Summary
Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.
Abstract
Lo strato endoteliale è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi nel corpo controllando molte funzioni diverse. Regolamento della risposta infiammatoria dallo strato endoteliale è fondamentale per combattere efficientemente ingressi è nocivi e aiuto nel recupero di aree danneggiate. Quando le cellule endoteliali sono esposti a un ambiente infiammatorio, ad esempio il componente esterno della membrana di batteri gram-negativi, lipopolisaccaride (LPS), esprimono solubile citochine pro-infiammatorie, quali Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e innescare il attivazione dei leucociti circolanti. Inoltre, l'espressione di molecole di adesione sulla superficie endoteliale E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 consente l'interazione e l'adesione dei leucociti attivati per lo strato endoteliale e alla fine lo stravaso verso il tessuto infiammato. In questo scenario, la funzione endoteliale debba essere strettamente regolata perché attivazione eccessiva o difettosa nel reclutamento dei leucociti potrebbe portare a patologie infiammatorie. Poiché molti di questi disordini non hanno un trattamento efficace, è necessario studiare nuove strategie con un focus sullo strato vascolare. Vi proponiamo le analisi complete che sono utili per la ricerca di nuovi regolatori endoteliale che modificano la funzione del leucocita. Analizziamo l'attivazione endoteliale tramite le destinazioni di espressione specifici coinvolti nel reclutamento leucocitario (ad esempio, citochine, chemochine e molecole di adesione) con diverse tecniche, tra cui: (reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale RT-qPCR), western-blot, saggi di adesione e citometria di flusso. Questi approcci determinano la funzione endoteliale in contesto infiammatorio e sono molto utili per eseguire analisi di selezione per caratterizzare nuovi regolatori infiammatori endoteliale che sono potenzialmente utili per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.
Introduction
L'infiammazione è una risposta biologica benefica contro agenti infettivi, con lo scopo principale di eliminare il patogeno e riparare il tessuto danneggiato. In determinate condizioni, come le infezioni croniche o malattie autoimmuni, l'infiammazione non si risolve. Invece, c'è una reazione anomala con continua infiltrazione dei leucociti, conseguente a una risposta immunitaria prolungata che porta al danno tissutale, fibrosi, perdita della funzione e nel complesso, disabilità e in alcuni morte casi del paziente. Questi disordini umani, catalogati come malattie infiammatorie, tutti coinvolgono i vasi sanguigni per il controllo di stravaso del leucocita1,2.
Le cellule endoteliali gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta infiammatoria controllando il traffico del leucocita. Quando lo strato endoteliale è esposto a mediatori infiammatori quali LPS, l'endotelio che riposa attiva ed esprime le citochine pro-infiammatorie (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, ecc.) e molecole di adesione (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) quel favore reclutamento dei leucociti nel sito di infezione circolanti. I leucociti innescati dalle citochine rilasciate quindi mediano rotolamento e l'interazione con lo strato endoteliale attraverso le controparti adesive corrispondente: PSGL-1-selectina, integrina α4β1 VCAM-1 e αLβ2 integrina di ICAM-1. Infine, i leucociti migrano attraverso il sistema vascolare verso la messa a fuoco di infiammazione3.
Il ruolo essenziale dell'endotelio nella regolazione della risposta infiammatoria è stato dimostrato sui topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere il LPS recettore, il recettore toll-like 4 (TLR4), solo sulle cellule endoteliali. Questi animali endoteliale TLR4 sono stati in grado di rispondere ad un'infiammazione LPS-mediata e per rilevare l'infezione generata dopo l'inoculo di batteri e di conseguenza ottenere un infezione risoluzione e sopravvivenza a livelli simili come i topi wild-type4 , 5.
Per raggiungere la risposta infiammatoria dell'endotelio-regolato, è stato postulato che l'inibizione in alcune fasi dell'interazione leucocita-endotelio comporterebbe la riduzione della migrazione trans-endoteliale e una migliore prognosi per malattie infiammatorie legate. In realtà, diverse strategie di targeting per l'interazione di attivazione e del leucocita-endotelio endoteliale sono state progettate per ostacolare lo stravaso delle cellule immuni come un trattamento per i disordini infiammatori6,7.
In questo rapporto, descriviamo un gruppo approfondito di tecniche in vitro per caratterizzare l'attività endoteliale in risposta a stimolo infiammatorio LPS e suo ruolo nella attivazione del leucocita e adesione allo strato vascolare. Il modello delle cellule endoteliali utilizzato in questo manoscritto era la linea di mouse del polmone delle cellule endoteliali (MLEC-04), come descritto da Hortelano et al. 8. linea cellulare il MLEC-04 è stato convalidato nella letteratura per essere un sistema adeguato per studiare l'attivazione endoteliale9,10. Basato su interessi di ricerca, questi approcci possono essere facilmente estrapolati per ogni endoteliale o sistemi del leucocita e profilo infiammatorio. Una volta definiti i parametri endoteliali in condizioni selezionate, il sistema può testare nuovi farmaci sulla sperimentazione proposta di valutare l'attivazione vascolare. In questo contesto infiammatorio, le cellule di endotelio testate con il composto di interesse possono essere paragonate per le condizioni di controllo delle cellule, ed eventuali differenze risultanti possono informare il risultato prognostico della droga per lo sviluppo e la progressione dell'infiammazione. Per concludere, vi proponiamo un sistema pertinente per caratterizzare nuovi bersagli farmacologici per le cellule endoteliali, che possono influenzare la progettazione di nuove terapie vascolari specifici contro le malattie infiammatorie legate.
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Protocol
1. coltura di cellule endoteliali
- di coltura del tessuto trattato piastre
- piastre di coltura del tessuto cappotto 100 mm con gelatina di 2,5 mL soluzione (in autoclave, gelatina di 0,1% in acqua distillata) per 30 min a 37 ° C; questo possono essere estrapolati al formato richiesto ben. Aspirare la soluzione di gelatina e lasciare piatti asciugare all'aria nella cappa di coltura del tessuto.
- Condizioni di coltura del tessuto
- coltivare le cellule MLEC-04 all'interno di un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2). Crescere le cellule in multimediale completo di Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: miscela nutriente F-12 (DMEM/F-12) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina (P/S).
- Contare le celle con il metodo standard della camera Neubauer e aggiungere le cellule MLEC-04 le piastre di gelatina-trattati di 100 mm in media completa da 10 mL, a una bassa densità di 2-11 x 10 4 cellule/cm 2. Quando raggiungono la confluenza di dividere le celle 1:3.
Nota: Questo si verifica in genere dopo due o tre giorni nella cultura. - Sottocultura le cellule lavando i piatti con 10 mL sterili Phosphate Buffered Saline (PBS) seguita con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 5mm EDTA) e incubare per 3 min a 37 ° C.
- Fermare la reazione di tripsina-EDTA e recuperare le cellule sospese aggiungendo multimediale completo di 10 mL. Rotazione verso il basso le cellule (300 x g, 5 min), eliminare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in media completi e sottocultura opportunamente.
2. Trattamento dei LPS e mediatori
- le cellule MLEC-04 nel multimediale completo Sub-confluenza nel seguente ben formato del piatto: 7 x 10 5 cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti e 2.5 x 10 5 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti.
- Incubare la cultura per 6 h in un'incubatrice di cellulare (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2). Passare le cellule ai media incompleta (DMEM-F12, P/S) e lasciare durante la notte (il) per sincronizzare e per ridurre l'attività delle cellule.
- Rimuovere i supporti e testare nuovi composti farmacologici incubando le cellule endoteliali con (o senza) il farmaco in questione (ad es. DT 10) diluito nei mezzi di comunicazione incompleta (30 min, 37 ° C); aggiungere 1,4 mL/bene per piastra a 6 pozzetti o 0,14 mL/pozzetto per piastre da 96 pozzetti).
- Sfida le cellule aggiungendo LPS ai media incubazione (100 ng/mL, concentrazione finale) per il periodo di tempo specificato in ogni analisi. Utilizzare PBS come controllo.
3. Valutazione del profilo trascrizionale sull'endotelio attivato da RT-qPCR
- cellule di seme MLEC-04 Sub-confluenza nella cultura 6 pozzetti piastre (7 x 10 5 cellule/pozzetto). Incubare per 6 h (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2) e successivamente procedere alla deprivazione di siero (Incubare ON).
- Rimuovere i supporti e trattare (o non trattata) la cellula endoteliale culture con il farmaco di interesse diluito nei media incompleti (Incubare per 30 minuti, 37 ° C); aggiungere 1,4 mL/bene per piastra a 6 pozzetti (30 min, 37 ° C).
- Sfidare le cellule con l'aggiunta di 100 ng/mL LPS ai media incubati (come descritto al punto 2.3) e incubare per 6 h. fermare la reazione di lavaggio due volte con PBS freddo e mantenere piastre a-80 ° C fino al trattamento del campione.
- Estrazione di RNA
- scongelare le piastre e aggiungere 1 mL/pozzetto RNA tampone di estrazione (38% fenolo e 0,8 M guanidinio isotiocianato; Vedi tabella materiali). Lasciare per 30 min a temperatura ambiente (TA) sotto agitazione e raccogliere omogeneato in provette da 1,5 mL.
- Aggiungere cloroformio di 200 µ l e frizionare delicatamente per 15 s. Incubare per 3 min a RT e centrifugare (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Fase acquosa di trasferimento in un'altra provetta da 1,5 mL. Precipitare il RNA aggiungendo 500 µ l isopropanolo, seguita da un'incubazione di 10 min a RT e quindi centrifugazione (11.600 x g, 4 ° C).
- Scartare il surnatante e lavare il precipitato con etanolo al 75% da vortice agitazione e poi centrifugazione (7.500 x g, 4 ° C).
- Asciugare il pellet e solubilizzare RNA in 25 µ l puro H 2 O incubando per 10 minuti a 55 ° C. Keep RNA a-80 ° C fino al trattamento del campione.
- Quantità e la purezza del RNA
- quantificare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza del campione a 260 nm in uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).
- Misura a 230 nm e 280 nm per determinare la purezza RNA.
Nota: Il rapporto a 260/280 indica contaminazione della proteina o fenolo. Un rapporto vicino 2 è accettabile. Il rapporto di 260/230 indica EDTA, carboidrati o contaminanti di fenolo. Valori tra 2.0-2.2 sono accettabili.
- RNA controllo integrità
- Run 2 µ g di RNA totale e un RNA scaletta su un 1,5% denaturante del gel dell'agarosi; visualizzare su un sistema di documentazione del gel (Vedi Tabella materiali).
Nota: Un rapporto di 2:1 di chiare e nitide bande di rRNA 28S e 18S indica un RNA intatto. Parzialmente degradata RNA si risolve come un aspetto spalmato.
- Run 2 µ g di RNA totale e un RNA scaletta su un 1,5% denaturante del gel dell'agarosi; visualizzare su un sistema di documentazione del gel (Vedi Tabella materiali).
- RT-qPCR
- sintetizzano il DNA complementare (cDNA) da un singolo RNA incagliato seguendo lo standard protocollo (Vedi Tabella materiali) 11.
- Valutare l'espressione genica di RT-qPCR
- preparare la miscela di reazione per ogni campione: Mix 2 µ l cDNA, composto fluorescente di 7 µ l, 300 nM forward primer e primer reverse 300 nM (tabella 1) in un volume finale di 13 µ l e aggiungere alla piastra 96 pozzetti di reazione (Vedi Tabella materiali).
- Sigillare la piastra con un coperchio adesivo ottico, centrifuga (300 x g, 1 min) ed eseguire la reazione su un sistema di PCR in tempo reale (avviamento a caldo 95 ° C per 20 s seguiti da 40 cicli: 95 ° C per 3 s e 60 ° C per 30 s) (Vedi Tabella materiali).
- Analizzare i risultati di quantificazione relativa utilizzando il metodo comparativo 2 -ΔΔCt con le pulizie geni gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) o acida ribosomal fosfoproteina P0 (36B4) 12 .
4. Valutare l'attivazione endoteliale tramite flusso Cytometry
- trattare le cellule MLEC-04 seguendo le condizioni descritte nella sezione 2 e valutare i cambiamenti delle proteine di superficie endoteliale tramite flusso cytometry.
- Staccare le cellule dopo 6 h di stimolazione dei LPS con il metodo di tripsina-EDTA descritto in passaggio 1.2.3 e lavare con i mezzi di comunicazione incompleta a 4 ° C.
- Contare le celle utilizzando il metodo della camera Neubauer e inserire 10x10 4 cellule in piastre da 96 pozzetti fondo u. Centrifuga (300 x g, 5 min) e gettare il surnatante di un 180° a scatto del polso dall'alto verso il basso e il recupero rapido alla posizione originale.
- Aggiungere 50 µ l dell'anticorpo selezionato diluito nei mezzi di comunicazione incompleta (10 µ g/mL, concentrazione finale) per le cellule e incubare (30 min, 4 ° C).
- Lavare le cellule due volte with media incompleti seguendo la procedura descritta nel passaggio 4.3 e incubare con 50 µ l a 10 µ g/mL di anticorpo secondario corrispondente accoppiato al FITC o un simile coniugato (30 min, 4 ° C in uno spazio buio).
- Lavare le cellule una volta con i mezzi di comunicazione incompleta seguita da un lavaggio con PBS. Recuperare le cellule con 300 µ l PBS utilizzando puntali per pipette da 1 mL e posto in tubi di citometria.
- Valutare i campioni nel sistema di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali). Regolare la popolazione delle cellule dall'avanti e parametri di scattering di lato. Cancello della popolazione di interesse. Regolare cancelli basate sul controllo negativo da cellule incubate con controllo di isotipo. Analizzare i risultati come la percentuale di cellule positive o dire fluorescenza intensità 8.
5. Valutare l'attivazione endoteliale mediante Western Blot
- seme l'endotelio Sub-confluenza in piastre di coltura 6 pozzetti (7 x 10 5 cellule/pozzetto) e trattare con LPS come descritto nella sezione 2. Analizzare l'espressione di proteina infiammatoria dal seguente protocollo occidentale della macchia.
- Interrompere la stimolazione dei LPS in diversi momenti per chiarire diversi aspetti della risposta endoteliale:
- accertare il profilo di proteine infiammatorie dopo 6 h di stimolazione dei LPS.
- Determinare la cella segnalazione ogni 15 minuti attraverso un periodo di 60 min.
- In entrambi i casi, è necessario arrestare la reazione di lavaggio due volte con PBS freddo e conservare i campioni a-80 ° C fino al trattamento del campione. Buffer di
- Lyse le cellule e l'estrazione della proteina
- lisi di aggiungere 200 µ l in ogni pozzetto (1% tensioattivi non ionici, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM di cloruro di sodio, pirofosfato di sodio 30 mM, 50 mM sodio fluoruro, 2,1 mM sodio ortovanadato presso pH 7,6, completati con l'inibitore della proteasi cocktail) (Vedi tabella dei materiali).
- Incubare per 15 min a 4 ° C sotto agitazione, raschiare pozzi con una pipetta e raccogliere l'omogenato in provette da 1,5 mL.
- Centrifugare le provette a 11.600 x g a 4 ° C.
- Conservare il supernatante in provette pulite 1,5 mL a-80 ° C fino a elaborazione.
- Misura la concentrazione di proteina dall'analisi di acido bicinconinico seguendo lo standard di protocollo (Vedi tabella materiali) 13.
- Risolvere il 30 µ g di proteina totale lysata per ogni campione, la tecnica standard di laurilsolfato di sodio 0,1%, 10% gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE) 14. Eseguire i campioni con 10mm β-mercaptoetanolo (condizioni riducenti) o senza (condizioni non riducenti) a seconda dell'anticorpo utilizzato per rilevare la proteina di interesse.
- Trasferire le proteine separate da gel di poliacrilammide ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) trasferimento con 0,45 µm pori utilizzando la procedura standard.
- Dopo transfert, lavare la membrana due volte con PBS, 0,1% polisorbato-20 (PBS-T) e bloccare i siti di legame non specifico aggiungendo 20 mL 2% BSA diluito in PBS-T per fosfoproteine rilevati o latte in polvere senza grassi 5% in PBS-T per proteine totali, sotto agitazione (90 min, RT).
- Diluire l'anticorpo selezionato in 10 mL di buffer blocco appropriato presso la concentrazione consigliata e incubare la membrana sotto agitazione (ON, 4 ° C). In alternativa, posizionare la membrana in sacchetti di plastica sigillati e usato 5 mL di anticorpo diluito.
- Giorno successivo, lavare la membrana tre volte (in eccesso PBS-T, 15 min, RT).
- Incubare la membrana sotto agitazione (30 min, RT) con 10 mL di anticorpo secondario corrispondente associata alla perossidasi di rafano (HRP) diluito a 1: 10.000 nell'appropriato tampone bloccante.
- Lavare la membrana tre volte sotto agitazione (PBS-T in eccesso, 15 min, RT).
- Incubare la membrana per 1 min con 0,1 mL/cm 2 di chemiluminescenza di substrato migliorato la perossidasi (ECL). Posizionare la membrana drenata tra due fogli di plastica trasparente e inserire il sistema di rilevazione di chemiluminescenza che include una fotocamera Charged-Coupled Device (CCD).
- Utilizzare la telecamera CCD per rilevare il segnale e il relativo software per registrare le immagini con il programma accumulativo (immagini visualizzare il segnale accumulato presso ogni 30 s esposizione per un periodo di totale 15 min).
- Quantificare l'intensità di banda da densitometria utilizzando il software ImageJ seguendo il protocollo descritto nella Guida utente 15.
- Aprire l'esempio nel software ImageJ e selezionare la banda di interesse con lo strumento selezione rettangolare.
- Selezionare come prima corsia e premere trama corsie per ottenere le trame profilo.
- Delimitare l'area dei picchi con la linea retta selezione.
- Misurare la dimensione di ciascuna banda facendo clic all'interno di ogni picco.
- Rappresentano i risultati rispetto al caricamento di controllo proteine (β-actina, tubulina, ecc.).
6. Valutare endoteliale fattore rilasciato dall'attivazione del leucocita di analisi di adesione
- ottenere il media condizionati endoteliali.
- Trattare le cellule MLEC-04 come indicato nella sezione 2 e raccogliere il surnatante della cultura dopo stimolazione h 24 con LPS (100 ng/mL).
- Raccogliere il media condizionati dalle cellule trattate MLEC-04 e centrifugare (600 x g). Mantenere il supernatante in aliquote di 0,5 mL a-80 ° C fino all'utilizzo.
- Analisi di adesione del leucocita
- cappotto le piastre da 96 pozzetti con 50 µ l/pozzetto di proteine della matrice extracellulare selezionato diluito in PBS (ad eccezione di collagene, che è diluito in acido acetico 0,1 M): fibronectina (1-10 µ g/mL ), laminina (1-10 µ g/mL) e collagene di tipo I (10-40 µ g/mL). Lasciare ON a 4 ° C.
- Scartare il supporto rivestito e bloccare i siti di legame aspecifici su pozzi con 150 µ l di PBS, BSA 1% inattivati (1 min, 100 ° C) per 90 minuti a TA.
- Lavare i pozzetti due volte con PBS e aggiungere 100 µ l di raccolti in precedenza endoteliale condizionata media (sezione 6.1) ai pozzetti.
Nota: Le piastre sono pronte per eseguire il dosaggio di adesione. - Cultura la linea di cellulare di monociti-macrofagi J774 topo in un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2) con Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Nota: Le cellule J774 crescono in sospensione. - Raccogliere le cellule J774 in una provetta da 15 mL e centrifugare (300 x g, 5 min). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con media privo di siero di 10 mL. Contare le celle in una camera di Neubauer. Centrifugare le cellule (300 x g, 5 min), scartare il surnatante e risospendere le cellule in media senza siero alle cellule di 15 x 10 4 J774 per media di 50 µ l.
- Aggiungi 15 x 10 4 J774 cellule a ciascuno in media di siero senza 50 µ l ed incubare per 15 min a 4 ° C, seguita da 1 h a 37 ° C nell'incubatore CO 2 cell.
- Lavare i pozzetti per due volte, delicatamente aggiungendo PBS caldo; centrifugare (5 min a 300 x g) e scartare il surnatante di un attimo di 180° del polso dall'alto verso il basso e il recupero rapido alla posizione originale. Difficoltà la cella collegatas aggiungendo 100 µ l/pozzetto di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS e incubare (10 min, RT).
- Scartare i media delicatamente e permeabilize le cellule con metanolo al 2% in PBS per 2 min a RT. scartare i media delicatamente e macchiare le cellule aggiungendo 50 µ l/pozzetto di cristalvioletto di 0,5% a 20% metanolo per 90 s a RT.
- Lavare la piastra con abbondante acqua corrente, eliminare il liquido in eccesso e lasciare asciugare all'aria. Segnalazione le cellule allegate da fotocamera digitale accoppiata ad un microscopio chiaro.
- Diluire aggiungendo 100 µ l/pozzetto di citrato di sodio 0,1 M, 50% di etanolo di colorazione cellulare. Misura l'assorbanza a 545 nm e rappresentano i risultati come unità arbitrarie di assorbanza o percentuale di adesione considerando 100% come adesione cellulare raggiungono pozzetti rivestito con maggiore concentrazione di ligando
7. Testare l'attivazione endoteliale da analisi di co-adesione del leucocita-endotelio
- trattare le cellule MLEC-04 su piastre a 96 pozzetti, come descritto nella sezione 2 e incubare con LPS (6 h, 37 ° C).
- Fluorescente marcare le cellule J774 con Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
- Lavare il J774 cellule in PBS seguendo la procedura punto 6.2.5. Conteggio celle dalla Neubauer metodo da camera e risospendere a 1 x 10 6 cellule/mL in PBS, 0.1% BSA.
- Incubare le cellule con CFSE (5 µM, concentrazione finale) per 20 min a diluitore incompleta di 37 ° C. aggiungere 5 mL e incubare (5 min, 4 ° C).
- Lavare una volta con media incompleta, come spiegato nel 6.2.5., risospendere a 15 x 10 4 cellule/100 µ l e procedere con l'analisi di co-adesione.
- Dopo il trattamento di endotelio, lavare i pozzetti tre volte con media incompleta. Aggiungere le cellule J774 CFSE (15 x 10 4 cellule/100 µ l) a ogni endothelial-rivestite bene. Incubare la piastra per 10 min a 4 ° C, seguita da 60 min a 37 ° C.
- Lavare i pozzetti con delicatezza, come descritto in 6.2.7., usando riscaldato PBS e riferire l'adesione J774 lo strato endoteliale con i seguenti due metodi:
- lisare le cellule in 0.1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µ l/pozzetto) e misurare la Segnale di CFSE-J774 dalla fluorometria (eccitazione/emissione = 492 nm/517 nm). Rappresentare i risultati come unità arbitrarie di intensità di fluorescenza o la percentuale di adesione rispetto al controllo positivo (segnale da cellule totali aggiunta ad ogni pozzetto).
- Fissare le cellule nel 4% PFA e report l'allegato delle cellule J774 CFSE all'endotelio visualizzando sotto un microscopio a fluorescenza (eccitazione/emissione = 492 nm nm/517).
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Representative Results
Valutazione dell'attivazione delle cellule endoteliali indotta da LPS da RT-qPCR
Le cellule di MLEC-04 siero morto di fame sono state stimolate da 100 ng/mL di LPS per 6 h, e l'espressione genica endoteliale è stata valutata mediante RT-qPCR confrontando l'espressione di marcatori di attivazione alla condizione di riposo. Come mostrato in Figura 1A, le cellule incubate LPS MLEC-04 ha indotto l'espressione di mRNA di molecole di adesione selezionato coinvolte nel reclutamento dei leucociti durante la risposta infiammatoria (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1). PECAM-1 è stato utilizzato come controllo interno perché l'espressione non è modificato sotto questo trattamento sperimentale. Figura 1B rappresenta l'attivazione endoteliale di LPS misurata da aumentata espressione di mRNA delle citochine Ccl5, Cxcl10 e Cxcl1. Queste molecole sono coinvolti nell'attivazione dei leucociti, compreso il loro traffico per lo strato endoteliale e stravaso successivo al sito di infiammazione circolanti. La citochina, IL4, è stata utilizzata come controllo interno sotto questo trattamento sperimentale.
Figura 1: valutazione di LPS indotta endoteliali cellule attivazione di RT-qPCR. Il MLEC-04 cellule sono state stimolate con 100 ng/mL di LPS per 6 h (barre rosse) rispetto alla condizione di controllo (barre blu), e l'espressione genica è stata analizzata tramite RT-qPCR. I grafici mostrano piega induzione del mRNA per quanto riguarda la condizione di controllo selezionato endoteliale di molecole di adesione (A) e citochine (B) coinvolti nell'attivazione del leucocita e reclutamento durante la risposta infiammatoria. PECAM-1 e IL4 erano utilizzati come controlli negativi in questa condizione. I risultati sono espressi come media ± SEM da un esperimento, su tre eseguita, effettuati in triplice copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Espressione della proteina di molecole di adesione sulle cellule endoteliali LPS-trattati
Stimolo infiammatorio è stato effettuato sulle cellule MLEC-04 come descritto nella sezione precedente e l'espressione della proteina è stata studiata dalla tecnica occidentale della macchia. L'endotelio che riposa presenta livelli quasi inosservabili di molecole di adesione VCAM-1 e ICAM-1 (etichettati come-). In presenza di LPS (+), il fenotipo endoteliale attivato è evidente dal upregulation dell'espressione dei marcatori descritti (Figura 2). Le membrane sono state normalizzate dal rilevamento di β-actina, che è stato utilizzato come il controllo di carico per calcolare la densità relativa banda dopo analisi densitometria.
Figura 2: espressione della proteina di molecole di adesione sulle cellule endoteliali LPS-trattati. Rappresentante della macchia occidentale valutazione VCAM-1 e ICAM-1 espressione della proteina in riposo (-) rispetto ai LPS-trattati (+) le cellule MLEC-04. La β-actina è stato usato come un controllo di carico. Il peso molecolare di ogni proteina è tra parentesi. I valori rappresentano il semi-quantificazione delle densità relativa banda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Indicatori di superficie endoteliali in LPS-ha mediato l'infiammazione
L'attivazione endoteliale nel contesto infiammatorio è stata valutata tramite flusso cytometry dopo 6 ore-stimolazione di LPS (100 ng/mL). In questa condizione, la rilevazione di adesivo-relative molecole coinvolte nell'interazione del leucocita è stata valutata. Il pannello di sinistra della Figura 3A rappresenta espressione basale dei marcatori specificati nelle cellule che riposa MLEC-04 (rosso-solido istogramma) rispetto al controllo negativo isotype (istogramma punteggiato di nero). Il pannello di destra della Figura 3A Mostra i risultati derivati da stimolato MLEC-04. Il trattamento dei LPS hanno aumentato significativamente l'espressione delle molecole di adesione E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 nella membrana plasmatica (rosso-solido istogramma) rispetto alla condizione di riposo (istogramma punteggiato di nero). Come mostrato nella citometria a profili e citato prima, l'espressione di PECAM-1 è invariato in questa condizione sperimentale. Figura 3B Mostra i valori di quantificazione utilizzati come riferimenti per valutare possibili mediatori della reazione infiammatoria endoteliale. %: percentuale di cellule positive; MFI: significa che l'intensità di fluorescenza.
Figura 3: gli indicatori di superficie endoteliali in LPS-ha mediato l'infiammazione. Flusso cytometry profili di molecole di adesione cellulare sul riposo e cellule LPS-stimolate MLEC-04. Il pannello di sinistra mostra l'espressione della proteina sulle cellule quiescenti (istogramma di antigene etichettato-rosso) rispetto al controllo di isotipo abbinato (istogramma Ctrl-nero). Pannello di destra confronta l'espressione di proteine di superficie delle cellule di controllo (neri istogrammi) alle cellule endoteliali LPS-trattati (istogramma rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Vie di segnalazione attivate dalla stimolazione di LPS in cellule endoteliali
I meccanismi coinvolti nell'attivazione compartimento vascolare durante l'infiammazione sono studiati valutando le molecole chiave di segnalazione. Le cellule di MLEC-04 stimolate con i LPS in periodi diversi sono state elaborate per l'estrazione proteica, e il grado di attivazione è stato analizzato tramite tecnica occidentale della macchia. La figura 4 Mostra che il repressore IκB-α di segnalazione di NF-κB è fosforilato dopo i 15 min LPS-incubazione e ritorna ai livelli basali dopo 1 ora. D'altra parte, i LPS attiva ERK 1/2 di segnalazione dopo 15 min, che stabilisce un percorso essenziale coinvolto nell'attivazione endoteliale durante la risposta infiammatoria. Le membrane sono state normalizzate da β-actina o ERK 1/2 di rilevamento, che sono stati utilizzati come i controlli di caricamento per calcolare la densità relativa banda dopo analisi densitometria.
Figura 4: segnalazione vie attivate dai LPS sulle cellule endoteliali. Il MLEC-04 cellule stimolate con 100 ng/mL di LPS per i tempi indicati in figura e le vie di segnalazione ERK 1/2 (P-ERK 1/2) e NF-kB (attraverso P-IκBα) sono state valutate mediante western blot. ERK 1/2 totale e β-actina sono stati utilizzati come controlli in ogni condizione di carico. Il peso molecolare per ogni proteina è tra parentesi. I valori rappresentano il semi-quantificazione delle densità relativa banda. Per favore clicca qui per visualizzare una versione ingranditaQuesta figura.
Regolamento del comportamento del leucocita dall'endotelio stimolato con LPS
La rilevanza biologica del regolamento dell'attivazione endoteliale sulla progressione della reazione infiammatoria è determinata dalle analisi funzionale delle prestazioni del leucocita. Come descritto nella sezione protocollo, due diversi approcci sono inclusi per il test di funzione del leucocita regolato dalle cellule endoteliali. Anche se i dosaggi interrogano diversi aspetti della risposta infiammatoria (RT-qPCR per endoteliale citochine liberate dall'attivazione del leucocita e western blot per molecole di adesione endoteliali nell'interazione del leucocita), i dati ottenuti sono entrambe restituiscono dettagli microscopici di attaccamento del leucocita. L'attivazione del leucocita di fattori solubili endoteliale è essenziale per lo sviluppo di un'efficiente risposta infiammatoria, come favorisce l'adesione delle cellule di diversi substrati. Figura 5A Mostra l'adesione delle cellule J774 a 0,5 µ g/mL fibronectina rivestito pozzi in risposta a raccolti in precedenza media condizionati dal controllo o LPS trattati delle cellule endoteliali. Il campo luminoso immagini e misure spettrofotometriche indicano che i fattori rilasciati in media condizionati dall'endotelio LPS-trattati sono sufficienti per indurre efficientemente J774 attivazione, come indicato tramite l'induzione di collegamento delle cellule a fibronectina. Figura 5B rappresenta un'analisi di co-adesione per valutare la capacità dello strato vascolare per supportare ferma adesione del leucocita dall'espressione di molecole di adesione endoteliali romanzo. Brevemente, le culture subconfluent siero morto di fame delle cellule stimolate con i LPS per 6 h MLEC-04 sono state lavate più volte e co-incubate con la linea del leucocita che J774 precedentemente etichettati con la sonda fluorescente, CFSE. Come mostrato nella micrografie e misure di spectrofluorometric, la stimolazione LPS-vascolare favorisce l'interazione delle cellule J774 CFSE per il monostrato endoteliale.
Figura 5: interazione monostrato endoteliale LPS-incubato da analisi di co-adesione del leucocita. Immagini di microscopia (A) risultati cristalvioletto macchiatura delle cellule J774 attaccate ai pozzi di fibronectina rivestita 0,5 µ g/mL in risposta a media condizionati dal controllo o cellule endoteliali LPS-trattati. Barra della scala, 50 µm. L'analisi spettrofotometrica illustrato di seguito indica la misura di assorbanza espressa in unità arbitrarie (a.u.) ± SEM per un rappresentanza esperimento eseguito in triplice copia. (B) fluorescenza micrografie mostrano attaccato cellule J774 CFSE al controllo o cellule LPS-trattati MLEC-04 valutate tramite l'analisi di co-adesione. Barra della scala = 50 µm. L'analisi fluorometrica illustrato di seguito indica l'intensità di fluorescenza espressa in unità arbitrarie (a.u.) ± SEM per un rappresentanza esperimento eseguito in triplice copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Destinazione | NCBI RefSeq ID | Trasmettere la sequenza (a 5 minuti-3 ´) | Sequenza inversa (a 5 minuti-3 ´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | GTG ATTO GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC GATTO CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| CXCL1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG AGC TAC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG GATTO CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selectina | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati in questo studio.
| A riposo | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| CTRL | 1.79 | 3.5 | 0.55 | 3,48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12,09 | 37.82 | 12.24 |
| E-selectina | 17.12 | 8,06 | 88,13 | 49,84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204,05 |
| ICAM-1 | 99,76 | 114.81 | 99,82 | 363.89 |
Tabella 2: indicatori della superficie endoteliali in LPS-ha mediato l'infiammazione. Quantificazione dell'espressione di molecole di adesione delle cellule sulle cellule MLEC-04 riposa e LPS-stimolato dall'analisi di citometria a flusso. I valori rappresentativi per ogni marcatore corrispondente alla percentuale di cellule positive (%) e di intensità media di fluorescenza (MFI) nelle cellule endoteliali che riposa e LPS-stimolato. PECAM-1 è stato utilizzato come controllo negativo in queste condizioni sperimentali.
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Discussion
Questo protocollo endothelial descrive una tecnologia graduale che costituisce le basi per esplorare nuovi meccanismi coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria. Questi approcci sono basati sullo studio dell'attività endoteliale stimolata da LPS e valutare i passaggi critici coinvolti nel reclutamento dei leucociti durante la risposta infiammatoria, in particolare: liberazione di citochine endoteliale, adesione endoteliale adesione di molecole del leucocita e l'espressione a livello vascolare. Una volta stabiliti i parametri endoteliali, il sistema può cercare nuovi composti coinvolti nella regolazione della funzione endoteliale e di conseguenza, progressione infiammatoria. Quei farmaci regolamentazione possono potenzialmente essere di interesse per il mercato farmaceutico. La proiezione principale del presente protocollo sequenza è quello di istituire una Fondazione per estendere questi studi a diversi tipi di endoteliali e stimolatori condizioni regolando ai relativi parametri di attività vascolare relativa.
Farmaci selezionati da questo screening costituiranno dei candidati interessanti per la progettazione di nuove strategie terapeutiche contro disordini infiammatori. Da un lato, i composti che favoriscono la risposta endoteliale e contribuiscono al reclutamento leucocitario sarà promettenti per immunodeficenza condizioni16,17. D'altra parte, gli inibitori endoteliali costituirebbe eccellente terapie per le malattie infiammatorie croniche10.
Caratterizzazione delle citochine espresse dall'endotelio stimolato predice l'evoluzione dell'infiammazione. Le citochine sono piccole proteine rilasciati dallo strato endoteliale nel contesto infiammatorio e fortemente regolano il comportamento del leucocita. Membri pro-infiammatorie, quali Ccl5, Cxcl10 e Cxcl1, legarsi a loro specifici recettori sulla superficie dei leucociti e del segnale per indurre l'interazione dei leucociti con le molecole di adesione nuova espressione sullo strato vascolare (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1), e migrazione dei leucociti all'area patologica (Figura 1, Figura 2, Figura 3)8,10,18. Altri membri della stessa famiglia di proteine sono coinvolte nella risoluzione dell'infiammazione e di conseguenza della riparazione tissutale. L'espressione di queste citochine antinfiammatorie è rilevante per le malattie infiammatorie croniche perché ostacolano il reclutamento dei leucociti e favoriscono l'immunità liquidazione10,19,20. Per selezionare possibili regolatori infiammatori endoteliale, si consiglia di eseguire questa analisi di espressione di cytokine e valutare l'espressione di molecole di adesione endoteliale in presenza di composti di interesse. Infatti, analizzando i livelli tra antinfiammatorio contro citochine pro-infiammatorie può essere utilizzato come un valore predittivo per la progressione della malattia e rivela il farmaco di interesse terapeutico21.
Il LPS vincolante ai suoi trigger di recettore di superficie delle cellule complesse cascate di segnalazione intracellulare, guidate da MAP chinasi ERK 1/2, JNK e p38 e il signalosoma di NF-kB per indurre il programma trascrizionale infiammatorio. Molte di queste vie sono comuni ad altri stimoli infiammatori quali TNF-α o IL-110,22. L'attivazione endoteliale è determinato rilevando la forma fosforilata dei membri di chinasi della mappa come mostrato per ERK 1/2 in Figura 4. Inoltre, l'attivazione endoteliale di LPS induce l'attività enzimatica della IKKβ complesso, che fosforila e degrada l'inibitore di NF-kB IκB complessi, permettendo ai membri di effector di NF-kB di traslocazione nucleare di eseguire il corrispondente attività trascrizionale (Figura 4). Caratterizzare i meccanismi da cui il composto di droga colpisce la risposta endoteliale infiammatoria è molto utile, non solo descrivendo la droga, ma anche in progettazione di trattamenti novelli infiammatori in combinazione con le terapie convenzionali compatibile 23.
Composti selezionati tra i saggi di screening infiammatorio endoteliale, deve essere ulteriormente studiata per confermare la loro rilevanza funzionale nelle fasi critiche di analisi di comportamento del leucocita, poiché in ultima analisi, le cellule sono responsabili di disordini infiammatori. Queste analisi analizzano l'attività del leucocita in due diverse impostazioni sperimentali. Il primo è nel valutare il ruolo delle citochine endoteliale rilasciato sull'attivazione del leucocita di analisi di adesione integrina-mediata. Le integrine leucocitarie sono attivate dalle citochine rilasciate endoteliale. Così, capacità adesiva del leucocita per ligandi delle integrine è una misurazione rappresentativa per leucocita funzione8,10,18. Il secondo è nello studio del ruolo delle molecole di adesione endoteliale nuova espressione sull'interazione dei leucociti a livello vascolare da analisi di co-adesione. Le molecole di adesione endoteliale espresse nel contesto infiammatorio è essenziale per il reclutamento leucocitario al tessuto circostante. Così, analizzando i leucociti che interagiscono con il monostrato di cellule endoteliali-trattato costituisce un valore prognostico per progressione infiammatorie (Figura 5)8,10,18. I risultati derivati da questi approcci vorrei suggerire che i composti selezionati sono seri candidati nella progettazione di strategie future per il trattamento di disordini infiammatori
La proposta sperimentale definita qui è uno strumento versatile per applicazioni future a causa della sua capacità di estrapolare a diversi sistemi cellulari o stimolatore. La procedura può essere modificata all'endotelio da origini diverse o specie e per testarne il funzionamento su diverse cellule del sistema immunitario, come pure diversi agenti infiammatori quali LPS, TNF-α, batteri, virus, ecc. Come descritto nel testo, i ricercatori in primo luogo devono caratterizzare l'attivazione endoteliale nel proprio sistema più tardi caratterizzare il ruolo di un composto selezionato sulla risposta infiammatoria. Limitazioni del protocollo sono la selezione di un appropriato controllo negativo e definire con precisione i parametri di attività endoteliale che discernere il riposo dallo stato stimolato. Nel caso in cui le condizioni descritte in questo articolo non funzionano per un sistema diverso, i ricercatori devono risolvere i parametri sperimentali eseguire ulteriori dosaggi dipendente dal tempo e utilizzando un gradiente di concentrazione dello stimolo infiammatorio per definire una finestra stimolatore che permette di testare nuovi farmaci per la regolazione della risposta infiammatoria.
Per concludere, questo protocollo infiammatorio endoteliale è consigliato per la ricerca di nregolatori di endoteliale EW targeting la risposta infiammatoria. Eseguendo questa procedura fornirà romanzo, composti interessanti che possono essere applicati per studiare le sue future applicazioni e progettazione innovative vascolari specifiche terapie contro malattie infiammatorie legate, e che potenzialmente potrebbe essere di interesse per il mercato farmaceutico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) e l'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (concessione numero IERPY 1149/16 da A.L.; MPY 1410/09 a S. Hortelano); da MINECO attraverso il Fondo de Investigación en Salud (FIS) (assegna numeri PI11.0036 e PI14.0055 a S. Hortelano). S. Herranz è stata sostenuta da IERPY 1149/16 da ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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