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Developmental Biology

सेल भेदभाव के दौरान मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेस पाथवे के प्रकाश-मध्यस्थतापूर्ण प्रतिवर्ती मॉडुलन और Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55823
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 1,3,4
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल सेल भेदभाव और ज़ीनोपस भ्रूणिक विकास के दौरान मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन कीनेज़ (एमएपीके) गतिविधि को व्यवस्थित करने के लिए एक ऑप्टोगैनेटिक रणनीति का वर्णन करता है। यह पद्धति स्तनधारी कोशिका संस्कृति में एमएपीके सिग्नलिंग मार्ग के प्रतिवर्ती सक्रियण और उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ ज़ीनोपस भ्रूण जैसे बहुकोशिकीय जीवों के जीवों के लिए अनुमति देता है।

Abstract

सेल्युलर कार्यों, सेल प्रसार, भेदभाव, प्रवासन, और एपोप्टोसिस सहित, अधिकतर के लिए किनास गतिविधि महत्वपूर्ण है। शुरुआती भ्रूणीय विकास के दौरान, किनेज गतिविधि बहुत ही गतिशील और भ्रूण भर में व्यापक है। औषधीय और आनुवांशिक दृष्टिकोण आमतौर पर किनेज़ की गतिविधियों की जांच के लिए उपयोग किया जाता है। दुर्भाग्य से, इन रणनीतियों का उपयोग करते हुए बेहतर स्थानिक और अस्थायी संकल्प प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, जीवित कोशिकाओं और बहुकोशिकीय जीवों में प्रतिवर्ती फैशन में कीनेज गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए यह संभव नहीं है। विकास और भेदभाव के दौरान कीज़ गतिविधि की मात्रात्मक समझ प्राप्त करने के लिए इस तरह की सीमा एक अवरोधक बना हुआ है। यह काम एक ऑप्टोगैनेटिक रणनीति को प्रस्तुत करता है जो कि फोटोएक्टिवेटेबल प्रोटीन अरबिडोप्सिस थालियाना क्रिप्टोच्रोम 2 (सीआरवाई 2) और क्रिप्टो-क्रोम-इंटरैक्टिंग मूल-हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (सीआईबीएन) के एन-टर्मिनल डोमेन वाले एक बायिसिस्टोनिक सिस्टम का लाभ उठाता है। रिवर्सीमिटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण जीना कोशिकाओं में प्रकाश-मध्यस्थता वाले प्रोटीन स्थानान्तरण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। यह दृष्टिकोण स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों और जीवित कशेरुकाय भ्रूणों पर लागू किया जा सकता है। इस बायिसिस्टोनिक प्रणाली को समान सक्रियण तंत्र के साथ अन्य किनों की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है और अन्य मॉडल सिस्टमों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

ग्रोथ कारक सेल फ़ंक्शंस के व्यापक प्रसार में शामिल हैं, जिसमें प्रसार, भेदभाव, प्रवास और एपोपोसिस शामिल हैं, और भ्रूण विकास, बुढ़ापे, और मानसिक स्थिति 1 , 2 , 3 , 4 के विनियम सहित कई जैविक घटनाओं में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाएं , 5 जटिल इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग कैसकेड के माध्यम से कई वृद्धि कारक संकेत देते हैं। ये सिग्नलिंग इवेंट प्रायः ठीक से नियंत्रित फैशन 6 , 7 में प्रतिवर्ती प्रोटीन फास्फोरायलेशन द्वारा संचालित होते हैं। इस प्रकार, प्रोटीन कैनेसेस के सिग्नलिंग परिणामों की समझ, जो प्रोटीन फास्फोरायलेशन के लिए ज़िम्मेदार है, मूलभूत रूप से महत्वपूर्ण है।

अलग-अलग विकास कारक एक आम इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग नेटवर्क के माध्यम से कार्य करते हैं, भले ही वे जिले को उत्तेजित करते हैंईंक्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं 8 , 9 रिसेप्टर टाइरोसिन किनेसेस के आम इंट्रासेल्युलर मध्यस्थों में रास, आरएएफ, बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेज़ (ईआरके), मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन कीनेज (एमएपीके) / ईआरके किनेसे (एमईके), फॉस्फोइनोसिटिड 3-किनेज (पीआई 3 के), आक्ट और फॉस्फोलाइपेस सी गामा शामिल हैं। (पीएलसीआईटी) 10 , 11 एकत्रित सबूत बताता है कि सिग्नलिंग विविधता और विशिष्टता सिग्नलिंग गतिविधि 12 के स्थानिक और अस्थायी विनियमन पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, चूहे फेमोमोसाइटोमा कोशिकाओं (पीसी 12) में, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) उत्तेजना, जो सेल प्रसार में परिणामस्वरूप, ईआरके मार्ग 9 को सक्रिय रूप से सक्रिय करता है दूसरी ओर, तंत्रिका वृद्धि कारक (एनजीएफ) के साथ उत्तेजना, जो सेल भेदभाव की ओर जाता है, ईआरके मार्ग को निरंतर तरीके से 9 , 13 में सक्रिय करता है। सुसंस्कृत आर मेंहिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में, मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ़) द्वारा क्षणिक सिग्नलिंग प्राथमिक न्युरेटिक परिणाम को बढ़ावा देता है, जबकि निरंतर सिग्नलिंग न्यूरेट शाखाओं में बढ़ जाती है 14 । शुरुआती भ्रूणीय विकास के दौरान, phosphorylated ERK गतिविधि अस्थायी रूप से गतिशील है और भ्रूण 6 भर में व्यापक है। शुरुआती जेनोपस भ्रूणजनन के दौरान हाल ही में आनुवंशिक स्क्रीन ने दिखाया कि ईआरके और एक्ट सिग्नलिंग कैसकेड, दो डाउनस्ट्रीम प्राथमिक विकास कारक रास्ते, चरण-विशिष्ट सक्रियण प्रोफाइल 7 प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, किनेज सिग्नलिंग परिणामों की समझ उपकरण के लिए कॉल करता है जो कि पर्याप्त संकल्प के साथ कीनेज गतिविधि के स्थानिक और अस्थायी विशेषताओं की जांच कर सकते हैं।

विकास के दौरान संकेत पारगमन की गतिशील प्रकृति की जांच के लिए पारंपरिक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में वांछनीय स्थानिक और अस्थायी संकल्प की कमी है। उदाहरण के लिए, औषधीय दृष्टिकोण छोटे रसायन का उपयोग करते हैंकोशिकाओं और ऊतकों में संकेत पारगमन को उत्तेजित या दबाने के लिए िकल या जैविक अणु। इन छोटे अणुओं की विलक्षण प्रकृति उनके हित के एक विशिष्ट क्षेत्र में अपनी कार्रवाई को सीमित करने के लिए चुनौती देती है। आनुवंशिक दृष्टिकोण ( जैसे ट्रांसजेनेसिस , क्रे-लॉक्स सिस्टम, या उत्परिवर्तजन) अक्सर लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन गतिविधि 16 , 17 , 18 के अपरिवर्तनीय सक्रियण या दमन के लिए प्रेरित करते हैं। टेट-ऑन / टेट-ऑफ सिस्टम 1 9 में जीन ट्रांसक्रिप्शन के सुधार का अस्थायी नियंत्रण होता है लेकिन इसमें कठोर स्थानिक नियंत्रण नहीं होता क्योंकि यह टेट्रासाइक्लिन के प्रसार पर निर्भर करता है रासायनिक प्रेरित प्रोटीन डिमराइजेशन 20 या फोटो-असरिंग 21 , 22 , 23 , 24 में हाल के घटनाक्रम में काफी वृद्धि हुई हैसिग्नलिंग नेटवर्क का अस्थायी नियंत्रण हालांकि, कैजल के रसायनों के विलक्षण प्रकृति के कारण स्थानिक नियंत्रण, चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।

हाल ही में उभरते हुए ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण, जो प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश की शक्ति का उपयोग करते हैं, उच्च स्पीटियोटेम्पोरल परिशुद्धता के साथ सिग्नलिंग मार्गों के साथ-साथ प्रतिवादात्मकता के लिए मॉड्यूलन की अनुमति देते हैं। न्यूरॉनल फायरिंग 25 , 26 , 27 को नियंत्रित करने में अपनी प्रारंभिक सफलता के कुछ समय बाद, जैव प्रतिलेखन, अनुवाद, सेल प्रवासन, भेदभाव और एपोपोसिस जैसे अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोगनेटिक्स को 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 पी का उपयोग करते हुए एक रणनीतिहॉट-एक्टिवेटेबल प्रोटीन जोड़ी अरबिडोप्सिस थलियाना क्रिप्टोच्रोम 2 (सीआरवाई 2) प्रोटीन और क्रिप्टो-क्रोम-इंटरैक्टिंग मूल-हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (सीआईबीएन) के एन टर्मिनल डोमेन हाल ही में स्तनधारी कोशिकाओं में रफ1 कीनेस गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया गया था और एक्सनोपस भ्रूण 35 CRY2 नीले-प्रकाश उत्तेजना पर सीआईबीएन से बांधता है, और सीआरवाई 2 / सीआईबीएन प्रोटीन जटिल गहरे 34 में अनायास ही अलग हो जाता है। ब्लू लाइट सीआरवाई 2 कॉफ़ैक्टर, फ्लेविन एडिनइन डिन्यूक्लियोटाइड (एफएडी) को उत्तेजित करता है, जो सीआर 2 2 में गठनात्मक परिवर्तन और इसके बाद सीआईबीएन के लिए बाध्यकारी होता है। सीआरए 2 2 के सीधा उपयोग के साथ सीआरए 2 W374 ए उत्परिवर्ती प्रकाश से स्वतंत्र सीआईबीएन के साथ बांधता है, जबकि CRY2 D387A उत्परिवर्ती नीले रंग के तहत सीआईबीएन से बाध्य नहीं करता है। -लाइट उत्तेजना 36 , 37 ऑप्टोगनेटिक सिस्टम ने वर्णित IN इस प्रोटोकॉल को जंगली-प्रकार CRY2 और सीआईबीएन का उपयोग जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानान्तरण-मध्यस्थता वाले Raf1 सक्रियण को प्रेरित करता है। यह ज्ञात है कि आरएएफ 1 की झिल्ली भर्ती इसकी गतिविधि को बढ़ाता है 38 इस प्रणाली में, एक अग्रानुक्रम सीआईबीएन मॉड्यूल प्लाज्मा झिल्ली पर लंगर डाला जाता है और CRY2-mCherry को Raf1 35 के एन-टर्मिनल में जोड़ा जाता है। नीली रोशनी की अनुपस्थिति में, सीआरवाई 2-एम-शेरी-आरएएफ 1 साइटोप्लाज्म में रहता है, और आरएफ़ 1 निष्क्रिय है। ब्लू-लाइट उत्तेजना सीआरवाई 2-सीआईबीएन बंधन लाती है और आरएएफ 1 को प्लाज्मा झिल्ली में भर्ती करती है, जहां आरएफ़ 1 सक्रिय होता है। आरएएफ सक्रियण एक आरएएफ / एमईके / ईआरके सिग्नलिंग कैस्केड को उत्तेजित करता है दोनों CRY2- और CIBN- संलयन प्रोटीन एक बायिसिस्टल आनुवंशिक प्रणाली में एन्कोडेड हैं। इस रणनीति को अन्य परिस्थितियों को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जैसे आक्ट, जिसका सक्रियण राज्य को कक्षों में प्रोटीन स्थानान्तरण द्वारा चालू किया जा सकता है। यह काम स्तनधारी सेल कल्चर में इस ऑप्टोगैनेटिक रणनीति को लागू करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता हैरेस और बहुकोशिकीय जीव

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Protocol

पशु अनुसंधान इलिनोइस संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसीएसी) और यूनिवर्सिटी ऑफ इलिनॉय डिपार्टमेंट ऑफ एनल रिसर्च (डीएआर) द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. बीएचके 21 स्तनधारी सेल संस्कृति में प्रोटीन स्थानीयकरण के ऑप्टोजनैटिक प्रेरण

नोट: चरण 1.1-1.3 उच्च इज़ाफ़ा उद्देश्यों ( जैसे, 63 एक्स या 100 एक्स) के साथ इमेजिंग के लिए एक सेल संस्कृति चैम्बर को इकट्ठा करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं, जो आमतौर पर कम दूरी पर काम करते हैं। इमेजिंग सब्सट्रेट के रूप में इन उद्देश्यों को एक पतली कांच के कवर ( जैसे, # 1.5, 170 माइक्रोन मोटाई) की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, एक गिलास-नीचे सेल कल्चर डिश / स्लाइड का इस्तेमाल किया जा सकता है। इस स्थिति में, 1.1-1.3 के चरणों को छोड़ दिया जा सकता है।

  1. कांच के कवर्लिप्स क्लीनिंग
    1. एक कवरलिप धारक में 30 ग्लास कवरलाइन रखें।
    2. 600 एमएल प्लास्टिक बीकर में, 20 ग्राम डिटर्जेंट और 400 एमएल का गर्म नल का पानी जोड़ें। प्लेसमेंटई एक चुंबकीय उत्तेजक पर बीकर और हलचल जब तक सभी डिटर्जेंट भंग कर दिया जाता है। टिशू पेपर का उपयोग करके फोम निकालें
    3. हलचल बार से एक स्पेसर के रूप में 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश के तल का उपयोग करें और कतरलपी धारक के लिए एक सतह के रूप में। सफाई प्रक्रिया के दौरान पर्याप्त प्रवाह बनाए रखने के लिए, पेट्री डिश में 3-4 नाली के छेद करें।
    4. नाली के छेद को बनाने के लिए, एक सोल्डर लोहे को गर्म करें और प्लास्टिक के माध्यम से एक प्रवाहित हुड में जलाएं।
      सावधानी: नंगे हाथों से गरम सोल्डर लोहे को न छूएं।
    5. बीकर में पेट्री डिश पर कवरलिप धारक को रखें। कमरे के तापमान पर रात भर 2 घंटे के लिए हिलाओ।
    6. 1,000 मिलीलीटर बीकर में 500 मिलीलीटर पानी के साथ तीन बार धो लें। डिटर्जेंट समाधान का पुनः उपयोग किया जा सकता है
    7. संदंश का उपयोग करते हुए अलग-अलग कवरलिप्स उठाएं 1 मिनट के लिए 190-सबूत (9 5%) इथेनॉल में कवरलाप को विसर्जित करें
    8. एक बाँझ हुड अंदर coverslips सूखी उपयोग होने तक एक बाँझ प्लास्टिक के कंटेनर में कवर लिप्स को स्टोर करें।
    9. पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) -कॉलेटेड कवरलाइप्स बनाना
      1. 0.1 एम बोराट बफर को 1.24 ग्राम बोरिक एसिड और 1. 9 ग्राम डिजोडियम टेट्राबोरेट 400 मिलीलीटर पानी में भंग कर बनायें। पीएच को 8.5 एमएमओओओएच के साथ समायोजित करें
      2. बोरेट बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता में पीएलएल भंग करें। 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में PLL समाधान को विभाजित करना।
      3. 10 सेमी सेमी टिशू कल्चर डिश में 50 मिलीलीटर पीएलएल कोटिंग समाधान जोड़ें। पीएलएल समाधान को गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डिश रखें।
      4. एक बाँझ हुड में कवरलिप कंटेनर खोलें (चरण 1.1.8)।
      5. टिशू कल्चर डिश में पूर्व-गर्म पीएलएल समाधान में साफ-सुथरे कवर्लिप्स को एक-एक करके विसर्जित करें। सभी सतहों को विसर्जित करने के लिए बबल गठन से बचें
      6. एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर रातोंरात में coverslip के साथ पकवान रखें। प्रत्येक कंडोली को बाहर निकालें और इसे बाँझ कंडलिप धारक में रखें। आटोक्लेवटेड अल्ट्रापेर वॉटर के साथ तीन बार कुल्ला (18.2 एमबी & #183 सेमी प्रतिरोधी) एक बाँझ हुड में 1,000 मिलीलीटर बीकर में।
      7. बाँझ हुड में कसलीप धारक में कवच का टुकड़ा सूखी। उपयोग होने तक एक बाँझ प्लास्टिक के कंटेनर में कवर लिप्स को स्टोर करें।
    10. पॉलीडिमथाइलसिलोसेन (पीडीएमएस) कोशिका संस्कृति कक्षों को इकट्ठा करना
      1. एक प्लास्टिक के कंटेनर में, 40 ग्राम PDMS बेस का वजन और पीडीएमएस के इलाज के लिए 10: 1 डब्लू / पी अनुपात हासिल करने के लिए 4 जी का इलाज एजेंट जोड़ें। 2 मिनट के लिए एक विंदुक टिप के साथ सरगर्मी द्वारा PDMS / इलाज एजेंट मिलाएं वैकल्पिक रूप से, एक केन्द्रापसारक मिक्सर का उपयोग करें
      2. एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के साथ एक धारक बनाने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में एक 4 इंच व्यास के साथ एक बीकर का उपयोग करें। एक 15 सेमी पेट्री डिश में एल्यूमीनियम पन्नी धारक रखें। इस एल्यूमीनियम पन्नी धारक के अंदर एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर रखें।
      3. धारक में मिश्रित PDMS समाधान डालें। वफ़र के किनारे को धीरे से स्पर्श करने के लिए एक पतली कांच रॉड का उपयोग करें वफ़र के नीचे फंसे किसी हवा के बुलबुले को निकालें।
      4. वैक्यूम कक्ष में 15 सेमी पेट्री डिश डालेंPDAS समाधान के लिए डी डी। लगभग 20 मिनट के लिए डिग्रेसिंग को जारी रखें, जब तक कोई बुलबुले उत्पन्न न हो जाए। इस बीच, एक संवहन ओवन से पहले 65 डिग्री सेल्सियस से पहले
      5. सावधानी से 15 सेमी पेट्री डिश ओवन में रखें। 2 घंटे के लिए सेते
      6. ओवन से प्लेट निकालें पीडीएमएस के किनारे को धीरे से स्पर्श करें और पूर्ण क्रॉस्लिंकिंग सुनिश्चित करने के लिए एक ग्लास रॉड का उपयोग करें। यदि नहीं, तो लंबे समय तक सेते, जब तक कि PDMS ठोस और गैर-चिपचिपा हो।
      7. प्लेट से एल्यूमीनियम पन्नी निकालें और सिलिकॉन वेफर से छील कर दें। किनारे से शुरू, सिलिकॉन वेफर से ठीक पीडीएमएस को सावधानी से छीलना।
        सावधानी: बहुत अधिक बल लागू करने से बचें, क्योंकि यह वेफर को तोड़ सकता है
      8. एक रेज़र ब्लेड के साथ 24 मिमी x 40 मिमी कंडोली फिट करने के लिए पीडीएमएस को 20 मिमी x 30 मिमी आयताकार टुकड़ों में ट्रिम करें।
      9. प्रत्येक पीडीएमएस टुकड़े के केंद्र से 10 मिमी x 20 मिमी के एक आयताकार उद्घाटन में कटौती करने के लिए छेनी के आकार के ब्लेड का उपयोग करें।
      10. चरण 1.1 में वर्णित डिटर्जेंट प्रोटोकॉल का उपयोग कर PDMS कक्षों को साफ करें।
      11. एक स्वच्छ हुड में PDMS कक्षों को सूखा। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक autoclavable कंटेनर में सूखा कक्षों रखें।
      12. 30 मिनट के लिए ग्रेविटी (121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआई) का उपयोग कर कंटेनर आटोक्लेव करें और कंटेनर को कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    11. बीएचके 21 सेल संवर्धन और अभिकर्मक
      1. बीएचके 21 कोशिका संस्कृति के लिए 50 एमएल की डीएमईएम के 50 मिलीलीटर एफबीएस और 5 एमएल के 100 × पेन-स्ट्रेप-ग्लुटामाइन (10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 29.2 मिलीग्राम / एमएल एल) के मिश्रण के लिए 500 एमएल का माध्यम बनाएं। -glutamine)। सुनिश्चित करें कि एफबीएस की अंतिम एकाग्रता 10% है
      2. गैर-एचईपीईएस सीओ 2 के 10 एमएल की असंतुलन-लाइव सेल इमेजिंग के लिए स्वतंत्र माध्यम।
        नोट: सीओ 2- स्वतंत्र माध्यम सीओ 2 इनक्यूबेटर के बिना सेल विकास का समर्थन करता है और वायुमंडलीय परिस्थितियों में इमेजिंग कोशिकाओं के लिए आदर्श है। विस्तृत जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें। बीएचके 21 सेल लाइन के अतिरिक्त, अन्य प्रकार के स्तनधारी कोशिकाओं को भी देना चाहिएसमान परिणाम
      3. एक बाँझ हुड में एक बाँझ पीएलएल लेपित कंडोली (चरण 1.2) पर एक आटोक्लेव, बाँझ PDMS कक्ष (चरण 1.3) रखकर एक सेल संस्कृति डिवाइस को इकट्ठा करें।
      4. हर डिवाइस को बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश में रखें।
      5. 12-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.5 एमएल की 0.25% ट्रिप्सिन का प्रयोग करें। एक हेमोसिटामीटर के साथ सेल घनत्व की गणना करें सेल संस्कृति माध्यम के 200 μL के साथ कक्ष में 20,000 बीएचके 21 कोशिकाओं (लगभग 10,000 कोशिकाओं / सेमी 2 ) प्लेटें।
      6. प्लाज्मिड तैयारी केट (सामग्री सूची देखें) के साथ डीएनए प्लाज्मिड तैयार करें।
        नोट: CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CAAX की डिजाइन और कार्यक्षमता चित्रा 1 ए -1 बी में दिखायी गयी है
      7. सेल चढ़ाना के बाद चौबीस घंटे (24) एच, 50-100 एनजी CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CAAX प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़र, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार
      8. तीन (3) घंटे अभिकर्मक के बाद, मी बदलएडियम को ताजा संस्कृति माध्यम के 200 μL (चरण 1.4.1) और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति के इनक्यूबेट करके रातोंरात पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दी जाती है।
    12. फ्लोरोसेंस लाइव-सेल इमेजिंग
      1. कंप्यूटर, प्रकाश स्रोत, माइक्रोस्कोप और कैमरा चालू करें बाकी प्रोटोकॉल के लिए एक कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (10000 तेल-विसर्जन उद्देश्य से लैस) का प्रयोग करें।
        नोट: एक औंधा एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
      2. सेल संस्कृति माध्यम को 200 μL सीओ 2- स्वतंत्र माध्यम के साथ बदलें।
      3. माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं को रखने से पहले डेटा-अधिग्रहण प्रोटोकॉल सेट करें। ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए 488-एनएम उत्तेजना एफआईटीसी चैनल का उपयोग करें। ट्रांसफ़ेक्ट सेल का पता लगाने के लिए 561 एनएम उत्तेजना TRITC चैनल का उपयोग करें और mCherry-labeled protein के सेलुलर स्थानीयकरण को ट्रैक करें।
      4. एफआईटीसी और टीआरआईटीसी चैनलों का लाभ क्रमशः 120 और 200 के रूप में निर्धारित करें। 2.2 के पिक्सेल-निवास समय का उपयोग करें1; एस और आकार 512 x 512 पिक्सल
      5. उद्देश्य विंडो के करीब एक बिजली मीटर रखकर 488-एनएम प्रकाश की शक्ति को मापें। सीआईबीएन-सीआरवाई 2 पीएचआर एसोसिएशन को प्रेरित करने के लिए 2 μW की कुल शक्ति (लगभग 10,000 डब्लू / सेंटीमीटर 2 फ़ोकस) पर्याप्त है।
      6. 5 सेकंड अंतराल के साथ एक टाइमस्टैम्प अधिग्रहण और 2 मिनट का कुल अधिग्रहण समय सेट करें
      7. उद्देश्य विंडो पर उचित सूचकांक मिलान सामग्री (विसर्जन तेल) लागू करें। Coverslip सतह पर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चरण-विपरीत मोड का उपयोग करें
      8. सूक्ष्मदर्शी चरण को स्थानांतरित करके 561 एनएम प्रकाश के नीचे एक ट्रांसफ़ेक्ट सेल का पता लगाएँ।
        सावधानी: इस चरण के दौरान नीले प्रकाश का उपयोग करने से बचें, क्योंकि यह फोटोएक्टिवेटेबल प्रोटीन के बीच संबंध को सक्रिय करेगा।
      9. एक ट्रांसफ़ेक्ट सेल स्थित हो जाने के बाद, डेटा अधिग्रहण आरंभ करें।
        नोट: सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं को एफआईटीसी (2 सीआईबीएन-जीएफपी-सीएएएक्स) और टीआरआईटीसी (CRY2-mCherry-Raf1) चैनल ( चित्रा 1 सी-डी ) दोनों में प्रतिदीप्ति दिखाना चाहिए।
      10. एफआईटीसी और टीआरआईटीसी चैनलों ( चित्रा 1 डी ) दोनों में टाइम-स्टैंप की गई छवियों की श्रृंखला को रिकॉर्ड करें।
      11. CRY2-CIBN प्रोटीन परिसर के सहज रूप से पृथक्करण की जांच के लिए, केवल 30 मिनट के अंतराल के साथ, केवल 20 मिनट के लिए टेक्ड चैनल के साथ एक अन्य टाइमस्टैम्प रिकॉर्ड करें।
      12. डेटा विश्लेषण के लिए टाइम-स्टैंप किया गया चित्र सहेजें
    13. छवि विश्लेषण
      1. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को खोलें जो एक छवि 40 से तीव्रता निकाल सकते हैं।
      2. दो प्रतिनिधि स्नैपशॉट चुनें: एक नीले-प्रकाश के पहले और दूसरे नीले-प्रकाश के प्रदर्शन से पहले।
      3. पृष्ठभूमि, प्लाज्मा झिल्ली, और साइटोप्लाज्म फैले हुए सेल के बीच एक रेखा खींचें। परियोजना इस रेखा के साथ तीव्रता मूल्यों को बचाएं और प्रकाश एक्सपोजर ( चित्रा 1 डी ) के पहले और बाद के अंतर के साथ तुलना करने के लिए उन्हें बाहर कीजिए।
      4. प्रोटीन एसोसिएशन के कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए, सिलेकप्लाज्मा झिल्ली में एक प्रतिनिधि क्षेत्र (आरओआई), पृष्ठभूमि में एक आरओआई और पृष्ठभूमि में एक आरओआई।
      5. छवि स्टैक के लिए प्लाज्मा झिल्ली (आई पी एम), साइटोप्लाज्म (आई सीवायटी) और पृष्ठभूमि (आई बीकेडी) की माध्य तीव्रताओं को प्राप्त करें।
      6. निम्न समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक छवि के लिए झिल्ली / साइटोसोलिक तीव्रता के अनुपात की गणना करें:
        समीकरण 1
      7. अनुपात बनाम समय का प्लॉट करें और CRY2-CIBN ( चित्रा 1 ई -एफ) के बाध्यकारी या पृथक्करण कैनेटीक्स का निर्धारण करें।

    2. सीओ 2 इनक्यूबेटर में दीर्घकालिक प्रकाश उत्तेजना के लिए एक एलईडी सरणी का निर्माण

    नोट: प्रयोगात्मक सेटअप का समग्र योजनाबद्ध चित्र 2 ए में दिखाया गया है।

    1. दो ब्रेड बोर में 12 नीले एल ई डी को डालने के द्वारा एलईडी सरणी बनाएंडी एस और वर्तमान-सीमित प्रतिरोधों को जोड़ने
      नोट: 30 वी बिजली की आपूर्ति के साथ, चार एल ई डी श्रृंखला में जोड़ा जा सकता है, और उनकी चमक को वर्तमान-सीमित रोकनेवाला द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।
    2. ब्रेड बोर्ड को एक एल्यूमीनियम बॉक्स में रखें
      नोट: एल्यूमीनियम बॉक्स की ऊंचाई 2 इंच होनी चाहिए। यह ऊंचाई 12-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट को रोशन करने के लिए अनुकूल है, क्योंकि विचलन प्रकाश स्थान का आकार एक ही अच्छी तरह से एक जैसा है।
    3. बिजली की आपूर्ति से जुड़ने के लिए दो धातु के तारों का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि तार की लंबाई पर्याप्त होती है जब सीओ 2 इनक्यूबेटर के अंदर प्रकाश बॉक्स रखा जाता है।
    4. प्रकाश बॉक्स ( चित्रा 2C ) के कवर के रूप में एक पारदर्शी प्रकाश विसारक का उपयोग करें।
    5. वोल्टेज इनपुट की एक सीमा पर प्रत्येक एलईडी के पावर आउटपुट को कैलिब्रेट करें। 24 एच पीसी 12 सेल भेदभाव परख के लिए 0.2 मेगावॉट / सेमी 2 की शक्ति का उपयोग करें। लाइव क्सीनोपस भ्रूण या व्याख्यान के लिए 5 मेगावाट / सेमी 2 की शक्ति का उपयोग करेंassays।

    3. PC12 सेल भेदभाव का ऑप्टोगैनेटिक प्रेरण

    1. सेल संवर्धन और अभिकर्मक
      1. घोड़े सीरम के 75 एमएल के साथ 407.5 एमएल का एफएमएस के मिश्रण के साथ 500 एमएल का माध्यम बनाओ, 12 एमएम का एफबीएस + 5 एमएल का 100 × पेन-स्ट्रेप-ग्लुटामाइन (घोड़े सीरम और एफबीएस की अंतिम सांद्रता) : क्रमशः 15% और 2.5%)। F12K माध्यम के 99 वॉल्यूम में पूर्ण माध्यम के 1 मात्रा को मिलाकर कम सीरम माध्यम बनाएं।
      2. प्लैट पीसी 12 कोशिकाओं में 12-अच्छी तरह से थाली में 300,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से या 75,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर।
      3. सेल चढ़ाना के बाद CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 घंटे के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें (1.4.7 चरण के समान)। प्रत्येक कुएं के लिए डीएनए की 1.2 μg का उपयोग करें कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें जो 5% सीओ 2 के साथ पूरक है। अभिकर्मक के बाद अभिकर्मक दक्षता की जांच करें 16 घंटे
        नोट: एक 30-50% अभिकर्मक ईएफएफपर्याप्त सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए दक्षता प्राप्त की जानी चाहिए
      4. अभिकर्मक के बाद मध्यम-निम्न सीरम मध्यम 24 घंटे में बदलें। एक 12-अच्छी तरह से प्लेट की मध्यम प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल का प्रयोग करें।
    2. हल्के से प्रेरित पीसी 12 सेल भेदभाव
      1. सीओ 2 इनक्यूबेटर में एलईडी सरणी रखें। तारों की एक जोड़ी का उपयोग करके इसे बिजली की आपूर्ति से कनेक्ट करें एलईडी की शक्ति को 0.2 मेगावॉट / सेमी 2 सेट करें एलईडी सरणी की खिड़की पर ट्रांसफ़ेक्ट पीसी 12 कोशिकाओं (चरण 3.1.3) युक्त 12-अच्छी तरह प्लेटें रखें। 5 डिग्री सीओ 2 के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए सतत प्रकाश रोशनी लागू करें
    3. प्रतिदीप्ति लाइव सेल इमेजिंग
      1. माइक्रोस्कोप और नमूना तैयार करने के लिए चरण 1.5.1-1.5.4 का पालन करें।
      2. एकल स्नैपशॉट डेटा अधिग्रहण सेट करें जीएफपी और टीसीड चैनल दोनों के लिए 200 एमएस का उपयोग करें।
      3. जीएफपी और टेक्डर्ड दोनों चैनलों में ट्रांसफ़ेक्ट सेल की छवियां कैप्चर करें रिकॉर्ड लगभग 200 सीएलप्रत्येक स्थिति के लिए एलएस डेटा विश्लेषण के लिए फ़ाइलें सहेजें
    4. छवि विश्लेषण
      1. ट्रांसफ़ेक्ट सेल की कुल संख्या के आधार पर विभेदित कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।
      2. कक्ष विश्लेषण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में किसी भी सेल-गिनती मॉड्यूल का उपयोग करें।
      3. विभेदित कक्षों की मैन्युअल रूप से गणना करें
        नोट: विभेदित कोशिकाओं को उन लोगों के रूप में परिभाषित किया जाता है जिनमें कम से कम एक न्यूरेट कोशिका निकाय ( चित्रा 3 ए -3 बी ) की तुलना में काफी अधिक है।
      4. बिना आवर्तित कोशिकाओं के साथ चरण 3.4.3 दोहराएं।
      5. निम्न समीकरण का उपयोग करके भेदभाव अनुपात की गणना करें:
        समीकरण 2

    4. Xenopus भ्रूण में किनास गतिविधि के ऑप्टोजनैटिक कंट्रोल

    1. बफ़र्स की तैयारी
      1. 1 एल के 1 एल मार्क की संशोधित घंटी (एमएमआर) तैयार करें: 100 मिमीNaCl, 2 मिमी केएलएल, 1 मिमी एमजीएल 2 , 2 मिमी CaCl 2 , और 5 मिमी HEPES; पीएच 7.5
    2. एमआरएनए की तैयारी
      1. 2 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एपीआई (50 इकाई) के 1 μL के साथ CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN- जीएफपी-कैएक्स प्लाज्मिड डीएनए (2 माइक्रोग्राम) डाइजेस्ट करें
      2. 60 μL के 100% इथेनॉल में रैखिकीकृत डीएनए की शुद्धता डीएनए गोली के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 12,000 × छिन पर स्पिन करें सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें और फिर 60 μL 70% इथेनॉल के साथ गोली फिर से धो लें। कमरे के तापमान पर एक और 5 मिनट के लिए 12,000 × छिन पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला को ध्यान से हटा दें और 6 μL आरएनज मुक्त एच 2 ओ में डीएनए गोली को फिर से खोलें।
      3. एक राइबोन्यूक्लिओटिड मिश्रण (10 मिमी एटीपी, सीटीपी, और यूटीपी; 2 एमएम जीटीपी; और 8 एमएम कैप एनालॉग), और 20 μL एन्यूकेलीज-बीपी के 2 μL के साथ 1 μg रेखीय डीएनए युक्त इन विट्रो प्रतिलेखन में प्रदर्शन करें । 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मुफ्त पानी
      4. डी निकालेंकम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DNase I पाचन द्वारा एनए टेम्पलेट और एक सिलिका झिल्ली स्पिन स्तंभ का उपयोग करके संश्लेषित आरएनए शुद्ध करना।
      5. रिएक्शन को रोकें और 30 एनएलईएल न्युकेलेज फ्री पानी और 30 μL लीक्ल वर्षा सोल्यूशन जोड़कर आरएनए को कम कर दें। अच्छी तरह मिक्स करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठंडा करें
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 × जी शाही सेना गोली के लिए अपकेंद्रित्र
      7. सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें 1 एमएल 70% इथेनॉल के साथ आरएनए धो लें और 40 μL न्युकेलेज-फ्री पानी में पुन:
      8. स्पिन कॉलम में आरएनए के 40 μL लोड करें। अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 12,000 × छ में अवनित न्यूक्लियोटाइड्स और कैप्स को निकालने के लिए।
    3. हार्वेस्ट Xenopus भ्रूण
      1. साई एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें 41 क्सीनोपस भ्रूण प्राप्त करने के लिए।
    4. एमआरएनए माइक्रोइन्जेनाइजेशन
      1. निर्माणकेशिका खींचने वाली कांच के केशिकाओं को खींचकर माइक्रोइंजेंशन के लिए सुई। पुलिंग प्रोग्राम को सेट करें: गर्मी = 355, पुल = 80, वेग = 50, और समय = 100।
      2. भ्रूण से 3% सिस्टीन (0.2x एमएमआर में पतला) के साथ इलाज करके जेली कोट निकालें।
      3. माइक्रोिनजेक्शन के लिए भ्रूण को 3% पॉलिसुकोस और 0.5 एमएमआर समाधान में स्थानांतरित करें। प्रत्येक भ्रूण में 500 पीजी से 1 एनजी CRY2-एम-शेरी-आरएएफ 1-2 ए -2 सीआईबीएन-जीएफपी-सीएएएक्स आरएनए को इंजेक्षन करें।
        नोट: एमएपीके सिग्नलिंग के नीले प्रकाश-स्वतंत्र सक्रियण में 1 एनजी परिणामों से अधिक की खुराक के इंजेक्शन
    5. कीनेस गतिविधि के ऑप्टोगैनेटिक उत्तेजना
      1. संस्कृति 3% पॉलिसुकोस में 0.5% एमएमआर समाधान में गर्भनिरपेक्षी भ्रूण, जब तक वे मध्य गैस्ट्रुला चरण (चरण 12) तक नहीं पहुंच जाते। फिर, संस्कृति में भ्रूण 0.2x एमएमआर समाधान में।
      2. भ्रूण या एक 12-अच्छी तरह से थाली को explants स्थानांतरण। नीली-लीग के लिए घर-निर्मित एलईडी सरणी (चरण 2.5) पर 12-अच्छी तरह से प्लेट रखेंटी (475 एनएम) उपचार
      3. भ्रूण या स्पष्टीकरण के पूर्ण नीले-प्रकाश रोशनी सुनिश्चित करने के लिए 12-अच्छी तरह से थाली के शीर्ष पर दर्पण रखें।
      4. नीले प्रकाश की शक्ति को 5 मेगावाट / सेमी 2 तक ट्यून करें
        नोट: ब्लू-लाइट का इलाज किसी भी वांछित समय में किया जा सकता है, या तो 3% पॉलिसुकोस, 0.5 एमएमआर समाधान, या 0.2 एक्सएमएमआर समाधान।
      5. किसी भी वांछित समय पर भ्रूण काटा। उन्हें हिस्टोलॉजिकल, वेस्टर्न ब्लॉट या जीन-एक्स्प्रेशन विश्लेषण के लिए उपयोग करें।

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Representative Results

फोटोएक्टिवेटनीय प्रोटीन जोड़े की रेटाइमेट्रिक अभिव्यक्ति: चित्रा 1 ए पोर्किन टेस्कोरोइरम पर आधारित, एक बायिसिस्टोनिक ऑप्टोजेनेटिक कन्स्ट्रक्शन, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP- CaaX (CRY2-2A-2CIBN के रूप में संदर्भित) के डिजाइन को दर्शाता है, 1 2 ए (पी 2 ए) पेप्टाइड, जो कि स्तनधारी सेल लाइनों 42 में सबसे अधिक रियोबोसम-लंघन क्षमता दर्शाता है। पिछले काम में, यह निर्धारित किया गया है कि सीआईबीएन-जीएफपी-सीएएएक्स: सीआरवाई 2-एमसीरी-आरएएफ 1 के लिए इष्टतम अनुपात 2: 1 35 है । यह विन्यास CRY2-mCherry-Raf1 ( चित्रा 1 बी ) के पर्याप्त झिल्ली भर्ती और सक्रियण की अनुमति देता है। CRY2-2A-2CIBN सीएनएबी -2 ए -2-सीआईबीएन के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है, जीपीपी और टेक्डड फ्लोरोसेंट चैनल दोनों में एपि-रोशनी ( चित्रा 1 सी ) या कन्फोकल माइक्रोस्कोपी ( चित्रा 1 डी ) के तहत स्पष्ट प्रतिदीप्ति दिखाता है। ब्लू लाइट-मध्यस्थता मेम्ब्रासीआरवाई 2-एम-शेरी-आरएएफ 1 ( चित्रा 1 डी ) की कोई भर्ती को स्पष्ट रूप से confocal microscopy में पता लगाया जा सकता है। संघ ब्लू-लाइट एक्सपोजर ( चित्रा 1 ई ) के बाद सेकंड के भीतर होता है, और CRY2-CIBN प्रोटीन जटिल लगभग आधे जीवन के साथ 5.5 मिनट ( चित्रा 1 एफ ) से अलग होता है।

तंत्रिका वृद्धि कारक की अनुपस्थिति में हल्की-नियंत्रित पीसी 12 सेल भेदभाव: वृद्धि कारक संकेतक में एक दिलचस्प अवलोकन यह है कि सामान्य डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग पथ ( जैसे ईआरके, पीआई 3 के-एक्ट, और पीएलसीआईजी) सिग्नलिंग प्रतिक्रियाओं में विविधता और विशिष्टता को दर्शाती हैं। विकास कारक-मध्यस्थता सिग्नलिंग की बेहतर समझ प्रौद्योगिकी को सक्षम करने से प्राप्त किया जा सकता है जो व्यक्तिगत कैसकेड के सटीक spatiotemporal विनियमन के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में पेश किया गया ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण ऐसी एक ऐसी तकनीक को दर्शाता है जो विशिष्ट सक्रियता के लिए अनुमति देता हैउच्च अस्थायी संकल्प के साथ राफ / एमईके / ईआरके सिग्नलिंग मार्ग का एन। चूंकि यह दृष्टिकोण एनजीएफ की झिल्ली रिसेप्टर्स के लिए बाइंडिंग की प्रक्रिया को छोड़कर, सिग्नलिंग कैनेटीक्स अब अंतर्जात रिसेप्टर्स पर निर्भर नहीं करता है। इसके बजाय, सटीक गतिज नियंत्रण को उत्तेजक प्रकाश की अस्थायी प्रोफ़ाइल ( चित्रा 2 ए ) को संशोधित करके प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण से किनेज़ गतिविधि के सिग्नल कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाएं खुलती हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रायोगिक सेटअप इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन ( चित्रा 2 बी -2 डी ) के अध्ययन में ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण को एकीकृत करने का एक अत्यंत सरल और आर्थिक तरीका प्रदान करता है। पीसी 12 सेल भेदभाव परख के लिए, 0.2-मेगावाट / सेंटीमीटर 2 में 24-एच निरंतर-प्रकाश उत्तेजना महत्वपूर्ण न्यूरेट परिणाम ( चित्रा 3 ए ) को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। प्रकाश के बिना ट्रांसफ़ेक्ट सेल सहित नकारात्मक नियंत्रण ( चित्रा 3बी) और प्रकाश के बिना या बिना गैर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ( चित्रा -3 सी -3 डी ), महत्वपूर्ण न्यूरेटी परिणाम प्रकट नहीं करते हैं। इस शक्ति पर, एक constitutively सक्रिय Raf1 (सीए राफ 1) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं सामान्य भेदभाव ( चित्रा 3 ई ) से गुजरना। विशेष रूप से, बायिसिस्टल ऑप्टोगैनेटिक कन्स्ट्रक्शन के साथ संक्रमित कोशिकाओं में सीए-आरएएफ 1 ( चित्रा 3 एफ ) द्वारा प्रेरित मूल्य तक पहुंचने वाले दो निर्माणों के साथ सह-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक भिन्नता अनुपात का उत्पादन होता है। भेदभाव अनुपात GFP प्रतिदीप्ति द्वारा निर्देशित ट्रांसफ़ेक्ट सेल की संख्या के द्वारा विभेदित कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके गणना की जाती है। विभेदित कोशिकाओं को उन कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जाता है जिनके कम से कम एक न्यूरेट सेल शरीर 35 के आकार से अधिक लंबा है। भेदभाव अनुपात में यह वृद्धि उत्पन्न होती है: 1) बायिकिस्टोनिक सिस्टम के साथ फोटोएक्टिवेटेबल प्रोटीन का बेहतर वितरण और 2) एक ऑप्शनCIBN और CRY2 35 के बीच समयबद्ध अभिव्यक्ति अनुपात

लाइव Xenopus laevis भ्रूण में आरएएफ / एमईके / ईआरके सिग्नलिंग मार्ग का प्रतिवर्ती ऑप्टोगैनेटिक उत्तेजना: एक्स लाईविस जीन ट्रांसक्रिप्शन, सिग्नल ट्रांसडकेशन, और भ्रूणिक विकास के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है। पिछला काम ने पाया कि आरएएफ / एमईके / ईआरके मार्ग की सक्रियता एक सेल भाग्य परिवर्तन की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप टेलब्यूड चरण 43 में एक्टोपिक पूंछ की संरचना का निर्माण होता है। एक शक्तिशाली मिसोदर्म इंड्युसर के रूप में, अतिप्रतिबंधित आरएएफ 1 अंकुश-स्तरीय विनिर्देशन के दौरान एक्टोपिक मेसोडर्म को प्रेरित कर सकता है, जो ब्लास्टुला और शुरुआती गास्ट्रूल चरणों के दौरान होता है, और बाद में एक्टोपिक पूंछ जैसी संरचनाओं के गठन के परिणामस्वरूप। वैकल्पिक रूप से, अतिप्रभावित आरएएफ 1 एक उपकला-मेसेनचिमल ट्रांज़िशन (ईएमटी) की तरह-तरह की घटना को ट्रिगर कर सकता है जिससे कि जर्म-लेयर स्पेसिफिकेशन पूरा हो और सीधे हो सकता हैतंत्रिका और मेसोदर्म वंशावली के लिए एक्टोडर्म को बदलना। इसके बाद इन संरचनाओं का प्रसार और विस्तार 43 के बाद किया जाता है । इन प्रयोगों में, आरएनए एन्कोडिंग एमईटी रिसेप्टर, रास, और आरएएफ 1 को दो कोशिकाओं के चरण में भ्रूण में अंतःक्षिप्त किया गया था। आरएनए भ्रूण में इंजेक्शन के कुछ ही समय बाद, ओवरेक्सेड एमईटी / रास / आरएएफ 1 ने गहराई से डाउनस्ट्रीम सिग्नल कैसकेड सक्रिय किया। इसलिए, यह तकनीकी रूप से प्रारंभिक विकास के चरणों को बाईपास करने और आरएएफ 1 सक्रिय करने के लिए चुनौतीपूर्ण था, विशेष रूप से जर्म-लेयर विनिर्देश के बाद। यह निर्धारित करने के लिए ऐसी रणनीति का उपयोग करना असंभव था कि रोगी परत विनिर्देशन के बाद आरएएफ / एमईके / ईआरके सिग्नल को सक्रिय करने से एक्टोपिक पूंछ जैसी ढांचे के गठन के कारण, सेल भाग्य परिवर्तन को प्रेरित किया जाए।

ऑप्टोगनेटिक्स Raf1 गतिविधि के समय को नियंत्रित करने के लिए एक तंत्र प्रदान करता है। जब CRY2-2A-2CIBN के आरएनए को प्रारंभिक विकास चरण में भ्रूण में अंतःक्षिप्त किया गया थाS, Raf1 तब तक निष्क्रिय रहा जब तक नीले प्रकाश की आपूर्ति नहीं की गई थी। पशु कैप परख आसानी से सिगनल परिणाम को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि बेसल ईआरके गतिविधि पशु टोपी में कम है। आरएएफ / एमईके / ईआरके सिग्नलिंग कैस्केडेड की प्रकाश -मध्यस्थता सक्रियण ने आरटी-पीसीआर ( चित्रा 4 ए ) या स्वस्थानी संकरण ( चित्रा 4 बी ) में पूरे माउंट के रूप में निर्धारित एक्सब्रा, एक मेसोडर्मल मार्कर की एक महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन को प्रेरित किया। नीले प्रकाश के जवाब में ईआरके के फास्फोराइलेशन में गतिशील परिवर्तन भी पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण ( चित्रा 4 सी ) द्वारा पता लगाए गए थे। पूरे भ्रूण में, CRY2-2A-2CIBN और n-β-gal आरएनए का एक मिश्रण 8 सेल चरण में एक पृष्ठीय पशु ब्लास्टोमेरे में इंजेक्ट किया गया था, जो बाद में पृष्ठीय पूर्वकाल ऊतक को जन्म देती है। अनुपचारित भ्रूणों ( चित्रा 4 डी -4 ई ) के साथ तुलना की गई, जिन्हें CRY2-2A-2CIBN के साथ इंजेक्ट किया गया और इसके लिए नीले प्रकाश के साथ इलाज किया गयामध्य एक्टोपिक पूंछ-समान संरचनाएं ( चित्रा 4 एफ -4 जी ) अंधेरे में इंजेक्शन किए गए भ्रूण ( चित्रा 4 एच ) या नीले-हल्के रोशनी ( चित्रा 4 ई ) के तहत बिना इंजेक्शनल पूंछ की तरह संरचना का निर्माण नहीं किया था जर्म-लेयर स्पेसिफिकेशन के बाद ब्लू-लाइट रोशनी में महत्वपूर्ण पूंछ-समान संरचनाएं ( चित्रा 4 जे) प्रेरित हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रकाश प्रेरित प्रेरित स्थानीयकरण और किनेज संकेत मार्ग के सक्रियकरण की व्यवस्था। ( ए ) ऑप्टिमाइज्ड सीआईबीएन-टू-सीआरवाई 2 अनुपात (2 सीआईबीएन: 1 सीआरवाई 2) के साथ एक बायिकास्टोनिक कंसोल का डिज़ाइन, जो आरएएफ / एमईके / ईआरके केनेज सिग्नलिंग मार्ग के प्रकाश-प्रेरित सक्रियण के लिए अनुमति देता है। रिबोसोमल छोड़ने पर, एक एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट दो प्रोटीन उत्पन्न करती है: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (समापनएमिनो एसिड एनपीजी के साथ) और प्रोलाइन -2 सीआईबीएन-जीएफपी-सीएएएक्स। ( बी ) सीआईबीएन और सीआरवाई 2 के बीच प्रकाश-प्रेरित बंधन सीआरवाई 2-एम-शेरी-आरएएफ 1 की झिल्ली भर्ती की ओर जाता है, जो आरएएफ / एमईके / ईआरके सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करता है। ( सी ) एपी-रोशनी के तहत CRY2-2A-2CIBN के साथ ट्रांसफ़ेक्ट बीएचके 21 कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति छवियाँ। स्केल बार: 20 माइक्रोन ( डी ) CRY2-2A-2CIBN के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाओं के कन्फोकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग बाएं पैनल में प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीयकृत 2 सीआईबीएन-जीएफपी-सीएएएक्स से पता चलता है; मध्य पैनल नीला-प्रकाश उत्तेजना से पहले CRY2-mCherry-Raf1 का स्नैपशॉट दिखाता है; नीले-प्रकाश उत्तेजना के 10 दालों के बाद सही पैनल CRY2-mCherry-Raf1 का स्नैपशॉट दिखाता है नीचे का पैनल सामान्यीकृत तीव्रता प्रोफाइल को सेल में एक पीला बिंदीदार रेखा के साथ दिखाता है, इससे पहले और प्रकाश उत्तेजना के बाद। स्केल बार = 20 माइक्रोन ( ई - एफ ) प्रकाश प्रेरित CRY2 - सीआईबीएन एसोसिएशन ( ई ) के लिए कैनेटीक्स और सहज रूप से असंतोषअंधेरे में CRY2-CIBN प्रोटीन जटिल के एन ( एफ ) चित्रा 1 ए- बी संदर्भ 35 से अनुकूलित किया गया था, जो जीवविज्ञानियों की कंपनी की अनुमति से पुन: पेश किया गया था। चित्रा 1 ई -F को क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बाय) लाइसेंस के तहत संदर्भ 44 से अनुकूलित किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: घर-निर्मित एलईडी सरणी के डिजाइन और कैलिब्रेशन ( ए ) जीवित कोशिकाओं में प्रकाश-नियंत्रित कीनेज गतिविधि के लिए प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध। ( बी ) घर निर्मित एलईडी सरणी के लिए सर्किट बोर्ड ( सी ) एक लिगएचटी बॉक्स का उपयोग सीओ 2 इनक्यूबेटर में दीर्घकालिक प्रकाश उत्तेजना के लिए किया जा सकता है। एल्यूमीनियम बॉक्स की ऊंचाई 2 इंच है। ( डी ) विशिष्ट एलईडी आउटपुट पावर बनाम वोल्टेज मान एक सर्किट में प्रति एलईडी प्रकाश शक्ति है जिसमें एक मौजूदा-सीमित रोकनेवाला और चार एल ई डी श्रृंखला में जुड़े हुए हैं। चित्रा 2 ए संदर्भ 35 से अनुकूलित किया गया था, जीवविज्ञानियों की कंपनी की अनुमति से पुन: पेश किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: पीसी 12 सेल भेदभाव के ऑप्टोजनैटिक प्रेरण ( ए ) नीले-प्रकाश उत्तेजना (0.2 मेगावाट / सेमी 2 ) के 24 घंटे के बाद CRY2-2A-2CIBN के साथ ट्रांसफ़ेक्ट पीसी 12 कोशिकाओं के मल्टी-चैनल स्नैपशॉट। एसीकुटिलता एक विभेदित सेल को दर्शाता है एक वर्ग एक असावधानित सेल को चिन्हित करता है ( बी ) किसी भी नीले प्रकाश उत्तेजना को छोड़कर ( ए ) के समान, इस्तेमाल किया गया था। ( सी डी ) गैर-ट्रांसफ़ेक्टेड पीसी 12 कोशिकाओं में 24 घंटे नीली-प्रकाश उत्तेजना (0.2 मेगावाट / सेमी 2 ) ( सी ) या अंधेरे ऊष्मायन ( डी )। ( ई ) Raf1-GFP-CAAX (सीए-आरएएफ 1) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। चक्र और आयताकार चिह्न विभेदित और असामान्य कोशिकाओं, क्रमशः। ( एफ ) सीसी-आरएएफ 1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट पीसी 12 कोशिकाओं के विभेदक अनुपात, CRY2-mCherry-Raf1 और सीआईबीएन-जीएफपी-सीएएक्स के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट और सीआर 2 2-ए -2-सीआईबीएन के साथ अकेले ट्रांसफ़ेक्ट। अभिकर्मक के बाद 24 घंटे, कोशिकाओं को या तो प्रकाश से अवगत कराया गया था या एक और 24 घंटे के लिए अंधेरे में incubated। मान चार स्वतंत्र डेटा सेटों से माध्य ± एसडी दर्शाते हैं केवल नीले प्रकाश से अवगत कराए गए कोशिकाओं ने महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। चित्रा 3 एफसंदर्भ 35 से अनुकूलित किया गया था, जीवविज्ञानियों की कंपनी की अनुमति से पुन: निर्मित किया गया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: लाइव क्सीनोपस भ्रूण में किनेज गतिविधि का ऑप्टोजनेटिक प्रेरण। ( ए ) आरटी-पीसीआर के परिणाम दिखाते हैं कि नीले प्रकाश के संपर्क में प्रारंभिक गैस्ट्रुला चरण में क्रैया 2-2-2 सीआईबीएन-इंजेक्शन वाले पशु कैप में एक्सब्रा, एक पैन-एमएस्डर्मामल मार्कर की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया गया था। ( बी ) भ्रूण में एक्सब्रा के स्वस्थानी संकरण में संपूर्ण माउंट। एमएपीके गतिविधि का हल्का-प्रेरित सक्रियण xbra के स्थानिक वितरण को नियंत्रित करता है (नीचे दाएं पैनल में लाल तीरों)। काले तीर परमाणु β-ga के निशानवंश ट्रेसर के रूप में लैक्टोसिडेस एपी: पशु ध्रुव वीपी: वनस्पति पोल ( सी ) पश्चिमी-धब्बा विश्लेषण यह दर्शाते हैं कि, एक पशु टोपी परख में, CRY2-2A-2CIBN प्रेरित ब्लू लाइट-आश्रित, ईआरके के प्रतिवर्ती फास्फोरायलेशन। ( डी ) सामान्य भ्रूण के आकारिकी दिखाए जाने वाले चित्र, बिना एमआरएनए इंजेक्शन और बिना हल्के उपचार के चित्र। ( ई ) एक एकल भ्रूण की ज़ूम इन-छवि ( एफ - जी ) CRY2-2A - 2CIBN एमआरएनए के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूणों के लिए ज़ूम-इन और पूरे क्षेत्र की छवियों और नीले-प्रकाश उत्तेजना के अधीन। सीआरवाई 2-2 ए -2 सीआईबीएन-इंजेक्ट किए गए भ्रूणों का इलाज करके आरएएफ 1 की सक्रियता, नीले रंग की रोशनी से सिर क्षेत्र में एक्टोपिक पूंछ जैसी संरचनाएं पैदा होती है। ( एच - I ) नकारात्मक नियंत्रण, जिसमें सीआरवाई 2 -2 ए -2 सीआईबीएन के साथ इंजेक्ट भ्रूण भी शामिल है, लेकिन प्रकाश उत्तेजना ( आई ) के तहत अंधेरे ऊष्मायन ( एच ) और असिनकृत भ्रूण के तहत। सभी प्रकाश उत्तेजना प्रयोगों को 5 मेगावाट / सेंटीमीटर की शक्ति के साथ आयोजित किया गया थासमर्थन> 2 ( जे ) प्रत्येक स्थिति के तहत एक्टोपिक पूंछ-समान संरचना दिखाने वाले भ्रूणों के प्रतिशत के सांख्यिकीय विश्लेषण। स्केल बार = ( डी ) और ( जी ): 1 मिमी; ( ई - एफ ) और ( एच - आई ) 0.5 मिमी चित्रा 4 ए , सी , ई - एफ , और एच - जे को संदर्भ 35 से अनुकूलित किया गया था, जो जीवविज्ञानियों की कंपनी की अनुमति से पुन: पेश किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

प्रकाश बॉक्स का निर्माण करते समय, व्यक्तिगत एल ई डी की शक्ति को मापा जाना चाहिए। पिछले अनुभव के आधार पर, विनिर्माण भिन्नता के चलते प्रत्येक एलईड के बीच बिजली उत्पादन अलग-अलग हो सकता है। एक दूसरे का 10% के भीतर बिजली का उत्पादन करने वाले एल ई डी का एक समूह चुनें। विभिन्न प्रकार के सेल कल्चर कंटेनरों ( जैसे, एक 6-अच्छी तरह या 24-अच्छी तरह से प्लेट) के लिए एलआईडी की संख्या, वर्तमान-सीमित रोकनेवाला और पावर इनपुट को संशोधित किया जा सकता है। 0.2 मेगावाट / सेंटीमीटर 2 की शक्ति पर 24 घंटे की हल्की रोशनी में पता लगने योग्य फोटोटोक्सिसिटी 44 नहीं होती है । यदि एक उच्च शक्ति का उपयोग किया जाता है, तो गर्मी पीढ़ी और फोटोटोक्सिसिटी कम करने के लिए आंतरायिक प्रकाश का उपयोग करने पर विचार करें। इस प्रोटोकॉल में शुरू की गई ऑप्टोगैनेटिक प्रणाली, पीसी -12 कोशिकाओं में लगातार अवरुद्ध प्रकाश उत्तेजना के तहत न्यूरेट आउटग्रोव को प्रेरित करती है, यह देखते हुए कि दोनों आसन्न हल्के दालों के बीच का काला अंतराल 45 मिनट 44 से कम है। देयप्रोटीन संघ और हदबंदी के कैनेटीक्स में आंतरिक मतभेदों के लिए, हल्के दालों के बीच की अवधि प्रत्येक अद्वितीय प्रोटीन जोड़ी के लिए ट्यून की जानी चाहिए। साइटोसोलिक आरएएफ 1 का ओवेरक्स्पशन नीले-प्रकाश रोशनी के बिना पीसी 12 सेल भेदभाव का कारण नहीं है। प्रत्येक भ्रूण में इंजेक्शन वाले एमआरएनए की मात्रा को नियंत्रित करते हुए, अंधेरे में कोई भी महत्वपूर्ण भ्रूणिक फेनोटाइप नहीं देखा गया था।

यद्यपि एक कम-शक्ति नीले प्रकाश CRY2- और CIBN- संलयन प्रोटीन के संघ को प्रोत्साहित करने के लिए पर्याप्त है, हालांकि नीले प्रकाश की गहरी पैठ गहराई गहरी ऊतक उत्तेजना में इसका उपयोग सीमित करता है। यद्यपि इस तरह की उत्तेजना अन्य उपकरणों ( जैसे फाइबर ऑप्टिक्स) के माध्यम से प्रकाश देने के द्वारा प्राप्त की गई है, इस दृष्टिकोण में आक्रामक 45 हैं । इस मुद्दे को दो तरीकों से संबोधित किया जा सकता है: एक प्रोटीन जोड़ी का इस्तेमाल करके जो लंबी तरंगदैर्ध्य ( जैसे, फाइटोक्रोम- पीआईएफ 6 प्रोटीन जोड़ी) का जवाब देती है या दो-फ़ोटॉन उत्तेजना का उपयोग कर। दोनों दृष्टिकोण डीप प्रदान कर सकते हैंआर प्रवेश, लेकिन वे अन्य सीमाओं से पीड़ित हो सकता है। उदाहरण के लिए, PhyB-PIF6 जोड़ी को काम करने के लिए एक सिंथेटिक कॉफ़ैक्टर की आवश्यकता होती है, और दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है। CRY2-CIBN बातचीत में ट्यूनिटी की कमी का विचार करने के लिए एक और सीमा है। जंगली प्रकार CRY2 अनायास 34 में 5.5 मिनट के आधे जीवन के साथ सीआईबीएन से सहजता से अलग करता है। लक्ष्य सिग्नलिंग मार्ग के कैनेटीक्स पर निर्भर करते हुए, एक छोटा या लंबे समय तक पृथक्करण आधा जीवन को प्राथमिकता दी जा सकती है। सीआरवाई 2 में उत्परिवर्तन किया गया है जो कि पृथक्करण आधा जीवन को 2.5 मिनट (डब्ल्यू 349 आर) तक कम कर सकते हैं या 24 मिनट (एल 348 एफ) 46 तक लम्बा हो सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, फंगल रिसेप्टर वाइवड (वीवीडी) और पी / एनएमएगास्ट 1 और 2 के आधार पर इंजीनियर फोटोएक्टिवेटनीय प्रोटीन जोड़े क्रमशः 4.2 मिनट और 25 एस के आधे जीवन को क्रमशः दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल में, जंगली प्रकार की CRY2-CIBN प्रोटीन जोड़ी 5 डिग्री प्रकाश स्थिरता के भीतर एमएपीके मार्ग पर बदलती हैम्यूलेशन, और गतिविधि बेसल स्तर पर स्तनधारी कोशिकाओं 44 में 30 मिनट के भीतर और Xenopus भ्रूण 35 में 1-2 घंटे के भीतर वापस आती है। स्थानिक नियंत्रण के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी छवि विमान में लगभग 200 एनएम के विवर्तन-सीमा स्थान के आकार में नीले लेजर को ध्यान केंद्रित कर सकते हैं। गैर-सुसंगत प्रकाश स्रोत से लैस एपी-रोशनी माइक्रोस्कोप में फ़ील्ड आरेख के आकार को समायोजित करके, संभव है कि रोशनी का आकार व्यास में लगभग 10 माइक्रोन तक सीमित किया जा सके। दोनों तरीकों सेल संस्कृतियों में optogenetic उत्तेजना के subcellular नियंत्रण प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए

उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प के साथ संकेत पारगमन को प्रतिरूपपूर्वक पूछताछ के लिए ऑप्टोगनेटिक्स की क्षमता लाइव कोशिकाओं में गतिशील अंतःस्रावी सिग्नलिंग का अध्ययन करने का एक नया अवसर प्रदान करती है। इस प्रोटोकॉल के परिणामों से पता चला है कि पीसी में न्यूरॉनल भेदभाव को शामिल करने के लिए आरएएफ 1 सक्रियण मुख्य रूप से जिम्मेदार है12 कोशिकाओं 44 उसी मार्ग से Xenopus भ्रूण को विकसित करने में माध्यमिक पूंछ की संरचनाओं का निर्माण भी होता है। आरएएफ 1 सक्रियण के समय को नियंत्रित करते हुए, पूंछ की तरह संरचना को जर्म-लेयर गठन 35 के चरण के बाद प्रेरित किया जा सकता है। हाल ही में वर्णित LOVTRAP पद्धति में दो इंजीनियर प्रोटीन, ज़ेडार और LOV2 का उपयोग किया जाता है, जो चुनिंदा ब्याज प्रोटीन (पीओआई) 48 के प्रकाश-प्रेरित हदबंदी को समायोजित करने के लिए केवल अंधेरे में एक-दूसरे से जुड़ जाता है। हल्का मध्यस्थता वाले प्रोटीन-प्रोटीन संघ के विपरीत, जो इस दृष्टिकोण में उपयोग किया जाता है, LOVTRAP प्रोटीन पृथक्करण को प्रेरित करने के लिए प्रकाश का उपयोग करता है। प्रोटीन स्थानीयकरण और जीवित कोशिकाओं में गतिविधि को मापने में यह नया साधन अधिक लचीला है। सिग्नलिंग कैस्केड के भीतर सक्रियण के मोड का चयन करके, अपरंपरागत तरीकों से संकेत पारगमन को छेदना संभव है। उदाहरण के लिए, एल बिना बिना रिसेप्टर टाइरोसिन केनेज को सक्रिय करना संभव हैIgand-receptor बाध्यकारी 49 या ligand-elicited संकेत कैसकेड 44 के एक सबसेट प्रेरित करने के लिए यहां रिपोर्ट की गई रणनीति को अन्य चीजें नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जैसे कि 39 और जीटीपीस ( जैसे, आरओ जीटीपीस), जिसका सक्रियण राज्य प्रोटीन स्थानान्तरण द्वारा चालू किया जा सकता है। ऑप्टोगैनेटिक्स जीवित जीवित जीवों पर लागू होने के लिए जारी रहेगा, जैसा कि हालिया कार्यों में प्रोटीन स्थानीयकरण के ऑप्टोगनेटिक नियंत्रण और ड्रोसोफिला 50 , ज़ेबराफिष 51 , 52 , 53 , 54 और क्नीनोपस भ्रूण 35 में सिग्नल को दर्शाती है ।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम अर्बन-चैंपियन (यूआईयूसी) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईजीएमएस आर 01 जीएम 111816) में इलिनोइस विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 124 ऑप्टोगनेटिक्स प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पीसी 12 सेल भेदभाव, भ्रूण विकास क्रिप्टोच्रोम CRY2-CIBN बायिसिस्टोनिक आरएएफ / एमईके / ईआरके केनेज सिग्नलिंग कास्केड
सेल भेदभाव के दौरान मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेस पाथवे के प्रकाश-मध्यस्थतापूर्ण प्रतिवर्ती मॉडुलन और<em&gt; Xenopus</em&gt; भ्रूण विकास
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Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).

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