को समय-समय पर मापा जाता है, जो शिक्षा और स्मृति के एक संकेतक के रूप में काम करता है। मूल अंकइस परख का शास्त्रीय आउटपुट प्रेसीडेंट इंडेक्स (सीआई) है, जिसे एक पुरुष 10 मिनट के अंतराल के दौरान नौकरी के समय के प्रतिशत के रूप में परिभाषित करता है। लर्निंग इंडेक्स (एलआई) सीआई की रिश्तेदार कमी मक्खियों में है, जो कि पिछली सोशल मुठभेड़ों के साथ भोले मक्खियों की तुलना में किसी प्रत्याशी महिला के सामने खुलती हैं। जीनोटाइप के बीच लिसा की सांख्यिकीय तुलना के लिए, बूटस्ट्रैपिंग के साथ एक यादृच्छिक परीक्षण प्रयोग किया जाता है। यह वर्णन करने के लिए कि कैसे सीखने और स्मृति से संबंधित जीन की भूमिका को संबोधित करने के लिए परख का उपयोग किया जा सकता है, डायहाइड्रोक्सियासेट फॉस्फेट एसीएलट्रांसफेरस ( धाप-एट ) के पैन-न्यूरोनल पछाड़ना को यहां वर्णित किया गया था। धोप-एट , ग्लिसरोनफोस्फेट ओ-एसीएलट्रांसफेरस ( जीएनपीटी ) के मानव यांत्रिकी , rhizomelic chondrodysplasia punctata प्रकार 2 में शामिल है, एक आटोसॉमल-अपस्मात्मक सिंड्रोम जिसमें गंभीर आईडी होती है। कोर्टशिप कंडीशनिंग परख का उपयोग करना, यह निर्धारित किया गया था कि ढाप-ए पर दीर्घकालिक स्मृति के लिए आवश्यक है, लेकिन इसके लिए नहींअल्पकालिक स्मृति। यह परिणाम अंतर्निहित आणविक तंत्र की आगे की जांच के लिए आधार के रूप में कार्य करता है।

Introduction

सीखने और स्मृति के अंतर्गत आणविक तंत्र कई प्रजातियों में संरक्षित होते हैं। घ्राण सीखने और स्मृति में दोषों के लिए ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर उत्परिवर्ती लाइनों की अग्रणी काम स्क्रीनिंग सीखने और स्मृति 1 की प्रक्रियाओं में प्रमुख आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। इन अध्ययनों ने सीखने और मेमोरी में शामिल पहले जीनों में से कुछ की पहचान की है, जैसे कि रूटाबागा 2 , स्ममेसियस 3 , और डून 4 , चक्रीय एडेनोसिन मोनोफोस्फेट (सीएएमपी) सिग्नलिंग 5 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का खुलासा करते हुए।

मेमोरी म्यूटेंट के लिए प्रारंभिक आनुवंशिक स्क्रीन मुख्य रूप से घृणास्पद कंडीशनिंग के जरिये आयोजित किए गए थे। हालांकि, सीखने और स्मृति के अन्य रूपों को मापने के कई तरीके समय के साथ उभरे हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले सीखने और स्मृति मानदंडों में से एक और यहाँ वर्णित परख को सी के नाम से जाना जाता हैभारतीयता कंडीशनिंग, जिसे पहली बार सीगल और हॉल 6 द्वारा वर्णित किया गया था और बाद में 7 , 8 , 9 के कई अन्य शोध समूहों द्वारा परिष्कृत किया गया था। कंट्रीशिप कंडीशनिंग एक विशिष्ट फेरोमोन, सीआईएस- वेजेनएसी एसीटेट (सीवीए) की उपस्थिति पर निर्भर होती है, जो मादा पेट पर होती है, जो संभोग के दौरान पुरुष द्वारा जमा होती है। मादा पेट पर सीवीए संवेदना स्वाभाविक रूप से प्रेमालाप व्यवहार को कम करती है, और जब महिला द्वारा अस्वीकृति के कार्य के साथ युग्मित किया जाता है, तो पुरुष प्रणोदन कम करने पर सीवीए का प्रभाव नाटकीय रूप से बढ़ा है। इस परख के पुरुष मक्खियों की प्रतिक्रिया आसानी से अपने अलग प्रत्याहार व्यवहार को देखकर मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जो पंथ को हिलाने, मारने और हिलाने, मारना, और संभ्रम 10 ( चित्रा 1 ए ) का प्रयास करने की दिशा में और उसके पीछे माहिर होने और उसके पीछे की जाने वाली विशेषता है। पुरुष मक्खियों को सीखते हैं ग्रहणशील कुंवारी और गैर-ग्रहणशील महिलाएं 11 के बीच , और यौन अस्वीकार किए जाने के बाद, वे 9 दिनों तक 8 दिनों तक गैर-अनुज्ञेय महिलाओं के प्रति प्रारम्भिक व्यवहार कम दिखाते हैं। इस प्राकृतिक व्यवहार का इस्तेमाल सीखने, अल्पावधि मेमोरी (एसटीएम), और दीर्घावधि स्मृति (एलटीएम) 8 , 9 , 12 के आधार पर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है। लर्निंग को परिभाषित किया जाता है कि प्रशिक्षण अवधि के दौरान प्रसूति व्यवहार में तत्काल कटौती होती है और इसे अक्सर तत्काल स्मरण मेमोरी के रूप में संदर्भित किया जाता है, मादा 6 , 8 के एक्सपोजर के बाद 0 - 30 मिनट मापा जाता है। एसटीएम को प्रशिक्षण के बाद 30 मिनट और 1 घंटे के बीच मापा जाता है, जबकि एलटीएम को अक्सर 8 ( चित्रा 1 बी ) प्रशिक्षण के बाद 24 घंटे मापा जाता है। एसटीएम 1-एच प्रशिक्षण अवधि का उपयोग करके प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन यह केवल 2-3 घंटे तक रहता हैS = "xref"> 6 , 8 अधिकतर सीखने के सिद्धांतों में, एलटीएम केवल दोहराए जाने वाले प्रशिक्षण के स्थान से प्रेरित हो सकते हैं। मैकब्राइड एट अल (1 999) 8 ने दिखाया कि एक घंटे के प्रशिक्षण सत्र से प्रेरित 2-3 एच के विपरीत, तीन स्थान, 1-एच प्रशिक्षण सत्र, 9 दिनों तक के लिए प्रेमालाप स्मृति कायम करने के लिए पर्याप्त थे। मैकब्राइड एट अल 8 ने यह भी दिखाया कि एक 5-एच प्रशिक्षण सत्र ने 9 दिन तक एक समान एलटीएम प्रतिक्रिया का उत्पादन किया। इस 5-एच अवधि के दौरान मक्खियों ने निरंतर अदालत नहीं किया है, एक प्रशिक्षण सत्र में एलटीएम को प्रेरित करने के लिए अपने स्वयं के प्रशिक्षण के लिए अपने स्वयं के प्रशिक्षण का निर्माण किया। यह एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से बहुत महत्वपूर्ण है, जिसकी आसानी से इस परख का उपयोग एलटीएम की जांच के लिए किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल मुख्य रूप से एलटीएम 11 , 12 के लिए 7-एच के एकल प्रशिक्षण सत्र का उपयोग करते हैं। कई अध्ययनों ने अलग-अलग जांच की हैउत्परिवर्ती परिस्थितियां जो प्रेम प्राप्ति सीखने के विभिन्न पहलुओं में विशिष्ट दोष हैं। उदाहरण के लिए, मशरूम का शरीर पृथककरण एसटीएम और एलटीएम को प्रभावित करता है, लेकिन 8 सीखना नहीं है एमानेसियस जीन में उत्परिवर्तन, जिसे पहली घंटिका कंडीशनिंग 3 का उपयोग करके स्मृति के एक विशिष्ट नियामक के रूप में परिभाषित किया गया था, एसटीएम पर असर पड़ता है लेकिन सीखने में नहीं 6 । अनुवाद नियामक orb2 (oo18 आरएनए-बाध्यकारी (orb) सीपीईबी 2 सबफ़ैमिली) और ईसीडीसोन का विशेष रूप से प्रभावी एलटीएम 9 , 13 प्रभाव का विघटन। इस प्रकार, प्रेरणशक्ति कंडीशनिंग सीखने और स्मृति के विभिन्न चरणों में अंतर्निहित तंत्रों काटना करने के लिए एक उपयोगी प्रतिमान है।

यह काम एक अनुकूलित प्रयोगात्मक सेटअप को दर्शाता है जो कि प्रणोदन कंडीशनिंग के अपेक्षाकृत उच्च-थ्रुथपुट परीक्षण की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह एक सांख्यिकीय विश्लेषण स्क्रिप्ट का वर्णन करता है और परख के महत्वपूर्ण कारकों पर चर्चा करता है। यह sh हैयहां ही है कि ड्रोसोफिला जीन डाइहाइड्रोक्सिसेट फोसफाइट एसीएलट्रांसफेरेज ( धाप-एट ) एलटीएम के लिए न्यूरॉन्स में आवश्यक है, लेकिन एसटीएम के लिए नहीं। इस जीन के मानव यास्वाणु , ग्लिसरीफॉस्फेट ओ-एसीएलट्रांसफेरस ( जीएनपीएटी ), रेजोमोमेलिक चॉन्ड्रोडाइस्प्लेसिया पेक्टाटा टाइप 2 14 में बदल जाता है , एक बौद्धिक विकलांगता, बरामदगी और कई अन्य नैदानिक ​​लक्षणों की विशेषता आटोसॉमल-अपस्मिक विकार 15 । इस संदर्भ में, प्रारम्भिकरण कंडीशनिंग को प्रयोगशालाओं के अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान करने, सीखने और स्मृति में मानव रोग जीनों की भूमिका को कार्यात्मक रूप से मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

नोट: नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल में, एक संग्रह, प्रशिक्षण, और परीक्षण की एक प्रतिकृति वर्णित है। परिणाम की पुनरुत्पादन की जांच के लिए, इन चरणों को समानांतर में दोहराया जाना चाहिए, कई दिनों पर, और मक्खियों के अलग-अलग समूह ( तालिका 1) के साथ । प्रोटोकॉल अंडे से लेकर वयस्क तक 10 दिन के जीवन चक्र पर आधारित होता है, जो 25 डिग्री सेल्सियस, 70% आर्द्रता और 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र की लगातार स्थितियों के दौरान मक्खियों का पालन करते समय सामान्य है। इस प्रोटोकॉल के सभी पहलुओं का मानना ​​है कि परिस्थितियों को पूरे परख में लगातार रखा जाता है। टाइम्स को इंगित किया जाता है कि रोशनी चालू होने से पहले (बीएलओ) या इनक्यूबेटर में रोशनी चालू होने पर (एएलओ) के रूप में यह आसानी से दिन के शोधकर्ता के पसंदीदा समय के आधार पर सेट किया जा सकता है। सीओ 2 गैस का प्रयोग केवल भोले नर मक्खियों के शुरुआती संग्रह के लिए और पिछली महिलाओं के संग्रह के लिए करें। प्रणोदन कंडीशनिंग के लिए यह प्रोटोकॉल निम्न चरणों से बना है:

  1. एपरिस्थित महिला संग्रह संस्कृतियों की स्थापना
  2. पुरुष परीक्षण विषयों के संग्रह के लिए संस्कृतियों की स्थापना
  3. आवास ब्लॉकों की तैयारी
  4. मानकीकृत परिस्थितियों वाली महिलाओं के उत्पादन के लिए शिष्ट शीशियों की स्थापना
  5. पुरुष परीक्षण विषयों का संग्रह
  6. प्रशिक्षण
  7. परिक्षण
  8. वीडियो डेटा विश्लेषण और आंकड़े

1. परिष्कृत महिला संग्रह संस्कृतियों की स्थापना

  1. पॉवरफ़ूड 16 तैयार करें 2% (डब्ल्यू / वी) खमीर निकालने, 2% (डब्ल्यू / वी) पेप्टोोन, 3% (डब्ल्यू / वी) सोक्रोस, 6% W / v) ग्लूकोज, 0.05% (w / v) MgSO 4 , और 0.05% (w / v) CaCl 2 पानी में 15 मिनट के लिए समाधान को 0.05% (w / v) methylparabene (सावधानी: विषाक्त) और 0.5% (वी / वी) प्रोपोनिक एसिड (सावधानी: विषाक्त) जोड़ने से पहले 70 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए आगे बढ़कर 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करते हुए अच्छी तरह मिलाएं।
  2. खाना खाने से पहलेकमरे के तापमान पर lidifies, प्रत्येक 175 एमएल प्लास्टिक की शीशी को ~ 50 एमएल की पावरफूड जोड़ें। भोजन को और अधिक शांत करने दें एक प्लग के साथ शीशी को बंद करें
    नोट: पावरफूड विशेष रूप से मक्खियों के उत्पादन के लिए बनाई गई विशेष खाद्य मिश्रण है, संभवतः अंडा बिछाने से प्रेरित है। पावरफूड का उपयोग पुरुष मक्खियों का उत्पादन करने के लिए नहीं किया जाता है जो कि व्यवहार विश्लेषण (चरण 2) के लिए इस्तेमाल किया जाएगा क्योंकि अस्थिर आहार और संभावित भीड़ विकास को प्रभावित कर सकते हैं।
  3. दिन -11 ( तालिका 1 ) पर, पावरफूड शीशियों में लगभग 60-100 मक्खियों (पुरुषों और महिलाओं का एक मिश्रण) के साथ 5-20 जंगली संस्कृतियां शुरू करें; इनका प्रयोग 4 चरण में किया जाएगा जो कि मानकीकृत परिस्थितियों वाली महिलाएं 17 उस क्षेत्र को बढ़ाने के लिए प्रत्येक शीशी पर एक फिल्टर पेपर जोड़ें, जिस पर लार्वा कुल्ला कर सकते हैं; इससे मक्खियों की संख्या में इजाफा होगा जो कि लगा सकते हैं।
  4. समय-समय पर दोहराने 1.1-1.3 चरणों में प्रयोग के लिए पर्याप्त नए मक्खियों को प्राप्त करने के लिए इनपुट के रूप में"मानकीकृत परिस्थितियों वाली महिलाओं के उत्पादन के लिए विवाह शीशियों की स्थापना" (चरण 4)।

2. पुरुष परीक्षण विषयों के संग्रह के लिए संस्कृतियों की स्थापना

  1. 0.5% (डब्ल्यू / वी) अगर, 2.75% (डब्ल्यू / वी) खमीर, 5.2% (डब्लू / वी) मकई का आटा, 11% (डब्लू / वी) चीनी, 0.05% (डब्ल्यू / वी) के साथ सामान्य भोजन 16 तैयार करें। ) मेथिलपरैबिन, और 0.5% (वी / वी) प्रोपोनिक एसिड पानी में, जैसा कि चरण 1.1 और 1.2 में वर्णित है। एक मक्खी शीशी प्लग के साथ 175 मिलीलीटर प्लास्टिक की शीशियों को बंद करें
  2. दिन -10 ( टेबल 1 ) पर, लगभग 30-75 कुंवारी महिलाओं ( सामग्री / उपकरण तालिका ) के साथ लगभग 10-20 पुरुषों को सामान्य भोजन युक्त प्रत्येक 175 एमएल शीशी में रखें। पोटापा के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए और उत्पादकता को अधिकतम करने के लिए एक फिल्टर पेपर जोड़ें।
  3. परीक्षण विषय वाले पुरुषों की अपेक्षित संख्या प्राप्त करने के लिए जीनोटाइप प्रति तीन से छः 175 मिलीलीटर शीशियों की स्थापना करें।
    नोट: वांछित जीन की उत्पादकता के आधार पर अधिक शीशों की आवश्यकता हो सकती हैotype।

3. हाउसिंग ब्लॉकों की तैयारी ( चित्रा 2 ए )

  1. एक माइक्रोवेव में लगभग 50 एमएल का प्रति पावरफूड मिलाया, या इसे ताज़ा बना दिया।
  2. एक मल्टीडिस्पेंसर पिपेट का उपयोग करते हुए 96-अच्छी तरह से, फ्लैट-नीचे ब्लॉक के प्रत्येक कुएं में 500 μL पावरफूड जोड़ें।
  3. भोजन को कमरे के तापमान पर मजबूत करने की अनुमति दें
  4. पीसीआर चिपकने वाला फिल्म के साथ ब्लॉकों को कवर करें और मक्खियों को ताजी हवा देने के लिए कम से कम 4 छेद बनाने के लिए सुई का उपयोग करें।
  5. हर अच्छी तरह से खोलने में सक्षम होने के लिए प्रत्येक पंक्ति के बीच लंबाई में चिपकने वाली फिल्म को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें ब्लॉक के एक छोर पर फिल्म को बरकरार रखें।
  6. ब्लॉक 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: ब्लॉकों को उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को फिर से संतुलित करने की अनुमति दें।

4. मानकीकृत परिष्कृत महिलाओं के उत्पादन के लिए मिलनसार शीशियों की स्थापना

  1. दिन -1 पर, निकालें औरसभी वयस्क व्यंगव्यों को त्यागने से पहले महिला संग्रह संस्कृतियों से 2-5 घंटे बीएलओ में मक्खियों से उबरती है।
  2. इन शीशियों से 2 से 3-एच अंतराल ( जैसे, 30 मिनट, 2.5 एच, और 5 घंटे एएलओ) में एस्पीरेटर ( चित्रा 2 बी ) का उपयोग करके मक्खियों को इकट्ठा करें और उन्हें खमीर की एक छोटी मात्रा के साथ पूरक एक नया पावरफूड शीशी में रखें पेस्ट और फिल्टर पेपर
  3. भीड़ से बचने के लिए और एक इष्टतम संभोग वातावरण को बढ़ावा देने के लिए, प्रत्येक नए शीशी से 150-200 मक्खियों को स्थानांतरित न करें। कम से कम 25% पुरुषों को प्रदान करके सभी मादाओं के संभोग सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कि प्रयोग के आकार को समायोजित करने के लिए संभोग शीशियों में पर्याप्त मादाएं मौजूद हैं।
    नोट: जैसा कि प्रोटोकॉल में यह एक महत्वपूर्ण कदम है, यह सुनिश्चित करें कि केवल ताजे मक्खियों और पुराने मक्खियों, लार्वा, या पिएय को नयी संभोग शीशी में स्थानांतरित किया जाए।
  4. इन मातृत्व शीशियों को चार दिनों तक सेवन करने के लिए सभी मादाओं के लिए पर्याप्त समय की आवश्यकता होती है।

5. कर्नलपुरुष परीक्षण विषयों का प्रयोग

  1. 2-3 घंटे बीएलओ में 1 दिन ( तालिका 1 ) पर पुरुष संग्रह शीशियों (चरण 2) से सभी वयस्क मक्खियों को हटाने के लिए सीओ 2 का उपयोग करें, लेकिन अगले कुछ घंटों में अधिक मक्खियों को लगा दें।
  2. अगले 5-6 घंटे में, सीओ 2 का इस्तेमाल करते हुए हर 20-30 मिनट में नवनिर्मित मक्खियों को हटा दें और प्रत्येक पुरुष को एस्पिरेटर ( चित्रा 2 बी ) का उपयोग करके आवास ब्लॉक (चरण 3) के व्यक्तिगत खण्ड में डाल दें।
  3. चिपकने वाला पीसीआर फिल्म के साथ अच्छी तरह से फिर से मुहर।
    नोट: यह प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। पुरुषों को बार-बार एकत्र किया जाना चाहिए। इकट्ठे किए गए पुरुषों को पृथक्करण के समय के करीब आवास ब्लॉक में अलग किया जाना चाहिए, जब वे पारदर्शी पेट में पीला रंगद्रव्य और मेकोनियम की उपस्थिति प्रदर्शित करते हैं।
    नोट: एस्पिरेटर के कोमल उपयोग मक्खियों के स्थानांतरण की अनुमति देता है; हालांकि, अनुचित उपयोग मक्खियों पर जोर देगा, जिससे परख में विचरण हो सकता है (चर्चा देखें)।
  4. सह करने के लिए उद्देश्यजीनोटाइप प्रति 48 पुरुष तक लाइक करें यह दोनों भोले और प्रशिक्षित परिस्थितियों के विश्लेषण के लिए आवश्यक पुरुषों की अधिकतम संख्या को एक छोटा अतिरिक्त प्रदान करता है, जो बाद में स्थानांतरण चरणों में कुछ नुकसान की इजाजत देता है।

6. प्रशिक्षण

  1. सीओ 2 का उपयोग करते हुए संभोग शीशी (चरण 4.2) से मक्खियों को निकालें और पुरुषों से प्रत्याशी महिलाओं को अलग करें।
  2. एस्पिरेटर का उपयोग करना, एक नए आवास ब्लॉक की एक पंक्ति में प्रत्येक अच्छी तरह से एक anesthetized, premated महिला को जोड़ दें।
  3. एस्पिरेटर का उपयोग करना और बिना संज्ञाहरण के, चरण 5.2 में स्थापित आवास ब्लॉक से व्यक्तिगत भोले आदमी को स्थानांतरित करना, जिसमें एक महिला के साथ अच्छी तरह से युक्त महिला शामिल है। नर को अच्छी तरह से रखा जाता है, फिर से चिपकने वाली फिल्म के साथ फिर से मुहर; पुरुष को भागने की अनुमति न दें
    नोट: उनके स्वाभाविक "नकारात्मक जियोटेक्सिस" व्यवहार (चर्चा देखें) का लाभ उठाकर आवास ब्लॉक में एस्पिरेटर से पुरुष मक्खियों को स्थानांतरित करें।
  4. दोहराएं चरण6.2-6.3 तक पर्याप्त नर-मादा जोड़े स्थापित की जाती हैं। आदर्श रूप से, 24 जोड़े, एक आवास ब्लॉक की दो पूर्ण पंक्तियां, प्रति जीनोटाइप स्थापित करें। चरण 5.2 में स्थापित मूल आवास ब्लॉक में शेष भोले लोगों को छोड़ दें।
  5. प्रशिक्षण अवधि ( तालिका 2 , चित्रा 1 बी ) के दौरान पुरुष-मादा जोड़े को अव्यवस्थित छोड़ दें।
    नोट: इस समय के दौरान, नर अदालत और पूर्व में महिला द्वारा खारिज कर दिया जाएगा। सीखने और एसटीएम के लिए, प्रशिक्षण अवधि 1 घंटे है और एलटीएम के लिए, प्रशिक्षण अवधि 7-9 घंटे है।
  6. एक एस्पिरेटर का इस्तेमाल करके प्रशिक्षण को समाप्त करें ( तालिका 2 , चित्रा 1 बी ) धीरे-धीरे महिला को नर से अलग करने के लिए; संज्ञाहरण का उपयोग न करें नए आवास ब्लॉक में अलग-अलग पुरुष रखें।
  7. सभी भोले आदमीों को धीरे-धीरे और बिना किसी और संज्ञाहरण के चरण 5.2 में स्थापित एक नए आवास ब्लॉक के लिए एच्छिक का उपयोग करें।
    नोट: यह चरण एसटीएम और लीआ के लिए वैकल्पिक हैआरिंग, लेकिन एलटीएम के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि मक्खियों को एलटीएम की जांच के लिए एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए रखा गया है।
  8. एसटीएम और एलटीएम के लिए, पुरुषों को 1 घंटे और ~ 24 घंटे के लिए आराम करने की अनुमति दें, (क्रम 7) परीक्षण से पहले ( तालिका 2 , चित्रा 1 बी )।
  9. सीखने के लिए, तुरंत प्रशिक्षित और भोले आदमी (चरण 7) का परीक्षण करें।

7. परीक्षण

  1. सीओ 2 का उपयोग करते हुए मैथुन शीशियों (चरण 4.2) से मक्खियों को इकट्ठा करें और पुरुषों से परिचित महिलाओं को अलग करें।
  2. महिलाओं को संज्ञाहरण से कम से कम 1 घंटे के लिए सामान्य भोजन युक्त एक शीशी में उगलने दें।
  3. परीक्षण शुरू होने से पहले सभी उपकरण तैयार करने के लिए, वीडियो रिकार्डर अग्रिम में माउंट करें ( चित्रा 2 सी )।
  4. सीखने, एसटीएम, और एलटीएम ( तालिका 2 , चित्रा 1 बी ) के लिए विभिन्न समय-सारिणी के अनुसार परीक्षण शुरू करें। प्रशिक्षण के तुरंत बाद परीक्षण करनासीखने के लिए, एसटीएम के लिए प्रशिक्षण के बाद 1 घंटे, और एलटीएम के लिए प्रशिक्षण के बाद 24 घंटे
  5. एस्पिरेटर का उपयोग करना, आराम से आवास ब्लॉक या प्रशिक्षण आवास ब्लॉक से अलग-अलग व्यक्ति को धीरे-धीरे स्थानांतरित करें यदि सीखने का परीक्षण किया जा रहा है (चरण 6.7, प्रशिक्षित; चरण 6.8, भोलेपन) विभाजक के एक आधे से विभाजित बंदरगाह ( चित्रा 2 डी) एक इमारत की योजना के लिए फ़ाइल एस 1 देखें)।
    नोट: प्राकृतिक "नकारात्मक जियोटेक्सिस" व्यवहार का प्रयोग प्रणय क्षेत्र (चर्चा) के लिए एस्पिरेटर से पुरुष मक्खियों को हस्तांतरित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  6. जल्दी लेकिन धीरे से अगले क्षेत्र में प्रविष्टि छेद ले जाएं और चरण 7 दोहराएं जब तक सभी 18 क्षेत्रों में एक पुरुष न हो।
  7. एस्पिरेटर का उपयोग करना और सीओ 2 के बिना, सभी 18 एरेनाओं के दूसरे छमाही में एक स्थानांतरित महिला (चरण 7.2 में एकत्रित) जोड़ें।
  8. सावधानी से कैमरे के तहत प्रेमीता चैंबर रखें, नीचे खड़े कुओं के उद्घाटन के साथ ( चित्रा 2 सी
  9. पुरुषों और महिलाओं के बीच प्रत्यक्ष संपर्क की अनुमति देने के लिए एरेनाओं के विभक्त को निकालें।
  10. कम से कम 10 मिनट के लिए व्यवहार को तुरंत रिकॉर्ड करना शुरू करें
    नोट: दो-कैमरे के सेटअप का उपयोग करते समय, दक्षता को अधिकतम करने के लिए दो प्रीपेडशिप प्लेट्स की समानांतर रिकॉर्डिंग समय सीमा में किया जा सकता है।
  11. एक हाथ से पकड़े हुए वैक्यूम क्लीनर का इस्तेमाल करके प्रेसीडेंसी एनाएंस रिक्त करें और फिर से इस्तेमाल करने से पहले प्रेसीडेंसी चैम्बर को हवा दे दें।
  12. दोहराएँ चरण 7.4-7.11 जब तक सभी जीनोटाइप और शर्तों ( यानी, भोले और प्रशिक्षित) का परीक्षण पूरा हो चुका है।

8. वीडियो डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

  1. प्रेसीडेंट इंडेक्स (सीआई) की गणना करें, जो उस समय के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया है, जो कि प्रत्येक व्यक्ति नर मक्खी के लिए, परीक्षण अवधि के पहले 10 मिनट के दौरान पुरुष अदालियां
    नोट: यह मैन्युअल रूप से टकसाली प्रताप व्यवहार ( चित्रा 1 ए ) या यू द्वारा देखकर किया जा सकता हैप्रेमालाप व्यवहार (चर्चा) के स्वचालित मात्रा का ठहराव के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर गाएं।
    नोट: पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करने के लिए और सीआई आंकड़ों की स्थिरता का न्याय करने के लिए तीन दिनों के दौरान 40-60 पुरुष प्रति स्थिति का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
  2. लर्निंग इंडेक्स (एलआई) की गणना करें, जो भोले आदमी (ली = (सीआई अनुभवहीन - सीआई प्रशिक्षित) / सीआई अनुभवहीन ) की तुलना में प्रशिक्षित पुरुषों के औसत सीआईआई में प्रतिशत में कमी के रूप में परिभाषित है। परीक्षण के प्रत्येक दिन के लिए LI का मूल्यांकन करें और सभी परीक्षण दिनों से एकत्रित संचयी ली की तुलना करें।
  3. हेनर्स के रूप में "जीनोटाइप" और "सीआई" के साथ एक अलग दो-कॉलम टैब डेटा फ़ाइल बनाएं
    नोट: ये हेडिंग मामले संवेदनशील हैं। प्रत्येक सीआई के लिए जीनोटाइप का नाम में एक अंडरस्कोर और प्रशिक्षण की स्थिति ( उदाहरण के लिए, जीनोटाइप_एन और जीनोटाइप_एलटीएम, आदि) के बाद जीनोटाइप का वर्णन होना चाहिए, जहां एन = भोले और एलटीएम = दीर्घकालिकयाद; एक उदाहरण के लिए पूरक फ़ाइल S2 देखें)। यह एनोटेशन जरूरी है, क्योंकि फ़ंक्शन अन्वेषण "जीनोटाइप" कॉलम में पहले अंडरस्कोर के बाद मौजूद वर्णों के आधार पर प्रशिक्षित और भोले-उक्रेनी मक्खियों की पहचान करेगा।
  4. विभिन्न जीनोटाइप से लाई मूल्यों के बीच के अंतर के सांख्यिकीय महत्व का न्याय करने के लिए एक अनारक्षितता परीक्षण करने के लिए अनलेरन आर स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल S3) का उपयोग करें।
    1. स्रोत स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल S3) को R 18 में , जो "अनलेरन" नामक फ़ंक्शन को परिभाषित करता है।
      नोट: फ़ंक्शन परिभाषा है: analearn <- फ़ंक्शन (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', पुनःनामांकन = एनए, डेटानाम = एनए, हेडर = TRUE, बीड = एनए, राइटआउटपुट = TRUE)।
    2. आर कमांड लाइन में "अनलेरन ()" दर्ज करके और पॉप-अप विंडो के माध्यम से विश्लेषण करने के लिए डेटा फ़ाइल का चयन करके (चरण 8.3 में उत्पादित) फ़ंक्शन शुरू करें।
    3. संदर्भ उत्परिवर्तन चुनें, जोसंगत संख्या दर्ज करके और दर्ज करने के लिए, नियंत्रण जीनोटाइप है
      नोट: संदर्भ जीनोटाइप को चुनने के बाद, स्क्रिप्ट को 10,000 बूटस्ट्रैप प्रतिकृति बनाने में कई सेकंड लगते हैं।
    4. आउटपुट तालिका (तालिका 3) को देखें, जिसमें जीनोटाइप, सीखने की स्थिति ( यानी, सीखना, एसटीएम, या एलटीएम) है, सीआई भोले का मतलब है, सीआई प्रशिक्षित, लाई, प्रयोगात्मक स्थिति की तुलना में नियंत्रण की ली के बीच का अंतर (एलआईईईईईई), कम सीरिज (एलएल) और ऊपरी सीमा (उल) के 95% विश्वास अंतर अंतराल की है, और पी- वेल्यू यह दर्शाता है कि कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है
      नोट: अन्तर्निर्देशन एक आउटपुट टेक्स्ट फ़ाइल को उस निर्देशिका में संग्रहीत करेगा जहां डेटा फ़ाइल स्थित है। हालांकि, आउटपुट तालिका आर-स्टूडियो कंसोल में भी दिखाई देती है। डिफ़ॉल्ट नाम का निर्माण डेटा फ़ाइल के नाम के आधार पर किया गया है।
    5. अनलेशनल फ़ंक्शन में कई तर्क हैं जो डी को बदलने में इस्तेमाल किया जा सकता हैबूटस्ट्रैपिंग के मापदंडों को समायोजित करने के लिए कार्य की गलती सेटिंग्स।
      नोट: "nboot" बूटस्ट्रैप की संख्या को परिभाषित करता है और डिफ़ॉल्ट रूप से 10,000 पर सेट है यह मान शून्य से किसी भी पूर्णांक संख्या में बदल सकता है तालिका 5 में कई तर्क दिए गए हैं जिनका उपयोग फ़ंक्शन की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को बदलने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह कम डेटा बूटस्ट्रैप के साथ उत्पादित डेटा का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है।

Representative Results

ड्रॉसोफिला में शिक्षा और स्मृति को मापने के लिए प्रणोदन कंडीशनिंग परख का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसे प्रदर्शित करने के लिए, यहां प्रस्तुत परिणामों में नियंत्रण मक्खियों में एसटीएम और एलटीएम का विश्लेषण किया गया है, जो ढाप-इन के न्यूरॉन-विशिष्ट पछाड़ना के साथ मक्खियों की तुलना में है। नियंत्रण पुरुषों एक आरएनए हस्तक्षेप hairpin अनुक्रम व्यक्त एक Caenorhabditis एलिगेंस- विशिष्ट जीन, मस्तिष्क जस्ता उंगली प्रोटीन C02F5.12 19 लक्ष्यीकरण । यह नियंत्रण तनाव एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि में पछाड़ना और नियंत्रण के बीच एक अपवाद सक्रियण अनुक्रम (यूएएस) तत्वों की एक समान संख्या सुनिश्चित करता है, और आरएनएआई हेयरपिन आरएनएआई प्रणाली के किसी भी गैर-विशिष्ट प्रभाव के लिए खाता है। नियंत्रण पुरुषों (जीनोटाइप: यूएएस-डीसीआर 2 / +; पी {केके 10810 9} VIE-260 बी / एलाव-गेल 4 / + ) एसआईटी दोनों के लिए प्रशिक्षित बनाम भोले में सीआई में महत्वपूर्ण कमी दिखाते हैं ( चित्रा 3 ए , पी = 1.2 x 10 - 4 , मान-व्हिटनवाई यू-टेस्ट) और एलटीएम ( चित्रा 3 बी , पी = 1.2 x 10 -4 , मान-व्हिटनी यू-टेस्ट)। यह परिणाम सीखने और इन मक्खियों में स्मृति के लिए सामान्य क्षमता को दर्शाता है। ढाप-पर दस्तक- मार मक्खियों (जीनोटाइप: यूएएस-डीसीआर 2 / +; पी {केके -101437} VIE-260 बी / + एलाव-गल 4 / + ) एसआईटी के लिए प्रशिक्षित बनाम भोले-मक्खियों में सीआई की महत्वपूर्ण कमी भी दिखाती है ( चित्रा 3 ए , पी = 1.2 x 10 -4 , मान-व्हिटनी यू-टेस्ट)। हालांकि, एलटीएम प्रशिक्षण ( चित्रा 3 बी , पी = 0.33, मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) के बाद वे सीआईआई में महत्वपूर्ण कमी नहीं दिखाते हैं। कुछ शर्तों ( चित्रा 3 ए और 3 बी ) के लिए सीआई आंकड़ों के गैर-पैरामीट्रिक वितरण के कारण मान-व्हिटनी यू-टेस्ट का प्रयोग सरल और प्रशिक्षित मक्खियों के औसत सीआई की तुलना करने के लिए किया गया था। सीआई के विश्लेषण के माध्यम से देखे गए मतभेद प्रत्येक जीनोटाइप के लिए लाई द्वारा प्रतिबिंबित होते हैं, जो प्रतिशत रिडक्टि को मापते हैंसीआई में भोले बनाम प्रशिक्षित मक्खियों ( चित्रा -3 सी ) में। नियंत्रण और धाप-इन-नाकडाउन में एसईएम ( पी = 0.115, 10,000 बूटस्ट्रैप प्रतिकृतियां, चित्रा -3 सी , तालिका 3 ) के लिए लीड्स में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, जबकि ढाल पर एलएटी के लिए लाइट काफी कम है। 0.0034, 10,000 बूटस्ट्रैप प्रतिकृतियां, आकृति 3C , तालिका 3 )। जीनोटाइप के बीच लाई की तुलना के लिए, कैम्शेव एट अल द्वारा पहली बार सिफारिश की गई विधि से अनुकूलित एक रैंडमाईशन टेस्ट 20 7 का इस्तेमाल किया गया था चूंकि लाई जनसंख्या डेटा ( यानी, सीआई-भोले और सीआई-प्रशिक्षित) का मतलब है, एक मानक मान है, जो प्रयोगात्मक व्युत्पन्न वितरणों पर भरोसा करते मानक मानक तरीकों पर लागू नहीं होते हैं। यादृच्छिकता परीक्षण वितरण रहित है और बूटस्ट्रैपिंग का उपयोग करता है ( यानी, यादृच्छिक नमूनाप्रतिस्थापन के साथ एनजी) वास्तविक डेटा से प्राप्त होने वाले काल्पनिक डेटा सेट उत्पन्न करने के लिए। अन्वेषण स्क्रिप्ट (फ़ाइल एस 3) प्रत्येक जीनोटाइप के लिए काल्पनिक लिज़ का एक सेट बनाता है और नियंत्रण और परीक्षण जीनोटाइप (LIIDIF) के बीच अंतर की गणना करता है। इस प्रक्रिया को 10,000 बार दोहराया जाता है, और जिसके परिणामस्वरूप मान लीडिफ ( तालिका 3 ) के 95% आत्मविश्वास अंतराल को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस डेटा को पी- वेल्यू उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है जो कि संभावना दर्शाता है कि दो जीनोटाइप्स की लीज़ अलग है। यहां दिखाए गए परिणाम दिखाते हैं कि एलएटीएम के लिए धाप-एट न्यूरॉन्स में आवश्यक है लेकिन एसटीएम के लिए नहीं।

दिन-प्रति दिन परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने के लिए, सीआई और लाई को दोहराने वाले दिन ( तालिका 4 ) के बीच तुलना की जाती है। हालांकि लाइट में कुछ उतार-चढ़ाव दिन-प्रतिदिन मनाया जाता है, परिणाम आम तौर पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सीआई डेटा कंट्रोल स्ट्र के आधार पर बहुत भिन्न हो सकता हैऐन इस्तेमाल किया और परीक्षण की पर्यावरण की स्थिति। सीआई डेटा यहां दिखाया गया है जो इस नियंत्रण जीनोटाइप के लिए विशिष्ट है, लेकिन अन्य जीनोटाइप एक उच्च या निम्न अर्थ सीआई और वितरण का प्रदर्शन कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: न्यायालय सूचकांक और प्रायोगिक अवलोकन का निर्धारण। ( ) महिला मक्खी की दिशा में रूढ़िवादी नर प्रेम का व्यवहार दिखा रहा है। प्रणोदन व्यवहार के विभिन्न चरणों को दिखाया गया है: अभिविन्यास (I), निम्नलिखित (द्वितीय), विंग कंपन (विस्तार) और टैपिंग (III), चाट (IV), और संभोग (वी) का प्रयास। ( बी ) इनक्यूबेटर प्रकाश चक्र के सापेक्ष प्रशिक्षण और परीक्षण के समय के लिए योजनाबद्ध अवलोकन, घंटे में चिह्नित। ट्रेनिंग बार को बार के साथ संकेत दिया जाता है, एसटीएम और एलटीएम के लिए आराम की अवधि को एक धराशायी रेखा से दर्शाया जाता है, और परीक्षण प्रारंभ बिंदु को एक तीर के रूप में दर्शाया गया है। ध्यान दें किएलटीएम के लिए परीक्षण का समय प्रशिक्षण के बाद का दिन है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: उपकरण ड्रोसोफिला कोर्टशिप कंडीशनिंग परख के लिए इस्तेमाल किया। ( ) आवास ब्लॉक एक सपाट, तल ब्लॉक है जिसमें 500 μL प्रति पावरफूड प्रति अच्छी तरह से होता है। इसे एक qPCR चिपकने वाली फिल्म के साथ सील कर दिया गया है जिसमें कम से कम 4 छेद प्रति अच्छी तरह से लगाया गया है जो सिरिंज सुई का उपयोग 0.8 मिमी व्यास के साथ किया गया था। अलग-अलग पंक्तियों को लंबाई के साथ एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके स्ट्रिप्स में काट दिया जाता है ताकि खोलने और बंद होने की अनुमति मिल सके। ( बी ) संज्ञाहरण के उपयोग के बिना पुरुष और महिला मक्खियों के कोमल हस्तांतरण के लिए एस्पिपेटर आवश्यक है इनसेट में एस्पिरेटर की टिप दिखती है, कपास के टुकड़े के साथ बंद कर दिया गयायुक्ति टिप के भीतर मक्खी ( सी ) दो प्रीपेडशिप चैंबर की एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए दो कैमरे प्रणाली की स्थापना ( डी ) 18 एरेनाओं के साथ एक प्रेमालाप कक्ष। एंट्री छेदों को फिसलने के लिए एरेनास में मक्खियां लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। नर और मादाओं के बीच बातचीत शुरू करने के लिए सफेद डिवाइडर को एक साथ खोला जा सकता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: नियंत्रण में एसटीएम और एलटीएम का विश्लेषण और ढाप-नाकडाउन मक्खियों में। ( एबी ) बॉक्स प्लॉट्स को सीआई वैल्यू के भोले (एन) और प्रशिक्षित (टी) मक्खियों के नियंत्रण (ग्रे) और ढाप-को पीटकर (सफेद) जीनोटाइप एसटीएम (ए) और एलटीएम (बी) के लिए परीक्षण किया गया है। ( सी ) कॉरपोनियंत्रण के लिए लाई मूल्यों को बांटना और ढाप पर दस्तक - मार के लिए एसटीएम और एलटीएम का परीक्षण किया गया। नियंत्रण और पछाड़ना जीनोटाइप के बीच ली में अंतर की तुलना एक यादृच्छिक परीक्षण (10,000 बूटस्ट्रैप प्रतिकृति) के साथ की गई थी। त्रुटि बार विभिन्न परीक्षण दिनों की गणना की गई लाई मानों से प्राप्त मतलब के मानक त्रुटि का संकेत देते हैं। जीनोटाइप हैं: w +, यूएएस-डीसीआर 2 / + ; पी {केके 10810 9} VIE-260 बी / + ; और एलिव-गल 4 / + (कंट्रोल) और डब्ल्यू +, यूएएस-डीसीआर 2 / + ; पी {KK101437} VIE-260 बी / +; और एलिव-गल 4 / + ( धाप-ए- आरएनएआई)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

सामान्य एकत्र रेल गाडी परीक्षण
दिन -11 प्रारंभिक महिला संग्रह संस्कृतियां प्रारंभ करें (चरण 1.3)
दिन -10 पुरुष परीक्षण विषयों के संग्रह के लिए संस्कृतियों को प्रारंभ करें (चरण 2.2)
पहला दिन प्रतिनिधि। 1
दूसरा दिन प्रतिनिधि। 2
तीसरा दिन प्रतिनिधि। 3
दिन 4 प्रतिनिधि। 4 प्रतिनिधि। 1
दिन 5 प्रतिनिधि। 2 प्रतिनिधि। 1
दिन 6 प्रतिनिधि। 3 प्रतिनिधि। 2
दिन 7 प्रतिनिधि। 4 प्रतिनिधि। 3
दिन 8 प्रतिनिधि। 4
दिन 9 वीडियो डेटा विश्लेषण और आंकड़े (चरण 8)
Rep = repeat

तालिका 1 : एलटीएम के परीक्षण के लिए उदाहरण समयरेखा अलग-अलग दिनों पर तीन प्रतिकृतियां

सीख रहा हूँ एसटीएम LTM
प्रशिक्षण काल 1 घंटे 1 घंटे 8 घंटे
आराम का समय 0 घंटे 1 घंटे ~ 24 घंटे
प्रशिक्षण शुरू करो 0एच। ALO 0 घंटे ALO 4 घंटे BLO
प्रशिक्षण बंद करो 1 घंटे ALO 1 घंटे ALO 4 घंटे ALO
परीक्षण शुरू करें 1 घंटे ALO 2 घंटे ALO 0 घंटे एएलओ (अगले दिन)
एएलओ = रोशनी चालू होने के बाद, बीएलओ = रोशनी से पहले, एसटीएम = अल्पावधि मेमोरी, एलटीएम = दीर्घावधि स्मृति

तालिका 2 : प्रशिक्षण अवधि, प्रशिक्षण टाइम्स, और टेस्टिंग टाइम्स फॉर लर्निंग, एसटीएम, और एलटीएम

जीनोटाइप सीख रहा हूँ
शर्त
सीआई
अनुभवहीन
सीआई
प्रशिक्षित
LI LI
अंतर
निचली सीमा
(95% चौराहे अंतराल)
ऊपरी सीमा
(95% चौराहे अंतराल)
पी-मूल्य
नियंत्रण एसटीएम 0.467 0.116 0.752 NA NA NA NA
Dhap-एट-आरएनएआई एसटीएम 0.699 0.257 0.633 0.119 -0.030 0.265 0.116
नियंत्रण LTM 0.590 0.384 0.348 NA NA NA NA
Dhap-एट-आरएनएआई LTM 0.697 0.650 0.068 0.280 0.103 0.446 0.003

विश्लेषणात्मक स्क्रिप्ट से उत्पादित सांख्यिकीय डेटा जीनोटाइप, सीखने की स्थिति ( यानी, सीखने, एसटीएम, या एलटीएम) युक्त बूटस्ट्रैपिंग आर-स्क्रिप्ट की आउटपुट फाइल, सीआई भोले का मतलब है, सीआई प्रशिक्षित, लाई, प्रायोगिक हालत (एलई डीईएफ़) की तुलना में एलआईसी के नियंत्रण में अंतर है। , निम्न सीमा (एलएल) और ऊपरी सीमा (उल) की 95% आत्मविश्वास अंतराल की भिन्नता, और पी- वेल्यू यह दर्शाता है कि कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है।

नियंत्रण Dhap-एट-आरएनएआई
औसत सीआई भोलेपन औसत सीआई प्रशिक्षित LI औसत सीआई भोलेपन औसत सीआई प्रशिक्षित LI
एसटीएम पहला दिन 0.300 0.125 0.584 0.679 0.239 0.648
दूसरा दिन 0.634 0.107 0.831 0.720 0.276 0.617
सभी दिन 0.467 0.116 0.752 0.699 0.257 0.633
LTM पहला दिन 0.590 0.441 0.252 0.630 0.646 -0.027
दूसरा दिन 0.640 0.363 0.432 0.709 0.710 -0.002
तीसरा दिन 0.547 0.349 0.363 0.738 0.598 0.190
सभी दिन 0.590 0.384 0.348 0.697 0.650 0.068

तालिका 4 : सीआई और लाइट मान अलग टेस्टिंग डे पर प्राप्त किए गए।

"नाइववेवल" पाठ को निर्धारित करता है जो प्रत्येक जीनोटाइप के लिए भोले मूल्यों की पहचान करेगा। डिफ़ॉल्ट "N" है, लेकिन इसे किसी अन्य अल्फ़ान्यूमेरिकल पाठ में बदला जा सकता है।
डिफ़ॉल्ट रूप से "अस्वीकार" "लागू नहीं" (लागू नहीं) पर सेट है, लेकिन सांख्यिकीय तुलना करने के लिए इसे नियंत्रण या जीनोटाइप के नाम से बदला जा सकता है।
यह एस का कारण होगास्वचालित रूप से नियंत्रण जीनोटाइप का चयन करने के लिए cript
"डाटा नाम" डेटा फ़ाइल के नाम को संदर्भित करता है और डिफ़ॉल्ट फ़ाइल चयन के बजाय इस तर्क में निर्दिष्ट किया जा सकता है।
"हैडर" का उपयोग यह संकेत करने के लिए किया जा सकता है कि डेटा फ़ाइल में कॉलम हेडर शामिल हैं या नहीं
डिफ़ॉल्ट "सही है", लेकिन कोई हेडर वाला फ़ाइल उपयोग नहीं किया जा सकता है, जब यह तर्क बदलकर "FALSE।"
"बीज" यादृच्छिक संख्या जनरेटर को आरम्भ करता है। यह डिफ़ॉल्ट रूप से "एनए" पर सेट होता है और प्रत्येक बार स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए एक यादृच्छिक संख्या सुनिश्चित करता है।
डिज़ाइन के अनुसार, एक बूटस्ट्रैप विश्लेषण प्रत्येक डेटा को चलाने में भी थोड़ा अलग परिणाम देगा, यहां तक ​​कि एक ही डेटा फ़ाइल का उपयोग करते समय।
जब बीज शून्य से अधिक किसी भी पूर्णांक संख्या से निर्दिष्ट होता है, तो यादृच्छिक बूटस्ट्रैप नमूनों का एक ही सेट प्राप्त होता है।
"लिखें डाल "को" सही "या" गलत "पर सेट किया जा सकता है यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक आउटपुट फाइल उत्पन्न हो जाएगी। डिफ़ॉल्ट "सही है।"

तालिका 5: विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले तर्क बूटस्ट्रैप के पैरामीटर्स समायोजित करने के लिए फंक्शन की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को बदल सकते हैं

पूरक फाइल एस 1: एक प्रेसीडेंसी चैम्बर की बिल्डिंग प्लान फ़ाइल को किसी भी अनुप्रयोग से खोला जा सकता है जो .stp एक्सटेंशन (सीएडी-फाइल) की अनुमति देता हैकृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल S2 : विश्लेषणात्मक स्क्रिप्ट के लिए एक इनपुट फ़ाइल का उदाहरण ।S2.zip "target =" _ blank "> कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल एस 3 : विश्लेषण। आर एक्रिप्ट फ़ाइल आर-स्टूडियो 18 के साथ खोला जा सकता है कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ड्रॉसोफिला में सीखने और मेमोरी के विश्लेषण के लिए प्रीपेडशिप कंडीशनिंग परख क्लासिक प्रतिमान है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल 6 6 , 7 , 8 , 9 के अनुसार वर्णित सामान्य पद्धति का अनुसरण करता है , लेकिन व्यावहारिक दिशानिर्देश, विशेष उपकरण, और एक डेटा विश्लेषण स्क्रिप्ट 9 , 12 को यादृच्छिक परीक्षण के लिए अद्वितीय पहलुओं को शामिल करता है। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग करना, पुरुषों के एकत्र और प्रशिक्षित करने के लिए 96-अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे वाले ब्लॉकों ( चित्रा 2 ए ) का उपयोग करके समानांतर में बड़ी संख्या में मक्खियों का विश्लेषण करना संभव है। ब्लॉकों को पीसीआर चिपकने वाली फिल्म के साथ बंद कर दिया जाता है, जिससे मक्खियों को आसानी से सुलभ हो जाता है जब आवश्यक हो। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित अनूठी प्रेमालाप कक्षों को लगभग दो-आयामी अंतरिक्ष में 18 पुरुष और महिला जोड़े की एक साथ युग्मन के लिए अनुमति दी जाती है।वीडियो विश्लेषण के लिए इष्टतम कस्टम-डिज़ाइन किए गए प्रियाराधन कक्षों का उपयोग करना आसान है, और एक इमारत योजना प्रदान की गई है ( फ़ाइल एस 1 , चित्रा 2 डी )। वीडियो प्रोटोकॉल के अधिग्रहण के लिए परीक्षण विषयों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग की जाने वाली संस्कृतियों की स्थापना से यह प्रोटोकॉल लगभग 20 दिन ( तालिका 1 ) लेता है। वीडियो डेटा के विश्लेषण के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता है। हमारे अनुभव में, एसटीएम परख बहुत ही मजबूत है। एलटीएम परख भी काफी मजबूत है, लेकिन यह पर्यावरणीय परिवर्तनों को उलझाने के प्रति अधिक संवेदनशील है और इसलिए गुरु के लिए अधिक मुश्किल हो सकता है।

पशु व्यवहार काफी चर हो सकता है इसलिए, इस भिन्नता को कम करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम देखभाल के साथ किए जाने चाहिए। सबसे पहले, आकांक्षी ( चित्रा 2 बी ) का कोमल उपयोग तनाव को कम करेगा जो किसी न किसी प्रकार से निपटने या बहुत दृढ़ता से उड़ाने से लगाया जा सकता है। व्यक्ति को स्थानांतरित करने का सुझाव दिया गया तरीकाएस्पिरेटर से मक्खियों को नकारात्मक जियोटेक्सिस का उपयोग करना है जैसे-जैसे मक्खियों को चलना पड़ता है, वैसे ही एस्पिरेटर की टिप को आसानी से इंगित कर सकते हैं; मक्खी टिप तक पहुंचने से पहले, एक कोमल झटका उड़ने के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, पुरुषों को परीक्षण से पहले प्रलय कक्षों में जाने के लिए, एक झटका अक्सर आवश्यक नहीं है

एक और महत्वपूर्ण कदम है पुरुष परीक्षण विषयों का संग्रह और उत्पादन। जब सभी बहुत युवा और सामाजिक रूप से भोले होते हैं, तब सभी पुरुषों को इकट्ठा किया जाना चाहिए। यह एक्लूसन के चरम समय (चरण 5.2) के दौरान लगातार संग्रह द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। अगर इस तंग समय सीमा में पुरुषों को एकत्रित नहीं किया जाता है, तो वे शुरुआती सामाजिक संपर्क कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सीआई में खराब सीख या उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है। पुरुष परीक्षण विषयों का एक और पहलू जिनका मूल्यांकन किया जाना चाहिए, आनुवांशिक पृष्ठभूमि है विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि अलग-अलग स्तरों के भोले प्रेम प्रसंग प्रदर्शित करेंगे और यह सामान्य गतिविधि या गतिरोध की क्षमता में भिन्न हो सकती है। जब कंपाकई जीनोटाइप करें, आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संबंध में सावधानी बरतने के लिए इन भ्रामक कारकों से बचने के लिए लाइट स्कोर को प्रभावित कर सकते हैं इसके अतिरिक्त, सीआई डेटा का वितरण सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए। सीआई डेटा जीनोटाइप या अन्य पर्यावरणीय कारकों के आधार पर पैरामीट्रिक और गैर-पैरामीट्रिक दोनों हो सकता है। कुछ मामलों में, अगर सीआई का वितरण नाटकीय तौर पर सामान्य वितरण से दूर हो जाता है, तो लीड्स की गणना के लिए माध्य की बजाय औसत सीआई का उपयोग करना बेहतर हो सकता है। हालांकि, हमारे अनुभव में, औसत या माध्य सीआई का उपयोग डेटा के सांख्यिकीय व्याख्या में कोई अंतर नहीं करता है, और माध्य सीआई का उपयोग साहित्य में आम बात है।

सफल प्रत्यायन कंडीशनिंग के लिए, प्रत्याशित महिलाओं द्वारा पुरुष प्रणोदन प्रयासों की सक्रिय अस्वीकृति प्रशिक्षण अवधि के दौरान महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि इस परख में प्रयुक्त महिलाएं कुशलतापूर्वक विकसित हुईं और ये हैंइस प्रकार संभोग की अनुमति नहीं है। चरण 4 में तैयार किए गए संभोग शीशियों में इस परिस्थिति की स्थापना की जाती है, जहां पुरुष और महिलाएं 4 दिन ( टेबल 1 ) के लिए इकट्ठी होती हैं। इसके बाद, वीडियो परीक्षण करने और प्रशिक्षण के दौरान पुरुष-महिला जोड़े को देखकर नियमित परीक्षण द्वारा संभोग किया जा सकता है। यदि संभोग होता है, तो कई उपाय हैं जो पूर्वस्थ महिलाओं की तैयारी के दौरान लिया जा सकता है। सबसे पहले, प्रत्याशित महिलाओं को इष्टतम प्रजनन शर्तों के तहत पेश किया जाना चाहिए। शीशियों को संभावित संभोग सतहों को बढ़ाने के लिए खमीर पेस्ट और एक जोड़ फिल्टर पेपर के साथ पूरक किया जा सकता है। यहां वर्णित शर्तों के तहत मक्खियों के ऊष्मायन से पहले की स्थिति में मजबूत महिलाओं का उत्पादन हुआ है, लेकिन यह अलग-अलग प्रयोगशालाओं में भिन्न हो सकता है और विभिन्न आनुवांशिक नस्लों के इस्तेमाल से भिन्न हो सकता है। इसलिए, ऊष्मायन समय और परिस्थितियों को बदलकर पिछला महिलाओं की पीढ़ी को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

प्रेमालाप व्यवहार का मात्राकरण हैइस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम यह विशिष्ट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम 9 या मैन्युअल रूप से स्वचालित रूप से किया जा सकता है स्वचालित मात्रा का ठहराव तेजी से और, सिद्धांत रूप में, निष्पक्ष है। कई कार्यक्रम 21 , 22 , 23 प्रकाशित किए गए हैं; हालांकि, वे उपयोग करने के लिए सरल नहीं हैं, अक्सर विशेष वीडियो प्रारूपों और उन्नत कम्प्यूटेशनल कौशल की आवश्यकता होती है। मैनुअल मात्रा का ठहराव आसान और सटीक है, लेकिन यह बेहद श्रम गहन और व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता और पूर्वाग्रह के अधीन है। यह ज़रूरी है कि यह प्रोटोकॉल वीडियो प्रारूपण की आवश्यकताओं को पूरा न करें जो सीआई के स्वचालित मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक हो। मैनुअल क्वांटिफिकेशन के लिए, किसी भी सरल वीडियो रिकॉर्डिंग डिवाइस का उपयोग करें, जिसमें प्रेरकता व्यवहार को सही ढंग से निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता वाला वीडियो तैयार करने की क्षमता है। स्वचालित मात्रा का ठहराव के लिए, वहाँ अलग अलग संभावना होगीउपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के आधार पर आवश्यकताओं, और स्वचालित मात्रा का ठहराव वांछित होने पर प्रयोक्ताओं को यह अच्छी तरह से जांच करनी चाहिए।

मक्खियों के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपलब्ध व्यापक टूल के संयोजन में, प्रेरणशक्ति कंडीशनिंग परख एक मजबूत पढ़ाता प्रदान करता है जिसका इस्तेमाल आणविक तंत्रों और सीखने और स्मृति में शामिल न्यूरॉनल नेटवर्क काटना करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम ड्रोसोफिला नस्लों को प्रदान करने के लिए वियना ड्रोसोफिला संसाधन केंद्र को स्वीकार करते हैं। इसके अतिरिक्त, इस अध्ययन में ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (एनआईएच P40OD018537) से प्राप्त स्टॉक का उपयोग किया गया था। इस शोध को यूरोपीय संघ के एफपी 7 बड़े पैमाने पर एकीकृत नेटवर्क जेनकोडी के के के, एचवीबी और एएस और एनएसईआरसी डिस्कवरी और सीआईएचआर परियोजना अनुदानों द्वारा जेएमके को समर्थन प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
P{KK101437}VIE-260B VDRC 101437 Dhat-at-RNAi in 60100 background 
P{KK108109}VIE-260B - - Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)  - - panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture VWR 960177 175 mL plastic vials
Folded filters Whatman 10311643 Filter paper to enlarge area flies can pupate on 
Flat-bottom blocks (96-wells) Qiagen 19579 Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film Applied Biosystems 4306311 PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade - - Any sharp will do
Needle  - - 0.8 mm diameter
Aspirator - - Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. 
Courtship chambers - - file S1 can be opened with indicated CAD software 
Camcorder Sony - camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name Company Catalog Number Comments
power food
Agar Sigma A7002
Yeast Bruggeman -
Yeast extract MP biomedicals 0210330391 
Peptone Sigma P6838
Sucrose Sigma S9378
Glucose Sigma G7021
MgSO4 Sigma M2643
CaCl2 Merck 1023780500
Methylparabene (CAUTION) Sigma H5501
Propionic acid (CAUTION) Sigma P1386
Demineralized water -
Yeast paste - yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name Company Catalog Number Comments
normal food
Agar MP biomedicals 215017890
Yeast bruggeman -
Corn flour de Molen -
Sugar de Molen -
Methylparabene (CAUTION) Sigma H5501
Propionic acid (CAUTION) Sigma P1386
Demineralized water -

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References

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Koemans, T. S., Oppitz, C., Donders, More

Koemans, T. S., Oppitz, C., Donders, R. A. T., van Bokhoven, H., Schenck, A., Keleman, K., Kramer, J. M. Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory. J. Vis. Exp. (124), e55808, doi:10.3791/55808 (2017).

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