Summary
هذا العمل تفاصيل طريقة المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . إعداد فيليه من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لمحور محور عصبي باثفيندينغ والاعتراف الهدف خلال التنمية العصبية.
Abstract
إنشاء الدوائر العصبية والعضلية وظيفية تعتمد على اتصالات دقيقة بين محاور تطوير المحرك والعضلات المستهدفة. الخلايا العصبية موتور توسيع المخاريط النمو للتنقل على طول مسارات محددة من خلال الاستجابة لعدد كبير من العظة التوجيه المحاور التي تنبعث من البيئة خارج الخلية المحيطة بها. نمو مخروط الهدف الاعتراف أيضا يلعب دورا حاسما في خصوصية العصبية والعضلية. يقدم هذا العمل بروتوكول المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . ويشمل هذا البروتوكول بضع خطوات رئيسية، بما في ذلك إجراء التنميط الجيني، لفرز الأجنة متحولة المطلوب. إجراء إمونوستينينغ، لوضع علامة الأجنة مع فاسيكلين الثاني (فاسي) الأجسام المضادة. وإجراء تشريح، لتوليد الاستعدادات فيليه من الأجنة الثابتة. توقعات المحاور الحركية وأنماط العضلات في المحيط هي أفضل بكثير تصور في الاستعدادات مسطحة من الأجنة فيليه من في وأولي جبل الأجنة. ولذلك، فإن إعداد شرائح من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لالمحور محور الباطنة والاعتراف الهدف، ويمكن أيضا أن تطبق على كل من فقدان من وظيفة وكسب وظيفة من الشاشات الوراثية .
Introduction
وصلات دقيقة والانتقائية بين المحاور الحركية والعضلات المستهدفة خلال التطور الجنيني ضرورية للحركة العادية في يرقات ذبابة الفاكهة . يتم إنشاء الزخرفة الجنينية من 30 ألياف العضلات في كل من هيميسيغمينتس البطن A2-A7 من قبل المرحلة 16 1 . الخلايا العصبية الحركية 36 التي يتم إنشاؤها في الحبل العصب البطني تمديد محاورهم في محيط لعصبية عضلات الهدف محددة 2 . يمكن أن تصور المحرك محور عصبي الباثل والاعتراف الهدف من قبل المناعية مع الأجسام المضادة (الماوس 1C4 الأجسام المضادة 1) 4 ، 4 . صور متعددة من أنماط الإسقاط محور عصبي المحرك في الأجنة ويلديب متاحة على شبكة الإنترنت 5 . يصف الجسم المضاد 1D4 جميع المحاور الحركية وثلاث كراسات محورية طولية على كل جانب من خط الوسط للجهاز العصبي المركزي الجنيني (نس) 4 ، 6 ( الشكل 1C والشكل 2A ). ولذلك، المناعية مع الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتحديد الجينات المطلوبة للاتصال العصبية والعضلية لإثبات الآليات الجزيئية الكامنة وراء التوجيه محور عصبي المحرك والاعتراف الهدف.
في كل من هيميسيغمينتس البطن A2-A7، ومحاور محور عصبي المشروع وفاسيكولاتي انتقائي إلى اثنين من فروع الأعصاب الرئيسية، والعصب القطعي (سن) والعصب بين الأوعية (إيسن) 2 ، 4 ، وفرع الأعصاب طفيفة، والعصب المستعرض (تن ) 7 . ويتحلل ال سن بشكل انتقائي ليؤدي إلى فرعين عصبيين يطلق عليهما سنا و شنك، في حين تنقسم إيسن إلى ثلاثة فروع عصبية تسمى إيسن و إيسنب و إيسند 2 ، 4 . من بينها، إيسن، إيسنب، و سنا محور عصبي المحركيتم تصور أنماط الإسقاط على وجه التحديد عندما تكون ملطخة المرحلة المتأخرة 16 الأجنة مع الأجسام المضادة فاسي ويتم فيليتد ( الشكل 1C والشكل 2A ). الخلايا العصبية الحركية إيسن تمتد محاورها إلى عضلات الظهرية العصبية 1، 2، 3، 4، 9، 10، 11، 18، 19، و 20 2 ، 4 ( الشكل 2A ). الخلايا العصبية الحركية إيسنب العصبية عضلات بطني 6 و 7 و 12 و 13 و 14 و 28 و 30 2 و 4 ( الشكل 2A و 2 B). مشاريع فرع العصب سنا لعضلات العضلات العصبية 5، 8، 21، 22، 23، و 24 2 ، 4 ( الشكل 2A ). تن، التي تتكون من محاور اثنين من المحركات، والمشاريع إبسيلاتيرالي على طول الحدود القطاعية إلى العضلات العصبية 25 ويجعل نقاط الاشتباك العصبي مع العصبية الشريان القطباني الجانبي الجانبي (لبد) فيمحيط 7 ( الشكل 2A ). هذه الأعصاب العضلات المستهدفة تتطلب ليس فقط التصفية انتقائية للمحاور الحركية في نقاط اختيار محددة، ولكن أيضا تستهدف التعرف على العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على بعض الخلايا المفترضة الأديم المتوسط الأديم التي تعمل كأهداف وسيطة في كل من مسارات إيسن و سنا، ولكن ليس على طول مسار إيسنب 4 . وهذا قد يوحي بأن إسنب المحرك محور عصبي يمكن تنظيمها بطريقة متميزة بالمقارنة مع إيسن و سنا التوجيه محور عصبي المحرك، وأنه يشير أيضا إلى أن التوجيه المحوري محور عصبي يوفر نموذج تجريبي جذابة لدراسة الأدوار التفاضلية أو الحفاظ على جديلة التوجيه واحد الجزيء 8 .
يقدم هذا العمل طريقة قياسية لتصور أنماط الإسقاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في ذبابة الفاكهة . وتشمل البروتوكولات وصفها كيفية تشريح الأجنة ثابتة ملطخة 1D4 أنتيبودي ومعالجتها في 3،3'-ديامينوبنزيدين (داب) للاستعدادات فيليه. واحدة من المزايا الحرجة للاستعدادات مسطحة من الأجنة الثابتة هو التصور أفضل من الإسقاطات محور عصبي وأنماط العضلات في المحيط. وعلاوة على ذلك، يظهر هذا العمل أيضا كيفية التركيب الوراثي الأجنة ثابتة لفرز الأجنة الطافرة المطلوب باستخدام طريقة تلطيخ لاش.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد
- إعداد 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس) مع t-أوكتيلفينوكسيبوليثوكسيثانول (بت) حل بإضافة 0.5 غرام من ألبومين المصل البقري (بسا) و 0.5 مل من تي أوكتيلفينوكسيبوليثوكسيثانول (انظر جدول المواد) إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني 1X والتحريك لمدة 30 دقيقة على الأقل. تخزين في 4 درجات مئوية. استخدام عندما جديدة نسبيا وتخزين الحل في زجاجة نظيفة.
- جعل 10 مل من بارافورمالدهيد 4٪ عن طريق إضافة 2.5 مل من 16٪ حل بارافورمالدهيد الأسهم و 1 مل من برنامج تلفزيوني 10X إلى 6.5 مل من الماء منزوع الأيونات. تخزين في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون أسبوع واحد.
تنبيه: تجنب ملامسة الجلد مع الحل بارافورمالدهيد لأنه سامة للغاية. - جعل X- غال الركيزة (10٪ ث / الخامس X- غال في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (دمسو)) عن طريق إذابة 0.1 غرام من الركيزة X- غال لكل 1 مل من دمسو. تخزين في -20 درجة مئوية في 100 قسامة ميكرولتر.
- جعل X- غال تلطيخ الحل باستخدام 10 ملي العازلة الفوسفات (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي مغكل 2 ، 3 ممك 4 [في (ن) 6 ]، 3 ملي ك 3 [فيي (ن) 6 ]، و 0.3٪ t-أوكتيلفينوكسيبوليثوكسيثانول. تخزين في 4 درجات مئوية في الظلام.
- جعل 3٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين عن طريق تمييع 30٪ من الأسهم بيروكسيد الهيدروجين 1:10 مع الماء منزوع الأيونات.
- جعل 3،3'-ديامينوبنزيدين (داب) الحل عن طريق حل تماما 1 قرص (10 ملغ) من داب في 35 مل من حل بت جديدة. تصفية من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون وتخزينها في -20 درجة مئوية في أليكوتس 910 ميكرولتر.
تنبيه: التخلص من جميع النفايات داب في التبييض لتدمير داب. - جعل لوحات البيض مع عصير التفاح. إضافة 35 غرام من أجار و 1 لتر من الماء منزوع الأيونات إلى قارورة 2 لتر. إضافة 33 غرام من السكروز، 2 غرام من تيغوسيبت، و 375 مل من عصير التفاح إلى 1- L قارورة. تذوب لهم عن طريق التعقيم لمدة 30 دقيقة. تسمح كلا الحلول لتبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية. الجمع بين وتخلط هذه الحلول بشكل جيد عن طريق التحريك. صب ~ 11 مل من الحل مجتمعة في 60 مم طبق الثقافة.
- جعل معجون الخميرة عن طريق مزج الخباز نعمست إلى الماء منزوع الأيونات (1: 0.8 نسبة) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. مجموعة الجنين (يوم 1)
- جمع الذباب الشابة والذكور (أقل من 5 أيام)، و لمدة 1-2 أيام، والحفاظ عليها في قفص كوب من البلاستيك مع لوحة البيض (60 مم × 15 ملم) التي تحتوي على كمية صغيرة من معجون الخميرة في المركز.
- للحصول على مجموعة الأمثل من أواخر مرحلة 16 الأجنة، وإنشاء قفص زجاجة مع الذباب (> 50) في حوالي 5 مساء والسماح لهم وضع البيض في 25 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- نقل الذباب إلى زجاجة الغذاء الطازج.
- إغلاق لوحة البيض مع غطاء واحتضان رأسا على عقب في 25 درجة مئوية في حاضنة ترطيب (~ 70٪ الرطوبة) بين عشية وضحاها.
3. إعداد الأجنة المناعية (يوم 2)
- إضافة 1.8 مل من حل بت إلى لوحة البيض في جميع أنحاء 10:20 صباحا واستخدام مسحة القطن لتخفيف الأجنة من لوحة في حين إمالة ذلك.
ملاحظة: بواسطة الهريس بلطف عجينة الخميرة باستخدام كوخعلى مسحة، حله في حالة العثور على عدد كبير من الأجنة على ذلك. تبدأ جمع الأجنة ~ 40 دقيقة قبل التثبيت (حوالي 11:00 صباحا). - نقل الأجنة من لوحة البيض إلى ميكروتوب 1.5 مل باستخدام تلميح ماصة 1 مل.
- السماح للأجنة لتسوية ونضح حل بت قدر الإمكان. شطف الأجنة مرتين مع 1 مل من حل بت. نضح حل بت قدر الإمكان.
- ملء أنبوب مع 1 مل من 50٪ التبييض ( أي المخفف في الماء منزوع الأيونات) و ديكوريونات الأجنة عن طريق احتضان لهم على نوتاتور لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (رت).
ملاحظة: هذه الخطوة لا يقتل الأجنة ديكوريوناتد. - السماح للأجنة ديكوريوناتد لتسوية، نضح التبييض 50٪ قدر الإمكان، وشطف الأجنة 3 مرات مع 1 مل من حل بت.
- إضافة 0.5 مل من هيبتان وبعد ذلك إضافة 0.5 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ إلى أنبوب في رت في حوالي 11:00 صباحا.
- احتضانالأجنة على نوتاتور لمدة 15 دقيقة في رت.
- إزالة الحل بارافورمالدهيد 4٪ (الطبقة السفلية).
- إضافة 0.5 مل من الميثانول 100٪ و ديفيتلينيز الأجنة عن طريق هز الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية.
- إزالة هيبتان ( أي، الطبقة العليا).
- إضافة 0.5 مل من الميثانول 100٪ ويهز الأنبوب بقوة لمدة 10 ثانية.
- السماح للأجنة لتسوية عن طريق التنصت على أنبوب ونضح الميثانول إلى أقصى حد ممكن. شطف الأجنة مع 1 مل من الميثانول 100٪، والهز لمدة تقل عن 10 ثانية.
ملاحظة: التعرض الموسعة للميثانول يدمر النشاط β غال. - إزالة الميثانول وشطف الأجنة ديفيتلينيزد 3 مرات مع 1 مل من حل بت.
4. التنميط الجيني الأجنة باستخدام تلوين لاش (يوم 2)
- إضافة 1 مل من حل بت إلى أنبوب واحتضان الأنبوب في كتلة حرارة 37 درجة مئوية أو حمام الماء لمدة 15 دقيقة.
- خلال الحضانة، مكان X- غال تلطيخ الحل (1 مل لكل تويكون) في 65 درجة مئوية في حمام مائي حتى يحصل غائم. احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- نضح حل بت وإضافة 1 مل من X- غال تلطيخ الحل و 20 ميكرولتر من الركيزة X- غال إلى الأنبوب.
- احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع نوتاتيون حتى راسب الأزرق هو واضح.
ملاحظة: الوقت الحضانة ل 2 و 3 أردي الأزرق موازين في عموما يتراوح 2-4 ح. - إزالة X- غال تلطيخ الحل وشطف الأجنة 3 مرات مع 1 مل من رت بت الحل.
- باستخدام التحقيق إبرة أو ملقط، ومن ناحية فرز الأجنة من النمط الوراثي المطلوب ( أي الأجنة البيضاء غير ملطخة) مع المجهر تشريح الضوء (أهداف 1.6X-2.5X).
ملاحظة: منذ بعض الموازين الزرقاء، مثل سيو، أكتين لاش و TM3، أكتين-لاتش ، تحمل بناء المعدلة وراثيا معربا عن البكتيرية β غال (لاز) تحت سيطرة المروج أكتين ، والأجنة الملون الأزرق في كل مكان تحتوي علىواحد أو نسختين من الكروموسومات الزرقاء الموازن. لذلك، الأجنة البيضاء غير الملطخة هي متماثل متماثلة للأليل المميت المطلوب.
5. إمونوستينينغ الأجنة مع أنتي-فاسكلين إي الأجسام المضادة (يوم 2-3)
- جمع ونقل الأجنة من النمط الوراثي المطلوب ( أي الأجنة البيضاء غير ملطخة) إلى ميكروتوب 0.5 مل باستخدام طرف ماصة 1 مل.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن أن تعقد الأجنة تقريبا وفقا للمعايير المورفولوجية، بما في ذلك أنماط تجزئة من بشرة وهياكل الرأس والذيل 9 . خلال ثورة الرأس، بين 10 و 16 ساعة بعد وضع البيض، والجنين يخضع لخفض واضح من الجزء الأمامي الأكثر 9 . - غسل الأجنة مرة واحدة مع 0.4 مل من محلول بت وإضافة 0.3 مل من حجب الحل (5٪ مصل الماعز الطبيعي و 5٪ دمسو في حل بت).
- منع الأجنة مع نوتاتيون في رت لمدة 15 دقيقة.
- غسل الأجنة 4 مرات مع 0.4 مل من حل بت لمدة 20 دقيقة على الأقل لكل غسل.
- إضافة 0.3 مل من عرقلة الحل (5٪ مصل الماعز الطبيعي في حل بت) التي تحتوي على الماعز المضادة للفأر-هرب الأجسام المضادة (2 ميكروغرام / مل) واحتضان الأنبوب مع نوتاتيون في رت بين عشية وضحاها.
- غسل الأجنة 6 مرات مع 0.4 مل من حل بت لمدة 20 دقيقة على الأقل في غسل.
- إضافة 0.3 مل من حل داب إلى الأنبوب.
تنبیھ: ارتد القفازات ووضع جمیع نفایات / أنابيب / داب في التبييض. - إضافة 2 ميكرولتر من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين واحتضان الأنبوب في الظلام مع نوتاتيون في رت حتى يتم إنتاج المبلغ المطلوب من راسب.
ملاحظة: الوقت الحضانة ل 1 D4 المناعية بشكل عام يتراوح من 0.5-1 h. - غسل الأجنة 4 مرات مع 0.4 مل من حل بت.
تنبيه: إزالة الحل داب وغسل الأولين مع ماصة وديخدش لهم في التبييض. - إضافة 0.2 مل من تركيب 70٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني الحل إلى الأنبوب وتخزينها في رت أو 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إبقاء الأنبوب بعيدا عن الضوء. يمكن الحصول على استعدادات أكثر وضوحا من خلال وضع الأجنة في الجلسرين 90٪ / برنامج تلفزيوني الحل 10 . ومع ذلك، فإنه من الصعب تشريح الأجنة تطهيرها في 90٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني الحل من تلك التي تم تطهيرها في 70٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني الحل 10 .
6. التدريج، تشريح، تصاعد، والتصوير الأجنة (يوم 4)
- ل التدريج، ونقل الأجنة معايرتها مع الجلسرين 70٪ / برنامج تلفزيوني على شريحة زجاجية.
- جمع أواخر المرحلة 16 الأجنة التي لها الجزء البطن 7 (A7)، A8، و A9 إيسن الأعصاب تتلاقى على اتصال بعضها البعض أو / ويكون ميدغوت التي تنقسم إلى ثلاثة نطاقات.
ملاحظة: الأجنة الملطخة الأجسام المضادة 1D4 يمكن أن تنظم على أساس أنماط الإسقاط من إيسن والمحاور إيسنب المحرك. بعد الخروج من الجهاز العصبي المركزي، A7، A8، و A9 إيسن نرف من أواخر المرحلة 16 الأجنة تتلمس لمسة بعضها البعض، وبعد ذلك تتباعد لتمتد بعيدا إلى العضلات الظهرية (رأس السهم في الشكل 1A ). في منتصف المرحلة 16 الأجنة، ومع ذلك، A7 إيسن الأعصاب تمتد بالتوازي مع A8 / A9 الأعصاب (قوس مربع في الشكل 1B ). وبالإضافة إلى ذلك، محاور الإسقاط من الأعصاب A6 إيسنب (عمودي على العضلات البطنية) في كل من هيميسيغمينتس يتم محاذاة تقريبا مع نهاية الخلفي من نس الكراسات محور عصبي طولية (السهام وخط في الشكل 1C ). هذه المعايير المورفولوجية تختلف إلى حد ما بين مختلف الأنماط الجينية. بدلا من ذلك، يمكن أن تنظم الأجنة على أساس مورفولوجيا الأمعاء 9 ، 11 . قبل المرحلة 17، و ميدغوت لديها شكل قلب مثل، في حين أن منتصف السنقسم إلى ثلاثة نطاقات حسب المرحلة 17 12 . - تشريح الأجنة.
- باستخدام 1 مL حقنة، نقل كل الجنين من قطرة الجلسرين ووضع الجنين بطني الوجه. قطع الجزء الأمامي في 1/4 من طول الجسم والمنطقة الأكثر الخلفي التي هي خالية من المحاور الحركية.
- باستخدام مسبار إبرة، نقل الجنين نهاية قطع من قطرة الجلسرين، لفة لتوجيه ذلك الظهرية الجانب حتى، ووضعه أفقيا في هذا المجال.
ملاحظة: عندما يتم نقل الجنين من انخفاض الجلسرين، قليلا من الجلسرين المرتبطة الجنين يجعلها لزجة. - قطع الجنين على طول خط الوسط الظهري باستخدام إبرة واحدة التنغستن غرامة جدا 13 . جعل قطع صغيرة في نهاية الخلفي من الجنين ومن ثم الاستمرار في خفض خط الوسط الظهري نحو الأمامي. وقطع في الاتجاه المعاكس هو أيضا على ما يرام.
- باستخدام مسبار الإبرة، نقل الجنين قطع خط الوسط في قطرة الجلسرين، ووضعه الجانب الظهرية، وفصل الأمعاء من جدار الجسم من خلال تتكشف كل جدار الجسم في اتجاه بطني (قطري) (2).5X الهدف).
ملاحظة: تأكد من أن خط الوسط الظهرية هو قطع تماما، مما أدى إلى الفصل الكامل بين جدران الجسم اليسار واليمين. - نقل بعناية الجنين قطع خط الوسط من قطرة الجلسرين ثم وضع اثنين من اللوحات من جدار الجسم أسفل على الشريحة الزجاجية باستخدام التحقيق إبرة غرامة (2.5X الهدف).
- باستخدام إبرة التنغستن غرامة جدا، وإزالة الأعضاء الداخلية من الجنين تشريح عن طريق دفع لهم أفقيا (5X الهدف).
ملاحظة: وصف أكثر تفصيلا لإجراء تشريح مماثل آخر يمكن العثور على الموقع 5 .
- لتركيب، إضافة 2-3 ميكرولتر من الجلسرين 70٪ / برنامج تلفزيوني الحل لتنظيف والأجنة تشريح و، وذلك باستخدام التحقيق إبرة غرامة، ونقلها إلى شريحة زجاجية جديدة على 8 ميكرولتر من 70٪ الجلسرين / حل برنامج تلفزيوني قد انتشر في المركز (2.5X الهدف).
- وضع على ساترة (18 مم × 18 ملم). ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر العادية (إماواضحة أو ملونة على ما يرام).
- التقاط الصور بدقة عالية (20X، 40X، و 63 X أهداف الغمر النفط) تحت تباين تدخل تباين (ديك) ضوء المجهر، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: أفضل التصور والتوصيف المظهري، وخاصة بالنسبة للمحاور محور إيسنب، يمكن أن تنتج باستخدام 63X الهدف الغمر النفط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اتصالات دقيقة بين محاور المحرك والعضلات المستهدفة خلال التنمية العصبية تعتمد على انتقائي محوار عصبي محور التنافر والاعتراف الهدف في نقاط اختيار محددة 4 . في ذبابة الفاكهة ، يندرج التنافر الانتقائي بين المحاور الحركية في جزء من العمل المشترك من الصف 1 و 2 سيمافورينز (سيماس)، بما في ذلك سيما-1A، سيما-2A، و سيما-2b 8 و 14 و 15 و 16 و 17 و 18 . لذلك، وفقدان وظيفة سيما-1 a كثيرا ما يؤدي إلى فشل محاور إيسنب إلى ديفسيكولات في نقاط اختيار محددة، مما تسبب لهم لعرض مورفولوجيا سميكة بشكل غير طبيعي (رأس السهم في الشكل 2C ). في الأجنة ويلديب، على الأقل 7 الخلايا العصبية الحركية تمتد و فاسيكولات محاورها لتشكيل Iفرع العصب البنك المركزي السويسري ( الشكل 2A ). عندما يصل فرع العصب إسنب نقطة الاختيار، والذي يقع بين العضلات 6 و 7، محاور اثنين ديفاسيكلات انتقائي من حزمة إيسنب الرئيسي وبعد ذلك عضلات العصبية 6 و 7 ( الشكل 2B ). في نقطة الاختيار التالية، والذي يقع بين العضلات 6، 13، و 30، ثلاثة محاور أخرى المحرك ديفاسيكولات انتقائي للعضلات الأعصاب 13 و 14 و 30 ( الشكل 2B ). محاور اثنين المتبقية تمتد ظهريا للوصول إلى نقطة الاختيار الأخيرة بالقرب من حافة العضلات 12، وبالتالي عرقلة العضلات 12 في الاتجاه المعاكس ( الشكل 2B ). هذه النتائج تظهر بوضوح أن بروتوكول إعداد فيليه يوفر أداة مفيدة لدراسة الجينات المطلوبة لتوجيه محور عصبي الحركية.
الشكل 2: أنماط الإسقاط محور محوري في البرية من نوع و سيما-1 a الأجنة متحولة. ( A - C ) إعداد فيليت من أواخر الأجنة المرحلة 16 ملطخة الأجسام المضادة فاسي. الأمامي هو اليسار والبطني هو أسفل. المخططات التخطيطية التي تبين أنماط الإسقاط محور عصبي ممثلة في كل لوحة. الحانات مقياس = 15 ميكرون. ( A ) صورة حقل مشرق من اثنين هيميسيغمينتس البطن متتابعة، A3 و A4، في الأجنة ويلديب. ثلاث حزم محور عصبي متماثل ثنائيا موجودة في الجهاز العصبي المركزي. يشار إلى أنماط التعصيب العادية من إسنب، سنا، إيسن، و تن محاور عصبية من قبل الصناديق والسهم في المحيط. أما الخلايا العصبية ثنائية القطب الثنائي القطب (لبد)، التي تعصب العضلات العضلية، فهي إنديكاتمحرر بواسطة رأس السهم. في الرسم التخطيطي، وتقدم فروع العصب وأنماط التعصيب من إيسنب (باللون البني)، سنا (باللون الأزرق)، إيسن (باللون الأخضر)، و تن (باللون الأصفر) الخلايا العصبية الحركية والعضلات المستهدفة. وتظهر أيضا مواقع الجسم الخلية من هذه الخلايا العصبية الحركية في الجهاز العصبي المركزي في ألوانها الخاصة. ( B ) في الأجنة ويلديب، ومشروع محاور إسنب للعضلات البطنية، والتي هي مرقمة، وتعصيبهم عند نقاط اختيار محددة (السهام في صورة مدينة دبي للإنترنت). ( C ) في سيما-1 a المسوخ فقدان وظيفة، محاور إسنب كثيرا ما تفشل في ديفيسكولات من بعضها البعض بين العضلات 6 و 13 (رأس السهم في صورة مدينة دبي للإنترنت). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تسجيل تفاصيل عيوب التوجيه محور عصبي المحرك بشكل أسرع ومع دقة أفضل من قبل إعداد شرائح من الأجنة الملطخة داب من المسح الضوئي المجهري متحد البؤر الليزر من تلك المسمى فلورزنتلي. ولذلك، فإن إعداد شرائح من الأجنة الثابتة و 1 D4 الملون هو الأنسب لتوصيف وظيفي للجزيئات جديلة التوجيه. أربع فئات رئيسية من العظة الإرشاد، بما في ذلك النترينات، الشقوق، سيمافورينز (سيماس)، والإفرين، والمستقبلات المشابهة لها قد حافظت على الأدوار التطورية عبر الديدان والذباب والفقاريات 20 . بين جزيئات الأسرة (روبو) التي تعمل كمستقبلات للشقوق، تم تحديد ذبابة الفاكهة روبو لأول مرة للتوسط وظيفة التوجيه الثائرة في الجهاز العصبي المركزي 6 ، 21 . سيماس هي عائلة كبيرة من جزيئات التوجيه التي ترتبط بمجمعات مستقبلات تحتوي على بليكسين 22 . وظيفة التوجيه محور عصبي من سيماستم اكتشاف أول مرة في جندب نس 14 . وفي وقت لاحق، وقد تم وصف الطبقة 1 غشاء سيمافورين سيما-1A على نطاق واسع في ذبابة الفاكهة . سيما-1a، الذي يعمل ليس فقط كما يجند لبليكسين A، ولكن أيضا كمستقبل ليجند غير معروف، يلعب دورا هاما في التنافر محور عصبي محاور في نقاط اختيار محددة خلال التطور العصبي الجنينية 15 و 16 و 17 و 18 ( 18 ) الشكل 2C ).
هناك بعض خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة التي قد تحدث مع البروتوكول الحالي. أولا، في الخطوات 3.9-3.13، يمكن ديفيتلينيزد الأجنة مع كفاءة منخفضة إذا تم استخدام العديد من الأجنة أو صغيرة جدا في الإجراء ديفيتلينيزاتيون الميثانول. في هذه الحالة، فمن المستحسن استخدام حجم السرير من 40-80 ميكرولتر من الأجنة الثابتة ل ديفيتلينيزاتيون في الخطوة 3.5. ثانيا، في ستيبس 3.9-3.13، ضعيفة تلطيخ X- غال يمكن أن يحدث في حالة التعرض لفترة أطول للميثانول أو إزالة هبتان غير مكتملة، منذ الميثانول المستخدمة كما تثبيتي يدمر نشاط β غال. في هذه الحالة، فمن الأفضل أن يتم إجراء ديفيتلينيزاتيون باستخدام الميثانول في الخطوات 3.9-3.13 في أسرع وقت ممكن. وبالإضافة إلى ذلك، هبتان المتبقية التي هو ذوبان في الميثانول قد تتداخل مع تلطيخ. وبالتالي، فمن الأفضل لإزالة أكبر قدر ممكن من الميثانول في الخطوات 3.11-3.13.
يمكن تطبيق بروتوكول إعداد فيليه الحالي لفقدان وظيفة والوظائف من الحصول على وظيفة الجينات الوراثية لتحديد الجينات الجديدة التي تشارك في الحركي محور المسار والتعرف على الهدف. ومع ذلك، فإن عيب هذا البروتوكول هو أنه يستهلك وقتا طويلا جدا لتشريح الأجنة ثابتة لتوليد الاستعدادات فيليه. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن رصد توصيف المظهري للإسقاطات محور عصبي في إعداد جبل كامل من 1D4 ملطخةريوس، على الرغم من أن هذا الأسلوب يوفر التصور منخفضة الدقة من إسقاطات محور عصبي في المحيط. ومع ذلك، وقد ثبت بروتوكول إعداد كامل جبل ليكون نهجا فعالا للفحص الجينات التوجيه محور عصبي 4 . تم تطوير بروتوكول بديل باستخدام تشريح الحية من الأجنة فلورزنتلي المسمى مؤخرا للفحص المنهجي 11 . بروتوكول تشريح الحية يسمح لإعداد سريع نسبيا للتحليل المظهري 11 . ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول ليست كافية للأجنة أقدم من بداية المرحلة 17 11 .
بروتوكول تحضير فيليه وصفها هنا يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير البروتين مع الأجسام المضادة المختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا على الأجنة ذبابة الفاكهة في مراحل مختلفة من التنمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحب البلاغ أنه ليس لديه مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
أشكر أليكس L. كولودكين، كما تعلمت هذا البروتوكول إعداد فيليه مختبره. وأود أيضا أن أشكر الشباب جي هونغ للمساعدة التقنية. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل جبهة الخلاص الوطني 2013R1A1A4A01011329 (سج).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from: http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
