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Immunology and Infection

Foodborne रोगज़नक़ चुंबक-फ्लोरोसेंट Nanosensor का उपयोग कर स्क्रीनिंग: ई. कोलाई O157 का तेजी से पता लगाने: H7

Published: September 17, 2017 doi: 10.3791/55821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Kansas Polymer Research Center, Pittsburg State University

Summary

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य चुंबकीय छूट और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन मोडलों के संयोजन के माध्यम से विशेष रूप से लक्षित रोगजनक बैक्टीरिया के पोर्टेबल, लागत प्रभावी और तेजी से पता लगाने के लिए कार्यात्मक nanosensors को संश्लेषित करना है ।

Abstract

Enterohemorrhagic ई कोलाई O157: H7 को जलजनित और foodborne बीमारियों दोनों से जोड़ा गया है, और वर्तमान में इस्तेमाल किए जाने वाले भोजन-और पानी की जांच के तरीकों के बावजूद खतरा बना रहता है । जबकि पारंपरिक बैक्टीरिया का पता लगाने के तरीकों, जैसे पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) विशेष रूप से रोगजनक दूषित पदार्थों का पता लगाने कर सकते हैं, वे व्यापक नमूना तैयारी और लंबी प्रतीक्षा अवधि की आवश्यकता है । इसके अलावा, इन प्रथाओं की मांग परिष्कृत प्रयोगशाला उपकरणों और सेटिंग्स, और प्रशिक्षित पेशेवरों द्वारा निष्पादित किया जाना चाहिए । इस के साथ साथ, एक प्रोटोकॉल एक सरल नैदानिक तकनीक है कि एक nanoparticle आधारित मंच में चुंबकीय और फ्लोरोसेंट मापदंडों के अद्वितीय संयोजन सुविधाओं के लिए प्रस्तावित है । प्रस्तावित multiparametric चुंबक-फ्लोरोसेंट nanosensors (MFnS) का पता लगा सकते है ई. कोलाई O157: के रूप में छोटे रूप में 1 के रूप में कॉलोनी-समाधान में मौजूद इकाई बनाने के साथ H7 संदूषण से कम 1 ज । इसके अलावा, MFnS की क्षमता इस तरह के दूध और झील के पानी के रूप में जटिल मीडिया में अत्यधिक कार्यात्मक रहने के लिए सत्यापित किया गया है । अतिरिक्त विशिष्टता परख भी MFnS की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए ही विशिष्ट लक्ष्य बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया, यहां तक कि समान जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति में । चुंबकीय और फ्लोरोसेंट विधियों के बाँधना का पता लगाने और सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में रोगज़नक़ संदूषण के ठहराव के लिए अनुमति देता है, दोनों जल्दी और देर से चरण संदूषण का पता लगाने में अपने उच्च प्रदर्शन का प्रदर्शन. प्रभावशीलता, सामर्थ्य, और MFnS के पोर्टेबिलिटी उंहें सेटिंग्स की एक विस्तृत रेंज में जीवाणु संदूषणों के लिए बिंदु की देखभाल स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श उंमीदवार बनाने के लिए, जलीय जलाशयों से व्यावसायिक रूप से पैक खाद्य पदार्थों के लिए ।

Introduction

दोनों वाणिज्यिक उत्पादित खाद्य और जल स्रोतों में बैक्टीरियल संदूषण की लगातार घटना तेजी से और विशिष्ट नैदानिक प्लेटफार्मों के लिए एक की जरूरत पैदा की है । 1 , 2 खाद्य और जल संदूषण के लिए जिंमेदार अधिक आम जीवाणु पदार्थों के कुछ साल्मोनेला, Staphylococcus, लिस्टिरिया, Vibrio, शिगेला, बैसिलस, और ई पीढ़ी से हैं । 3 , इन रोगजनकों द्वारा 4 जीवाणु संक्रमण अक्सर बुखार, हैजा, आंत्रशोथ, और दस्त जैसे लक्षणों में परिणाम है । जल स्रोतों का 4 संदूषण अक्सर पर्याप्त फ़िल्टर्ड पानी के उपयोग के बिना समुदायों पर कठोर और प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है, और खाद्य संदूषण बीमारियों और उत्पाद याद प्रयासों की एक बड़ी संख्या के लिए नेतृत्व किया गया है । 5 , ६

आदेश में जीवाणु संक्रमण की वजह से बीमारियों की घटना को कम करने के लिए, जिसके द्वारा पानी और भोजन कुशलता से बिक्री या खपत करने से पहले स्कैन किया जा सकता है तरीकों को विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । 3 तकनीक जैसे पीसीआर,1,7,8,9,10 एलिसा,11,12 लूप-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन ( चिराग),13,14 अन्य लोगों के अलावा15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 हाल ही में विभिंन रोगजनकों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । पारंपरिक बैक्टीरियल संवर्धन तरीकों की तुलना में, इन तकनीकों के साथ और अधिक कुशल है विशिष्टता और समय का संबंध है । हालांकि, इन तकनीकों अभी भी झूठी सकारात्मक और नकारात्मक, जटिल प्रक्रियाओं, और लागत के साथ संघर्ष । 1 , 3 , 25 यह बहुत ही कारण है कि multiparametric चुंबक-फ्लोरोसेंट nanosensors (MFnS) बैक्टीरियल पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में प्रस्तावित कर रहे हैं ।

इन nanosensors विशिष्ट एक साथ जोड़ी चुंबकीय छूट और फ्लोरोसेंट रूपरेखा, एक दोहरे पहचान मंच है कि दोनों तेजी से और सही है के लिए अनुमति देता है । ई. कोलाई O157 का उपयोग करना: एक नमूना contaminant के रूप में H7, MFnS की क्षमता के रूप में कम मिनट के भीतर 1 CFU का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया है । रोगज़नक़ विशिष्ट एंटीबॉडी विशिष्टता बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है, और दोनों के संयोजन चुंबकीय और फ्लोरोसेंट विधियों का पता लगाने और दोनों कम और उच्च संदूषण पर्वतमाला में जीवाणु पदार्थों के ठहराव के लिए अनुमति देता है । 16 बैक्टीरियल संदूषण के मामले में, nanosensors रोगज़नक़ के लक्ष्यीकरण क्षमताओं के कारण बैक्टीरिया विशिष्ट एंटीबॉडी के आसपास झुंड होगा । चुंबकीय nanosensors और बैक्टीरिया के बीच बंधन चुंबकीय लौह कोर और आसपास के पानी प्रोटॉन के बीच बातचीत की सीमा । यह टी 2 विश्राम के समय में वृद्धि का कारण बनता है, के रूप में एक चुंबकीय relaxometer द्वारा दर्ज की गई । समाधान में बैक्टीरिया की एकाग्रता के रूप में उगता है, बैक्टीरिया की वृद्धि हुई संख्या के साथ nanosensors फैलाने, कम टी 2 मूल्यों में जिसके परिणामस्वरूप । इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बैक्टीरिया की एकाग्रता के साथ अनुपात में वृद्धि होगी, nanosensors की वृद्धि की संख्या के कारण सीधे रोगज़नक़ के लिए बाध्य । नमूनों के केंद्रापसारक, और बैक्टीरिया की गोली के अलगाव, केवल नैनोकणों सीधे संरक्षण बैक्टीरिया से जुड़ा होगा, किसी भी मुक्त अस्थाई nanosensors को हटाने, और सीधे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की संख्या के साथ correlating समाधान में मौजूद बैक्टीरिया । इस तंत्र का एक योजनाबद्ध निरूपण चित्र 1में दर्शाया गया है ।

इस MFnS मंच मन में बिंदु की देखभाल स्क्रीनिंग के साथ डिजाइन किया गया है, कम लागत और पोर्टेबल विशेषताओं में जिसके परिणामस्वरूप । MFnS कमरे के तापमान पर स्थिर हैं, और केवल बैक्टीरियल पदार्थों का सटीक पता लगाने के लिए बहुत कम सांद्रता में आवश्यक हैं । इसके अलावा, संश्लेषण के बाद, MFnS का उपयोग सरल है और क्षेत्र में प्रशिक्षित पेशेवरों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है. अंत में, इस नैदानिक मंच उच्च अनुकूलन लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है, एक साधन है जिसके द्वारा यह एक मंच के लिए कई अलग सेटिंग्स में, सभी प्रकार के रोगजनकों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. मल्टी-पैरामीट्रिक चुंबक-फ्लोरोसेंट Nanosensors (MFnS) का संश्लेषण और Functionalization.

  1. संश्लेषण की superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONPs)
    1. IONP संश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए, निम्नलिखित 3 समाधान तैयार करें: समाधान 1: FeCl 3 (०.७० g) और FeCl 2 में ज 2 O (2 मिलीलीटर), समाधान 2: NH 4 OH (२.० एमएल, १३.४ मीटर) में एच 2 ओ (15 एमएल), और समाधान 3: polyacrylic एसिड (०.८५५ ग्राम) में एच 2 ओ (5 मिलीलीटर).
    2. Add ९० & #181; 2 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (1 समाधान के लिए HCl) के एल और फिर तुरंत समाधान 2 के साथ मिश्रण है, जबकि ८७५ rpm पर भंवर । तब समाधान 3 जोड़ें । ६० min.
      3. के लिए भंवर जारी रखें १,६२० x जी में 20 मिनट के लिए
    3. केंद्रापसारक २,८८० x g.
      4. में 20 मिनट के लिए supernatant केंद्रापसारक
    4. डायलिसिस के जरिए अंतिम supernatant को शुद्ध करते हैं. supernatant को एक डायलिसिस बैग में जोड़ें (MWCO 6 & #8722; 8 K) और इसे फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पंजाब) (पीएच = ७.४) और स्पिन पट्टी युक्त चोंच में रखें । यह 12 घंटे के लिए सोख, ताजा बफर के साथ की जगह हर 2-3 ज.
  2. विकार लक्ष्य-विशिष्ट एंटीबॉडी की सतह को IONPs
    1. निम्न चार समाधान तैयार करें: समाधान A: 5 मिलीग्राम 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) in २५० & #181; L एमईएस [2-( N - morpholino) ethanesulfonic अम्ल] बफर (०.१ मीटर, पीएच = ६.८), समाधान बी: 3 मिलीग्राम N-Hydroxysuccinimide (एन एच एस) में २५० & #181; एमईएस बफर के एल (०.१ एम, पीएच = ६.८), समाधान C: 5 & #181; g of IgG1, the E. कोलाई मॉब, in २२५ & #181; के एल फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) (पीएच ७.४) , और समाधान D: पंजाब के 1 मिलीलीटर (pH ७.४) में IONP की 4 मिलीलीटर (५.० mmol) ।
    2. जोड़ें 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर समाधान के लिए एक है, तो तुरंत समाधान के लिए एक समाधान डी में जोड़ने के लिए 15 एस के भीतर छोटे वेतन वृद्धि, मिश्रण के लिए एक अतिरिक्त के बाद समाधान औंधा.
    3. तुरंत समाधान डी को एक तीन मिनट की अवधि में छोटे वेतन वृद्धि में समाधान बी जोड़ने के लिए शुरू करते हैं । एक अतिरिक्त के बाद समाधान पलटने से मिश्रण.
    4. 5 & #181 के वेतन वृद्धि में हल करने के लिए समाधान ग जोड़ें; एल, मिश्रण के लिए एक अतिरिक्त के बाद समाधान पलटना.
    5. कमरे के तापमान पर 3 ज के लिए जारी रखने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें और फिर 4 & #176 पर मशीन जारी; सी रात भर.
    6. संयुग्मित IONPs चुंबकीय स्तंभ के माध्यम से आने वाले अटल बिहारी शुद्ध, पंजाब (पीएच = ७.४, अंतिम [Fe] = ३.५ mmol) किसी भी unconjugated एंटीबॉडी हटाने के लिए ।
      1. पंजाब (1 मिलीलीटर) के साथ चुंबकीय कॉलम धो लो । स्तंभ को चुंबकीय प्लेट से अनुलग्न करें, और IONP समाधान जोड़ें ।
      2. (1 मिलीलीटर) फिर से पंजाब के साथ चुंबकीय कॉलम धो लो । चुंबकीय प्लेट से चुंबकीय स्तंभ निकालें । इस कॉलम में पंजाबियों को जोड़ें और समाधान एकत्र करें । 4 & #176 पर स्टोर; C
  3. का encapsulation फ्लोरोसेंट 1, 1 & #39;-Dioctadecyl-3, 3, 3 & #39;, 3 & #39;-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (दिी) polyacrylic एसिड (पा) कोटिंग में डाई-एंटीबॉडी संयुग्मित का प्रयोग एक विलायक प्रसार विधि ।
    1. के 4 मिलि IONPs, add dropwise २.० & #181; l के दिी डाई (2 mmol) मे १०० & #181; l DMSO के एल ११०० rpm पर सतत मिश्रण के साथ.
    2. Dialyze के परिणामस्वरूप समाधान (MWCO 6-8 केडीए, 12 ज) पंजाबियों के खिलाफ, [Fe] = 2 mmol.
      3. की एक अंतिम लौह एकाग्रता के साथ एक अंतिम MFnS समाधान बनाने
  4. के लक्षण वर्णन MFnS
    1. के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, एक प्लेट रीडर का उपयोग करने के लिए दिी उत्सर्जन के साथ encapsulated प्रतिदीप्ति डाई का पता लगाने ५९५ एनएम ।
    2. डायनेमिक लाइट कैटरिंग
      1. zetasizer के औसत आकार और सरफ़ेस प्रभार निर्धारित करने के लिए एक MFnS में MFnS समाधान का एक नमूना रखें ।
        नोट: यहां, औसत आकार और कार्यात्मक MFnS के भूतल प्रभारी को ७७.०९ एनएम और-२२.३ एमवी, क्रमशः हो पाया गया ।
< p class = "jove_title" > 2. बैक्टीरियल संवर्धन और स्टॉक समाधान तैयारी

  1. बैक्टीरियल संवर्धन
    1. एक फ्रीज-सूख गोली ( ई. कोलाई O157: H7) पोषक तत्व शोरबा के 1 मिलीलीटर में और फिर शोरबा के एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. लागू १०० & #181; इस समाधान की एक आगर प्लेट और लकीर के लिए एक बाँझ टीका पाश का उपयोग कर, ३७ पर मशीन के बाद & #176; C for 24 h.
    3. के बाद 24 ज, आगर प्लेट से एक अलग कॉलोनी का चयन करें और यह संस्कृति शोरबा के एक 15 मिलीलीटर में जोड़ें । ३७ पर मशीन & #176; सी के लिए 4-6 एच, जबकि निगरानी ऑप्टिकल घनत्व मूल्य (६०० एनएम पर अवशोषक) ।
    4. एक बार ०.१ के एक ऑप्टिकल घनत्व मूल्य प्राप्त की है, संवर्धन बंद करो, और धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं ।
  2. सीरियल कमजोर पड़ने
    1. Add ९०० & #181; पोषक शोरबा के एल आठ बाँझ microcentrifuge ट्यूबों.
    2. Add १०० & #181; पहली ट्यूब (कमजोर पड़ने 10 -1 ) को बैक्टीरियल सस्पेंशन के एल.
    3. कग १०० & #181; पहली ट्यूब से एल और इसे दूसरी में जोड़ने के लिए, 10 -2 के एक कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए । शेष ट्यूबों के लिए इस पद्धति जारी रखें, 10 के एक अंतिम कमजोर पड़ने के साथ समाप्त-8 .
    4. Transfer १०० & #181; L प्रत्येक ट्यूब से अलग करने के लिए प्लेटें आगर, और गर्मी में 24 ज के लिए ३७ & #176; ग.
      5. अगले दिन
    5. , प्रत्येक प्लेट पर कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) की गिनती करें । के साथ थाली का चयन करें ~ १०० CFUs । आगे के प्रयोगों के लिए इसी कमजोर पड़ने का प्रयोग करें (१०० & #181; L = ~ १०० CFUs).
      नोट: यहां यह था 10 -6 कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप कि ~ १०० CFUs.
< p class = "jove_title" > 3. ई. कोलाई O157 का तेजी से पता लगाने: H7 का उपयोग MFnS

  1. स्पाइक विभिन्न पंजाबियों समाधान (1x, पीएच ७.४, ३०० & #181; L) की मात्रा बढ़ाने के साथ 10 -6 बैक्टीरियल स्टॉक, 1-100 से CFU पर्वतमाला में जिसके परिणामस्वरूप. इन समाधानों के लिए MFnS (१०० & #181; L) की संगत मात्रा जोड़ें.
  2. एक आधारभूत समाधान बनाएं जिसमें केवल पंजाबियों (1x, pH ७.४, ३०० & #181; l) और MFnS (१०० & #181; l) हैं.
    3. ३७ & #176 पर 30 मिनट के लिए
  3. मशीन समाधान; सी और फिर उंहें कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. चुंबकीय relaxometer (०.४७ Tesla) के लिए व्यक्तिगत समाधान हस्तांतरण और विश्राम के समय में रिकॉर्ड परिवर्तन (टी 2) प्रत्येक समाधान में CFUs के सापेक्ष ।
      टी 2 मूल्यों में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए
    1. , आधारभूत समाधान है कि केवल पंजाब और MFnS शामिल की टी 2 मूल्य को मापने से शुरू करते हैं ।
      1. जगह हल & #160; चुम्बकीय relaxometer में. संबंधित सॉफ्टवेयर खोलें, & #34 का चयन करें; टी 2 विश्राम & #34; सेटिंग और प्रेस & #34; उपाय. & #34;
    2. आधारभूत टी 2 के संग्रह के बाद, अतिरिक्त समाधान है कि विभिंन के साथ नुकीला थे टी 2 मूल्यों को मापने बैक्टीरिया की सांद्रता.
      नोट: टी 2 में परिवर्तन आधारभूत टी 2 के बराबर है नुकीला टी 2 से घटाया ।
  5. चुंबकीय relaxometer से नमूनों को हटाने और 10 मिनट के लिए २८८० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  6. supernatant और १०० में बैक्टीरियल छर्रों reसस्पेंड कर सकते हैं & #181; पंजाब के एल (1x, पीएच ७.४).
  7. Add ८० & #181; प्रत्येक निलंबन के एल एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट और रिकॉर्ड ५९५ एनएम में प्रतिदीप्ति तीव्रता ।
    नोट: परीक्षण के रूप में परिणाम खंड
में वर्णित झील के पानी, दूध और दूसरों सहित विभिंन सॉल्वैंट्स, का उपयोग कर दोहराया जा सकता है

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Representative Results

MFnS क्रिया का तंत्र आरेख 1में दर्शाया जाता है । बैक्टीरियल पदार्थों की सतह के आसपास MFnS के क्लस्टरिंग MFnS के चुंबकीय कोर और आसपास के हाइड्रोजन नाभिक के बीच बातचीत के साथ हस्तक्षेप । इस clustering का एक परिणाम के रूप में, चुंबकीय छूट मूल्यों में वृद्धि । बैक्टीरियल संदूषण की एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में, clustering कम कर देता है, और टी 2 मूल्यों में परिवर्तन कम हो जाती है । इसलिए, एक फ्लोरोसेंट रूपरेखा के अलावा महत्वपूर्ण है । बैक्टीरियल एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में, MFnS द्वारा उत्पादित फ्लोरोसेंट संकेत की ताकत बढ़ जाती है, दोनों कम और उच्च एकाग्रता पर्वतमाला में जीवाणु पदार्थों के प्रति संवेदनशील का पता लगाने के लिए अनुमति देता है ।

प्रोटोकॉल के बाद,16 MFnS संश्लेषित और पहले पंजाब के समाधान में परीक्षण किया गया (1x, पीएच ७.४) । प्रारंभिक पता लगाने, चुंबकीय विश्राम के लिए इस्तेमाल किया मोडल, टी 2 मूल्यों में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रोटोकॉल के अनुसार, नमूने फिर केंद्रापसारक थे, छर्रों reसस्पैंड, और प्रतिदीप्ति डेटा एकत्र किए गए थे । संगत ΔT2 और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन मान चित्रा 2में प्रस्तुत किया जाता है । के रूप में दिखाया गया है, ΔT2 मूल्य जीवाणु संक्रमण के कम सांद्रता में सबसे बड़ी थी, और लगभग 20 CFUs पर संतृप्ति तक पहुंच गया । प्रतिदीप्ति उत्सर्जन, दूसरी ओर, पर अधिक सटीक बन गया & #62; 20 CFUs, इन दो मोडलों के संयोजन के महत्व को प्रदर्शित करना । इन प्राथमिक परख के बाद, इसी तरह के परीक्षण जटिल मीडिया में झील के पानी और दूध सहित आयोजित किए गए थे । यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि nanosensors अभी भी अधिक जटिल मीडिया में प्रभावी हैं । इन परख से एकत्र आंकड़ों को चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे है और बहुत ही पंजाबियों में आयोजित की परख के समान हैं । यह सत्यापित करता है कि ये nanosensors जटिल मीडिया में प्रभावी रहते हैं ।

पुष्टि करने के बाद कि MFnS दोनों सरल और जटिल मीडिया में बैक्टीरियल पदार्थों की उपस्थिति का पता लगा सकता है, परीक्षणों के एक नंबर तो nanosensors द्वारा बनाए रखा विशिष्टता के स्तर का निर्धारण करने के लिए आयोजित किया गया । इस अंत करने के लिए, MFnS लक्ष्य बैक्टीरिया युक्त समाधान में तैयार थे, गर्मी-लक्ष्य बैक्टीरिया, गैर लक्ष्य जीवाणु (गैर रोगजनक ई. कोलाई और एस. typhimurium) और एक मिश्रण को मार डाला । के रूप में यह केवल एक विशिष्टता परख था, चुंबकीय छूट अकेले डेटा का संग्रह पर्याप्त था, और इसी डेटा चित्रा 4में प्रस्तुत किया है । के रूप में देखा जा सकता है, MFnS ही ई. कोलाई O157: H7 रहते हैं, और नहीं अंय गर्मी मारे गए या गैर लक्ष्य जीवाणुओं के लिए बाध्य । विशिष्टता के इस स्तर संयुग्मित लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी के लिए जिंमेदार ठहराया है, और आगे की पुष्टि करता है कि MFnS विशिष्ट रोगजनक पदार्थों का पता लगाने में प्रभावी हो जाएगा, यहां तक कि जब गैर रोगजनक बैक्टीरियल प्रजातियों की उपस्थिति में ।

Figure 1
चित्र 1 : चुंबक-फ्लोरोसेंट जांच तंत्र । MFnS संश्लेषण और जीवाणु का पता लगाने के दोहरे मोडल तंत्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. एक छोटी गर्मी की अवधि के बाद (30 मिनट), MFnS संवेदनशील चुंबकीय अनुनाद और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का एक संयोजन के माध्यम से लक्ष्य बैक्टीरिया का पता लगाने में सक्षम हैं । MFnS के आसपास के जीवाणुओं की सतह के लिए क्लस्टरिंग चुंबकीय विश्राम मूल्यों में परिवर्तन का कारण बनता है, जो एक चुंबकीय relaxometer द्वारा पता लगाने के लिए कर रहे हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट संकेतों MFnS सीधे जीवाणु पदार्थों के लिए बाध्य से एकत्र किया जा सकता है । यह दोनों कम और उच्च एकाग्रता पर्वतमाला में जीवाणु पदार्थों का पता लगाने में सक्षम एक दोहरे मॉडल का पता लगाने मंच प्रदान करता है । 16 यह आंकड़ा से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 16

Figure 2
चित्र 2 : संकल्पना का प्रमाण. एक) चुंबकीय विश्राम डेटा (ΔT2) पहले ई. कोलाई O157 के कमजोर पड़ने से एकत्र किया गया था: H7 (1-100 CFU) में पंजाब विलायक (1x, पीएच = ७.४) । जीवाणुओं के श्री का पता लगाने के निचले CFU गिनती (इनसेट: 1-20 CFU से लेकर) में अत्यधिक संवेदनशील था । हालांकि, ΔT2 रीडिंग उच्च बैक्टीरियल सांद्रता (& #62; 20 CFU) पर संतृप्त हो गया, जो यह दर्शाता है कि श्री प्रारंभिक चरण जीवाणु संक्रमण का पता लगाने और ठहराव के लिए अधिक मूल्यवान है । ख) एक ही नुकीला पंजाब समाधान (इनसेट: रैखिकता भूखंड) से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन डेटा । परिणामों से पता चला कि प्रतिदीप्ति डिटेक्शन पद्धति अधिक CFU काउंटियों पर अधिक संवेदनशील है, जबकि कम CFU नमूनों के लिए संवेदनशीलता में कमी है । एक साथ, इन आंकड़ों दोनों चुंबकीय और फ्लोरोसेंट तरीकों का पता लगाने और जीवाणु संक्रमण के प्रारंभिक और देर चरणों में बैक्टीरियल संदूषण यों की क्षमता प्रदर्शित करता है । तीन माप के 16 औसत मूल्यों ± मानक त्रुटि चित्रित कर रहे हैं । इस आंकड़े से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 16

Figure 3
चित्र 3 : जटिल मीडिया में बैक्टीरियल पता लगाने । चुंबकीय छूट ΔT2 डेटा अधिक जटिल मीडिया से एकत्र, सहित एक) झील के पानी और ख) पूरे दूध । पिछले पंजाब समाधान से एकत्र आंकड़ों के समान, यह नोट किया गया था कि जीवाणु पदार्थों का पता लगाने के 1-20 CFU (presets) की सीमा में अधिक संवेदनशील था. इसी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन डेटा सी के लिए एकत्र किया गया था) झील के पानी और घ) दूध के नमूने (presets: रैखिकता भूखंडों), जो बढ़ती CFU गिनती के साथ उच्च संवेदनशीलता दिखाया. एक बार फिर, इन आंकड़ों के प्रभाव के साथ जो प्रत्येक रूपरेखा दूसरे पूरक प्रदर्शित करता है, और उनके जटिल मीडिया में कार्यात्मक रहने की क्षमता को मांय । तीन माप के 16 औसत मूल्यों ± मानक त्रुटि चित्रित कर रहे हैं । इस आंकड़े से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 16

Figure 4
चित्र 4 : MFnS विशिष्टता. MFnS की विशिष्टता एक युक्त पोषक तत्व शोरबा समाधान में श्री विश्लेषण का उपयोग कर परीक्षण किया गया था) बैक्टीरियल पार-संदूषण और एक मिश्रण के एक नंबर, और ख) गर्मी-निष्क्रिय ई. कोलाई O157: H7 । के रूप में दिखाया गया है, यह स्पष्ट है कि nanosensors गैर के साथ कोई बाध्यकारी जीवाणु को कम किया है, और अभी भी अंय पदार्थों की उपस्थिति में लक्ष्य बैक्टीरिया का पता लगाने में सक्षम हैं, यह सुनिश्चित करना है कि स्क्रीनिंग के इस फार्म के माध्यम से होगाजटिल मीडिया में उपयोग के लिए ble जिसमें गैर-रोगजनक जीवाणु प्रजातियों की संख्या शामिल है । ग) आगे विशिष्टता परीक्षण synthesizing MFnS द्वारा एक isotype एंटीबॉडी के साथ आयोजित किया गया था (लाल हलकों: विरोधीई. कोलाई O111), जो O157 की तुलना में कोई बाध्यकारी करने के लिए थोड़ा परिणामस्वरूप: H7 एंटीबॉडी-संयुग्मित MFnS (काले चौकों). इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि MFnS केवल व्यवहार्य लक्ष्य बैक्टीरिया के साथ प्रतिक्रिया, आगे एक बिंदु की देखभाल नैदानिक मंच के रूप में उनके प्रभाव की पुष्टि । तीन माप के 16 औसत मूल्यों ± मानक त्रुटि चित्रित कर रहे हैं । इस आंकड़े से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 16

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के रूप में संभव के रूप में बस के रूप में पूरी तरह कार्यात्मक MFnS उत्पादन डिजाइन किया गया है । हालांकि, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर प्रोटोकॉल के परिवर्तन उपयोगकर्ता के अंतिम लक्ष्य के आधार पर, उपयोगी हो सकता है । उदाहरण के लिए, विभिंन एंटीबॉडी का उपयोग कई अंय रोगजनकों के लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति होगी । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अणुओं को लक्षित करने के रूप में एंटीबॉडी के उपयोग तक ही सीमित नहीं है । किसी भी अणु, जो लक्ष्य रोगजनकों के लिए विशिष्ट बाध्यकारी समानता है, जैसे मेजबान सेल रिसेप्टर्स, भी अणुओं को लक्षित करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । जब तक लक्ष्यीकरण अणु एक प्राथमिक अमीन या शराब समूह है, या एक के लिए कार्यात्मक किया जा सकता है, यह EDC के अनुसार लोहे की ऑक्साइड नैनोकणों की सतह के लिए संयुग्मित/एन एच एस विकार रसायन विज्ञान प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध किया जा सकता है । दूसरे, प्रत्येक खोज समाधान में उपयोग MFnS की मात्रा अलग हो सकता है । यह पर्याप्त उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि आधार रेखा समाधान के लिए टी 2 मान (लक्ष्य रोगज़नक़ के बिना केवल विलायक और nanosensor युक्त) 100-250 ms. की सीमा में है यदि आधारभूत मूल्य १०० से नीचे है, तो टी 2 मूल्यों में परिवर्तन कम संवेदनशील होगा , nanosensor की एक बहुतायत के कारण । आधारभूत टी 2 मूल्य बढ़ाने के लिए, समाधान में nanosensor की मात्रा कम । यदि, तथापि, आधार रेखा २५० से ऊपर है, यह पीढ़ी संवेदनशील हो जाता है, और झूठी सकारात्मक अधिक होने की संभावना हो सकती है । इन कारणों के लिए, यह 100-250 ms के बीच एक आधारभूत समाधान टी 2 मान के लिए लक्ष्य के लिए सुझाव दिया है

इस प्रोटोकॉल की वर्तमान सीमाएं, जब एक बिंदु की देखभाल नैदानिक के रूप में इसके उपयोग पर विचार कर रहे हैं, वर्तमान benchtop चुंबकीय relaxometer पर निर्भरता । जबकि प्रभावी और स्थिर, इस चुंबकीय विश्राम मंच आकार में कम किया जा सकता है अपनी पोर्टेबिलिटी वृद्धि हुई है । इस के साथ इस मंच विभिंन वातावरण में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के रूप में पानी के स्रोतों में या किराने की बाजार में, प्रभावी साइट पर बैक्टीरियल स्क्रीनिंग के लिए, आसानी से वृद्धि होगी । यह भी इस मशीन की लागत कम हो सकता है, यह बिंदु की देखभाल रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए और अधिक व्यवहार्य बना ।

रोग निदान और कम संसाधन सेटिंग्स में रोगज़नक़ का पता लगाने के विषय में, इस मंच की क्षमता वर्तमान रोगज़नक़ निदान आज इस्तेमाल किया, पीसीआर और एलिसा सहित तकनीक की तुलना में अधिक प्रभावी हो गया है । हालांकि इन पारंपरिक तकनीकों को काफी हद तक कुशल साबित किया है, वे अत्यधिक जटिल, महंगा है, और धीमी गति से । जैसे, वहां एक सटीक नैदानिक मंच है कि कम में उपयोग के लिए विकसित किया जा सकता है के लिए एक की जरूरत है, बिंदु की देखभाल के लिए संसाधन सेटिंग्स रोगजनकों और रोग निदान का पता लगाने । इस मंच का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, लागत प्रभावी और तेजी से. के अलावा प्रारंभिक शुरू से आवश्यक मशीनों (relaxometer और प्लेट रीडर) की लागत, वास्तविक MFnS अपेक्षाकृत सस्ते और बहुत स्थिर हैं । इसके अलावा, टी 2 मूल्यों का संग्रह सरल है और एक पेशेवर प्रयोगशाला तकनीशियन की आवश्यकता नहीं है ।

भविष्य में, रासायनिक और जैविक इंजीनियरों के साथ सहयोग के लिए एक और अधिक पोर्टेबल, हाथ से आयोजित उपकरण है कि दोनों जीवाणु संक्रमण MFnS का उपयोग कर के चुंबकीय और फ्लोरोसेंट पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता डिजाइन करने के लिए पीछा किया जाएगा । एक छोटे डिवाइस के विकास के लिए आगे इस खोज मंच के साथ जुड़े लागत को कम करने और क्षेत्र में अपनी प्रभावशीलता में वृद्धि में मदद मिलेगी । इसके अलावा, इस मंच के लिए biocide एजेंटों के विकास की प्रभावशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है । के रूप में हमारे डेटा में दिखाया गया है, हमारे MFnS ही रहते लक्षित बैक्टीरिया के साथ बांध कर रहे थे, और कोई संकेत जब गर्मी मारे बैक्टीरिया के साथ मशीन के लिए थोड़ा उत्पादन किया । इस पर आधारित, हमारे मंच biocide उंमीदवारों की प्रभावशीलता का परीक्षण किया जा सकता है, और हम भविष्य में यह आगे का पता लगाने की योजना है ।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम MFnS और टी 2 डेटा के संग्रह के प्रारंभिक संश्लेषण शामिल हैं । यह ठीक से MFnS शुद्ध करने के लिए सुनिश्चित करें कि मुक्त अस्थायी एंटीबॉडी टी 2 डेटा संग्रह के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, प्रत्येक परीक्षण के नमूने में रखा MFnS की राशि के अनुरूप होना चाहिए, MFnS एकाग्रता में परिवर्तन टी 2 मूल्यों को बदल देगा, झूठी सकारात्मक जोखिम/

अंत में, MFnS बैक्टीरियल संदूषण के खिलाफ लड़ाई में एक उपंयास कदम आगे हैं, और आगे अतिरिक्त रोगजनकों के लक्ष्यीकरण के रूप में विकसित किया जाएगा हासिल की है और डिजाइन और अधिक पोर्टेबल मशीनरी को आगे बढ़ाया है । कम लागत और कम जटिलता MFnS के उपयोग के साथ जुड़े उंहें एक व्यवहार्य उंमीदवार जीवाणु संदूषण का पता लगाने पर साइट के लिए इस्तेमाल किया जा बनाता है । जबकि इन nanosensors के संश्लेषण के लिए सावधानी की तैयारी की आवश्यकता होती है, उनका वास्तविक उपयोग अपेक्षाकृत सरल है, और उन्हें foodborne और जलजनित बीमारियों को कम करने की क्षमता देता है. आगे के विकास के साथ, इन nanosensors के कार्यांवयन में देखा जा सकता है पानी जलाशयों की स्क्रीनिंग और व्यावसायिक रूप से उत्पादित खाद्य पैकेजिंग साइटों पर, बिक्री के अंक, और शायद भी घरों ।

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Disclosures

इस नैनो के प्रदर्शन आवेदन अभी तक एफडीए द्वारा अनुमोदित नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम K-INBRE P20GM103418, कैनसस सोयाबीन कमीशन (KSC/पीएसयू १६६३), ACS PRF ५६६२९-UNI7 और पीएसयू पॉलीमर केमिस्ट्री स्टार्टअप फंड, सभी SS के लिए समर्थित है । हम वीडियो के साथ अपने उत्कृष्ट कार्य के लिए विश्वविद्यालय videographer, श्री जैकब Anselmi, धंयवाद । हम भी अनुसंधान के लिए उनके उदार समर्थन के लिए श्री रोजर Heckert और श्रीमती कथा Heckert धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ferrous Chloride Tetrahydrate Fisher Scientific I90-500
Ferric Chloride Hexahydrate Fisher Scientific I88-500
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific A669S-500
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144S-500
Polyacryllic Acid Sigma-Aldrich 323667-100G
EDC Thermofisher Scientific 22980
NHS Fisher Scientific AC157270250
Anti-E. coli O111 antibody  sera care 5310-0352
Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]  Abcam ab75244
DiI Stain Fisher Scientific D282
Nutrient Broth Difco 233000
Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet ATCC 700728
Magnetic Relaxomteter  Bruker mq20
Zetasizer Malvern NANO-ZS90
Plate Reader  Tecan Infinite M200 PRO
Magnetic Column  QuadroMACS 130-090-976
Centrifuge Eppendorf 5804 Series
Centrifuge (accuSpin Micro 17) Fisher Scientific 13-100-676
Floor Model Shaking Incubator SHEL LAB SSI5
Analytical Balance Metler Toledo ME104E
Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Open-Air Rocking Shaker Fisher Scientific 02-217-765

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References

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Foodborne रोगज़नक़ चुंबक-फ्लोरोसेंट Nanosensor का उपयोग कर स्क्रीनिंग: <em>ई. कोलाई</em> O157 का तेजी से पता लगाने: H7
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Shelby, T., Sulthana, S., McAfee, J., Banerjee, T., Santra, S. Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7. J. Vis. Exp. (127), e55821, doi:10.3791/55821 (2017).

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