Summary
Det overordnede målet med denne protokollen er å syntetisere funksjonelle nanosensors for portable, kostnadseffektiv, rask påvisning av rettet patogene bakterier gjennom en kombinasjon av magnetiske avslapning og fluorescens utslipp modaliteter.
Abstract
Enterohemorrhagiske Escherichia coli O157: H7 har vært knyttet til både vannbasert og matbårne sykdommer, og forblir en trussel til tross for mat - og vann-screening metoder brukes i dag. Mens konvensjonelle bakteriell oppdagingsmetoder, som polymerasekjedereaksjons (PCR) og enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) finner spesielt sykdomsfremkallende miljøgifter, krever de omfattende utvalg forberedelse og lange ventetider. Dessuten, disse praksis krever sofistikerte laboratorium instrumenter og innstillinger, og må utføres av kvalifiserte fagfolk. Her, er en protokoll foreslått for en enklere diagnostiske teknikk som har en unik kombinasjon av magnetiske og fluorescerende parametere i en hydrogenion-basert plattform. Den foreslåtte multiparametric magneto-fluorescerende nanosensors (MFnS) finner E. coli O157: H7 forurensning med så lite som 1 colony-forming enhet i løsningen i mindre enn 1 time. Videre muligheten for MFnS å være svært funksjonell i komplekse medier som melk og vann er bekreftet. Ekstra spesifisitet analyser ble også brukt til å demonstrere av MFnS bare oppdage bestemt mål bakterier, selv i nærvær av lignende bakterie-art. Sammenkoblingen av magnetiske og fluorescerende modaliteter kan av kvantifisering av patogen forurensning i en rekke konsentrasjoner, viser høye ytelsen i både tidlig og sen-stadium forurensning gjenkjenning. Den effektivitet, kostnader og portabilitet av MFnS gjør dem en ideell kandidat til point-of-care screening for bakteriell forurensning i en rekke innstillinger fra akvatiske reservoarene til kommersielt pakket mat.
Introduction
Vedvarende forekomsten av bakteriell forurensning i både kommersielt produsert mat og vannkilder har skapt behov for stadig rask og spesifikk diagnostiske plattformer. 1 , 2 noen av de vanligste bakterielle forurensningene ansvarlig for mat og vann forurensning er fra Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus og Escherichia slektene. 3 , 4 bakteriell forurensning av disse patogener ofte resulterer i symptomer som feber, kolera, gastroenteritt og diaré. 4 forurensning av vannkilder ofte har drastisk og negative effekter på samfunn uten tilgang til tilstrekkelig filtrert vann, og maten forurensning har ført til en rekke sykdommer og produkt tilbakekalling innsats. 5 , 6
For å redusere forekomsten av sykdommer forårsaket av bakteriell forurensning, har det vært en rekke innsats for å utvikle metoder som vann og mat kan effektivt skannes før salg eller forbruk. 3 teknikker som PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(12 ) loop-mediert isotermiske forsterkning LAMPE),13,14 blant annet15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 har nylig blitt brukt for påvisning av ulike patogener. Sammenlignet med tradisjonelle bakteriell dyrking metoder, er disse teknikkene langt mer effektive spesifisitet og tid. Disse teknikkene strever imidlertid fortsatt med falske positive og negative, komplekse prosedyrer og kostnader. 1 , 3 , 25 det er av denne grunn at multiparametric magneto-fluorescerende nanosensors (MFnS) er foreslått som en alternativ metode for bakteriell gjenkjenning.
Disse nanosensors par unikt sammen magnetiske avslapning og fluorescerende modaliteter, slik at for en dobbel-gjenkjenning plattform som er både rask og nøyaktig. Bruker E. coli O157: H7 som eksempel forurensning, er muligheten for MFnS å oppdage så lite som 1 CFU minutter demonstrert. Patogen-spesifikke antistoffer brukes til å øke spesifisitet, og kombinasjonen av både magnetiske og fluorescerende modaliteter tillater av kvantifisering av bakteriell forurensning i både lav og høy forurensning områder. 16 ved bakteriell forurensning, nanosensors vil sverme rundt bakterier på grunn av målretting evnene av patogen-spesifikke antistoffer. Bindingen mellom magnetiske nanosensors og bakterier begrenser samspillet mellom den magnetiske jernkjerne og de omkringliggende vann protonene. Dette forårsaker en økning i T2 avslapning tid, som er registrert av en magnetisk relaxometer. Som konsentrasjonen av bakterier i løsningen stiger, spre nanosensors med økt antall bakterier, noe som resulterer i lavere T2 verdier. Derimot vil fluorescens utslipp øke proporsjonalt med konsentrasjonen av bakterier, på grunn av økt nanosensors direkte bundet til patogen. Sentrifugering prøvene og isolasjon av bakteriell pellets, vil bare spare nanopartikler direkte knyttet til bakterier, fjerne alle frittflytende nanosensors og direkte samkjøre fluorescens utslipp med antall bakterier i løsningen. En skjematisk fremstilling av denne mekanismen er representert i figur 1.
Denne MFnS-plattformen er designet med point-of-care screening i tankene, som resulterer i rimelige og bærbare. MFnS er stabile i romtemperatur, og er bare nødvendig i svært lave konsentrasjoner for nøyaktig påvisning av bakteriell forurensning. Videre etter syntese, bruk av MFnS er enkel og krever ikke bruk av utdannede fagfolk i feltet. Til slutt, dette diagnostiske plattformen tillater for tilpasses målretting, et middel av denne ene plattformen kan brukes til å oppdage patogener av alle slag, i mange sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese og Functionalization av flere parametrisk Magneto-fluorescerende Nanosensors (MFnS).
- Syntese av superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (IONPs)
- å forberede for IONP syntese, forberede følgende 3 løsninger: løsning 1: FeCl 3 (0,70 g) og FeCl 2 i H 2 O (2 mL), løsning 2: NH 4 OH (2.0 mL, 13,4 M) i H 2 O (15 mL) og løsning 3: polyacrylic syre (0.855 g) i H 2 O (5 mL).
- Legge til 90 µL 2 M saltsyre (HCl) løsning 1 og og bland umiddelbart løsning 2 under vortexing 875 RPM. Deretter Legg løsning 3. Fortsette vortexing i 60 min.
- Sentrifuger etter 20 min på 1,620 x g. sentrifuge nedbryting for 20 min på 2,880 x-g.
- Renser siste nedbryting via dialyse. Legge til nedbryting en dialyse bag (MWCO 6 − 8 K) og plasserer den i et beaker med fosfat bufret saltvann (PBS) (pH = 7.4) og spinn. La den suge i 12 h, erstatte med fersk buffer hver 2-3 h.
- Bøyning av mål-spesifikke antistoffer overflaten av IONPs
- forberede følgende fire løsninger: løsning A: 5 mg 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) i 250 µL MES [2-(N- morpholino) ethanesulfonic syre] buffer (0.1 M, pH = 6.8), løsning B: 3 mg av N-Hydroxysuccinimide (NHS) i 250 µL MES bufferen (0.1 M, pH = 6.8), løsning C: 5 µg av IgG1, E. coli mAb, i 225 µL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) (pH 7.4) , og løsningen D: 4 mL IONP (5.0 mmol) i 1 mL av PBS (pH 7.4).
- Legge til 2 (N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer løsning A, deretter umiddelbart legge løsning A løsning d i små intervaller innen 15 s, invertere løsningen etter hvert tillegg for å blande.
- Umiddelbart begynne å legge løsning B til løsning D i små trinn over en tre minutters periode. Blandingen av invertere løsningen etter hvert tillegg.
- Legge løsningen C løsning i intervaller på 5 µL, invertere løsningen etter hvert tillegg for å blande.
- Tillate reaksjon på fortsette 3t ved romtemperatur, og deretter fortsette inkubering på 4 ° C over natten.
- Renser de resulterende Ab-konjugerte IONPs via magnetisk kolonne ved hjelp av PBS (pH = 7.4, final [Fe] = 3,5 mmol) å fjerne alle unconjugated antistoffer.
- Vask magnetiske kolonnen med PBS (1 mL). Legge kolonnen til magnetisk plate, og Legg til IONP løsning.
- Vask magnetiske kolonnen med PBS (1 mL) igjen. Fjern kolonnen magnetiske fra magnetisk plate. Legge til PBS kolonnen og samle løsningen. Butikken på 4 ° C
- innkapsling av fluorescerende 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine-perklorat (DiI) fargestoff inn polyacrylic syre (PAA) belegg av antistoff-konjugerte IONPs bruker en løsemiddel diffusjon metode.
- 4 mL av IONPs, legge til dropwise 2.0 µL DiI fargestoff (2 mmol) i 100 µL av DMSO med kontinuerlig blanding på 1100 rpm.
- Dialyze den resulterende løsningen (MWCO 6-8 KDa, 12 h) mot PBS, opprette en endelig MFnS løsning med en siste jern konsentrasjon [Fe] = 2 mmol.
- Karakterisering av MFnS
- For Spektrofotometri analyse, bruke en plate-leser for å oppdage innkapslede DiI fargestoff med fluorescens utslipp på 595 nM.
- Dynamisk lys spredning
- plassere et utvalg av MFnS løsningen i en zetasizer å bestemme gjennomsnittlig størrelse og overflate ansvaret for MFnS.
Merk: Her, gjennomsnittlig størrelse og overflate ansvaret for funksjonell MFnS ble funnet for å være 77.09 nm og-22.3 mV, henholdsvis.
- plassere et utvalg av MFnS løsningen i en zetasizer å bestemme gjennomsnittlig størrelse og overflate ansvaret for MFnS.
2. Bakteriell lager løsning forberedelse og Culturing
- bakteriell dyrking
- hydrat frysetørket pellets (E. coli O157: H7) i 1 mL av næringsrik buljong og deretter legge til en ekstra 5 mL av kjøttkraft.
- Bruke 100 µL av denne løsningen agar plate og strek med en bakteriefri inoculation loop, etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i 24 h.
- Etter 24 h, Velg en isolert koloni fra agar platen og legge den til en 15 mL av kultur kjøttkraft. Ruge på 37 ° C for 4-6 h, mens overvåking optisk densitet verdien (absorbans ved 600 nm).
- Når en optisk densitet verdi på 0,1 er oppnådd, stoppe dyrking og utføre føljetong fortynninger.
- Seriell fortynninger
- legge til 900 µL av næringsstoffer kjøttkraft til åtte sterilt microcentrifuge rør.
- Legge til 100 µL av bakteriell suspensjon til første røret (fortynning 10 -1).
- Ta 100 µL fra første rør og legge den til den andre, å få en fortynning av 10 -2. Fortsett dette mønsteret for gjenværende rør, slutter med en avsluttende fortynning av 10 -8.
- Overføre 100 µL fra hver tube skille agar plater og ruge 24 h på 37 ° C.
- Neste dag, telle kolonien danne enheter (CFUs) på hver plate. Velg platen med ~ 100 CFUs. Bruke de tilsvarende fortynninger for videre studier (100 µL = ~ 100 CFUs).
Merk: Her var det 10 -6 fortynning som resulterte i ~ 100 CFUs.
3. Hurtig gjenkjenning av E. coli O157: H7 bruker MFnS
- pigg ulike PBS løsninger (1 X, pH 7.4, 300 µL) med økende mengder av 10 -6 bakteriell aksjen, noe som resulterer i CFU varierer fra 1-100. Legge til en konsekvent mengde MFnS (100 µL) til disse løsningene.
- Opprette en planlagt løsning som inneholder bare PBS (1 X, pH 7.4, 300 µL) og MFnS (100 µL).
- Ruge løsninger for 30 min på 37 ° C og deretter la dem avkjøles til romtemperatur.
- Overføring individuelle løsninger til magnetisk relaxometer (0.47 Tesla) og registrere endringer i avslapning tid (T2) i forhold til CFUs i hver løsning.
- å registrere endringer i T2 verdier, begynner ved å måle T2 verdien av den planlagte løsningen som inneholder bare PBS og MFnS.
- Plass løsningen i den magnetiske relaxometer. Åpne respektive programvare, Velg det " T2 avslapning " innstillingen og trykk " mål. "
- etter samlingen av opprinnelige T2, måle T2 verdiene for flere løsninger som ble tilsatt forskjellige konsentrasjoner av bakterier.
Merk: Endring i T2 er tilsvarende planlagte T2 trukket fra piggete T2.
- å registrere endringer i T2 verdier, begynner ved å måle T2 verdien av den planlagte løsningen som inneholder bare PBS og MFnS.
- Fjerne prøver fra den magnetiske relaxometer og sentrifuge rørene på 2880 x g for 10 min.
- Dekanter nedbryting og resuspend bakteriell pellets i 100 µL av PBS (1 X, pH 7.4).
- Legge til 80 µL av hver rørets en 96-brønns plate og registrere fluorescens intensiteter på 595 nM.
Merk: Testing kan gjentatt benytter ulike løsemidler, inkludert vann, melk og andre som beskrevet i delen resultater
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningsmekanismen MFnS er representert i figur 1. Klynging av MFnS rundt på overflaten av bakteriell forurensning forstyrrer samspillet mellom magnetic cores av MFnS og omkringliggende hydrogen kjerner. Som følge av denne klynging, magnetiske avslapning øke verdier. Som konsentrasjonen av bakteriell forurensning klynging reduserer, og endringen i T2 verdiene synker. Tillegg av en fluorescerende modalitet er derfor avgjørende. Som bakteriell konsentrasjonen øker, øker styrken på fluorescerende signalet produsert av MFnS, tillater for følsom påvisning av bakteriell forurensning i både lav og høy konsentrasjon områder.
Etter protokollen,16 MFnS ble syntetisert og første testet i løsninger av PBS (1 X, pH 7.4). Første modalitet brukt for påvisning, magnetiske avslapning, ble brukt til å registrere endringer i T2 verdier. I henhold til protokollen, prøvene var så sentrifugeres, pellets var resuspended og fluorescens dataene ble samlet. Den tilsvarende ΔT2 og fluorescens utslippsverdier presenteres i figur 2. Som vist, ΔT2 verdien var størst i lave konsentrasjoner av bakteriell forurensning, og nådd metning på omtrent 20 CFUs. Fluorescens utslipp, derimot, ble mer nøyaktig på > 20 CFUs, viser viktigheten av å kombinere disse to modaliteter. Etter disse primære analyser, lignende tester ble utført i komplekse medier, inkludert vann og melk. Dette ble gjort for å sikre at nanosensors fortsatt effektiv i mer komplekse medier. Dataene som samles inn fra disse analyser vises i Figur 3 og er svært lik analyser utført i PBS. Dette bekrefter at disse nanosensors forblir effektiv i komplekse medier.
Etter bekrefter at MFnS kunne oppdage tilstedeværelsen av bakteriell forurensning i både enkle og komplekse media, ble en rekke tester deretter gjennomført for å fastslå graden av spesifisitet av nanosensors. Dette ble MFnS inkubert løsninger som inneholder målet bakterier, varme-drepte målet bakterier, ikke mål bakterier (ikke-patogene E. coli og S. typhimurium) og en blanding. Dette var bare en spesifisitet analysen, innsamling av magnetiske avslapning data alene var tilstrekkelig, og de tilsvarende dataene vises i Figur 4. Som kan sees, MFnS bundet bare for å leve E. coli O157: H7, og ikke andre varme-drepte eller ikke-mål bakterier. Denne graden av spesifisitet er tilskrevet konjugert målretting antistoffer, og videre bekrefter at MFnS vil være effektiv på å oppdage bestemte patogen forurensning, selv når i tilstedeværelsen av ikke-patogene bakterielle arter.
Figur 1 : Magneto-fluorescerende oppdagingen. Skjematisk fremstilling av MFnS syntese og dual-modalt mekanisme bakteriell gjenkjenning. Etter en kort inkubasjonstid (30 minutter) er MFnS følsomt oppdage mål bakterier via en kombinasjon av magnetisk resonans og fluorescens utslipp. Klynging av MFnS rundt på overflaten av bakteriell forurensning forårsaker endringer i magnetiske avslapning verdiene, som er detectable av en magnetisk relaxometer. I tillegg kan fluorescerende signaler innhentes fra MFnS direkte bundet til bakteriell forurensning. Dette gir en dual-modalt oppdagelsen plattform kan oppdagelsen bakteriell forurensning i både lav og høy konsentrasjon områder. 16 dette tallet er endret med tillatelse fra. 16
Figur 2 : Bevis på konseptet. A) magnetiske avslapning data (ΔT2) ble først innhentet fra fortynninger av E. coli O157: H7 (1-100 CFU) i PBS løsemiddel (1 X, pH = 7.4). MR gjenkjenning av bakterier var svært følsom på lavere CFU teller (innfelt: fra 1-20 CFU). Men ΔT2 målingene ble mettet på høyere bakteriell konsentrasjoner (> 20 CFU), som angir at MR er mer verdifull for deteksjon og kvantifisering av tidlig stadium bakteriell forurensning. B) fluorescens utslippsdata fra samme piggete PBS løsninger (innfelt: linearitet plott). Resultatene viste at fluorescens oppdagelsen metoden er mer følsom på høyere CFU teller, mens det mangler i følsomhet for lav CFU prøver. Sammen viser disse dataene evne til både magnetiske og fluorescerende modaliteter å oppdage og kvantifisere bakteriell forurensning i tidlig og sent-etappene av bakteriell forurensning. 16 gjennomsnittlige verdiene av tre målinger er avbildet ± standardfeil. Dette tallet er endret med tillatelse fra. 16
Figur 3 : Bakteriell gjenkjenning i komplekse Media. Magnetisk avslapning ΔT2 data samlet inn fra mer komplekse medier, inkludert A) innsjøen vann og B) helmelk. Ligner dataene som samles inn fra forrige PBS løsninger, ble det bemerket at påvisning av bakteriell forurensning var mer følsom i området 1-20 CFU (insets). Tilsvarende fluorescens utslippsdata ble samlet inn for C) vann og D) melk prøver (insets: linearitet tomter), som viste høyere følsomhet med økende CFU teller. Igjen, disse dataene demonstrere effektiviteten som hver modalitet utfyller den andre, og godkjenne deres evne til fortsatt fungere i komplekse medier. 16 gjennomsnittlige verdiene av tre målinger er avbildet ± standardfeil. Dette tallet er endret med tillatelse fra. 16
Figur 4 : MFnS spesifisitet. Spesifisiteten av MFnS ble testet med MR analyse i næringsrik buljong løsninger som inneholder A) en rekke bakterielle kryss-forurensning og blanding, og B) varme-inaktivere E. coli O157: H7. Som vist, er det klart at nanosensors har liten eller ingen binding med ikke-målrettede bakterier, og er fortsatt i stand til å oppdage mål bakterier i nærvær av andre forurensninger, sikrer at denne formen for screening ville være viable for bruk i komplekse medier som inneholder en rekke ikke-patogene bakterielle arter. C) videre spesifisitet tester ble utført av syntetisere MFnS med en isotype antistoff (røde sirkler: Anti -E. coli O111), som resulterte i liten eller ingen binding sammenlignet O157: H7 antistoff-konjugerte MFnS (svarte firkanter). Disse dataene viser at MFnS bare reagerer med levedyktig mål bakterier, videre bekrefte effektiviteten som point-of-care diagnostiske plattform. 16 gjennomsnittlige verdiene av tre målinger er avbildet ± standardfeil. Dette tallet er endret med tillatelse fra. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er utformet for å produsere fullt funksjonell MFnS så enkelt som mulig. Men er det mange viktige poeng som endring av protokollen kan være nyttig, avhengig av brukerens målet. For eksempel ville bruk av ulike antistoffer tillate for målretting av mange andre patogener. I tillegg er denne protokollen ikke begrenset til bruk av antistoffer som målretting molekyler. Et molekyl som har bestemte forpliktende tilhørighet for målet patogener, som vert celle reseptorer, kan også brukes som målretting molekyler. Så lenge målretting molekylet har en primær Amin eller alkohol, eller kan være functionalized for å ha en, kan det bli bøyd på overflaten av jernoksid nanopartikler ifølge EDC/NHS Bøyning kjemien i protokollen. For det andre, hvor mye MFnS i hver gjenkjennings-løsning kan varieres. Det er viktig å bruke nok slik at T2 verdien for den planlagte løsningen (inneholder bare løsemiddel og nanosensor uten mål patogen) er mellom 100-250 ms. hvis den opprinnelige verdien er under 100, og endringene i T2 verdier blir mindre sensitive , på grunn av en overflod av nanosensor. For å øke opprinnelige T2 verdi, redusere nanosensor i løsningen. Hvis imidlertid grunnlinjen er over 250, blir følsom og falske positiver kan bli mer sannsynlig. For disse grunner, er det foreslått for å satse på en planlagt løsning T2 verdi mellom 100-250 ms.
Nåværende begrensninger av denne protokollen, når de vurderer sin bruk som en point-of-care diagnose, er avhengigheten av den gjeldende Borstemmaskin magnetisk relaxometer. Mens effektive og stabile, kan denne magnetiske avslapning plattformen reduseres i størrelse å øke dens portabilitet. Dette vil øke brukervennligheten som denne plattformen kan brukes i ulike miljøer, som vannkilder eller i dagligvare markeder, for effektiv på stedet bakteriell screening. Dette kan også redusere kostnaden for denne maskinen, noe som gjør det mer gjennomførbart for point-of-care patogen gjenkjenning.
Om sykdom diagnose og patogen oppdagelsen i lav-ressurs innstillinger har denne plattformen potensial til å være mer effektiv enn gjeldende patogen diagnostisering teknikker brukes i dag, inkludert PCR og ELISA. Mens disse tradisjonelle teknikker har vist seg for å være hovedsakelig effektiv, er de svært komplekse, kostbare og treg. Som sådan, er det behov for en nøyaktig diagnose plattform som kan utvikles for bruk i lav-ressurs for point-of-care påvisning av patogener og sykdom diagnose. Denne plattformen er relativt enkel å bruke, kostnadseffektiv og rask. Bortsett fra første oppstartskostnader nødvendige maskiner (relaxometer og plate leser) er de faktiske MFnS relativt billig og veldig stabilt. I tillegg samlingen av T2 verdier er enkel og krever ikke en profesjonell lab tekniker.
I fremtiden, vil samarbeid med kjemiske og biologiske ingeniører være forfulgt for å designe en mer bærbar, håndholdt enhet som kan brukes til både magnetiske og fluorescerende oppdagelsen av bakteriell forurensning med MFnS. Utviklingen av en mindre enhet vil bidra til å ytterligere redusere kostnadene forbundet med denne oppdagelsen plattformen og øke effektiviteten i feltet. Videre har denne plattformen potensial til å bli brukt til å analysere effektiviteten av utvikle biocid agenter. Som vist i våre data, vår MFnS var bare i stand til å binde med live-målrettet bakterier, og produsert liten eller ingen signal når inkubert med varme-drepte bakterier. Basert på dette vår plattform kan brukes til å teste effektiviteten av biocid kandidater, og vi planlegger å utforske dette videre i fremtiden.
Avgjørende skritt i denne protokollen inkluderer innledende syntese av MFnS og samling T2 data. Det er viktig å rense riktig MFnS for å sikre at frittflytende antistoffer ikke forstyrrer T2 datainnsamling. Dessuten, må hvor mye MFnS i hver testprøven være konsekvent, som endringer i MFnS konsentrasjon vil endre T2 verdier, risikere falske positive/negative.
Avslutningsvis MFnS er romanen fremskritt i kampen mot bakteriell forurensning, og vil bli videre utviklet som målretting av flere patogener oppnås og design mer bærbare maskiner er forfulgt. Den lave kostnader og lite komplekse forbundet med bruken av MFnS gjør dem en levedyktig kandidaten skal brukes på stedet deteksjon av bakteriell forurensning. Mens syntese av disse nanosensors krever forsiktig forberedelse, deres faktiske bruk er relativt enkel, og gir dem muligheter for å redusere infeksjon og vannbårne sykdommer. Videre utvikling, implementering av disse nanosensors kan sees i screening av vannmagasinene og kommersielt produsert mat på emballasjen nettsteder, salg, og kanskje til og med hjem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Programmet viste denne nanoteknologi er ennå ikke godkjent av FDA.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av K-INBRE P20GM103418, Kansas soyabønner Commission (KSC/PSU 1663) ACS PRF 56629-UNI7 og PSU polymer kjemi oppstart fund, alle SS. Vi takker universitetet videographer, Mr. Jacob Anselmi, for sitt fremragende arbeid med video. Vi også takke Mr. Roger Heckert og fru Katha Heckert for deres generøse støtte for forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
