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Genetics

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

乳腺上皮細胞での細胞の概日リズムを決定するための in vitro生物発光アッセイが表示されます。このメソッドは、期間 2遺伝子プロモーターの制御下で不安定化ルシフェラーゼを表現する哺乳類の細胞レポーターのプラスミッドを利用しています。それは、臓器特異概日リズムに及ぼす影響を評価する他の細胞型に適応できます。

Abstract

概日リズムは動作をスリープ状態に遺伝子発現に至る生物学的プロセスを調節する基本的な生理学的なプロセスすべての生物に存在します。脊椎動物の概日リズムは、視交叉上核 (SCN; 中央ペース メーカー) とほとんどの末梢組織を構成する個々 の細胞の両方で機能する分子の発振器によって制御されます。もっと重要なは、夜の光、環境ストレスや有害物質への暴露によって概日リズムの障害は老化や慢性疾患のリスクの増加に関連付けられています。中央および/または末梢の体内時計を乱すことができるエージェントと概日リズムの中断の影響を軽減または悪意のあるエージェントを識別する機能の慢性的な病気の予防にとって重要な意義があります。齧歯動物モデルは、エクスポー ジャーとは、誘導や概日リズムの混乱を防止または軽減するためのエージェントを識別するために使用できますが、これらの実験は動物の数が多い必要があります。In vivo研究も膨大なリソースとインフラストラクチャを必要とする、すべての夜を動作するように研究者を必要とします。したがって、必要がある緊急システム適切な培養細胞型の体内の内分泌攪乱と細胞の種類のエンハンサーは、画面をさまざまな臓器や病気の状態から。真核生物細胞を人間の期間 2の遺伝子のプロモーターの制御下のドライブの不安定化ルシフェラーゼ転写ベクターを構築しました。この概記者構築された人間の乳腺上皮細胞に安定発現し、概応答レポーター細胞の in vitro生物発光アッセイを開発しました。確立およびアッセイを検証する詳細なプロトコルを紹介します。我々 はさらに細胞の生物学的時計の様々 な化学物質の生体内で効果を要約する私達の in vitroアッセイの能力を示す概念実験の証拠の詳細を提供します。示唆されたアッセイが攪乱と概日時計の化学予防剤の両方の画面に携帯各種に対応できます。

Introduction

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体内時計を調節する様々 な疫学約 24 時間の周期性と予測可能なリズムでの動作をスリープ状態に遺伝子の日周発現から生物学的プロセスの研究は強くお勧め概の慢性混乱リズムは、乳房とシフト労働者、看護師、フライト クルー1,2,3などの前立腺癌のリスクを増加させます。これらの調査結果は、齧歯類での試験、時差ぼけ増加腫瘍発生を模倣し、腫瘍成長4,5を加速する一定の光、夜の光、または光サイクルへの暴露を示す裏付け。シフト勤務は、2010年6で考えられるヒト発がん性物質 (2 a) として人間と齧歯動物の研究からのデータに基づき、国際がん研究機関を分類します。

以前は、実証したNニトロソ乳腺腫瘍特定発癌物質の発癌性単回投与-モノメチルウレア (NMU)、中断 (CGs) (例えば期間 2 主要な概日遺伝子の概日式Per2) いくつか概日リズム制御遺伝子 (CCGs) を含む主な DNA 損傷応答、(武装) 遺伝子ターゲット乳腺 (が肝臓ではなく) を修復します。また、食事Lの化学予防療法によって通常に向かってPer2と武装の遺伝子の概日発現をリセット-メチル-セレノシステイン (MSC) は腫瘍の発生率を 63% 減します。これらの調査結果は、概日リズム、化学発がんの化学予防7,8の機構のリンクを表示する最初でした。概日遺伝子式体内を混乱させる示されているその他の環境有害物質への暴露は、環境の病気9,10のリスクの増加に関連付けられています。環境有害物質と病態によって概日リズムの混乱をリンク機構の解明は予防する機械論的手法に可能性があります。ただし、エクスポー ジャー間の相互作用を定義することを目的とした研究と、概日リズムが行われる体内。24 または 48 時間の期間にわたってすべての 3-4 h を収集する一般的な生体内の実験調査概日リズムへの影響から、少なくとも 3 つの組織のコントロールなど、3 つの公開されている動物がある必要があります動物の大規模な番号が必要です。体内観察とメカニズムを繰り返す検証培養システムの開発したがって、必要な動物の数を減らすだけでなく、実験費用、要件も大幅に削減します。研究者は、24-48 時間にわたって継続的に動作します。さらに、検証済みの in vitroシステムは、化合物や概日リズムや環境ストレスや有害物質への応答に影響を与える遺伝の変化の高スループット スクリーニングをされる可能性があります。したがって、異なる焦点を持つさまざまな洞察を得るための in vitroin vivoのモデルと実験の戦略的な組み合わせが必要です。

哺乳類のサーカディアン振動子集団存在、SCN の専門にされた神経細胞のみならずほとんどの末梢細胞の種類。これらの分子時計は胚または大人動物から確立された線維芽細胞株では主線維芽細胞に似ています。しかし、組織の種類に固有の細胞モデル11の必要性があります。その結果、自発運動は体内SCN の従来の調査の前のヴィヴォ、外植体し、不死化線維芽細胞の生体外の細胞ベースのアッセイは広く細胞自律的概欠陥を研究します。培養線維芽細胞セルベースのアッセイが概日リズム機構を再現することができますを示す証拠はないし、その他末梢臓器体内の細胞に存在する応答します。異なる種類の細胞は、遺伝子発現、代謝、および、武装の異なるパターンを持つことができ、毒性と体内の遺伝子発現との間のリンクは、携帯型特定および/または異なる生理学的パラメーターで変調します。さらに、レスポンス環境有害物質、ストレスと病気の発症と予防のメカニズムへの暴露にリンク予防薬の線維芽細胞系における概日振動子が完全に評価されていません。従って、安易な検証されたセルの種類によって異なります、器官特定概攪乱を研究する生物発光アッセイ培養の必要性があります。さまざまな細胞時計モデル (例えば肝臓、ケラチノ サイト、脂肪細胞と骨肉腫セルラインで) が開発されて近年12,13,14,15、ここで説明アッセイは、乳腺上皮細胞や体内環境ストレス、有害物質、薬物、および化学予防薬への応答を要約する最初のデモンストレーションの最初の細胞時計モデルです。

Renilla ルシフェラーゼ (rLuc)、ホタルのルシフェラーゼ酵素反応処理翻訳は必要ありません、翻訳時にすぐに遺伝的記者として機能することができます 30 61 kDa の単量体蛋白質。基板に関連付けますルシフェラーゼ酵素、触媒化学反応光のフラッシュを生成します。したがって、ルシフェラーゼの構造は、遺伝子発現レポーター システムの in vitroおよびin vivoとして広く使用されます。ただし、概日リズムの研究、ルシフェラーゼ レポーターのユーティリティのルシフェラーゼ蛋白質の比較的長い半減期によって制限されます (T1/2 = 3.68 h) 概日遺伝子の変化を (短い期間) に特に期間を基準にして式です。しかし、長年にわたって多くの研究では、急速分解性ルシフェラーゼができないよう特に長い期間とリズムのための概日リズムを報告するために必要なことを示す pGL3 のベクトルのルシフェラーゼ遺伝子を使用している正常に24 h。そのため、不安定化ルシフェラーゼ ベクトルを用いた記者プラスミド、pGL [Luc2P/Neo] hPEST (タンパク質の不安定化シーケンス) が含まれている、開発されている私たち私たちの現在体外の概記者ベクトルとしてそれを使用することができます。生物発光アッセイ。Luc2Pによって符号化される蛋白質は短い半減期 (T1/2 = 0.84 h) したがってより迅速かつより大きさを野生型よりも転写活性の変化に応答と私それがすることができます ndicating リズミカルなリアルタイム16で正確にPER2プロモーターによって規制ルシフェラーゼ発現を監視するために使用します。

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Protocol

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1 ベクターの構築 PER2 プロモーター駆動不安定ルシフェラーゼ レポーター

  1. を購入、カスタマイズされた pLS [hPER2P/rLuc/Puro] rLuc と人間の cDNA を含むベクター。PER2 プロモーター断片 (hPER2P、941 bp) の間サイトで私と ハインド 複数クローン地域 17 III
  2. 人間 PER2 プロモーター断片をカット (hPER2P、941 bp) ベクトルから
    1. 追加 2.5 μ L 制限酵素バッファー、10 μ L (180 ng) pLS [hPER2P/rLuc/Puro] ベクトル、および制限の酵素、Sac の 1 μ I (10 ユニット/μ L) とハインド III (10 ユニット/μ L)、DNA ・ RNA/ヌクレオチド フリーに遠心チューブ。ピペッティングで優しく純水 (10.5 μ L) 最大 25 μ L とミックスを追加します
    2. 加熱ブロックで 90 分の 37 ° C に加温します
    3. は 0.0001% 臭化エチジウム ベクトルから、hPER2P を分離する (EtBr) を含む 0.7% アガロースゲルに制限酵素反応のボリューム全体 (25 μ L) を実行します
      。 注: EtBr、3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium 臭化物 (CAS 登録番号: 1239-45-8)、無臭の赤い液体です。これは一般蛍光は agarose のゲルの電気泳動の (酸核酸染色) をタグとして使用、UV 光の下でオレンジ色として目に見えるデュアルインターカレーションのエージェントです。不可逆的な突然変異誘発の可能性のあるリスクは、 18 の発癌物質として分類規制機関のどれもが実験動物で発生しています。したがって、化学物質の危険廃棄物として EtBr を含む使用される agarose ゲル法と電気泳動バッファーを収集し、ラトガース大学の環境衛生を要求 & 安全性 (REHS) をピックアップし、安全に処分します
    4. 941 に EtBr 蛍光バンドを含んでいるゲルの部分をカット、bp 波長 260 nm で分光光度計で吸収濃度 (OD) を測定することによって定量化が続く DNA ゲルの抽出キットをゲルから hPER2P フラグメントを浄化と
  3. 不安定ホタルのルシフェラーゼ発現ベクター、pGL のリニア化 1.0 μ L (1 μ g) [Luc2P/ネオ] ステップ 1.2.1-1.2.2 に記載されていると同じ方法で。分光光度計を使用して上記のように定量化が続く DNA のクリーン アップ キットとベクトルを抽出します
  4. 一直線に並べられたベクトル pGL に、hPER2P を縛る [Luc2P/ネオ].
    注: 製造元ごと ' s 命令、挿入およびベクトルの理想的なモル比は 2:1。23.6 として 50 ng のベクター、挿入の理想的な量を計算式は、[(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb ベクトルと ng] (2/1) x = 23.6 ng 挿入]。HPER2P の濃度に基づく (7.26 ng/μ L) と pGL [Luc2P/ネオ] (50 ng/μ L)、50 ng pGL のボリューム [Luc2P/ネオ]、23.6 ng hPER2P が 1 μ L と 3.26 μ L、それぞれ計算されます。
    1. 追加 2 μ L T4 DNA リガーゼ反応 (10 X) をバッファーは、(50 mM トリス塩酸、10 mM MgCl 2 ATP、1 mM と 10 mM DTT) 3.26 μ L (23.6 ng) hPER2P、1 μ L (50 ng) pGL [Luc2P/ネオ]、13.74 μ L の水に 20 μ L と、優しく混ぜる。
    2. 1 μ L T4 DNA リガーゼ (400 単位/μ L) を追加、穏やかに混合し、16 ° c、たちで一晩インキュベート、結紮ベクトル、メーカーごとの氷の上でリラックスし ' s 命令
  5. 結紮ベクトル pGL を変換 [hPer2P/Luc2P/ネオ] 化学的に有能な エシェリヒア属大腸菌 19
    1. は、42 ° C、カタボライト抑制 (まで) 媒体でウォーム アップ スーパー最適なスープで風呂の水を設定 (2% トリプトン、0.5% 酵母エキス、10 mM の NaCl、KCl 2.5 mM、10 mM MgCl 2、10 mM MgSO 4 と 20 mM グルコース) 室温で、37 ° C のインキュベーターでルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培地プレート (IPTG 0.5 μ M、80 μ g/mL、X gal 100 μ g/mL アンピシリンを含む) をウォーム アップし、氷の上を解凍変換ごとに 1 バイアル有能な エシェリヒア属大腸菌 のセルします。
    2. 追加 6 μ L (21 ng) ベクトルまたは 1 μ L を結紮 (30 ng) 空のベクトル (マイナス コントロール) 化学的に有能な エシェリヒア属大腸菌 (50 μ L) の 1 つのチューブにし、優しくミックス チューブを反転します。氷上で 30 分間インキュベート
    3. 30 の 42 ° C の水浴の衝撃を熱を振ることがなく、氷に戻り s
  6. ブルー/ホワイト スクリーニングを使用して結紮ベクターで形質転換 大腸菌 コロニーを選択
    1. 追加の 250 μ L まで媒体変換された エシェリヒア属大腸菌 のチューブし、200 rpm で振とうしながら 37 ° C で 1 時間インキュベートします
    2. は、LB 寒天培地プレートの表面に変換された エシェリヒア属大腸菌 の 10-50 μ L を均等に 。一晩 37 ° C の定温器に逆さま皿を置く
      。 メモ: 効率的なクローニング反応いくつかの百の植民地を生成する必要があります。大きな、オフ白や青い色とよく間隔をあけられた植民地を少なくとも 1 つプレートがあることを確認するは、2 つの異なるボリュームをめっきすることをお勧めします。植民地が小さすぎると、色は見分けがつかない (10 X 50 X) 顕微鏡を使用する便利です
    3. 3 6 滅菌歯棒で板から白人の植民地をピックアップし、4 mL の LB 培地 50 μ G/ml アンピシリンとを含む 1 つの文化の管に各植民地を解放します
    4. では、37 ° C で一晩 200 rpm で振とうしながらチューブを孵化させなさい。4 mL の 2 mL を使用して DNA を抽出、プラスミド DNA 抽出ミニ準備キット、メーカーごとに 大腸菌 を培養した ' s 命令
  7. 確認および挿入を分析 (hPER2P、941 bp)
    1. 制限の酵素が付いているプラスミッド DNA を消化し、挿入があるかを確認するための手順 1.2.1-1.2.3 で説明されているように電気泳動を実行します
      。 注: 肯定的な制御 (hPER2P 1.2.4 のステップで精製) ネガティブ コントロール (大腸菌 を空のベクターに変換) が含まれていたとします
    2. の向きとプラスミド 19 の挿入のシーケンスを確認する M13 前方および逆の M13 プライマーを使用して選択したプラスミッド DNA のシーケンスします
      。 注: 電気泳動法と正しい方向に hPER2P とシーケンスの結果のシーケンスの正しいサイズで挿入があった 1 つだけのコロニーを選択した
    3. 人間 PER2 プロモーター断片を分析 (hPER2P、941 bp) シーケンス、概規制などの要素を E-ボックス モチーフ (Bmal1 の結合部位、猫/CGTG)、CCAATC、GC ボックスと転写開始サイト (CAGCGG) 20.
  8. を追加して選択した 大腸菌 残り 2 mL 200 mL の LB 培地 50 μ G/ml のアンピシリンを含むと 200 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩抱卵に 大腸菌 を培養増幅します
  9. 抽出 DNA プラスミドのエンドトキシン maxi 準備キット製造元 ' s 命令と、分光光度計で波長 260 nm で外径を測定することにより定量します。因数とストア プラスミド DNA、pGL [hPer2P/Luc2P/ネオ] は、将来使用するため-80 ° C のフリーザーで

2。トランスフェクション

  1. 購入 MCF10A 細胞の培養と
    1. 購入商業から不死化、非変形正常ひと乳腺上皮細胞線 (MCF10A) セル ・ バンク、細胞が細胞遺伝学的にはテストおよび認証済みと短いタンデムは、凍結前に分析を繰り返します。解凍し、冷凍最大 8 週間の培養細胞の各バイアルを維持します
      。 注: 他の細胞とは異なりこれらの細胞がある接触阻止合流 〜 70% になったらそれはそのサブカルチャー ~ 70% で行われている必要があります
    2. 乳腺上皮基礎培地 (MEBM)、成長サプリメントと 37 ° C、湿度 95%、および 5% CO 2 で細胞文化のインキュベーターでコレラ毒素を含む乳腺上皮細胞成長培地 (MEGM) の細胞の培養します
      。 注: SingleQuot (SQ) を提供する準備ができて成長因子を購入し、コレラ毒素を個別に入手します。成長サプリメントの最終濃度が 0.4% ウシ脳下垂体抽出物、インスリン 0.1%、0.1% ヒドロコルチゾン、0.1% 人間の表皮の成長因子、100 ng/mL コレラ毒素と 0.05% ゲンタマイシン硫酸塩、0.05% アムホテリシン b.
    3. 10 mL のトリプシン/EDTA と孵化によって 10 cm 培養皿の細胞を切り離して考える 〜 20 分 10 mL のトリプシン中和ソリューションを追加することによって、トリプシンを中和します。収集すべてのセル HEPES バッファー食塩 (HBSS).
    4. 倒立顕微鏡下で検定とセルをカウント単細胞浮遊液の濃度を計算して必要な細胞数をシードします。各板の細胞の均一な分布を得る徹底的にプレートを旋回します。37 ° C、湿度 95%、および 5% CO 2 で細胞文化のインキュベーターでセルをインキュベートします
      。 注: 使用する HBSS、トリプシン中和溶液/トリプシン EDTA を含むサブカルチャー試薬パックを購入
  2. 概ベクター構築と細胞のトランスフェクション
    1. 35 mm 文化全体に均一に種子 2 x 10 5 MCF10A 細胞 MEGM 皿し、20-30% コンフルエント (次の日) までに増殖します
    2. 。 減少を暖かい
    3. 血清メディア (例えば、オプティ MEM) 30 分間室温で 37 ° C 水のお風呂、トランスフェクション試薬の希釈プラスミド DNA 構築 (pGL [hPer2P/Luc2P/ネオ]) 遠藤毒素無料 30 ng/μ L に室温でトリス EDTA (TE) バッファーし
    4. は、最初、63.6 μ L 暖かい低下した血清中のメディアを追加し、33.4 μ L (0.1 μ g) プラスミド DNA を追加 1.5 mL 遠心チューブにプラスミド トランスフェクション混合物を準備し、軽くピペッティングして最後にトランスフェクションの 3 μ L を追加して、ミックス壁に触れることがなくチューブの中心に直接試薬です。軽くピペッティングして混合後 30 分の室温で維持
    5. は、プレートの媒体の中心表面に直接全プラスミドの混合物 (100 μ L) をドロップし、皿を揺することによって優しく混ぜます。追加 48 72 のための CO 2 インキュベーターで培養
      注: それはだろうと予言した最高のトランスフェクション効率の接触阻害によりこれらの細胞の 40-70% 合流で 〜 70%。そのため、トランスフェクションの作品で最高の出発点 ~ 20% との分岐点 ~ 70% 合流

3。一過性トランスフェクション MCF10A 細胞の 体外 生物発光アッセイの確立

  1. MEBM 24 時間の成長因子なしで (後でトランスフェクション 48-72 時間) ~ 70% 合流で培養細胞が餓死
  2. の同期エージェント (例えば 50% の馬の血清 (HS)) MEBM の CO 2 インキュベーターで 1.5 h で細胞を治療します
    。 注: 理想的な同期エージェント、10 μ M フォルスコリン、1 nM メラトニン、0.1 μ M デキサメタゾン、50 %hs、および 100% の選択のため SQ 比べると概日リズムの振幅と周期の観点から概日リズム ベクトル transfected セル。空のベクターが transfected セルは 100% 扱われる陰性対照として SQ.
  3. Pre-prepare 20 mL 記録媒体を (30 mm 培養皿の 10) MEGM 5 mL、15 mL MEBM、150 μ L の重炭酸ナトリウム、HEPES、200 μ L、40 μ L ルシフェリンを追加することによって貯蔵液 (50 mM) 50 mL の滅菌遠心管中です
    。 注: 各コンポーネントの最終濃度: 20 %sq と 20 ng/mL コレラ毒素、重炭酸ナトリウム 0.06%、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPES。事前に用意された記録媒体、37 ° C の水浴中で 30 分間 1x PBS を滅菌したウォーム アップ。使用直前に 100 μ M ルシフェリンを追加します
  4. 洗浄暖かい 1 セル ダルベッコ x ' 3 s Phosphate-Buffered 生理食塩水 (D-PBS) 同期エージェントと孵化後回し、2 mL の記録媒体を追加します
  5. 蒸発を防ぎ側にラベルを貼りますシリコン グリスを使用して滅菌カバー クラスで料理をシールします
  6. ルミノ中、席に封印された皿を置き、フォルダーにファイルの場所を保存するためのオプションを有効に (詳細は、セクション 6 を参照してください).

4。安定にトランスフェクト細胞の選択

  1. 製造業者に従って殺す曲線分析による理想的な G418 濃度 (800 μ g/mL) の最適化 ' 固定して transfected セルの選択の s 命令
  2. 48 時間または 72 時間の一過性トランスフェクション後サブカルチャーと種子 5,000 で大きい料理で MEGM と細胞細胞/料理 (100 mm)。24 h 後 (37 ° C、湿度 95% と 5% CO 2) 細胞文化のインキュベーターで培養は古い媒体を 2 週間ごとに 3-4 日 800 μ g/mL G418 を含む新しい媒体に置き換えることによって 800 μ g/ml の G418 の細胞を扱う
  3. 安定的存続サブカルチャー MEGM 500µg/mL hPer2P/Luc2P の安定した表現を維持し、将来使用するための液体窒素の中で凍結 G418 を含む 1-3 通路のコロニーをトランスフェクトした
  4. 生物発光アッセイ の in vitro の結果に生物発光強度は、多くの通路で使用した後徐々 に低くなる場合、再固定して transfected セル数を選択する一般的な継代後 500µg/mL G418 を扱う

5。化学物質による治療

  1. で 48 時間または 72 時間後トランスフェクション 24 時間の MEBM の成長因子から細胞を飢えさせる
  2. 50% との同期後 2 h の HS 0.25 mM または 0.5 mM nitrosomethylurea (NMU)、20 nM EX527、または 1 μ M cambinol 1 h で 20% を含む MEBM のために細胞を扱う平方
  3. 1 で洗浄後、D PBS x 単独で、または 20 nM EX527 またはセルに、1 μ M の cambinol との組み合わせで中含まれている 12.5 μ M MSC の記録を追加。ルミノで生物発光を監視します
  4. 治療固定して transfected MCF10A/PER2-NMU を 0.5、1、または 2 mM、40 nm EX527 または 2.0 μ M、50% との同期後 1 時間で Cambinol dLuc セル HS、記録媒体 MSC 含む 12.5 μ M で細胞をインキュベーションしてとまたは n-アセチルシステイン (NAC) の異なる用量 (5、10、または 20 μ M)。ルミノ、レコードのプレートを置き、セクション 3.6 で説明されているように 4-8 日のルミノ メーターで生物発光を保存します
    。 注: NMU はメチル化されたニトロソウレア、発がん性、変異原性、催奇形性のプロパティを持つ化合物です。NMU 直行型のアルキル化剤は、半減期が短い (T 1/2 = ~ 30 分)。それは酸性条件下 (pH 4 〜 5) がアルカリ条件 (pH 9-10) と 20 ° C を超える温度で不安定で安定してクリーニング ベンチ サーフェスおよび NMU ソリューションで汚染された可能性のあるラボ用品の効率的な非アクティブ化エージェントとして 10% の漂白剤を使用できますしたがって、上。残り原液は、ピックアップと REHS によって安全に破棄します。化学物質の作用のモードに基づいて、記録媒体で培養する前に短い時間のため同期セルを扱うことができます。細胞は、長い時間 (数日間) 記録媒体でまた治療できる

6。データの収集、分析、およびプレゼンテーション

注: セル実行可能性は示された同じ時代の同じ濃度で細胞の治療後を標準的な方法 (例えば MTT の試金) を使用して特定する必要があります。体外 の生物発光法で使用されるすべての治療濃度は 30% 致死濃度 (LC30) より低かった。3 通すべての実験を実施し、代表の結果が発表されました

  1. 皿 (ステップ 3.5) をシール後 37 ° C H 2 O および CO 2、なしに設定し、コンピューターに接続されているインキュベーター中保たれるルミノの席の上に料理をロードします
  2. クリック " 保存 " フォルダーおよび対応する皿から記録された発光信号を保存するファイルの名前を入力します
    。 注: システムで発光信号が検出される個々 の位置で皿に細胞からリアルタイム。信号の 4 光子計数光電子増倍管を使用してコンピューターに転送し保存され、データ収集ソフトウェアによってコンピューターに表示されます
  3. は続いて中型の変更や必要に応じて、第 2 週の連続記録が表示されることができる 4-7 日の録音後、信号を解析します
    。 注: 取得に概パラメーター、フェーズ、期間の長さ、リズムの振幅減衰率など使用してルミノ解析ソフト発光データを分析する
  4. 実行中の平均と raw データを detrend し、分析期間、位相、振幅、および減衰率 21 , 22 を取得する正弦波にベスト フィットします
  5. 治療および中型の変更の時に高い過渡発光、原因分析からデータの最初のサイクルを除外します
  6. データの表示、プロット時間 (時間または日) に対して raw データ (生物発光、カウント/秒)。振幅と位相を比較する基準減算データをプロットできます必要なときします。

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Representative Results

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概発光レポーター ベクトル: 人間PER2のプロモーターに駆動される表現の不安定化ルシフェラーゼ バリアントの

PGL、概記者ベクターの構築に使用される人間のPER2プロモーター由来 941 の bp のフラグメントで構成される DNA シーケンス [hPer2PLuc2P/Neo を規制する知られている規制の要素の存在をまず行った/概日遺伝子の発現。バイオインフォマティクス解析を示したこのプロモーター フラグメント内である 3 つの異なる Bmal1 の結合部位 (E-ボックス) (猫/CGTG)、2 つの概日転写強化サイト (CCAATG)、2 つの GC ボックス、および転写開始部位 (図 1)。それ故にこの記者のベクトルは概日遺伝子の発現を反映するように予想されました。

同期エージェントの最適化

いくつかのエージェントは、生物発光研究培養線維芽細胞の自律のサーカディアン リズムに影響を与えるまたは同期に使用されています。10 μ M のフォルスコリン、1 nM メラトニン、0.1 μ M デキサメタゾン、50 %hs、100% は乳腺上皮細胞の効率的かつコスト効果の高いセルの種類特定の同期エージェントを選択するために比較して乳腺上皮細胞 (MCF10A) 一過性トランスフェクション SQ概記者ベクトル。セル同期 HS ベストの概日リズムを示し、概 3 ピークで誘起ルミネッ センス、セルにのみ 1 つまたは 2 つのピークと比較して 50% と他のエージェントと同期します。また、データ分析 (図 2) の中に 50% 生産 HS の許容可能な期間、振幅、最適値と同期セルの発光プロファイル。これらの調査結果に基づいて、すべてのそれに続く実験用セル同期エージェントとしてこの方法を選びました。

混乱と化学物質暴露による細胞の概日リズムの回復

この生体外モデルでは、未処理、一時的に transfected セル (対照群) は発光信号同期 (図 3 a) の後の少なくとも 2 つの完全なサイクルを示した。直動変異原, NMU、細胞は発光ピークの損失を反映して概日遺伝子発現用量依存的混乱を示した。0.25 mM NMU と治療は、細胞の概日リズムを中断しなかった、0.5 mM NMU の線量最初の遅延し、治療 〜 72 時間後に発光の 2 番目のピークの消失によって示されるように後で概日リズムを廃止します。20 nM Ex257 または 1 μ M cambinol と SIRT1 活性の阻害は、同様に後続概日周期 (図 3 a-1) を湿し水によって概日リズムを中断しました。MSC のまた重要なは、(12.5 μ M) 培 NMU 処理細胞の概日遺伝子発現の通常の最初と 2 番目のサイクルへ復元します。MSC は、NMU によって破壊されるリズムを復元するだけでなく、SIRT1 阻害剤、Ex257、cambinol (図 3 a-2) の破壊的な影響も防止。

固定して transfected セルの NMU と SIRT1 の阻害剤は一過性形質転換細胞 (図 3 b-1) よりも高い濃度でとはいえの概日リズムを中断しました。MSC (12.5 μ M) が 1 mM NMU (図 3 b-2) で前処理した細胞の概日リズムを復元します。さらに、MSC も SIRT1 阻害剤, EX257 を含む細胞内の概日リズムを復元 (40 nM) (図 3B-3) と cambinol (2 μ M) (図 3B(4))、それぞれ。

図 3Aおよび図 3 bの比較は、発光強度は非常に高いが、一時的に transfected セルで短い時間対安定発現細胞のリズムを受けました (〜 10 倍、2 回短時間) で一般的に、NMU または MSC と細胞の治療後も。さらに、細胞の概日リズムは倍以上固定して transfected セルに比べて一時的に transfected セルの化学薬品への露出に敏感だった。

化学物質による細胞の概日リズムの定量的な用量依存的変化

同様に、固定して transfected セルの乱れた細胞概日リズム治療 1 mM NMU は NAC の処理による用量依存的 (0-20 μ M) に復元されました (図 4 a) 概日周期 (図 4 b の変化の観察) と相 (図 4)。

Figure 1
図 1: 一連の人間PER2プロモーター断片と概記者ベクトルします。(A) 人間PER2プロモーター フラグメント (941 bp) シーケンスは、シーケンス機能の概日プロモーターの要素について分析しました。E ボックス、CACGTT/CATGTG;概日転写 CCAATG; サイトを強化GC ボックス、CGCCCC/GGGGCGGG;転写開始サイト (TSS): CAGCGG。(B) 不安定化ルシフェラーゼ レポーター ベクトル、pGL の模式図 [hPer2P/Luc2P/Neo]。不安定化ルシフェラーゼ (dLuc) の転写がhPER2プロモーターの直接制御の下です。共発現ネオマイシン耐性遺伝子 (Neo) G418 による感染細胞の選択が容易になります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 異なる同期エージェントの in vitro細胞サーカディアン リズムの同期します。24 h 飢餓後概記者ベクトルによる一過性トランスフェクション MCF10A 細胞は発光信号を記録することによって、2 h の各同期エージェントと扱われました。青、10 μ M のフォルスコリン;赤、1 nM メラトニン。緑、0.1 μ M のデキサメタゾン;紫;50% 馬血清 (HS);ティール、100 %singlequot (SQ);黄色、空のベクター (マイナス コントロール)。X 軸 (日);Y 軸に生物発光 (カウント/分)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: MSC は乳腺上皮細胞における NMU と SIRT1 の阻害剤によって破壊される細胞の概日リズムを復元体外。MCF10A の生物発光アッセイを行ったPER2 dLucレポーター細胞 50% との同期/HS。X 軸に時間 (h) (ポスト NMU の処理時間)Y 軸に生物発光 (カウント/分)。一時的に transfected セルから (A) の結果です。(1) のセルは 0、0.25 または 0.5 mM NMU、20 nM EX527、または 1 μ M cambinol 1 h の次の同期のために扱われました。黄色: 制御;赤: 0.25 mM NMU;緑: 0.5 mM NMU;青: 20 nM EX527;黄緑: 1 μ m cambinol。12.5 μ m だけで、MSC または 20 nM EX527 または 0.5 mM NMU に中暴露の記録で 1 μ M cambinol との組み合わせで、(2) 細胞が扱われました。黄色: 制御;赤: 0.25 mM NMU;緑: 0.5 mM NMU;青: 0.5 mM NMU + 12.5 μ M MSC;黄緑: 0.5 mM NMU + 12.5 μ M MSC + 20 nM EX527;紫: 0.5 mM NMU + 12.5 μ M MSC + 1 μ M cambinol。(B) 固定して transfected セルからの結果。3rd- クリーンでクリアなグループ間で差はみられなかった 5thのピークは、代表的な結果として掲載されています。(1) のセルは 0、0.5、1.0 と扱われたまたは 2.0 mM NMU、40 nM EX527、または同期後 1 h の 2 μ M cambinol。黄色: 制御;赤: 0.5 mM NMU;緑: 1.0 mM NMU;青: 2.0 mM NMU;黄緑: 40 nM EX527;紫: 2 μ M cambinol。(2) 細胞は、12.5 μ m MSC 1.0 mM NMU に中暴露の記録に扱われました。黄色: 制御;赤: 1.0 mM NMU;緑: 1.0 mM NMU + 12.5 μ M MSC。(3) 細胞が 12.5 μ M MSC 以下に扱われた露出 40 nM EX257。黄色: 制御;赤: 40 nM EX257;緑: 40 nM EX257 + 12.5 μ M MSC。(4) 細胞が 12.5 μ M MSC 以下と扱われた 2 μ M cambinol への暴露。黄色: 制御;赤: 2 μ M cambinol;緑: 2 μ M cambinol + 25 μ M MSC。この結果は、以前報告され、CC で 2.022の下でライセンスされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: NAC カルシウムブ NMU によって破壊される細胞の概日リズムを復元します。セルは、同期後 1.0 mM NMU または 1 h の車両制御と扱われました。(A) 時間 (h) と発光 (カウント/分) の代表的な結果です。黄色: 制御;赤: 1.0 mM NMU;緑: 1.0 mM NMU、5 μ M NAC;青: 1.0 mM NMU、10 μ M NAC;黄緑: 1.0 mM 20 μ M NAC NMU。(B) 期間 (時間)。(C) 位相 (時間)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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哺乳類セルの概日時計の周期性は、相互接続された転写/翻訳フィード バック ループによって調整されます。ヘテロの Bmal1 とクロックまたは Npas2 コア CGs、 Per2叫び、多数の CCGs4などのプロモーターで E-ボックス要素にバインドによって概日転写を調節します。セルには、ヘテロの蓄積あたり: 泣くファーストクリーニング修正およびクロック: Bmal1 の転写活性を抑制する核に運ばれます。この負帰還のループでは、コア自身のトランスクリプションを調整、CGs と CCGs23のリズミカルな表現を設定する CGs をことができます。両方の本質的な条件 (例えば、酸化還元電位) で個々 のセルの時計を同期することができますほとんどの哺乳類細胞の本質的な時計ですが、外部環境からの刺激24。メラトニン、松果体中央ペース メーカー (SCN) から受け取った信号に応答によって産生されるホルモンによって概日遺伝子式体内を同期できます。SCN 統合に当たって専門 melanospin 表現から信号網膜の感光性網膜神経節細胞。メラトニンは松果体からリリースされた循環に入るし、ほとんど末梢細胞の in vitroin vivo25,26SCN の概日リズムを調節します。概日リズムは、ストレス ホルモン (例えばコルチゾール、カテコールアミン)27,28および成長因子29,30によって調節されることができます。成長因子の規制緩和は、細胞増殖・分化のための31の概日リズム障害に関連する知られています。

用いて概記者ベクトルは、この否定的な生化学的なフィード バック メカニズムを悪用します。コア概負帰還ループは転写活性化因子、BMAL1 とクロック、 PER2プロモーターとリプレッサー PERs と晶は、BMAL1 の式を負に制御する概 E/E´ ボックス結合モチーフにバインドで構成されます。現在のレポーター システムで BMAL1 と時計でPER2プロモーターのリズミカルな活性化概日発現不安定化ルシフェラーゼ、発光信号のより正確な概日周期を可能にする容易になります。記者プラスミドの建設では、BMAL1 結合部位、概日リズムの強化サイト、GC ボックス、およびhPER2プロモーターの転写開始部位を含まれています。ベクトルが transfected セル細胞自律神経リズムのリアルタイム再生でき条件またはこの内因性の概日パターンの遺伝子発現を変更する特定のエージェントを識別するために使用することができます。しかし、細胞が培養体外または前のヴィヴォの概日振動子すぐになる反します。それ実行される生体外で任意の概アッセイができる前にそのリズムを再同期化する必要です。わかった乳腺上皮細胞の 50 %hs、メラトニン、100 %sq ができた各概日リズム体外の効率的な同期化を誘導します。デキサメタゾンおよびフォルスコリンは、部分的な同期化のみを生産しました。線量に依存するテスト開発と将来の研究における新しい同期エージェントの選択の必要があります。低コスト、効率および広い使用を与えられた同期エージェント、HS は堅牢かつ再現可能な細胞の概日リズム乳腺上皮細胞と神経を生産する効果的な同期エージェントに発見された 50% の細胞、前述他の多くの種類の細胞と異なる実験的設定24に報告。

概規制の生体外モデルを検証するため、私たちは次に概日リズムの体外環境ストレスに対する応答が影響を要約するだろう場合我々 はin vivo観察を尋ねた。以前、我々 は NMU の単一発がんの線量が主要な CGs (例えばPer2) の概日リズムの表現を中断実証とターゲットの乳腺におけるいくつかの CCGs。また、MSC の化学予防療法は通常に向かってPer2と CCGs 遺伝子の概日リズム発現をリセットします。我々 はさらに細胞の有害物質への暴露を示したストレッサーは、NAD+に影響概日遺伝子発現を変えることができると -依存 SIRT1 活性7,8,22。NMU への暴露を示した生体外で概レポーターのアッセイを使用して得られた結果により細胞の概日遺伝子の表現の妨害と、さらに興味深いは、MSC はないだけ細胞の概日リズムをリセットすることによって破壊されます。NMU がまた SIRT1 阻害剤により中断する概日リズムをリセットします。これらの結果は、 in vitroアッセイが概日遺伝子の発現、NMU の効果を再現するだけでなく、乱れたサーカディアン リズム、体内SIRT1 依存性のメカニズムを介しての MSC の効果を再現するもに示されます。体外体内レポーター システム従って様々 な有害物質や直接阻害剤および変調器を含むセルに NAD+/NADH レベル変更ストレスを検出する可能性があります細胞レドックスの遺伝毒性だけでなく、サイクリングポリ ADP リボース依存 DNA による NAD+を使い果たすことができますエージェントは、32を修復します。体外レポーター システムが中断または概日遺伝子の規則体内の復元がある化学薬品及びセル条件の画面に便利なツールを提供することが示唆されました。

In vitroアッセイは、一過性または安定記者コンストラクト トランスフェクション細胞を使用して設定できますが、いくつかの違いが一過性かつ安定して transfected セル間の化学物質の処理への応答で認められました。固定して transfected セルされた化学物質の治療を受けにくく特に NMU と SIRT1 阻害薬、一時的に transfected セルより。これらの違いは、周囲の特定の統合サイトのシーケンスからの影響による安定形質転換細胞におけるベクトル プロモーターの規制で微妙な違いを反映できます。したがって、抗生物質による治療によって安定形質転換細胞の選択も概混乱に耐性クローンを選択可能性があります。したがって、生体内反応を要約する能力の一時的または安定形質転換細胞を用いて細胞モデル個々の in vitroを検証する必要があります。異なる遺伝子導入法は、化学物質の毒性は異なる感受性で遺伝毒性ストレスとなり、細胞毒性のさまざまなレベルを誘発します。したがって、細胞毒性テストとパイロット実験、トランスフェクションと処理条件の選定に必要です。にもかかわらず、彼らの感性の違い、化学物質私たちの乳腺上皮概レポーター細胞破壊と修復細胞の概日リズムの全体的な結果の一貫した、間で同等一過性transfected と固定して transfected セル、および結果は、我々 はin vivo観察効果を締めくくっています。

他のセルタイプで概記者のベクトルを使用できるかどうかを決定するには、ひと膠芽腫・星細胞腫細胞 (U-87 MG) 安定してこの概日リズム ベクトルを導入させた。生体外細胞生物発光アッセイを用いた予備的な結果を示した同期後は、これら神経由来の腫瘍細胞がある定期的かつ強力な細胞概日リズムに匹敵する人間の乳腺を観察上皮細胞。IC261、カゼインのキナーゼのよく知られている阻害剤で処理した細胞 1 δ (CK1δ)、CK1 ε、報告された b として低振幅ですが長時間概日周期を示したy (データは示されていない)33。これらの結果は、概ルシフェラーゼ レポーター ベクトルとの in vitro細胞生物発光アッセイが神経細胞を含む、他の器官特定のセルに適用されることを示します。

記者の携帯電話システムを構築したためとして使用できる広くの in vitroアッセイの異なる種類の細胞の概日遺伝子発現定量のため一般に。実験の手順は、簡単、迅速、かつ安全です。しかし、この記者の携帯電話システムはすぐに適応することはできません transfect に困難細胞、非分裂細胞 (例えば、神経細胞)、彼らは悪名高い低トランスフェクションの効率を持っているので。ウイルス ベースのトランスフェクションの方法 (例えば、レンチ ウイルス トランスフェクション) 可能性がありますこれらの細胞の34の高効率のソリューションを提供しています。しかし、時間とレンチ ウイルスの生産に関連付けられている難易度は、困難で時間のかかるメソッドをなります。また、適切な安全レベルの研究室は、ウイルスの生産そして使用のため必要です。さらに、高解像度単一のセル発光検出器は、非分裂細胞35における概日遺伝子発現の永続的な独立して段階的なリズムの定量される可能性があります。

生体内で哺乳類の概日リズムの研究は、労働集約的なと高価なだけでなく、彼らも動物の大規模な番号を使用する必要です。生体外でシステムの可用性は、概日リズム発現遺伝子の中断と、慢性疾患の開発の間の関連付けをテストするために必要な動物の数を減らすことができる大幅発癌など代謝症候群。概パラメーター、期間、振幅、位相などの定量的なデータは、線量や時間依存性細胞の概日リズムに及ぼす化学物質に知らせることができます。例えば、我々 は NAC の期間および NMU によって破壊される細胞の概日リズムの位相を復元できます用量依存的その抗酸化を観察しました。画面し、体内の内分泌攪乱を分類して中断の概日リズムの開発のための力学的洞察を提供する携帯電話の機能の減損の影響を調査するため、生体外モデルを使用もこと異常な仕事のスケジュールのための神経生理学的障害、メタボリック シンドローム、乳がんリスクが高いコホートの介入戦略。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は 2012 毒物学の社会 (SOT) によってサポートされていた-動物と植物検疫機関、大韓民国 (M. 牙) からコルゲート パルモリブ変化をもたらす研究 (M. 牙) 助成および国際共同研究に資金を供給し、NIEHS を付与P30ES005022 (H. Zarbl)。我々 は彼の役については、彼の実験的援助氏 Shao-An フアンと彼女の証拠読書のためさんキミ中田博士鄭陳 (マクガバン医科大学でテキサス州ヒューストン健康科学センター) に感謝する思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

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References

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<em>体外</em>乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ
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Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

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