Summary
Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 is gekoppeld aan beide materialen op waterbasis en door voedsel overgedragen ziekten, en blijft een bedreiging ondanks de voedsel - en water-screeningmethoden die momenteel gebruikt. Terwijl conventionele bacteriële detectiemethoden, zoals polymerase-kettingreactie (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) specifiek pathogene contaminanten, kunnen detecteren vereisen ze uitgebreide monstervoorbereiding en lange wachttijden. Bovendien, deze praktijken eisen van geavanceerde laboratoriuminstrumenten en instellingen, en moeten worden uitgevoerd door daartoe opgeleide beroepsbeoefenaren. Hierin wordt een protocol voor een eenvoudiger diagnostische techniek die beschikt over de unieke combinatie van magnetische en fluorescerende parameters in een nanoparticle gebaseerde platform voorgesteld. De voorgestelde multiparametric magneto-belichting fluorescerende nanosensors (MFnS) kan detecteren E. coli O157:H7 besmetting met zo weinig als 1 kolonie-vormende eenheid aanwezig in oplossing binnen minder dan 1 uur. Bovendien, het vermogen van MFnS om te blijven hoogfunktionele in complexe media zoals melk en meerwater is geverifieerd. Extra specificiteit assays werden ook gebruikt om aan te tonen van het vermogen van MFnS om alleen de specifieke doelgroep bacteriën, zelfs in aanwezigheid van soortgelijke bacteriesoorten te detecteren. De koppeling van magnetische en fluorescerende modaliteiten zorgt voor de detectie en kwantificering van pathogen besmetting in een breed scala van concentraties, exposeren zijn hoge prestaties in beide vroege - en late-stadium besmetting detectie. De doelmatigheid, de betaalbaarheid en de overdraagbaarheid van de MFnS laten een ideale kandidaat voor point-of-care screening voor bacteriële contaminanten in een breed scala van instellingen, van aquatische reservoirs aan commercieel verpakte levensmiddelen.
Introduction
Het permanente exemplaar van bacteriële besmetting in zowel commercieel geproduceerd voedsel en waterbronnen heeft behoefte aan een steeds snelle en specifieke diagnostische platformen gemaakt. 1 , 2 zijn enkele van de meest voorkomende bacteriële verontreinigingen die verantwoordelijk zijn voor de verontreiniging van voedsel en water uit de Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus en Escherichia geslachten. 3 , 4 bacteriële besmetting door deze ziekteverwekkers vaak leidt tot symptomen zoals koorts, cholera, gastro-enteritis en diarree. 4 besmetting van waterbronnen vaak drastische en nadelige gevolgen heeft voor de Gemeenschappen zonder toegang tot voldoende gefilterd water en verontreiniging van levensmiddelen heeft geleid tot een groot aantal ziekten en product recall inspanningen. 5 , 6
Teneinde het ontstaan van ziekten veroorzaakt door bacteriële besmetting, zijn er een aantal inspanningen voor de ontwikkeling van methoden waarmee water en voedsel kunnen worden efficiënt gescand vóór de verkoop of het verbruik. 3 technieken zoals de PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 ()-lus-gemedieerde isotherme amplificatie LAMP),13,14 o.a.15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 onlangs zijn gebruikt voor de detectie van verschillende ziekteverwekkers. Vergeleken met traditionele bacteriële culturing methoden, zijn deze technieken veel efficiënter met betrekking tot de specificiteit en de tijd. Echter, deze technieken nog steeds worstelen met valse positieven en negatieven, ingewikkelde procedures en kosten. 1 , 3 , 25 het is om deze reden dat multiparametric magneto-belichting fluorescerende nanosensors (MFnS) worden voorgesteld als een alternatieve methode voor de detectie van bacteriële.
Deze nanosensors koppel uniek samen magnetische ontspanning en fluorescerende modaliteiten, waardoor voor een dual-detectie-platform dat is zowel snel als nauwkeurig. Met behulp van E. coli O157:H7 als een monster verontreinigingen, wordt het vermogen van MFnS om op te sporen zo weinig als 1 CFU binnen enkele minuten aangetoond. Pathogeen-specifieke antilichamen worden gebruikt om de specificiteit, en de combinatie van zowel magnetische als tl modaliteiten zorgt voor de detectie en kwantificering van bacteriële contaminanten in zowel laag - en hoog-besmetting bereiken. 16 in het geval van bacteriële besmetting, zal de nanosensors rond de bacteriën als gevolg van de targeting mogelijkheden van de pathogeen-specifieke antilichamen zwerm. De binding tussen de magnetische nanosensors en bacteriën beperkt de interactie tussen de magnetische ijzeren kern en het omringende water protonen. Dit veroorzaakt een toename in de T2 ontspanning tijden, zoals geregistreerd door een magnetische relaxometer. Als de concentratie van bacteriën in oplossing stijgt, wordt de nanosensors met het toegenomen aantal bacteriën, wat resulteert in lagere T2 waarden verspreiden. Omgekeerd, fluorescentie emissie zal toenemen in verhouding met de concentratie van bacteriën, als gevolg van het toegenomen aantal nanosensors direct gebonden aan pathogenen. Centrifugeren van de monsters, en isolatie van de bacteriële pellet, zal alleen de nanodeeltjes die rechtstreeks zijn verbonden met de bacteriën, een vrij zwevende nanosensors verwijderen en direct correleren de fluorescentie-uitstoot met het aantal besparen bacteriën aanwezig in oplossing. Een schematische weergave van dit mechanisme wordt afgebeeld in Figuur 1.
Dit MFnS-platform is ontworpen met point-of-care screening in het achterhoofd, wat resulteert in lage kosten en draagbare kenmerken. MFnS zijn stabiel bij kamertemperatuur, en alleen in zeer lage concentraties voor nauwkeurige detectie van bacteriële verontreinigende stoffen zijn verplicht. Bovendien, na synthese, gebruik van de MFnS is eenvoudig en vereist niet het gebruik van opgeleide professionals in het veld. Tot slot, dit diagnostische platform voorziet hoogst klantgerichte richt, zodat zij over een middel door welke dit één platform kan worden gebruikt voor het detecteren van ziekteverwekkers van alle soorten, in vele verschillende settings.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. synthese en Functionalization van multi parametrische Magneto-belichting fluorescerende Nanosensors (MFnS).
- Synthese van superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (IONPs)
- voor te bereiden voor IONP synthese, voorbereiding van de volgende 3 oplossingen: oplossing 1: FeCl 3 (0.70 g) en FeCl 2 in H 2 O (2 mL), oplossing 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13.4 M) in H 2 O (15 mL) en oplossing 3: polyacryl zuur (0.855 g) in H 2 O (5 mL).
- 90 µL van 2 M zoutzuur (HCl) aan oplossing 1 toevoegen en onmiddellijk meng met oplossing 2 terwijl vortexing op 875 rpm. Voeg vervolgens oplossing 3. Blijven vortexing voor 60 min.
- Centrifugeer gedurende 20 min op 1,620 x g. Centrifugeer de bovendrijvende vloeistof gedurende 20 minuten op 2,880 x g.
- Zuiveren het definitieve supernatant via dialyse. Het supernatant toevoegen aan een zak dialyse (MWCO 6 − 8 K) en plaats deze in een bekerglas van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH = 7.4) en spin bar. Laat het weken voor 12u, vervangen door verse buffer elke 2-3-h.
- Vervoeging van doelgroepen gerichte antilichamen tegen oppervlak van IONPs
- voorbereiden van de volgende vier oplossingen: oplossing A: 5 mg 1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) in 250 µL MES [2-(N- Morfolino) ethanesulfonic zuur] buffer (0,1 M, pH 6.8 =), oplossing B: 3 mg van N-Hydroxysuccinimide (NHS) in 250 µL van MES buffer (0,1 M, pH 6.8 =), oplossing C: 5 µg van IgG1, de E. coli mAb, in 225 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4) , en oplossing D: 4 mL IONP (5.0 mmol) in 1 mL PBS (pH 7.4).
- Toevoegen 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer oplossing A, vervolgens onmiddellijk toevoegen oplossing A tot en met D van de oplossing in kleine stappen binnen 15 s, het omkeren van de oplossing na elke toevoeging voor het mengen van.
- Onmiddellijk beginnen met het toevoegen van oplossing B tot en met D van de oplossing in kleine stappen over een periode van drie minuten durende. Meng door het omkeren van de oplossing na elke toevoeging.
- De oplossing na elke toevoeging voor het mengen van oplossing C toevoegen aan oplossing in stappen van 5 µL, omkeren.
- Reactie op blijven gedurende 3 uur bij kamertemperatuur en vervolgens de incubatie op 4 ° C's nachts toestaan.
- Zuiveren de resulterende Ab-geconjugeerde IONPs via magnetische kolom met PBS (pH = 7.4, finale [Fe] = 3,5 mmol) te verwijderen van elk unconjugated antilichamen.
- De magnetische kolom wassen met PBS (1 mL). De kolom koppelen aan de magnetische plaat en IONP oplossing toevoegt.
- Was de magnetische kolom met PBS (1 mL) weer. Verwijder de magnetische kolom uit magnetische plaat. PBS toevoegen aan de kolom en verzamel de oplossing. Bewaren bij 4 ° C
- inkapseling van fluorescerende 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleurstof in de coating van polyacryl zuur (PAA) van de antilichaam-geconjugeerde IONPs met behulp van een oplosmiddel diffusie methode.
- Aan de IONPs 4 mL, voeg toe dropwise 2.0 µL van DiI kleurstof (2 mmol) in 100 µL van DMSO met Continu mengen op 1100 rpm.
- Dialyze van de resulterende oplossing (MWCO 6-8 KDa, 12 h) tegen PBS, het creëren van een eindoplossing van de MFnS met een definitieve ijzer-concentratie [FE] = 2 mmol.
- Karakterisering van MFnS
- voor spectrofotometrische analyse, een afleesapparaat te gebruiken voor het detecteren van ingekapselde DiI kleurstof met fluorescentie emissie bij 595 nM.
- Dynamisch licht verstrooiing
- plaats een steekproef van de MFnS-oplossing in een zetasizer om te bepalen van de gemiddelde grootte en oppervlakte last van de MFnS.
Opmerking: Hier, de gemiddelde grootte en oppervlakte last van functionele MFnS bleken 77.09 nm en-22.3 mV, respectievelijk.
- plaats een steekproef van de MFnS-oplossing in een zetasizer om te bepalen van de gemiddelde grootte en oppervlakte last van de MFnS.
2. Bacteriële Culturing en Stock oplossing voorbereiding
- bacteriële Culturing
- hydrateren een gevriesdroogd pellet (E. coli O157:H7) in 1 mL nutriënten Bouillon en voeg vervolgens een extra 5 mL Bouillon.
- Toepassing 100 µL van deze oplossing tot een agarplaat en streep met behulp van een steriele inoculatie lus, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 24 h.
- Na 24 h, selecteer een geïsoleerde kolonie in de agarplaat en toe te voegen aan een 15 mL Bouillon van de cultuur. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4-6 uur, terwijl het toezicht op de waarde van de optische dichtheid (absorptie bij 600 nm).
- Zodra de waarde van een optische dichtheid van 0,1 is verkregen, stoppen kweken, en uitvoeren van seriële verdunningen.
- Seriële verdunningen
- toevoegen 900 µL van nutriënten Bouillon acht buizen van de steriele microcentrifuge.
- Voeg 100 µL van de bacteriële suspensie aan de eerste buis (verdunning 10 -1).
- Nemen 100 µL van de eerste buis en voeg deze toe aan de tweede, het verkrijgen van een verdunning van 10 -2. Blijven dit patroon voor de overige buizen, eindigend met een uiteindelijke verdunning van 10 -8.
- Breng 100 µL van elke buis te scheiden van de agar platen, en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C.
- De volgende dag, tellen de kolonievormende eenheden (CFUs) op elke plaat. Selecteer de plaat met ~ 100 CFUs. Gebruik van de overeenkomstige verdunningen voor verdere experimenten (100 µL = ~ 100 CFUs).
Opmerking: Het was hier de 10 -6-verdunning die in ~ 100 CFUs resulteerde.
3. Snelle detectie van E. coli O157:H7 met MFnS
- Spike verschillende PBS oplossingen (1 X, pH 7.4, 300 µL) met steeds grotere hoeveelheden de bacteriële voorraad van 10 -6, wat resulteert in CFU varieert van 1-100. Voeg een consistent hoeveelheid MFnS (100 µL) naar deze oplossingen.
- Maken van een basislijn-oplossing die alleen PBS (1 X, pH 7.4, 300 µL bevat) en MFnS (100 µL).
- Broeden oplossingen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en vervolgens laten afkoelen tot kamertemperatuur.
- Overdracht individuele oplossingen voor de magnetische relaxometer (0.47 Tesla) en de recordwijzigingen in ontspanning tijden (T2) ten opzichte van de CFUs in elke oplossing.
- Wijzigingen vastleggen in T2 waarden te beginnen door het meten van de waarde van de T2 van de basislijn-oplossing die alleen PBS en MFnS bevat.
- Plaats de oplossing in de magnetische relaxometer. De respectieve software openen, selecteert u de " T2 ontspanning " instelling en druk op " maatregel. "
- de T2-waarden van de extra oplossingen die zijn verrijkt met verschillende na de collectie van de basislijn T2, meten concentraties van bacteriën.
Opmerking: De verandering in T2 is gelijk aan de basislijn T2 afgetrokken van de puntige T2.
- Wijzigingen vastleggen in T2 waarden te beginnen door het meten van de waarde van de T2 van de basislijn-oplossing die alleen PBS en MFnS bevat.
- Verwijderen van monsters van de magnetische relaxometer samen en centrifugeer de buizen bij 2880 x g gedurende 10 minuten
- Giet het supernatant en resuspendeer bacteriële pellets in 100 µL van PBS (1 X, pH 7.4).
- Toevoegen 80 µL van elke resuspensie een 96-wells-plaat en record fluorescentie intensiteiten op 595 nM.
Opmerking: Testen kan worden herhaald met gebruikmaking van verschillende oplosmiddelen, met inbegrip van meerwater, melk en anderen, zoals beschreven in het gedeelte ' resultaten '
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het werkingsmechanisme MFnS wordt afgebeeld in Figuur 1. De clusters van MFnS rond het oppervlak van bacteriële contaminanten interfereert met de interacties tussen de magnetic cores van de MFnS en de omliggende waterstofkernen. Als gevolg van deze clustering, magnetische ontspanning verhogen waarden. Als de concentratie van bacteriële contaminanten toeneemt, clustering vermindert, en de verandering in T2 waarden vermindert. De toevoeging van een fluorescerende modaliteit is daarom van cruciaal belang. Zoals de bacteriële concentratie toeneemt, stijgt de sterkte van het fluorescerende signaal geproduceerd door MFnS, rekening houdend met de gevoelige detectie van bacteriële contaminanten in beide hoge en lage concentratie bereiken.
Na het protocol van16 MFnS werden gesynthetiseerd en het eerst getest in oplossingen van PBS (1 X, pH 7.4). De eerste modaliteit gebruikt voor de detectie, magnetische ontspanning, werd gebruikt om wijzigingen in T2 waarden vastleggen. Overeenkomstig het protocol, de monsters werden vervolgens gecentrifugeerd, pellets waren geresuspendeerde en fluorescentie gegevens werden verzameld. De bijbehorende ΔT2 en fluorescentie emissiegrenswaarden worden gepresenteerd in Figuur 2. Zoals aangetoond, de ΔT2-waarde was grootste bij lagere concentraties van bacteriële besmetting en bereikt de verzadiging op ongeveer 20 CFUs. Fluorescentie emissie, aan de andere kant, werd nauwkeuriger op > 20 CFUs, weer te geven van het belang van het combineren van deze twee modaliteiten. Na deze primaire testen, vergelijkbare tests werden uitgevoerd in complexe media, met inbegrip van meerwater en melk. Dit werd gedaan om ervoor te zorgen dat de nanosensors nog steeds effectief in complexere media. De gegevens van deze testen worden gepresenteerd in Figuur 3 en lijken sterk op de tests uitgevoerd in PBS. Hiermee wordt gecontroleerd dat deze nanosensors effectief in complexe media blijven.
Nadat u hebt bevestigd dat MFnS kan de aanwezigheid van bacteriële contaminanten in zowel eenvoudige als complexe media, werden een aantal tests vervolgens uitgevoerd om te bepalen van het niveau van specificiteit onderhouden door de nanosensors. Te dien einde, waren MFnS in oplossingen met doel bacteriën, warmte-gedood doel bacteriën, doelsoort bacteriën (niet-pathogene E. coli en S. typhimurium) en een mengsel geïncubeerd. Als dit was slechts een specificiteit assay, het verzamelen van gegevens van de magnetische ontspanning alleen voldoende, en de bijbehorende gegevens worden weergegeven in Figuur 4. Zoals kan worden gezien, de MFnS alleen afhankelijk gemaakt van E. coli O157:H7, wonen en niet op de andere warmte-gedood of doelsoort bacteriën. Dit niveau van specificiteit wordt toegeschreven aan de geconjugeerde targeting antilichamen, en bevestigt verder dat MFnS effectief op het opsporen van specifieke pathogenen contaminanten, zelfs wanneer in aanwezigheid van niet-pathogene bacteriële soorten zal zijn.
Figuur 1 : Magneto-belichting fluorescerende detectiemechanisme. Schematische weergave van de MFnS synthese en het mechanisme van de dual-modal van bacteriële detectie. Na een korte incubatieperiode (30 min) kunnen MFnS gevoelig ontdekken de bacteriën doel via een combinatie van magnetische resonantie en fluorescentie emissie. Clusters van MFnS rond het oppervlak van bacteriële verontreiniging veroorzaakt veranderingen in magnetische ontspanning waarden, die aantoonbaar door een magnetische relaxometer. Fluorescerende signalen kunnen bovendien worden verzameld uit de MFnS die rechtstreeks afhankelijk zijn van bacteriële contaminanten. Dit biedt een dual-modal detectie platform staat detectie bacteriële contaminanten in beide hoge en lage concentratie bereiken. 16 dit cijfer is aangepast met toestemming van. 16
Figuur 2 : Proof of Concept. A) magnetische ontspanning gegevens (ΔT2) werd verzameld van verdunningen van E. coli O157:H7 (1-100 kve) in PBS oplosmiddel (1 X, pH = 7.4). MIJNHEER detectie van bacteriën was zeer gevoelig op lagere CFU graven (inzet: variërend van 1-20 CFU). Echter de ΔT2 lezingen verzadigd raakte bij hogere bacteriële concentraties (> 20 CFU), waarmee wordt aangegeven dat MIJNHEER meer waardevol voor de detectie en kwantificering van beginnende bacteriële besmetting. B) fluorescentie emissiegegevens uit hetzelfde spiked PBS oplossingen (inzet: lineariteit perceel). De resultaten toonden aan dat de detectiemethode fluorescentie gevoeliger op hogere CFU graven, is terwijl het ontbreekt in de gevoeligheid voor laag CFU monsters. Deze gegevens tonen samen, de mogelijkheid van zowel magnetische als tl modaliteiten voor het detecteren en kwantificeren van bacteriële besmetting in vroege - en late-stadia van bacteriële besmetting. 16 gemiddelde waarden van drie metingen zijn afgebeeld ± standaardafwijking. Dit cijfer is aangepast met toestemming van. 16
Figuur 3 : Bacteriële detectie in complexe Media. Magnetische ontspanning ΔT2 gegevens verzameld van meer complexe media, met inbegrip van A) meer water en B) volle melk. Vergelijkbaar met de gegevens verzameld uit de vorige PBS-oplossingen, werd opgemerkt dat de detectie van bacteriële contaminanten gevoeliger in het bereik van 1-20 CFU (openingen) was. Overeenkomstige fluorescentie emissiegegevens werd verzameld voor de C) meerwater en D) melk monsters (inzetstukken: lineariteit percelen), waaruit bleek dat hogere gevoeligheid met toenemende CFU graven. Nogmaals, deze gegevens tonen de effectiviteit waarmee elke modaliteit is een aanvulling op de andere, en valideren van hun vermogen om te blijven functioneren in complexe media. 16 gemiddelde waarden van drie metingen zijn afgebeeld ± standaardafwijking. Dit cijfer is aangepast met toestemming van. 16
Figuur 4 : MFnS specificiteit. De specificiteit van de MFnS werd getest met behulp van MIJNHEER analyse in nutriënten Bouillon oplossingen A) een aantal bacteriële Kruis-verontreinigingen en een mengsel, en B) hitte-inactiveren met E. coli O157:H7. Zoals u, is het duidelijk dat de nanosensors weinig tot geen binding met niet-doelgerichte bacteriën, en zijn nog steeds kunnen detecteren of de doel-bacteriën in aanwezigheid van andere verontreinigende stoffen hebben, om te waarborgen dat deze vorm van screening zou viable voor gebruik in complexe media die een aantal niet-pathogene bacteriële soorten bevatten. C) verdere specificiteit tests werd uitgevoerd door de synthese van MFnS met een antilichaam isotype (rode cirkels: Anti -E. coli O111), wat resulteerde in weinig tot geen bindende t.o.v. de O157:H7 antilichaam-geconjugeerde MFnS (zwarte vierkantjes). Deze gegevens tonen aan dat MFnS slechts met haalbare doelstelling bacteriën reageren, verdere verificatie van de doeltreffendheid ervan als een point-of-care diagnostische platform. 16 gemiddelde waarden van drie metingen zijn afgebeeld ± standaardafwijking. Dit cijfer is aangepast met toestemming van. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is ontworpen voor de productie van volledig functionele MFnS zo eenvoudig mogelijk. Echter, er zijn veel belangrijke punten waartegen de wijziging van het protocol nuttig zijn, afhankelijk van het einddoel van de gebruiker kunnen. Bijvoorbeeld, zou het gebruik van verschillende antilichamen voor het targeten van vele andere ziekteverwekkers. Bovendien, is dit protocol niet beperkt tot het gebruik van antilichamen als targeting moleculen. Een molecuul dat specifieke bindende affiniteit voor doel ziekteverwekkers, zoals host cel receptoren heeft, kan ook worden gebruikt als targeting moleculen. Zolang de targeting molecule een primair amine of alcohol groep heeft, of een matiemaatschappij kan worden, kan het aan de oppervlakte van ijzeroxide nanodeeltjes volgens de EDC/NHS vervoeging chemie vermeld in het protocol worden vervoegd. Ten tweede, de hoeveelheid MFnS gebruikt in elke detectie-oplossing kan worden gevarieerd. Het is belangrijk dat u genoeg zodat de T2-waarde voor de oplossing van de basislijn (met uitsluitend oplosmiddel en nanosensor zonder doel pathogen) in het bereik van 100-250 ms. is als de basislijn-waarde lager dan 100 is, dan de veranderingen in T2 waarden minder gevoelig zullen , als gevolg van een te grote overvloed van nanosensor. Om de basislijn T2 waarde te verhogen, de hoeveelheid nanosensor in oplossing te verminderen. Indien echter de basislijn boven 250 is, wordt het overdreven gevoelig, en valse positieven kunnen worden waarschijnlijker. Om deze redenen wordt voorgesteld om het streven naar een oplossing van de basislijn T2 waarde tussen 100-250 ms.
Huidige beperkingen van dit protocol, bij het overwegen van het gebruik ervan als een point-of-care-diagnose, zijn de afhankelijkheid van de huidige benchtop magnetische relaxometer. Terwijl doelmatige en stabiele, kan deze magnetische ontspanning platform worden verkleind om te verhogen zijn draagbaarheid. Dit zou het vergroten van het gemak waarmee dit platform kan worden gebruikt in verschillende omgevingen, zoals bij waterbronnen of in supermarkt markten, voor effectieve on-site bacteriële screening. Dit kan ook het verminderen van de kosten van deze machine, waardoor het meer haalbaar voor point-of-care pathogen detectie.
Met betrekking tot ziekte diagnose en ziekteverwekker detectie in lage-broninstellingen heeft dit platform de potentie om effectiever dan huidige pathogen diagnose technieken gebruikt vandaag, met inbegrip van PCR en ELISA. Terwijl deze traditionele technieken zijn grotendeels efficiënt gebleken, zijn ze zeer complex, duur en langzaam. Als zodanig, is er een behoefte aan een nauwkeurige diagnose platform dat kan worden ontwikkeld voor gebruik in lage-broninstellingen voor point-of-care opsporing van ziekteverwekkers en diagnose van de ziekte. Dit platform is relatief eenvoudig te gebruiken, kosteneffectieve en snelle. Naast de initiële start-up kosten van de vereiste machines (relaxometer en plaat-lezer) zijn de werkelijke MFnS relatief goedkoop en zeer stabiel. Bovendien is de collectie van T2 waarden is eenvoudig en vereist geen een professioneel lab technicus.
Samenwerking met chemische en biologische ingenieurs zullen in de toekomst worden voortgezet voor het ontwerpen van een meer draagbare, handbediende apparaat dat kan worden gebruikt voor zowel de magnetische en fluorescerende detectie van bacteriële besmetting met behulp van MFnS. De ontwikkeling van een kleiner toestel zou bijdragen tot verdere vermindering van de kosten in verband met dit platform detectie en doeltreffender in het veld. Bovendien, dit platform heeft het potentieel om te worden gebruikt voor het analyseren van de effectiviteit van het biocide agenten te ontwikkelen. Zoals blijkt uit onze gegevens, onze MFnS konden alleen binden met live-gerichte bacteriën, en weinig tot geen signaal wanneer geïncubeerd met warmte-gedood bacteriën geproduceerd. Gebaseerd op dit, ons platform kan worden gebruikt om de effectiviteit van biocide kandidaten testen, en we zijn van plan dit in de toekomst verder verkennen.
Kritische stappen in dit protocol zijn de eerste synthese van MFnS en verzameling van gegevens van de T2. Het is belangrijk om goed het zuiveren van de MFnS om ervoor te zorgen dat vrij zwevende antilichamen niet met het verzamelen van de gegevens van de T2 interfereert. Bovendien, moet de hoeveelheid MFnS geplaatst in elk monster consistent zijn, zoals veranderingen in de concentratie van MFnS T2 waarden, riskeren valse positieven/negatieven zal wijzigen.
Kortom, MFnS zijn een nieuwe stap vooruit in de strijd tegen bacteriële besmetting, en zal verder worden ontwikkeld als de doelgerichtheid van extra ziekteverwekkers wordt bereikt en het ontwerp meer draagbare machines wordt nagestreefd. De lage kosten en lage-complexiteit die is gekoppeld aan het gebruik van MFnS maakt ze een levensvatbare kandidaat om te worden gebruikt voor on-site detectie van bacteriële besmetting. Hoewel de synthese van deze nanosensors zorgvuldige voorbereiding vereist, hun werkelijke gebruik is relatief eenvoudig, en geeft hen het potentieel om foodborne en waterbasis ziekten te verminderen. Met de verdere ontwikkeling, de uitvoering van deze nanosensors kan worden gezien in de screening van de stuwmeren en commercieel geproduceerd voedsel op verpakking sites, punten van verkoop, en misschien zelfs huizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De aangetoond dat toepassing van deze nanotechnologie is nog niet goedgekeurd door de FDA.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de K-INBRE-P20GM103418, Kansas soja Commissie (KSC/PSU 1663), ACS PRF-56629-UNI7 en PSU polymeer chemie opstarten Fonds, alle aan SS. Wij danken de Universiteit videographer, Mr. Jacob Anselmi, voor zijn uitstekende werk met de video. Wij danken ook de heer Roger Heckert en Mrs. Katha Heckert voor hun gulle steun voor onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
