Summary
证明了一种用于小动物高速体内脑成像的紧凑型基于脉冲激光二极管的光声层析成像（PLD-PAT）系统。
Abstract
体内小动物成像在临床前研究中起重要作用。光声层析成像（PAT）是一种新兴的混合成像模式，显示临床前和临床应用的巨大潜力。传统的基于光学参数振荡器的PAT（OPO-PAT）系统体积庞大且昂贵，不能提供高速成像。最近，脉冲激光二极管（PLD）已被成功地证明是PAT的替代激发源。已经成功地证明了脉冲激光二极管PAT（PLD-PAT）用于光声模型和生物组织的高速成像。这项工作提供了使用PLD-PAT的体内脑成像的可视化实验方案。该协议包括紧凑的PLD-PAT系统配置及其描述，用于脑成像的动物准备，以及用于2D横断面大鼠脑成像的典型实验程序。 PLD-PAT系统紧凑且成本低廉有力的，可以提供高速，高品质的成像。提出了以各种扫描速度在体内收集的脑图像。
Introduction
光声层析成像（PAT）是一种混合成像模式，在临床和临床前研究1,2,3,4,5中都有许多应用。在PAT中，纳秒激光脉冲照射生物组织。由组织发色团吸收入射光导致局部温度升高，然后产生以声波形式发射的压力波。超声波检测器在样品周围的各个位置收集光声信号。使用各种算法（诸如延迟和和算法） 6重建光声（PA）信号以产生光声像。
这种混合成像模式提供高分辨率，深层组织成像和高光吸收对比度7 ，class =“xref”> 8。近来，借助于较长波长（〜1,064nm）和称为磷酞菁的外源性造影剂，在鸡胸肉组织中获得〜12cm成像深度9 。这种深度灵敏度远远高于其他光学方法的深度敏感度，如共聚焦荧光显微镜，双光子荧光显微镜， 10光学相干断层扫描等。使用多个波长，PAT可以显示器官的结构和功能变化。对于许多人类疾病，小动物模型已经确立了12,13,14,15 。对于小动物的成像，已经证明了几种方式。在所有这些方法中，PA成像由于上述优点而获得了相当快的关注。 PAT已经显示出在4,16,17,18小动物的组织和器官（ 即心脏，肺，肝脏，眼睛，脾脏，脑，皮肤，脊髓，肾脏等 ）中成像血管的潜力。 PAT是一种成熟的小动物脑成像模式。 PA波由于发色团的光吸收而产生，所以多波长PAT允许总血红蛋白浓度（HbT）和氧饱和度（SO 2 ）的映射19,20,21,22。借助外源性造影剂12,23,24获得脑神经血管成像。 PA模式可以帮助更好地了解大脑健康提供分子和遗传水平的信息。
对于小动物成像，Nd：YAG / OPO激光器被广泛用作PAT激发源。这些激光器以〜10Hz的重复频率25提供〜5ns的近红外脉冲，能量（在OPO输出窗口为〜100mJ）。配备这种激光器的PA系统是昂贵且庞大的，由于激光源的重复率较低，因此可以使用单元件超声换能器（UST）进行低速成像。这种PA系统的典型A线采集时间为每个截面25分钟〜5分钟。具有如此长的测量时间的成像系统对于小动物成像是不理想的，因为难以控制全身成像，时间分辨功能成像等的生理参数。通过采用多个单元件UST，阵列的UST或高重复率激光器，可以提高PA的成像速度系统。仅使用一个单元件UST来收集样品周围的所有PA信号将限制系统的成像速度。以圆形或半圆形几何形式布置的多个单元件UST被演示用于高速，高灵敏度成像技术。基于阵列的UST 26 ，例如线性，半圆形，圆形和体积阵列已经成功地用于实时成像1 。这些基于阵列的UST将增加成像速度并降低测量灵敏度，但是它们昂贵。然而，使用基于阵列的UST的PA系统的成像速度仍受激光器重复率的限制。
脉冲激光技术先进于制造高重复率脉冲激光二极管（PLD）。使用临床超声波平台的PLD证明了7,000帧/秒的B扫描光声成像。这样的PLD可以提高th的成像速度e PAT系统，即使采用单元件UST圆形扫描几何形状。不同于基于阵列的UST，单元件UST更便宜且高度灵敏。在过去十年中，很少有人研究使用高重复率PLD作为PA成像的激发源。已经证明了基于纤维的近红外PLD，用于PA成像的幻影28 。使用低能量PLD 29证明了在人皮肤下约1毫米深度的血管的体内成像。报道了基于PLD的光学分辨率光声显微镜（ORPAM）。使用PLD，以0.43Hz的帧率显示〜1.5cm深的成像。最近，一个PLD-PAT系统被报道，提供的图像在短短的〜3秒和在〜2厘米成像深度的生物组织25,31 。这项研究证明，这样一个低成本，紧凑的系统可以提供高品质甚至高速图像。 PLD-PAT系统可用于高帧率（7,000 fps）光声成像，表面血管成像，手指关节成像，2厘米深的组织成像，小动物脑成像等 。单波长和来自PLD的低脉冲能量脉冲将其应用限于多光谱和深层组织成像。使用与临床前应用相同的PLD-PAT系统对小动物进行实验。这项工作的目的是提供PLD-PAT系统的可视化实验演示，用于小动物的体内 2D横断面脑成像。
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Protocol
所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物保护和使用委员会批准的指导方针和规定进行（动物标本编号ARF-SBS / NIE-A0263）。
系统说明
- 将PLD安装在圆形扫描仪内， 如图1a所示。将PLD连接到激光驱动单元（LDU）。
注意：PLD在〜803 nm的波长下提供〜136 ns的脉冲，最大脉冲能量为〜1.42 mJ，重复率高达7 kHz。激光驱动单元（LDU）包括：温度控制器，可变电源，电源（12V）和功能发生器;见材料表。可变电源用于控制激光功率，功能发生器用于改变PLD的重复率。 - 打开PLD激光。将PLD重复率设置为“7,000”Hz通过使用LDU中的函数发生器。通过将可变电源的电压设置为“3.1”V将脉冲能量增加到1.42 mJ。
- 将光扩散器（OD）安装在PLD出口窗口前方，使输出光束均匀， 如图1a所示。
注意：使用细砂粒的扩散器（ 即 1500粒度抛光）。 - 将聚焦的UST安装在UST支架上，使其面向扫描区域的中心， 如图1a所示。
注意：UST的中心频率为2.25 MHz，焦距为1.9 in。 - 将超声波检测仪置于丙烯酸罐内， 如图1a所示。给水箱加水，使UST完全沉浸。
注意：水介质用于将来自大脑（样品）的光声信号耦合到UST。丙烯酸水箱（WT;见材料表）是习惯的- 设计用于小动物成像。水箱设计示意图如图1b所示。 - 使用脉冲发生器/接收器单元（PRU;参见材料表 ）检查样品中的PA信号。
注意：这些信号由12位DAQ卡（参见材料表 ）以100 MS / s采样率数字化，并保存在计算机上。
2.大鼠脑成像的动物准备
注意：上述的PLD-PAT系统被证明用于成像小动物大脑。对于这些实验，使用健康的雌性大鼠（参见材料表 ）。
- 通过腹膜内注射2mL氯胺酮，1mL的赛拉嗪和1mL的盐水（剂量为0.2mL / 100g）麻醉动物。
- 使用剪发器去除动物头皮上的毛皮。将剃毛膏轻轻涂抹于剃须面毛皮进一步耗尽的区域。
- 4-5分钟后使用棉签去除涂抹的霜。
- 将人造泪液用于动物眼睛，以防止由于麻醉和激光照射引起的干燥。
- 在实验室插孔上安装配有呼吸面罩的定制动物架（参见材料 表 ）。
- 将动物置于支架上的俯卧位。使用手术胶带将其固定到支架上，以避免动物在成像过程中移动。
- 确保呼吸面罩覆盖大鼠的鼻子和嘴巴以输送吸入麻醉剂。
3. 体内大鼠脑成像
- 将呼吸面罩连接到麻醉机。打开麻醉机，将其设置为以0.75％异氟烷提供1.0升/分钟的氧气。
- 将脉搏血氧仪固定在其上的尾巴来监测动物的生理状态。
- 在大鼠头皮上涂一层无色超声波凝胶。将实验室插孔位置调整到扫描仪的中心。呼吸面罩是定制的，以适应成像窗口。将10％的市售鼻锥切割然后连接到一块手套上。
- 手动调整实验室插孔的高度，使成像平面位于UST的焦点。
- 根据需要在数据采集软件中设置参数（参见材料表）。运行数据采集软件程序开始采集（ 即成像）。
注意：该程序用于旋转UST并收集A线PA信号。收集的A行将保存在计算机上。 - 在整个成像期间观察动物，并在成像完成后进行PAT重建。
- 数据采集结束后，使用重建软件程序从A线重建横断面脑图像。
- 关闭麻醉系统，从舞台上取出动物，将其返回笼子，并监视它，直至恢复意识。
注意：例如，如果UST旋转5秒，则PLD提供35,000（= 5×7000）个脉冲，UST收集35,000条A线。通过平均超过70个信号（平均A线= 35,000 / 70 = 500），将35,000条A线减少到500条。 图1c示出了激光脉冲和A线收集的照明。应该使用基于延迟和总和反投影算法的重建程序。
图1： PLD-PAT系统的示意图。 （ a ）PLD-PAT示意图。 PLD：脉冲激光二极管，CSP：电路AM：麻醉机，M：电机，MPU：电机皮带轮单元，LDU：激光驱动单元，PRU：脉冲发生器/接收器单元，UST：超声波换能器，WT：水箱，PF：聚合物膜和DAQ：数据采集卡。 （ b ）水箱示意图， 体内小动物脑成像的俯视图（1）和截面图（2）。 A：公制螺丝，B：丙烯酸环状板，C：硅胶“O”形环，D：100μm厚，透明聚乙烯盖。该罐的底部有一个9厘米直径的孔，并用超声光学透明的100μm厚的聚乙烯膜密封。 （ c ）来自PLD和A线的激光脉冲的照明示意图，在5秒的连续扫描时间内收集。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
本节将介绍展示所描述的PLD-PAT系统的能力的体内脑成像结果。为了演示PLD-PAT系统的高速成像能力，进行了两种不同健康大鼠的体内脑成像。 图2以各种扫描速度显示雌性大鼠（93g）的脑图像。 图2a和b显示了在脑区域去除头皮之前和之后的大鼠脑的照片。 PAT成像是非侵入性的（ 即，皮肤和颅骨完整）。通过循环旋转UST 5秒，10秒，20秒和30秒来收集来自大脑横截面的PA信号。 图2c -f显示了在5秒，10秒，20秒和30秒扫描时间获得的大鼠脑的PAT重建的横截面图像。在所有这些脑图像中，横窦（TS），上矢状窦（SS）和脑静脉（CV），包括分支，清晰可见。这些功能在图2f所示的图像上显示。这些结果承诺，即使在高扫描速度下，该系统也能提供高质量的体内图像。
图2： 非侵入性体内 PLD-PAT图像。 93g雌性大鼠脑血管系统的非侵入性PLD-PAT图像。 （ a ）之前和之后（ b ）去除头皮的大鼠脑的照片。不同扫描时间的体内脑图像：（ c ）5s，（ d ）10s，（ e ）20s和（ f ）30s。 SS：矢状窦，TS：横窦，CV：脑静脉。 les / ftp_upload / 55811 / 55811fig2large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
在另一只雌性大鼠（95g）上进行了类似的成像实验，并且在5秒，10秒，20秒和30秒中获得的相应的脑图像显示在图3中 。
图3 ：非侵入性体内 PLD-PAT图像。在95g雌性大鼠脑中脉管系统的非侵入性PLD-PAT图像。 （ a ）之前和之后（ b ）去除头皮的大鼠脑的照片。不同扫描时间的体内脑图像：（ c ）5s，（ d ）10s，（ e ）20s和（ f ）30s。rce.jove.com/files/ftp_upload/55811/55811fig3large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该工作提出了使用PLD-PAT系统对大鼠进行体内脑成像的方案。该方案包括成像系统及其对准的详细描述，以及对大鼠脑成像的说明。现有的基于OPO的PAT系统是昂贵且庞大的，并且可以在5-10分钟内提供一个横截面图像。 PLD-PAT系统紧凑，便携，低成本，可在3秒内提供高质量的图像。系统的性能先前在幻影中进行了研究，并与传统的PAT系统25进行了比较 。在这里，相同的PLD-PAT被证明用于快速体内脑成像。结果表明，该系统可以提供高质量的体内图像，甚至在5秒内。
虽然有几个优点，PLD-PAT系统有几个缺点。本研究中使用的PLD提供单个波长的脉冲，因此无法提供功能需要多波长照明。对于功能成像，需要具有多波长照明能力的PLD。低能量PLD脉冲限制成像深度。然而，使用外源造影剂，可以增强PLD-PAT系统的成像深度。
通常，PLD激光束不均匀，因此可以在激光窗前面使用合适的光学扩散器来提高图像质量。确保激光束的中心和成像区域的中心重合。在扫描大脑周围的UST的同时，确保UST始终面向扫描中心。在实施方案时，需要采取额外的护理：（a）麻醉剂量应根据动物体重进行施用; （b）麻醉注射必须精确，使器官（ 例如膀胱，肠和肾）不受影响; （c）在头发中倾倒，确保动物头皮不被刮伤; （d）水箱对动物的压力必须尽量小;和（e）在将动物定位在扫描仪下方时，确保大脑的成像横截面平面位于UST的中心。系统的未来应用包括脑肿瘤成像，小动物成像不同器官，5秒以内的高速成像，造影剂生物材料的研究和治疗应用。如果图像质量低，则可能需要进行故障排除。
激光安全小动物 体内 成像
皮肤的最大允许暴露（MPE）限制取决于几个参数，如激发波长，脉冲宽度，暴露时间，照射面积等 。 体内成像的MPE限制受美国国家标准s研究所（ANSI） 32 。在700至1050nm波长范围内，由单个脉冲输送的皮肤上的能量密度应小于20×10 2（λ-700）/ 1,000mJ / cm 2 （λ：激发波长（nm））。对于803nm PLD波长，限制为〜31mJ / cm 2 。如果激光在t = 5秒的时间内连续使用，则MPE为1.1×10 2（λ-700）/ 1000 ×t 0.25J / cm 2 （= 2.6J / cm 2 ）。在该实验中，PLD以7,000Hz运行。在5秒扫描时间内，总共输送了35,000（5×7000）个脉冲，因此每脉冲MPE为0.07mJ / cm 2 。在所描述的成像系统中，PLD以每脉冲约1.05mJ的能量递送脉冲，激光束在约12.6cm 2的面积上扩展。因此，脑区域的激光能量密度为〜0.08 mJ / cm 2 。 PAT系统的ANSI激光安全极限可以是ch通过降低激光功率，通过扩大激光束或通过降低脉冲重复率而衰减。
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Disclosures
作者对手稿没有相关的经济利益，也没有其他潜在的利益冲突披露。
Acknowledgments
研究由新加坡教育部（ARC2 / 15：M4020238）和新加坡卫生部国家医学研究委员会（NMRC / OFIRG / 0005/2016：M4062012）资助的第二级拨款支持。作者要感谢周伟雄博士为机加工店的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pulsed laser diode | Quantel, France | QD-Q1910-SA-TEC | It is the excitation laser source with specifications 803 nm, 1.4 mJ per pulse, 136 ns pulse, 7 kHz maximum, dimentions : 11.0 x 6.0 x 3.6 cm, weight: ~150 gm |
| Stepper motor with gearbox | LIN Engineering (Servo Dynamics) | Motor: CO-5718-01P, Gearbox: DPL64/1, I = 10 for NEMA 23; power supply PW100-48 | To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2 |
| Ultrasonic pulser/receiver | Olympus | 5072PR | To receive, filter and ampligy the PA signal from UST. Its bandwidth is 35 MHz, and gain is ±59 dB. |
| Ultrasound Transducer | Olympus | V306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069 | Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 2.25 MHz, 0.5 in, Cylindrical focus 1.9 inch |
| PCIe DAQ (Data acquisition) Card | GaGe | CSE4227/ A6000610/B0E00610 | 12 bit, 100 Ms/s, 2 channels, 1 Gs on board memory, PCIe x16 interface |
| Rats | In Vivos Pte Ltd, Singapore | NTac:SD, Sprague Dawley / SD | Female, weight 100 ±10g |
| Acrylic water tank | NTU workshop | Custom-made | It contains the water that acts as an acoustic coupling medium between brain and detector |
| Circular Scanner | NTU workshop | Custom-made | Scanner is made out of Alluminum |
| Anesthetic Machine | medical plus pte ltd | Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator. | Supplies oxygen and isoflurane to animal |
| Pulse Oxymeter portable | Medtronic | PM10N with veterinary sensor | Monitors the pulse oxymetry of the animal |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Clear ultrasound gel |
| Data acqusison software | National Instruments Corporation,Austin,TX,USA) | NI LabVIEW 2015 SP1 | LabVIEW based program was developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector |
| Data processing software | Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) | Matlab R2012b | Matlab code for reconstruction of PA images was developed in our lab |
| Temperature controller | LaridTech, MO,USA | MTTC1410 | It will constantly control temperature of the PLD |
| 12 V power supply | Voltcraft | PPS-11810 | To supply operating voltage for PLD |
| Variable power supply | BASETech | BT-153 | To change the laser output power |
| Funtion generator | Funktionsgenerator | FG250D | To change the repetetion rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation. |
| Animal distributor | In Vivos Pte Ltd, Singapore | Animal distributor that supplies small animals for research purpose. | |
| Animal holder | NTU workshop | Custom-made | Used for holding the animal on its abdomen |
| Breathing mask | NTU workshop | Custom-made | Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal |
| Pentobarbital sodium | Valabarb | Used for euthanizing the animal after the expeirment. | |
| Optical diffuser | Thorlabs | DG10-1500 | Used to to make the laser beam homogeneous |
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