Summary
Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER + pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K d est également discuté.
Abstract
Les transitoires de calcium intracellulaire (Ca 2+ ) évoqués par des stimuli extracellulaires initient une multitude de processus biologiques dans les organismes vivants. Au centre de la libération de calcium intracellulaire sont les principaux organelles de stockage de calcium intracellulaire, le réticulum endoplasmique (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) plus spécialisé dans les cellules musculaires. La libération dynamique du calcium à partir de ces organites est médiée par le récepteur du ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) avec un remplissage à travers la pompe ATC de calcium ATPase réticulum sarco / endoplasmique (SERCA). Un capteur de calcium génétiquement codé (GECI) appelé CatchER a été créé pour surveiller la libération rapide de calcium de l'ER / SR. Ici, les protocoles détaillés pour la transfection et l'expression du GECI CatchER + amélioré ER / SR ciblé dans les cellules HEK293 et C2C12 et son application dans la surveillance des transitoires de calcium à médiation par pompe IP 3 R, RyR et SERCAS dans les cellules HEK293 utilisant une microscopie à fluorescence est décrite. L'agoniste du récepteur ou l'inhibiteur de choix est dispersé dans la solution de la chambre et les changements d'intensité sont enregistrés en temps réel. Avec cette méthode, on observe une diminution du calcium ER avec une activation de RyR avec 4-chloro-m-crésol (4 cmc), l'activation indirecte d'IP 3 R avec de l'adénosine triphosphate (ATP) et l'inhibition de la pompe SERCA avec cyclopazonium Acide (CPA). Nous discutons également des protocoles pour déterminer le K D in situ et quantifier basal [Ca 2+ ] dans des cellules C2C12. En résumé, ces protocoles, utilisés conjointement avec CatchER + , peuvent provoquer une libération de calcium médiée par les récepteurs à partir de l'ER avec une application future dans l'étude des pathologies liées au calcium ER / SR.
Introduction
Les attributs spatio-temporels des transitoires intracellulaires de calcium (Ca 2+ ) activent diverses fonctions biologiques 1 . Ces événements de signalisation de Ca 2+ sont déclenchés de manière extracellulaire par différents stimuli et contrôlés intracellulairement par l'organelle de stockage principale de Ca 2+ et par de nombreuses pompes Ca 2+ , des canaux et des protéines de liaison Ca 2+ . Les transitoires de Ca 2+ peuvent être modifiés de manière significative à la suite de défauts de modulation du signal, entraînant différentes maladies 2 . En raison de la vitesse et de la complexité du système de signalisation Ca 2+ , avec le réticulum endo- (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) au centre, des sondes de Ca 2+ codées génétiquement, optimisées pour une expression mammaire avec une cinétique rapide, sont nécessaires Pour observer les changements mondiaux et locaux de Ca 2+ dans différentes cellules 3 .
L'ER et le SR, Son homologue dans les cellules musculaires, sont les principales organelles intracellulaires de stockage de Ca 2+ et agissent comme des éviers Ca 2+ qui aident à amplifier le signal Ca 2+ 4 . L'ER / SR fait partie intégrante de la signalisation Ca 2 + avec deux rôles d'émetteur et de récepteur de signaux 5 . Le récepteur de ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) sont des récepteurs de libération de Ca 2+ situés sur les membranes de l'ER / SR qui sont régulés par Ca 2+ 6 . D'autres agents stimulent directement ou indirectement la fonction de ces récepteurs. Le 4-chloro-m-crésol (4 cmc) est un agoniste puissant du RyR, ayant une sensibilité 10 fois plus élevée que la caféine pour induire une libération de SR Ca 2+ où les deux sont régulièrement employés pour étudier la libération de Ca 2+ médiée par RyR dans Cellules saines et malades 7 . L'ATP augmente le Ca 2+Bail via IP 3 R 8 . L'ATP se lie au récepteur purinergique P2YR, un récepteur couplé à la protéine G (GPCR), déclenchant la production d'IP 3 qui se lie à l'IP 3 R pour libérer Ca 2+ de l'ER 9 , 10 . La pompe ATPase de calcium du réticulum sarco-endoplasmique (SERCA) est une pompe ATPase de type P, également située sur la membrane ER / SR qui réduit le Ca 2+ cytosolique et recharge l'ER / SR en pompant activement l'ion dans la lumière ER / SR 11 . Les inhibiteurs spécifiques de la pompe SERCA comprennent thapsigargin, de Thapsia garganica et de l'acide cyclopiazonique (CPA), d' Aspergillus et Penicillium . CPA a une faible affinité pour la pompe et bloque de manière réversible le point d'accès au Ca 2+ 12 . Thapsigargin, d'autre part, se lie de manière irréversible à la pompe libre de Ca 2 + au résidu F256 dans l'hélice M3 avec nanomolAr affinité 11 . L'analyse et la quantification des changements impliqués dans les événements stimulés par Ca 2 + ont été et continuent d'être un défi. Étant donné que le ER / SR est le compartiment principal subcellulaire Ca 2+ avec une fonction centrale dans la propagation du signal Ca 2+ , beaucoup de travail a été mis au point pour la compréhension de la signalisation ER / SR Ca 2+ 5 .
La création de colorants synthétiques Ca 2 + a contribué à faire avancer le terrain et à pratiquer l'imagerie Ca 2+ . Bien que les colorants, tels que Mag-Fura-2, aient été largement utilisés pour mesurer le Ca 2+ compartimenté dans différentes cellules, 13 , 14 , 15 , ils ont des limitations telles que le chargement irrégulier de la teinture, le photoblanchage et l'incapacité d'être ciblés sur des organites spécifiques . La découverte de la protéine fluorescente verte (GFP) et l'avancement des protéines fluorescentes -Les sondes à base de Ca 2+ ont propulsé le champ de l'imagerie Ca 2 + vers l'avant 16 . Certains des GECI existants sont des paires de transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) impliquant des protéines fluorescentes jaunes (YFP), des protéines cyan fluorescentes (PCP), la calmoduline et le peptide de liaison M13 17 , 18 . Les GECI à base de Troponin C sont également disponibles sous forme de paires de CFP et de Citrine FRET et en tant que sondes fluorophores simples 19 , 20 , 21 . D'autres, comme GCaMP2 et R-GECO, sont des capteurs fluorophores individuels impliquant la calmoduline 22 , 23 . Pour surmonter les limites du réglage étroit de K d et de la liaison coopérative associée à de multiples sites de liaison au Ca 2+ trouvés dans leurs domaines de liaison au Ca 2+ 24 , une classe de calcium récenteSors a été créé en concevant un site de liaison au Ca 2+ à la surface du baril bêta dans un emplacement sensible au chromophore de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) 25 , 26 . Ce capteur hautement touché, appelé CatchER, a un K d de ~ 0,18 mM, ak sur près de la limite de diffusion, et ak hors de 700 s -1 . CatchER a été utilisé pour surveiller la libération de calcium ER / SR médiée par les récepteurs dans différentes lignées cellulaires de mammifères telles que HeLa, HEK293 et C2C12 25 . En raison de sa cinétique rapide, CatchER a été utilisé dans les fibres musculaires flexor digitorum brevis (FDB) des souris jeunes et anciennes Friend Virus B NIH Jackson (FVB) pour révéler que plus de Ca 2+ reste dans la SR après 2 s de dépolarisation dans la FDB Fibres de souris anciennes comparées à celles de souris jeunes 27 . Pour surmonter sa faible fluorescence à 37 ° C, ce qui entrave ses applications dans l'imagerie au calcium de mammifèresCell, nous avons développé une version améliorée de CatchER appelée CatchER + . CatchER + présente une fluorescence améliorée à 37 ° C pour une meilleure application dans les cellules de mammifères. Des mutations supplémentaires ont été incorporées dans CatchER pour améliorer la thermostabilité et la fluorescence à 37 ° C 28 , 29 , pour créer CatchER + . CatchER + affiche une augmentation de six fois de son rapport signal sur bruit (SNR) sur CatchER 30 .
Ici, les protocoles pour la culture et la transfection de cellules HEK293 et C2C12 avec CatchER + et son application pour la surveillance des transitoires de calcium médiés par les récepteurs ER / SR sont présentés. Des résultats représentatifs sont présentés pour CatchER + exprimé dans des cellules HEK293 traitées avec 4 cmc, CPA et ATP. Nous proposons également un protocole pour déterminer le K d in situ de CatchER + dans les cellules myoblastes C2C12 et quaNtification de basal [Ca 2+ ].
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Protocol
1. Préparation de la diapositive
- Placez des lames de microscope en verre de 22 mm x 40 mm dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm, 1 glissière par plat.
- Exposez chaque côté de chaque glissière ainsi que le plat de 6 cm à la lumière ultraviolette (UV) pendant 15 à 20 minutes pour la stériliser dans un capot stérile.
- Couvrir la vaisselle avec des toboggans à l'intérieur avec un parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.
2. Préparation des supports, des tampons, des solutions et des réactifs
- Préparer 1 L de solution équilibrée de sel de Hank (HBSS) dans de l'eau désionisée et ajouter 10 mM d'HEPES, 5 mM de NaHC03 et 1 mM d'EGTA. Ajuster à pH 7,2-7,3 avec du NaOH. Tampon de filtre avec un filtre de 0,22 μm dans une bouteille autoclavée.
- Préparez 900 ml de milieu Eagle Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) dans de l'eau désionisée. Ajouter 44 mM de NaHC03 et ajuster le pH à 7,2-7,3 avec du HCl. Filtre avec un filtre de 0,22 μm dans une bouteille autoclavée. Ajouter 100 ml de bovin fœtalNe Sérum (FBS) sur les médias pour rendre la concentration de FBS 10%. Conserver à 4 ° C.
- Préparer 1 L de tampon intracellulaire (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 mM) dans de l'eau désionisée et ajuster le pH à 7,25. La finale [Ca 2+ ] sera de ~ 100 nM. Avant utilisation, ajouter 0,5 mM d'ATP. Ranger à température ambiante.
- Préparer 1 L de tampon de Ringer (121 mM de NaCl, 2,4 mM de K 2 HPO 4 , 0,4 mM de KH 2 PO 4 , 10 mM d'HEPES et 1,2 mM de MgCl2) dans de l'eau désionisée et ajuster le pH à 7,2. Ranger à température ambiante. Pour utiliser, aliquotez 50 ml dans un tube de 50 ml et ajoutez 1,8 mM de Ca 2+ et 10 mM de glucose.
- Préparer 1 L de solution de rinçage KCl (125 mM de KCl, 25 mM de NaCl, 10 mM d'HEPES, 0,2 mM de MgCl2) dans de l'eau désionisée et ajuster le pH à 7,25.
- Dissoudre 5 mg d'ionomycine dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Aliquote 30 μL en microtubes et entreposez à -206; C.
- Préparer le stock d'acide cyclopiazonique (CPA) en dissolvant CPA dans DMSO. Assurez-vous que le pourcentage final de DMSO est ≤ 1% pour le CPA ajouté aux cellules pour prévenir l'apoptose. Préparer du 4-chloro-m-crésol 20 mM (4 cmc) en dissolvant dans de l'H 2 O filtré et le laisser dissoudre pendant une nuit en agitant à 37 ° C. Préparer le stock d'ATP en dissolvant dans H 2 O filtré à 100 mM.
- Pour déterminer le K d in situ , préparer 15 ml chacun de 1 mM d'EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM et 100 mM de Ca 2+ dans du tampon KCl en utilisant un 100 MM de stock d'EGTA et un stock de CaCl 2 1 M dissous dans de l'eau désionisée.
3. Culture cellulaire
- Culture C2C12 myoblast et cellules HEK293 selon les protocoles ATCC pour chaque utilisation de boîtes de culture cellulaire de 10 cm dans une hotte UV stérile.
NOTE: Les cellules C2C12 ne doivent pas être autorisées à croître à plus de ~ 70% de confluence puisque les myoblastes commenceront à différerDans les myotubes. Les cellules HEK293 et C2C12 se développent facilement et ne devraient pas dépasser 100% de confluence pour maintenir l'intégrité de la cellule. En outre, les cellules ne doivent pas être passées plus de 10 fois avant de les utiliser pour une expérience afin de préserver la santé des cellules.
4. Transfection des cellules HEK293
- Les cellules HEK293 de semences sur des lames de microscope en verre stérilisées de 22 mm x 40 mm dans des plaques de 6 cm, de sorte qu'elles sont confluées à 70% le jour de la transfection.
- Le lendemain, suivez le protocole du fabricant pour le réactif de transfection pour transfecter des cellules en utilisant 2 μg d'ADNc CatchER + et un rapport ADN: rapport de réactif de transfection dans le milieu de sérum réduit ( p. Ex. Opti-MEM) 1: 3 (poids / volume).
- Videz les milieux DMEM du plat et ajoutez 3 mL de sérum réduit. Ajouter l'ADN: mélange de réactif de transfection dans le plat et incuber pendant 4-6 h à 37 ° C.
- Après incubation, laver les cellules avec 5-6 mL de HBSS. Jeter le HBSS fRomper le plat et remplacer par 3 mL de DMEM frais et les incuber à 37 ° C pendant 48 h pour permettre l'expression du GECI.
- Transfection de cellules de myoblastes C2C12
- Pour les cellules de myoblastes C2C12, trypsiniser les cellules en ajoutant suffisamment de trypsine pour couvrir le fond du plat (1-2 ml). Placer le plat dans un incubateur de 37 ° C pendant 2 à 6 minutes pour permettre à la trypsine de desserrer les cellules du fond du plat.
- Une fois l'incubation terminée, retirer la trypsine et aspirer les cellules dans 8 mL de DMEM. Pipettez les cellules à fond avec le DMEM pour disperser et ré-suspendre les cellules et les semer sur des lamelles stériles dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm contenant 3 mL de DMEM afin que la confluence finale soit de 60%.
- Transférez les cellules le même jour que décrit à l'étape 4.2-4.3. Incuber pendant 24 h à 37 ° C.
- Répétez l'étape 4.4.
5. Préparation du microscope à glissière et fluorescence
- Allumez mIcroscope et source lumineuse, puis ouvrez le programme Simple PCI. Laisser le microscope se réchauffer pendant 15 à 20 minutes ou jusqu'à ce que la caméra du dispositif à couplage par charge (CCD) refroidisse à -65 ° C. Préparez la chambre et glissez avec les cellules en attente.
- Couvrez le fond de la chambre d'imagerie de bain à diamant ouverte à profil bas avec une fine couche d'agent d'étanchéité, à l'aide d'un coton-tige.
- Prenez la glissière contenant des cellules transfectées hors de l'incubateur et rincez doucement trois fois avec 1 ml de tampon de Ringer avec 10 mM de glucose et 1,8 mM de Ca 2 + préchauffé à 37 ° C.
- Laisser 1 mL de tampon de Ringer dans le plat, pour éviter que les cellules ne se séchent et utiliser une pince pour retirer la lame du plat. Laisser l'excès de solution absorber sur un tissu de laboratoire en touchant le bord de la glissière sur un tissu de laboratoire. Ensuite, placez-les sur le côté de la chambre contenant la graisse avec des cellules orientées vers le haut en direction de la graisse et fixez la chambre sur le montage du plateau à l'aide d'un tournevis.
- Ajouter 1Ml de tampon de Ringer dans la chambre pour empêcher les cellules de sécher pendant le montage de la chambre sur la scène et compléter le reste de la configuration du microscope. Une fois que le tuyau d'aspiration sous vide est fixé à la chambre, le volume final de la chambre est de ~ 450 μL.
- Changez l'objectif du microscope à l'objectif d'immersion en huile 40X.
- Utilisez un papier d'objectif et une solution de nettoyage d'objectif pour nettoyer et sécher l'objectif. Ne frottez pas l'objectif. Dab doucement jusqu'à ce que la surface soit propre.
- Ajouter une goutte de l'huile d'immersion à l'objectif.
- Placez le support sur le stade du microscope et ajoutez la pointe d'aspiration à la chambre. Une fois que le tuyau d'aspiration sous vide est fixé à la chambre et allumé, le volume final de la chambre est de ~ 450 μL. Ce volume final est au niveau des côtés de la chambre. Il est impératif que la solution de la chambre soit au niveau, au cours de l'expérience, pour éviter que la solution ne se déverse dans l'objectif en raison du remplissage excessif.
- En utilisant le mode de champ lumineux, ajustez le gain à 175 et le temps d'exposition à 0,03 s pour concentrer les cellules.
- Une fois que les cellules sont focalisées, passez en mode fluorescence en utilisant une excitation de 488 nm. Changez le temps d'exposition à 0,07 s. Localisez un champ de vision qui contient suffisamment de cellules qui sont en bonne santé avec une fluorescence adéquate à l'image.
- Une fois qu'un champ de vision a été choisi, prenez des photos en mode fluorescence et en champ lumineux.
- Entourez une région d'intérêt (ROI) dans les cellules ou encercler la cellule entière pour enregistrer l'intensité de la zone choisie.
6. Impression de transitoires Ca 2+ induits par des médicaments et Calibration in situ K d
- Mesure d'intensité de démarrage avec cadence de trame réglée à une fois tous les 5 s.
- Permettre à l'intensité de base de se stabiliser pour 20 à 30 images (100-150 s). Au besoin, diminuez la frAmes / s pendant cette étape pour empêcher le photoblanchage.
- Calculez la quantité de 4 cmc nécessaire à partir d'un stock 20 mM basé sur le volume final de la chambre de ~ 450 μL pour obtenir une concentration finale de 200 μM. Effectuez des dilutions du stock si nécessaire.
- Prenez soigneusement 60 μL de tampon Ringer de la chambre et placez-le dans un tube à microcentrifugeuse. Diluer la quantité calculée de 4 cmc avec cette solution et ajouter à la chambre pour évoquer la réponse voulue des cellules en cours d'image.
- Ajouter la quantité calculée de 4 cmc au tube de microcentrifugeuse et mélanger par pipettage.
- Ajoutez doucement la solution sur le champ de vision tout en ajoutant simultanément le marqueur d'événement dans la mesure d'intensité.
- Laisser le temps pour le médicament de se lier au récepteur et le signe subséquent diminuer, puis laver avec 3-6 mL de tampon de Ringer avec 1.8 mM de Ca 2+ et 10 mM de glucose tout en ajoutant simultanément le marqueur de l'événement. Comme le volume de la chambre est de 450 &# 181; L et est connecté à un vide, en ajoutant 3 à 6 ml de tampon assure que l'ancienne solution contenant le médicament a été emportée et remplacée par la solution nouvellement ajoutée.
- Répétez 6.1-6.7 pour ATP 100 μM et CPA 15 μM, en utilisant une nouvelle glissière de cellules transfectées pour chaque dosage.
- Une fois la mesure terminée, terminez la collecte de données dans la fenêtre de mesure d'intensité dans le programme Simple PCI.
- Prenez des images fluorescentes et lumineuses des cellules.
- Ouvrez le fichier de données pour l'expérience. Ici, re-encercler les cellules ou régions d'intérêt pour recalculer les valeurs d'intensité, si nécessaire.
- Pour déterminer le Kd in situ dans les cellules myoblastes C2C12, suivre le protocole décrit dans la section 4.2 et la section 5 et mettre 1 ml de tampon 0 mM Ca 2+ Ringer dans la chambre.
- Perméabiliser les cellules avec 0,002-0,005% de saponine dans un tampon intracellulaire pendant 15 à 30 s pour vider les cellules de toutCatch + + peut être dans le cytosol. Laver les cellules avec 3 à 6 ml de 1 mL d'EGTA dans un tampon KCl avec 10 μM d'ionomycine. Permettre à l'intensité de diminuer jusqu'à ce qu'un plateau soit atteint.
- Rincer avec 3-6 mL de tampon KCl avec une ionomycine 10 μM et permettre à l'intensité de se stabiliser, puis ajouter chaque solution de Ca 2+ détaillée à l'étape 2.7. Permettre à l'intensité d'atteindre un plateau entre chaque addition.
- Pour calibrer le capteur pour la quantification basale [Ca 2+ ], suivez l'étape 6.12. Utilisez l'EGTA et le tampon 100 mM Ca 2+ de l'étape 2.7 pour obtenir l'intensité de fluorescence minimale et maximale.
7. Traitement des données
- Téléchargez le fichier tableur des données de mesure d'intensité.
- Normaliser les données pour chaque cellule à l'intensité de la ligne de base (F / F 0 ). Tracer les données normalisées en fonction du temps dans n'importe quel programme graphique.
- Pour calculer le changement%, soustrayez le pic maximal normaliséUe de 1 et multipliez par 100. Calculer la moyenne et l'écart type si plusieurs cellules ont été imagées.
- Pour calculer le rapport signal sur bruit, SNR, ouvrez le fichier image sauvegardé à partir de l'expérience dans un logiciel de traitement d'image, tel que ImageJ, puis mesurez le signal, les cellules transfectées et le fond du bruit. Calculer le SNR en utilisant l'équation SNR = signal / bruit.
- Pour calculer le K D in situ à partir des données d'imagerie de fluorescence collectées, moyenne des données d'intensité, comprenant les plateaux, après addition de chaque concentration de Ca 2+ et EGTA (0 mM Ca 2+ ). Calculer la saturation fractionnaire (intensité relative) en utilisant θ = (F - F min ) / (F max - F min ), où θ est l'intensité relative, F est la fluorescence à n'importe quel point, F min est l'intensité de fluorescence minimale et F max est l'intensité maximale de fluorescence, pour voir la variation de l'intensité de tIl sonde avec l'addition de Ca 2+ par rapport à l'intensité minimale. Tracer les données d'intensité relative contre [Ca 2+ ] dans n'importe quel programme de montage graphique et de courbe. Utilisez l'équation de liaison 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) traduit pour n'importe quel programme de montage graphique et courbe pour calculer le K d . M T est la concentration totale en métal.
- Pour quantifier le calcium basal de l'étalonnage décrit en 6.13, moyenne des données d'intensité, comprenant les plateaux, après addition d'EGTA 1 mM (F min ) et 100 mM Ca 2+ (F max ). Utilisez l'équation d'étalonnage [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] pour calculer le calcium basal.
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Representative Results
Cette section illustrera les résultats obtenus en utilisant les méthodes décrites précédemment en utilisant le GECI CatchER + optimisé ER / SR pour surveiller les changements dans ER / SR Ca 2+ à travers différentes voies médiées par les récepteurs.
La figure 1 illustre la vidange ER à travers le RyR stimulé avec 200 μM de 4 cmc. 4 cmc est un agoniste du RyR. L'addition du médicament induit une diminution du calcium ER en fonction de la diminution de l'intensité de fluorescence CatchER + . Comme indiqué, le protocole décrit ici permet la visualisation et la mesure des transitoires de Ca 2+ médiés par le récepteur utilisant CatchER + qui fournit des informations sur les changements dans ER Ca 2+ .
Comme le montre la figure 2 , l'addition de 15 μM CPA, pour bloquer de manière réversible la pompe SERCA, produit une forte diminution de l'intensité de fluorescence qui forme un plateau. Comme la fonction de la pompe SERCA est inhibée, les canaux de libération de ER Ca 2+ libèrent encore activement Ca 2+ dans le cytosol, ce qui provoque une diminution de l'intensité de fluorescence. Les cellules se récupèrent après avoir lavé le CPA avec le tampon de Ringer contenant 1,8 mM de Ca 2+ et 10 mM de glucose. Ces résultats confirment la capacité de CatchER + à surveiller les transitoires Ca 2+ spécifiques à la pompe SERCA.
La figure 3 montre des données représentatives pour l'activation indirecte de l'IP 3 R avec 200 μM d'ATP dans des cellules HEK293 transfectées avec CatchER + . L'ATP se lie au récepteur P2Y, un récepteur couplé à la protéine G, qui génère IP 3 qui active la libération de Ca 2+ via IP 3 R. Bien que le changementEst faible, l'ajout d'ATP de 200 μM produit une diminution visible de l'intensité du signal. Le lavage des cellules avec le tampon de Ringer contenant 1,8 mM de Ca 2+ et 10 mM de glucose permet à l'ER de remplir et le signal pour revenir à la ligne de base. Ces résultats mettent en évidence la capacité de CatchER + à surveiller la libération de calcium par voie IP 3 R grâce à une stimulation indirecte.
Sur la figure 4 , CatchER + a été transfecté dans des cellules de myoblastes C2C12 pour déterminer le K d in situ . Les données ont été recueillies comme indiqué dans le protocole. Les cellules de myoblastes C2C12 ont été perméabilisées avec 0,005% de saponine pendant 15 à 30 s puis lavées avec de l'EGTA 1 mM dans un tampon KCl contenant 10 μM d'ionomycine. Les différentes concentrations de Ca 2+ ont été préparées dans un tampon KCl contenant 10 μM d'ionomycine et ont été ajoutées par étapes. Les données ont été normalisées et ajustées en utilisant la liaison 1: 1Équation. La moyenne K d était de 3,1 ± 1,4 mM pour 7 cellules. La faible affinité de CatchER + lui permet de détecter le Ca 2+ dans les organites Alto Ca 2+ comme l'ER ou le SR. Pour déterminer le basal [Ca 2 + ] dans le SR, les cellules C2C12 ont été perméabilisées avec 0,005% de saponine pendant 15 à 30 s, lavées avec du tampon KCl, puis lavées avec de l'EGTA 1 mM dans du tampon KCl contenant de l'ionomycine 10 uM pour obtenir F min . Après avoir nettoyé l'EGTA avec un tampon KCl maximum, on a ajouté F max , 100 mM de Ca2 + avec 10 uM d'ionomycine. Le Ca2 + basal a été calculé pour être 0,4 ± 0,2 mM.
Figure 1: Stimulation de RyR en utilisant 4 cmc dans des cellules HEK293. ( A ) Dépense de l'activation de RyR avec 4 cmc. ( B ) Enregistrement intensif des cellules HEK293Transfecté avec CatchER + , localisé dans l'ER, traité avec 200 μM de 4 cmc. La stimulation du RyR avec 4 cmc entraîne une diminution de l'intensité de fluorescence normalisée qui se rapproche directement d'une diminution de l' ER [Ca 2+ ]. N se réfère au nombre de cellules imagées. La diminution moyenne du signal était de 12,0 ± 2,2%. La présence de 1,2 mM de Ca 2+ dans le tampon de Ringer a facilité le remplissage de l'ER reflété dans la récupération d'intensité à la ligne de base. Les images en bloc montrent les cellules avant et après le traitement avec 4 cmc. La SNR a été calculée à 4,3 ± 0,8. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Diminution de [Ca 2+ ] ER en utilisant la SERCA réversible pCPA inhibiteur d'ump dans les cellules HEK293. ( A ) L'inhibition de la pompe SERCA par CPA. ( B ) Imagerie en direct des cellules HEK293 transfectées avec CatchER + , localisées dans l'ER, traitées avec 15 μM de CPA. Parce que Ca 2+ peut encore circuler à travers IP 3 R et RyR, le blocage de la pompe SERCA avec CPA provoque une diminution de l'intensité de fluorescence normalisée qui est directement corrélée à une diminution de [Ca 2+ ] ER . N se réfère au nombre de cellules imagées. Les images en bloc sont des cellules HEK293 transfectées avec CatchER + avant et après le traitement. La diminution moyenne du signal était de 21,0 ± 0,3%. La présence de 1,2 mM de Ca 2+ dans le tampon de Ringer a facilité le remplissage de l'ER reflété dans la récupération d'intensité à la ligne de base. La SNR était calculée à 5,5 ± 0,8. Cliquez ici pour voir une plus grande version decette figure.
Figure 3: L'ATP diminue [Ca 2+ ] ER dans les cellules HEK293. ( A ) Schéma de l'activation indirecte d'IP 3 R avec ATP par le récepteur purinergique P2YR. P2YR est un GPCR qui génère IP 3 sur la liaison ATP. L'IP 3 active l'IP 3 R, stimulant la libération de calcium de l'ER. ( B ) Imagerie en temps réel des cellules HEK293 transfectées avec CatchER + , localisées dans l'ER, traitées avec 200 μM d'ATP. La stimulation indirecte de l'IP 3 R par l'intermédiaire du récepteur P2Y avec ATP provoque une diminution de l'intensité de fluorescence normalisée qui est directement corrélée à une diminution de [Ca 2+ ] ER . N se réfère au nombre de cellules imagées. La diminution moyenne du signal était de 6,0 ± 3,0%. SNR était cCalculé à 6,7 ± 2,7. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Kd in situ de CatchER + dans des cellules de myoblastes C2C12. Des traces représentatives pour l'intensité normalisée recueillies à partir de cellules de myoblastes C2C12 perméabilisées transfectées avec CatchER + . Les cellules ont été perméabilisées avec 0,005% de saponine dans un tampon intracellulaire pendant 15 à 30 s. Des solutions EGTA et Ca 2+ ont été préparées dans un tampon KCl, n désigne le nombre de cellules imagées. ( A ) Les images de fluorescence intercalaires sont représentatives des cellules avant et après le traitement. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 et 100 mM Ca 2+ a été ajouté à des cellules de myoblastes C2C12 perméabilisées en présence de 10 uMIonomycine pour obtenir un K d de 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) Les images de fluorescence de l'insert sont représentatives des cellules aux valeurs minimales et maximales, après addition de 1 mM d'EGTA et 100 mM de Ca 2+ avec 10 uM d'ionomycine chacune, respectivement. Le Ca2 + basal a été calculé pour être 0,4 ± 0,2 mM. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'imagerie monocellulaire vivante de sondes fluorescentes, comme CatchER + , est une technique efficace pour analyser des processus complexes de signalisation ER / SR Ca 2+ dans chaque cellule en réponse à des agonistes ou antagonistes de récepteurs. Cette technique est également utile pour l'imagerie en utilisant simultanément plusieurs longueurs d'ondes, telles que nécessaire pour Fura-2 ou pour l'image de CatchER + et Rhod-2 pour surveiller à la fois les variations ER et cytosoliques, respectivement. Il existe plusieurs étapes critiques dans ce protocole; La transfection cellulaire peut avoir un grand effet sur la viabilité de l'imagerie. Les faibles taux de transfection peuvent entraîner une expression insuffisante du GECI pour la surveillance des réponses au calcium. D'autre part, la surexpression de CatchER + n'aura pas d'effet tampon sur ER / ER Ca 2+ , un problème associé aux colorants de calcium synthétiques. Les effets tampons des sondes Ca 2+ sont influencés par le [Ca 2+ ] dans l'organelle, le K d de la pRobe et la concentration de la sonde requise pour la mesure. Le cytosolique [Ca 2+ ] se situe généralement dans la faible gamme nanomolaire, cependant, la concentration requise de la sonde est dans une gamme comparable. Dans ce cas, la quantité de concentration de colorant et sa capacité à tamponner le calcium cytosolique était, et est, une préoccupation majeure pour l'imagerie cellulaire. En revanche, ER / SR [Ca 2+ ] est dans les 100s de la plage micromolaire à millimolaire 31 comme nous l'avons déterminé pour différentes lignées cellulaires de mammifères 25 . Étant donné que l'expression de 0,1-1 μM de CatchER + est suffisante pour permettre la détection du calcium ER, l'effet tampon de CatchER est négligeable. Ainsi, CatchER + peut surveiller le flux de Ca 2+ dans des environnements élevés [Ca 2+ ] sans effet tampon sur luminal ER / SR Ca 2+ 32 .
Plusieurs facteurs peuvent affecter l'efficacité de transfection de la GECI, comme le temps d'incubation, th.Le réactif de transfection, la température d'incubation et la confluence cellulaire. La confluence cellulaire, lors de l'ensemencement des cellules sur la glissière, peut affecter de manière significative la qualité de l'imagerie. La faible confluence peut entraîner un faible nombre de cellules (n) et moins de précision statistique, tandis que des niveaux élevés de confluence conduisent à des couches superposées de cellules produisant de grandes variables dans l'imagerie. Le temps et la température pour la transfection doivent être optimisés en fonction du type de cellule. En outre, l'ajout de DMEM avec un milieu sérique réduit est optimal pour des temps de transfection plus longs pour prévenir l'apoptose. La fluorescence originale GECI CatchER dans les cellules de mammifères, lorsqu'elles ont été cultivées et transfectées, n'était que de 30 ° C. La fluorescence de CatchER a été optimisée avec succès et améliorée pour l'expression à 37 ° C résultant en la nouvelle variante améliorée CatchER + . Un western blot utilisant un anticorps contre EGFP peut être effectué pour confirmer l'expression de la sonde Ca 2+ .
De plus, le moiLa qualité de la distribution des réactifs est essentielle. Des réactifs peuvent être ajoutés à la chambre par perfusion, diffusion à petit volume ou par des pompes mécaniques, ce qui peut provoquer des réponses différentes. Il est impératif que la chambre de solution soit correctement scellée en appliquant une couche de graisse d'étanchéité sur le fond de la chambre qui sera placée sur la glissière. Les longueurs d'onde correctes doivent être sélectionnées pour la sonde. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission pour CatchER + sont respectivement 395/488 nm et 510 nm. Pour l'imagerie cellulaire, seuls 488 nm sont utilisés pour l'excitation pour éviter les effets néfastes de la lumière UV sur les cellules. Par conséquent, l'utilisation de tous les filtres optiques qui excitent à 488 nm et de collecte de l'émission à 510 nm serait acceptable pour l'image avec CatchER + . Pour éviter tout photoblanchage, des efforts peuvent être axés sur l'optimisation de l'intensité de la lumière et de l'exposition à la lumière telles que les trames 33 .
Bien que ce protocole soit idéal pour analyser l'effEct des changements ER / SR à l'aide de la sonde fluorescente CatchER + Ca 2+ ER / SR, il existe des limites comme prévu dans toute expérience. Étant donné que l'imagerie en direct à une seule cellule analyse uniquement une petite structure de cellules, le nombre de cellules (n) peut varier de 1 à 100 cellules, en moyenne, mais peut être plus faible pour les lignées cellulaires plus importantes. Cela entraîne une diminution des nombres de cellules et des résultats statistiquement variés sans essais multiples. Un n> 6 est requis pour une précision statistique. Pour obtenir un plus grand n, il faut imaginer plusieurs plats ou d'autres techniques doivent être utilisées, simultanément. De plus, CatchER + est une sonde ER / SR Ca 2+ à une longueur d'onde unique, ce qui conduit à des problèmes d'autres sondes et colorants à longueur d'onde unique sans pouvoir quantifier le signal, sans savoir si le signal est vrai par opposition à la rupture des cellules Des artefacts et des gros bruit par rapport aux systèmes ratiométriques 34 .
Ce travail montre que ces sondes Ca 2+ optimisées peuventÊtre appliqué dans différents types de cellules ou types de tissus pour surveiller la libération d'ER / SR Ca 2+ médiée par les récepteurs. CatchER + est une sonde ER / SR Ca 2+ d' une seule longueur d'onde. Par conséquent, il est important que les paramètres expérimentaux et les paramètres soient cohérents pour la mesure quantitative. Un étalonnage détaillé de la concentration de calcium et K d du capteur de calcium dans les lignées cellulaires sont d'autres mesures importantes pour l'analyse quantitative.
Ces capteurs de calcium développés peuvent également être ciblés sur des emplacements spécifiques au sein de l'ER / SR pour surveiller les transitoires de Ca 2+ très différents qui existent par rapport aux changements globaux de Ca 2+ dans divers états biologiques et pathologiques. Ces résultats continueront à pousser les champs de l'imagerie Ca 2+ et la conception de la sonde pour fournir des outils futurs pour diagnostiquer les maladies liées au Ca 2+ . Les protocoles signalés et le capteur développé peuvent également être adaptés pour le médicament dEst contre les maladies associées à la signalisation du calcium.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, et une subvention supplémentaire NIH à FR, bourse BB à CM, bourse CDT à RG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
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