Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at syntetisere funktionelle sensorer på bærbar, omkostningseffektive, og hurtig påvisning af specifikt målrettet sygdomsfremkaldende bakterier gennem en kombination af magnetiske afslapning og fluorescens emission modaliteter.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 er blevet forbundet med både vandbårne og fødevarebårne sygdomme, og er stadig en trussel på trods af mad - og vand-screeningsmetoder bruges i øjeblikket. Mens konventionelle bakteriel påvisningsmetoder, såsom Polymerasekædereaktionen (PCR) og enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA) specifikt registrerer patogene stoffer, kræver de omfattende prøveforberedelsen og lange ventetider. Derudover disse praksis kræver avancerede laboratorieinstrumenter og indstillinger, og skal udføres af uddannede fagfolk. Heri, foreslås en protokol for en enklere diagnostisk teknik, der er udstyret med den unikke kombination af magnetiske og fluorescerende parametre i en nanopartikel-baseret platform. Den foreslåede multiparametric magneto-fluorescerende sensorer (MFnS) kan finde E. coli O157: H7 kontaminering med så lidt som 1 kolonidannende enhed i løsning inden for mindre end 1 time. Derudover MFnS evne til at forblive meget funktionelle i komplekse medier såsom mælk og søvand er blevet verificeret. Yderligere specificitet assays blev også brugt til at demonstrere evne til MFnS at kun opdage de specifikke målbakterierne, selv i nærværelse af lignende bakteriearter. Parring af magnetiske og fluorescerende modaliteter giver mulighed for påvisning og kvantificering af patogenet forurening i en bred vifte af koncentrationer, udstiller sine højtydende i både tidlige - og sene forurening påvisning. Effektivitet, overkommelighed og overførsel af MFnS gøre dem en ideel kandidat til punkt af pleje screening for bakterielle kontaminanter i en bred vifte af indstillinger, fra akvatiske reservoirer til kommercielt emballerede fødevarer.
Introduction
Den vedvarende forekomst af bakteriel forurening i både kommercielt fremstillede fødevarer og vandkilder har skabt et behov for mere og mere hurtig og specifik diagnostisk platforme. 1 , 2 nogle af de mere almindelige bakterielle kontaminanter ansvarlig for mad og vand kontaminering er fra Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus og Escherichia slægterne. 3 , 4 bakteriel forurening af disse patogener ofte resulterer i symptomer som feber, kolera, gastroenteritis, og diarré. 4 forurening af vandkilder ofte har drastiske og negative virkninger på Fællesskaber uden adgang til tilstrækkeligt filtreret vand, og forurening af fødevarer har ført til et stort antal sygdomme og produkt recall indsats. 5 , 6
For at mindske forekomsten af sygdomme forårsaget af bakteriel forurening, har der været en række bestræbelser på at udvikle metoder, som vand og fødevarer kan effektivt scannes før salg eller forbrug. 3 teknikker såsom PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 loop-medieret isotermisk forstærkning ( LAMPE),13,14 ,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 er for nylig blevet anvendt til påvisning af forskellige patogener. Sammenlignet med traditionelle bakteriel dyrkning metoder, er disse teknikker langt mere effektive med hensyn til specificitet og tid. Men disse teknikker stadig kamp med falske positiver og negativer, komplekse procedurer og omkostninger. 1 , 3 , 25 det er netop derfor at multiparametric magneto-fluorescerende sensorer (MFnS) er foreslået som en alternativ metode til registrering af bakteriel.
Disse sensorer par unikt sammen magnetiske afslapning og fluorescerende modaliteter, giver mulighed for en dobbelt-registrering platform, der er både hurtig og præcis. Ved hjælp af E. coli O157: H7 som prøve forurenende stof, er MFnS evne til at afsløre så lidt som 1 CFU inden for minutter påvist. Patogen-specifikke antistoffer bruges til at øge specificitet, og kombinationen af både magnetiske og fluorescerende modaliteter giver mulighed for påvisning og kvantificering af bakterielle kontaminanter i både lav - og høj-kontaminering intervaller. 16 for bakteriel forurening, vil sensorer sværmer omkring bakterier på grund af de målretning evner af patogen-specifikke antistoffer. Bindingen mellem den magnetiske sensorer og bakterier begrænser samspillet mellem den magnetiske jernkerne og de omkringliggende vand protoner. Dette medfører en stigning i T2 afslapning gange, som er registreret af en magnetisk relaxometer. Som koncentrationen af bakterier i løsning stiger, sprede sensorer med det øgede antal bakterier, resulterer i lavere T2 værdier. Omvendt, fluorescens emission vil stige i andelen med koncentrationen af bakterier på grund af det øgede antal sensorer direkte bundet til patogen. Centrifugering af prøverne, og isolering af den bakterielle pellet, vil kun spare nanopartikler direkte knyttet til bakterier, at fjerne enhver frit svævende sensorer, og direkte korrelerede fluorescens emission med antallet af bakterier er til stede i løsning. En skematisk gengivelse af denne mekanisme er repræsenteret i figur 1.
Denne MFnS platform er designet med punkt af pleje screening i tankerne, resulterer i lave omkostninger og bærbare egenskaber. MFnS er stabilt ved stuetemperatur, og er kun nødvendig i meget lave koncentrationer for nøjagtig påvisning af bakterielle kontaminanter. Desuden, efter syntese, brug af MFnS er enkel og kræver ikke brug af uddannede fagfolk på området. Endelig, denne diagnostiske platform giver mulighed for meget tilpasselig målretning giver dig mulighed for ved denne én platform kan bruges til at registrere patogener i alle former, i mange forskellige indstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese og Functionalization af multi parametrisk Magneto-fluorescerende sensorer (MFnS).
- Syntese af superparamagnetisk jernoxid nanopartikler (IONPs)
- at forberede IONP syntese, forberede de følgende 3 løsninger: løsning 1: FeCl 3 (0,70 g) og FeCl 2 i H 2 O (2 mL), løsning 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) i H 2 O (15 mL) og løsning 3: polyacrylic syre (0.855 g) i H 2 O (5 mL).
- Tilføje 90 µL 2 M saltsyre (HCl) til løsning 1 og derefter blandes straks med løsning 2 samtidig med vortexing på 875 rpm. Derefter tilføje løsning 3. Fortsat vortexing for 60 min.
- Der centrifugeres i 20 min. ved 1620 x g. centrifugeres supernatanten i 20 min. på 2,880 x g.
- Rense den endelige supernatanten via dialyse. Tilføje supernatanten til en dialyse taske (MWCO 6 − 8 K) og placere den i et bægerglas, der indeholder fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH = 7.4) og spin bar. Lad det trække til 12 h, erstatte med frisk buffer hver 2-3 h.
- Konjugation af target-specifikke antistoffer mod overfladen af IONPs
- forberede følgende fire løsninger: løsning A: 5 mg 1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) i 250 µL MES [2-(N- morpholino) ethanesulfonic syre] buffer (0,1 M, pH = 6,8), løsning B: 3 mg af N-Hydroxysuccinimide (NHS) i 250 µL af MES buffer (0,1 M, pH = 6,8), løsning C: 5 µg af IgG1, E. coli-mAb i 225 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH 7,4) , og løsningen D: 4 mL af IONP (5,0 mmol) i 1 mL PBS (pH 7,4).
- Tilføje 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer til opløsning A, derefter straks tilføje opløsning A til løsning D i små intervaller inden for 15 s, invertere løsningen efter hver tilsætning til at blande.
- Straks begynde at tilføje løsning B til løsning D i små intervaller over en tre-minutters periode. Mix af invertere løsningen efter hver tilsætning.
- Tilsættes opløsning C til løsning i intervaller af 5 µL, invertere løsningen efter hver tilsætning til at blande.
- Tillade reaktion til at fortsætte i 3 timer ved stuetemperatur og derefter fortsætte inkubation ved 4 ° C natten.
- Rense de resulterende Ab-konjugeret IONPs via magnetiske kolonne ved hjælp af PBS (pH = 7.4, endelig [Fe] = 3,5 mmol) til at fjerne enhver ukonjugeret antistoffer.
- Vask kolonnen magnetiske med PBS (1 mL). Knytte kolonnen til den magnetiske plade, og tilføje IONP løsning.
- Vaske kolonnen magnetiske med PBS (1 mL) igen. Fjern kolonnen magnetiske fra magnetisk plade. Tilføje PBS til kolonnen og indsamle løsningen. Opbevares ved 4 ° C
- indkapsling af fluorescerende 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DiI) farvestof i polyacrylic syre (PAA) belægning af antistof konjugeret IONPs ved hjælp af en opløsningsmiddel diffusion metode.
- Til 4 mL af IONPs, tilføje dråbevis 2.0 µL af DiI farvestof (2 mmol) i 100 µL af DMSO med kontinuerlig blanding på 1100 rpm.
- Dialyze den resulterende løsning (MWCO 6-8 KDa, 12 h) mod PBS, skabe en endelige løsning med MFnS med en afsluttende jern koncentration af [Fe] = 2 mmol.
- Karakterisering af MFnS
- For spektrofotometriske analyse, bruger en Pladelæser til at registrere indkapslede DiI farvning med fluorescens emission på 595 nM.
- Dynamiske lys spredning
- placere et udsnit af MFnS løsning til en zetasizer til at bestemme den gennemsnitlige størrelse og overflade afgift af MFnS.
Bemærk: Her, den gennemsnitlige størrelse og overflade afgift af funktionelle MFnS fandtes for at være 77.09 nm og-22.3 mV, hhv.
- placere et udsnit af MFnS løsning til en zetasizer til at bestemme den gennemsnitlige størrelse og overflade afgift af MFnS.
2. Bakteriel Culturing og Stock løsning forberedelse
- bakteriel dyrkning
- hydrat et frysetørret pellet (E. coli O157: H7) i 1 mL af næringsstof bouillon og derefter tilføje en ekstra 5 mL af bouillon.
- Anvende 100 µL af denne opløsning til en agar plade og streak ved hjælp af en steril podning løkke, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 24 h.
- Efter 24 h, Vælg en isoleret koloni fra agar plade og føje den til en 15 mL kultur bouillon. Der inkuberes ved 37 ° C i 4-6 h, mens overvågningen ekstinktionen værdi (absorbans på 600 nm).
- Når en optisk tæthed værdi på 0,1 er opnået, stoppe dyrkning, og udføre serielle fortyndinger.
- Serielle fortyndinger
- tilføje 900 µL af næringsstof bouillon til otte sterile microcentrifuge rør.
- Tilsættes 100 µL af den bakterielle suspension til det første rør (fortynding 10 -1).
- Tage 100 µL fra først tube og føje den til andet, at opnå en fortynding af 10 -2. Fortsætte dette mønster for de resterende rør, slutter med en endelige fortynding af 10 -8.
- Overføres 100 µL af hvert rør til at adskille agar plader og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C.
- Den næste dag, tælle kolonidannende enheder (CFUs) på hver plade. Vælg pladen med ~ 100 CFUs. Bruge de tilsvarende fortyndinger for yderligere eksperimenter (100 µL = ~ 100 CFUs).
Bemærk: Her var det den 10 -6 fortynding, der resulterede i ~ 100 CFUs.
3. Hurtig påvisning af E. coli O157: H7 ved hjælp af MFnS
- Spike forskellige PBS løsninger (1 X, pH 7,4, 300 µL) med stigende mængder af 10 -6 bakteriel materiel, hvilket resulterer i CFU spænder fra 1-100. Tilføje en sammenhængende mængde af MFnS (100 µL) til disse løsninger.
- Oprette en baseline løsning, der indeholder kun PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) og MFnS (100 µL).
- Ruger løsninger til 30 minutter ved 37 ° C og derefter give dem afkøle til stuetemperatur.
- Overførsel individuelle løsninger til den magnetiske relaxometer (0,47 Tesla) og registrere ændringer i afslapning gange (T2) i forhold til CFUs i hver løsning.
- Til at registrere ændringer i T2 værdier, begynder ved at måle T2 værdien af den oprindelige løsning, der indeholder kun PBS og MFnS.
- Sted løsning i den magnetiske relaxometer. Åbne den respektive software, skal du vælge den " T2 afslapning " indstilling og tryk " foranstaltning. "
- efter indsamling af baseline T2, måle T2 værdierne af de yderligere løsninger, der blev tilsat forskellige koncentrationer af bakterier.
Note: Ændring i T2 er svarende til baseline T2 fratrækkes den spidse T2.
- Til at registrere ændringer i T2 værdier, begynder ved at måle T2 værdien af den oprindelige løsning, der indeholder kun PBS og MFnS.
- Fjerne prøver fra den magnetiske relaxometer og centrifugeres rør på 2880 x g i 10 min.
- Den dekanteres og resuspend bakteriel pellets i 100 µL af PBS (1 X, pH 7,4).
- Tilføje 80 µL af hver resuspension til en 96-brønd plade og optage fluorescens intensiteter på 595 nM.
Bemærk: Test kan blive gentaget ved hjælp af forskellige opløsningsmidler, herunder søvand, mælk og andre som beskrevet i afsnittet resultater
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFnS virkningsmekanisme er repræsenteret i figur 1. Klynger af MFnS omkring overfladen af bakterielle kontaminanter forstyrrer interaktioner mellem magnetic cores af MFnS og de omkringliggende brint kerner. Som følge af denne klyngedannelse, magnetiske afslapning øge værdier. Da koncentrationen af bakterielle kontaminanter stiger, klyngedannelse reducerer, og ændringen i T2 værdier falder. Tilføjelse af en fluorescerende modalitet er derfor afgørende. Som bakteriel koncentrationen stiger, øger styrken af fluorescerende signal produceret af MFnS, giver mulighed for følsomme påvisning af bakterielle kontaminanter i både lav og høj koncentrationsintervaller.
Efter protokollen,16 MFnS blev syntetiseret og først afprøvet i løsninger af PBS (1 X, pH 7,4). Den indledende modalitet anvendes til detektion, magnetiske afslapning, blev brugt til at registrere ændringer i T2 værdier. I henhold til protokollen, prøverne blev derefter centrifugeres, pellets var genopslemmes og fluorescens data blev indsamlet. Tilsvarende Δt2 og fluorescens emissionsværdier er præsenteret i figur 2. Som vist, Δt2 værdi var størst ved lavere koncentrationer af bakteriel forurening, og nåede mætning på ca 20 CFUs. Fluorescens emission, på den anden side blev mere præcist på > 20 CFUs, viser betydningen af at kombinere disse to modaliteter. Efter disse primære assays, lignende tests blev udført i komplekse medier, herunder søvand og mælk. Dette blev gjort for at sikre, at sensorer er stadig effektiv i mere komplekse medier. Data indsamlet fra disse assays er præsenteret i figur 3 og er meget lig assays gennemføres i PBS. Dette kontrollerer, at disse sensorer forbliver effektiv i komplekse medier.
Efter at have bekræftet, at MFnS kunne påvise tilstedeværelsen af bakterielle kontaminanter i både enkle og komplekse medier, blev en række test derefter gennemført for at fastslå omfanget af specificitet vedligeholdes af sensorer. Med henblik herpå, blev MFnS udruget i opløsninger indeholdende målbakterierne, Varme-dræbte målbakterierne, ikke-målarter bakterier (ikke-sygdomsfremkaldende E. coli og S. typhimurium) og en blanding. Da dette var kun en specificitet, analyse, indsamling af magnetiske afslapning data alene var tilstrækkelig, og de tilsvarende data er præsenteret i figur 4. Som det ses, at MFnS bundet kun for at leve E. coli O157: H7, og ikke til andre varme-dræbte eller ikke-målarter bakterier. Denne grad af specificitet er tilskrevet de konjugerede målretning antistoffer, og yderligere bekræfter, at MFnS vil være effektiv til påvisning af specifikke patogen forureninger, selv når i nærværelse af ikke-sygdomsfremkaldende bakteriearter.
Figur 1 : Magneto-fluorescerende Detection mekanisme. Skematisk repræsentation af MFnS syntese og dual-modal mekanisme af bakteriel påvisning. Efter en kort inkubationstid (30 min) er MFnS købedygtig opdager nænsomt målbakterierne via en kombination af Kernemagnetisk resonans og fluorescens emission. Klynger af MFnS omkring overfladen af bakterielle kontaminanter medfører ændringer i værdier, magnetiske afslapning, som kan påvises ved en magnetisk relaxometer. Fluorescerende signaler kan desuden afhentes fra MFnS direkte bundet til bakterielle kontaminanter. Dette giver en dual-modal påvisning platform i stand til påvisning bakterielle kontaminanter i både lav og høj koncentrationsintervaller. 16 dette tal er blevet ændret med tilladelse fra. 16
Figur 2 : Proof of Concept. A) magnetiske afslapning data (Δt2) blev først indsamles fra fortyndinger af E. coli O157: H7 (1-100 CFU) i PBS opløsningsmiddel (1 X, pH = 7.4). Hr. påvisning af bakterier var meget følsomme på lavere CFU tæller (indsatser: lige fra 1-20 CFU). Dog Δt2 aflæsninger blev mættet ved højere bakteriel koncentrationer (> 20 CFU), som angiver, at hr. er mere værdifulde for påvisningen og kvantificeringen af tidlige bakteriel forurening. B) Fluorescens emissionsdata fra samme spidse PBS løsninger (indsatser: linearitet plot). Resultaterne viste, at fluorescens påvisningsmetode er mere følsom på højere CFU tæller, mens det mangler i følsomhed for lavt CFU prøver. Sammen, viser disse data evne til både magnetiske og fluorescerende modaliteter til at detektere og kvantificere bakteriel forurening i tidlige - og sene-stadier af bakteriel forurening. 16 gennemsnitlige værdier af tre målinger er skildret ± standardafvigelse. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra. 16
Figur 3 : Bakteriel påvisning i komplekse medier. Magnetiske afslapning Δt2 data indsamlet fra mere komplekse medier, herunder A) sø vand og B) sødmælk. Svarende til de data, der indsamles fra de tidligere PBS løsninger, blev det bemærket, at påvisning af bakterielle kontaminanter var mere følsom i intervallet 1-20 CFU (mellemværker). Tilsvarende fluorescens emissionsdata blev indsamlet til C) søvand og D) mælk prøver (mellemværker: linearitet parceller), som viste højere følsomhed med stigende CFU tæller. Igen, disse data viser den effektivitet, hvormed hver modalitet supplerer den anden, og validere deres evne til at forblive funktionelle i komplekse medier. 16 gennemsnitlige værdier af tre målinger er skildret ± standardafvigelse. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra. 16
Figur 4 : MFnS specificitet. Specificiteten af MFnS blev testet ved hjælp af hr. analyse i næringsstof bouillon opløsninger indeholdende A) en række bakterielle cross-forurenende og en blanding og B) varme-uvirksomme E. coli O157: H7. Som vist, er det klart, at sensorer har lidt at ingen bindende med ikke-øremærket bakterier, og er stadig i stand til at opdage målbakterierne i overværelse af andre forurenende stoffer, sikrer, at denne form for screening ville være viable til brug i komplekse medier, der indeholder en række ikke-sygdomsfremkaldende bakteriearter. C) yderligere specificitet test blev udført af syntese MFnS med en isotype antistof (røde cirkler: Anti -E. coli O111), hvilket resulterede i lidt at ingen bindende i forhold til O157: H7 antistof konjugeret MFnS (sorte firkanter). Disse data viser, at MFnS kun reagere med levedygtige målbakterierne, yderligere bekræfter deres effektivitet som et punkt af pleje diagnostiske platform. 16 gennemsnitlige værdier af tre målinger er skildret ± standardafvigelse. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er blevet designet til at producere fuldt funktionel MFnS så enkelt som muligt. Men der er mange vigtige punkter hvor ændring af protokollen kan være nyttig, afhængigt af brugerens endelige mål. For eksempel, brug af forskellige antistoffer ville give mulighed for målretning af mange andre patogener. Desuden, er denne protokol ikke begrænset til brug af antistoffer som målretning molekyler. Ethvert molekyle, som har specifikke bindende affinitet for target patogener, som værten cellereceptorer, kan også bruges som målretning molekyler. Så længe den målretning molekyle har en primær Amin eller alkohol gruppe, eller kan være functionalized for at have en, kan det være konjugeret til overfladen af jernoxid nanopartikler ifølge EDC/NHS konjugation kemi opført i protokollen. For det andet, mængden af MFnS bruges i hver registrering løsning kan varieres. Det er vigtigt at bruge nok så T2 værdien for den oprindelige løsning (med kun opløsningsmiddel og nanosensor uden mål patogen) er i størrelsesordenen 100-250 ms. hvis oprindelige værdi er under 100, så ændringer i T2 værdier bliver mindre følsomme , på grund af en overflod af nanosensor. For at hæve baseline T2 værdi, reducere mængden af nanosensor i løsning. Hvis imidlertid den oprindelige plan er over 250, det bliver alt for følsomme, og falske positiver kan blive mere sandsynlig. Af disse grunde, er det foreslået for at sigte mod en baseline løsning T2 værdi mellem 100-250 ms.
Nuværende begrænsninger af denne protokol, når de overvejer dets anvendelse som et punkt af pleje diagnostiske, er afhængigheden af den nuværende benchtop magnetisk relaxometer. Mens effektive og stabile, kunne denne magnetiske afslapning platform reduceres i størrelse for at øge dens portabilitet. Dette ville øge den lethed, hvormed denne platform kunne bruges i forskellige miljøer, såsom vandkilder eller købmand markeder, til effektiv on-site bakteriel screening. Dette kunne også reducere prisen på denne maskine, hvilket gør det mere overkommeligt for punkt af pleje patogen detektion.
Hvad angår sygdom diagnose og patogen detektion i lav-ressource indstillinger har denne platform potentiale til at være mere effektiv end nuværende patogen diagnose teknikker, der anvendes i dag, herunder PCR og ELISA. Mens disse traditionelle teknikker har vist sig for at være stort set effektivt, er de meget komplekse, dyre og langsomme. Som sådan, er der behov for en nøjagtig diagnostiske platform, der kunne udvikles til brug i lav-ressource indstillinger for punkt af pleje påvisning af patogener og klovesygediagnosticering. Denne platform er relativt enkel at anvende, omkostningseffektiv og hurtig. Bortset fra indledende opstartsomkostninger af de nødvendige maskiner (relaxometer og plade læser) er de faktiske MFnS forholdsvis billig og meget stabil. Derudover samling af T2 værdier er enkel og kræver ikke en professionel laborant.
I fremtiden vil blive videreført samarbejde med kemiske og biologiske ingeniører til at designe en mere bærbar, håndholdt enhed, der kunne bruges til både magnetiske og fluorescerende påvisning af mikrobiel forurening ved hjælp af MFnS. Udviklingen af en mindre enhed ville bidrage til yderligere reducere omkostningerne i forbindelse med denne påvisning platform og øge dens effektivitet i feltet. Desuden, denne platform har potentiale til at blive brugt til at analysere effektiviteten af udvikle biocid agenter. Som vist i vores data, vores MFnS var kun i stand til at binde med live-målrettet bakterier, og produceret lidt at ingen signal når inkuberes med varme-dræbte bakterier. Baseret på dette, vores platform kan bruges til at teste effektiviteten af biocid kandidater, og vi planlægger at udforske dette yderligere i fremtiden.
Kritiske trin i denne protokol omfatter den indledende sammenfatning af MFnS og indsamling af T2 data. Det er vigtigt at ordentligt rense MFnS for at sikre, at frit svævende antistoffer ikke interfererer med T2 dataindsamling. Derudover skal mængden af MFnS placeret i hver prøve stemme overens, da ændringer i MFnS koncentration vil ændre T2 værdier, risikere falske positiver/negativer.
Afslutningsvis, MFnS er et nyt skridt fremad i kampen mod bakteriel forurening, og vil blive yderligere udviklet som målretning af yderligere patogener opnås og design mere bærbare maskiner er forfulgt. Lave omkostninger og lav kompleksitet forbundet med brugen af MFnS gør dem en levedygtig kandidat skal bruges til on-site detektion af bakteriel forurening. Mens syntesen af disse sensorer kræver forsigtig forberedelse, deres faktiske anvendelse er relativt simpelt, og giver dem mulighed for at reducere fødevarebårne og vandbårne sygdomme. Med yderligere udvikling, gennemførelse af disse sensorer kan ses i screening af vandreservoirer og kommercielt produceret fødevarer på emballage websteder, salg, og måske selv hjem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Demonstreret anvendelsen af denne nanoteknologi er endnu ikke godkendt af FDA.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af K-INBRE P20GM103418, Kansas soja Kommissionen (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 og PSU polymer kemi start fond, alle SS. Vi takker Universitet Videograf, Mr. Jacob Anselmi, for hans fremragende arbejde med video. Vi takker også Mr. Roger Heckert og fru Katha Heckert for deres generøse støtte til forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
