Summary
Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.
Abstract
De circadiane ritme is een fundamentele fysiologische proces aanwezig in alle organismen dat biologische processen, variërend van genexpressie slapen gedrag regelt. In gewervelde dieren, wordt circadiane ritme geregeld door een moleculaire oscillator die functioneert in zowel de suprachiasmatic nucleus (SCN; centrale pacemaker) en de afzonderlijke cellen bestaande uit de meest perifere weefsels. Belangrijker, is verstoring van circadiane ritme door blootstelling aan licht-at-night, milieustressoren en/of toxische stoffen geassocieerd met verhoogd risico van chronische ziektes en veroudering. De mogelijkheid om agenten die centrale en/of perifere biologische klokken kunnen verstoren, en agenten die kunnen voorkomen of verzachten van de gevolgen van de verstoring van circadiane, te identificeren heeft aanzienlijke gevolgen voor de preventie van chronische ziekten. Hoewel knaagdier modellen kunnen worden gebruikt als aanduiding van de posities en agenten die veroorzaken of verstoring van circadiane voorkomen/verzachten, vereisen deze experimenten grote aantallen dieren. In vivo studies ook vereisen aanzienlijke middelen en infrastructuur, en vereisen van onderzoekers aan het werk van de hele nacht. Dus, is er dringend behoefte aan een celtype passende in vitro systeem naar scherm voor milieu circadiane disruptors en smaakversterkers in celtypes uit verschillende organen en ziekte staten. We hebben een vector die transcriptie van de gedestabiliseerd luciferase in eukaryote cellen onder de controle van de menselijke periode 2 gen promotor drijft gebouwd. Deze constructie circadiane verslaggever was stabiel naar menselijke borstklier epitheliale cellen transfected en circadiane responsieve verslaggever cellen werden geselecteerd om de Bioluminescentie in vitro assay. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol vaststellen en valideren van de bepaling. We leveren verdere details voor bewijs van concept experimenten aantonen van het vermogen van onze in vitro -assay te recapituleren de effecten in vivo van verschillende chemische stoffen op de cellulaire biologische klok. De resultaten wijzen erop dat de bepaling aangepast aan een verscheidenheid van celtypes worden kan te screenen voor zowel milieu disruptors en chemopreventive versterkers van circadiane klokken.
Introduction
De circadiane klok regelt een brede waaier van biologische processen uit een diurnale expressie van genen te slapen gedrag in een voorspelbare ritme met een frequentie van ongeveer 24 h. epidemiologische studies suggereren sterk dat chronische verstoring van circadiane ritme verhoogt het risico op borst- en prostaatkanker in werknemers in ploegendienst, met inbegrip van verpleegkundigen en vlucht bemanningen1,2,3. Deze bevindingen worden bevestigd door knaagdieren onderzoeken, die aantonen dat de blootstelling aan constant licht, licht-at-night of lichte cycli die verhoging van de jetlag tumor incidentie nabootsen en versnelt4,5van de groei van de tumor. Gebaseerd op gegevens uit zowel menselijke en knaagdier studies, het Internationaal Agentschap voor kankeronderzoek ploegenarbeid als een waarschijnlijke menselijk carcinogeen agens (Type 2A) in 20106ingedeeld.
Eerder, we laten zien dat een enkele kankerverwekkende dosis van de borstklier tumor specifiek carcinogeen, N- nitroso-N- methylurea (NMU), verstoord de circadiane expressie van genen die grote circadiane (CGs) (b.v., periode 2 , Per2) en verschillende circadiane-gecontroleerde genen (CCGs), met inbegrip van DNA-beschadiging responsieve toets en gerepareerd (DDRR) genen in de melkklier doel (maar niet in de lever). Bovendien, het resetten van de circadiane expressie van genen die zowel de Per2 als de DDRR naar de normale door een chemopreventive regime van dieet L-methyl-selenocysteine (MSC) de incidentie van tumor met 63 procent verminderd. Deze bevindingen waren de eersten om te laten zien een mechanistische koppeling tussen circadiane ritme, chemische carcinogenese en chemoprevention7,8. Vorderingen op andere milieu toxische stoffen aangetoond dat verstoort circadiane gen expressie in vivo zijn ook geassocieerd met verhoogd risico van milieu ziekten9,10. Inzicht in de mechanismen die een verstoring van de circadiane door toxische stoffen in het milieu en de pathogenese link kan leiden tot mechanistically gebaseerde benaderingen van ziektepreventie. Echter studies gericht op het definiëren van de interacties tussen de blootstelling en het circadiane ritme worden gewoonlijk uitgevoerd in vivo. Een typische in vivo experiment onderzoeken die de impact op de circadiane ritme grote aantallen dieren, vereist zoals weefsels uit ten minste drie controle en drie blootgestelde dieren moeten worden verzameld elke 3-4 h over een periode van 24 of 48 h. Ontwikkeling van een gevalideerde in vitro -systeem dat in vivo observaties en mechanismen recapituleert zou dus niet alleen het verminderen van het aantal dieren vereist, maar ook drastisch verminderen experimentele kosten en de eis dat onderzoekers werken voortdurend over een periode van 24-48 h. Bovendien kan een gevalideerde in vitro -systeem worden gebruikt voor high throughput screening van verbindingen en/of genetische wijziging die invloed hebben op het circadiane ritme, of haar reactie op milieustressoren of toxische stoffen. Daarom zijn de strategische combinatie van in vitro en in vivo modellen en experimenten nodig om het verkrijgen van verschillende inzichten met verschillende focus.
Bij zoogdieren bestaan circadiane oscillatoren niet alleen in gespecialiseerde neuronen van de SCN, maar ook in de meest perifere celtypes. Deze moleculaire klokken zijn vergelijkbaar met die in de gevestigde fibroblast cellijnen en primaire fibroblasten van embryo's of volwassen dieren; Er is echter behoefte aan een weefsel type-specifieke cellulaire modellen11. Bijgevolg, traditionele studies van motorische activiteit in vivo, SCN explants ex vivoen cel-gebaseerde in vitro testen in vereeuwigd fibroblast cellen worden veel gebruikt om te studeren van cel-autonome circadiane gebreken. Echter, er is geen bewijs dat aangeeft dat een in vitro fibroblast cel-gebaseerde bepaling circadiane mechanismen recapituleren kan en reacties in cellen van andere perifere organen in vivo. Verschillende soorten cellen kunnen verschillende patronen van genexpressie, xenobiotische metabolisme en DDRR, en het verband tussen giftigheid en circadiane genexpressie kunnen celtype specifieke en/of gemoduleerd door verschillende fysiologische parameters. Daarnaast hebben circadiane oscillatoren in fibroblast gebaseerde systemen niet volledig geëvalueerd voor reacties op toxische stoffen in het milieu, stressoren en preventieve agenten die link blootstelling aan mechanismen voor de ontwikkeling van de ziekte en preventie. Dus, is er een behoefte aan facile, gevalideerde cel-systeemeigen, in vitro bioluminescentie testen om te studeren orgel specifieke milieu circadiane disruptors. Hoewel een verscheidenheid van cellulaire klok modellen (bijvoorbeeldin de lever, de keratinocyten, en de vetcellen, evenals een cellijn van osteosarcoom) hebben ontwikkeld in de afgelopen jaren12,13,14, 15, de hier beschreven test is het eerste model van de cellulaire klok in epitheliale cellen van de borst, en de eerste demonstratie te recapituleren reacties- in vivo op milieustressoren, toxische stoffen, drugs en chemopreventive agenten.
Renilla luciferase (rLuc) en firefly luciferase zijn 30-61 kDa monomeer eiwitten die vereisen geen posttranslationele verwerking voor enzymatische activiteit en kunnen functioneren als een genetische verslaggever onmiddellijk na de vertaling. Zodra het substraat aan het enzym luciferase koppelt, genereert de biochemische reactie gekatalyseerd een lichtflits. Luciferase constructies zijn zo grote schaal gebruikt als een gen expressie verslaggever systeem in vitro en in vivo. Echter in de circadiane ritme studies, het nut van de verslaggever luciferase wordt beperkt door de relatief lange halveringstijd van het eiwit luciferase (T-1/2 = 3.68 h) ten opzichte van de periode (met name voor de korte periode) voor veranderingen in het circadiane gen expressie; echter heb tal van studies door de jaren heen met succes gebruikt het luciferase-gen in de pGL3 vector, waaruit blijkt dat het snel afbreekbaar luciferase niet mogelijk nodig voor het melden van circadiane ritmes, vooral voor de ritmes met een langere periode, zoals 24 h. Dus, een verslaggever plasmide met behulp van gedestabiliseerd luciferase vector, pGL [Luc2P/Neo], waarin de hPEST (een opeenvolging van de destabilisatie eiwit) is ontwikkeld, waardoor we kunnen gebruiken als een vector circadiane verslaggever voor onze huidige in vitro bioluminescentie assay. Het eiwit dat gecodeerd wordt door Luc2P heeft een veel kortere halfwaardetijd (T-1/2 = 0.84 h) en vandaar, sneller en met een grotere magnitude reageert op veranderingen in transcriptionele activiteit dan wild-type, ikndicating dat het kan worden gebruikt voor het bewaken van de ritmische uitdrukking van luciferase geregeld door de promotor van de PER2 nauwkeurig in real-time16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bouw van PER2 promotor gedreven gedestabiliseerd Luciferase verslaggever Vector
- kopen een aangepaste pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector waarin cDNA codering rLuc en mens PER2 promotor fragment (hPER2P, 941 bp) op de site tussen OSS ik en Hind III in de meerdere klonen regio 17.
- Gesneden van het menselijke PER2 promotor fragment (hPER2P, 941 bp) uit de vector.
- Toevoegen 2.5 µL restrictie-enzym buffer, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector, en 1 µL van het restrictie-enzymen, Sac I (10 eenheid/µL) en Hind III (10 eenheid/µL), in een DNA/RNA/nucleotide-vrij microcentrifuge buis. Ultrazuiver water (10.5 µL) tot 25 µL en meng zachtjes toevoegen door pipetteren.
- Incubate bij 37 ° C gedurende 90 min. in een blok Verwarming.
- Ronde het hele volume (25 µL) van de restrictie-enzym-reactie op 0,7% agarose gel met 0,0001% ethidiumbromide (EtBr) te scheiden van de hPER2P van de vector.
Opmerking: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium bromide (CAS-registratienummer: 1239-45-8), is een reukloos rode vloeistof. Het is een intercalating agens dat wordt over het algemeen gebruikt als een TL tag (nucleic zuur vlek) in agarose gelelektroforese en zichtbaar als een oranje kleur onder UV-licht. Mogelijke risico's van onomkeerbare mutagene effecten hebben plaatsgevonden in proefdieren, hoewel geen van de regelgevende agentschappen het gecategoriseerd als een kankerverwekkende stof 18. Dus wij gebruikte agarose gel en electroforese buffer met EtBr als chemische gevaren afval verzameld, en verzocht Rutgers milieu-gerelateerde gezondheid & veiligheid (REHS) te halen en te vervreemden veilig. - Knip een stukje van agarose gel met een band van de fluorescentie EtBr op 941 bp, en te zuiveren van de hPER2P fragmenten uit de gel met een DNA gel extractie kit, gevolgd door kwantificering op een spectrofotometer door het meten van de absorptie dichtheid (OD) bij 260 nm golflengte.
- Linearize 1.0 µL (1 µg) van de gedestabiliseerd firefly luciferase expressie vector, pGL [Luc2P / Neo] met dezelfde methode zoals beschreven in stappen 1.2.1-1.2.2. Uittreksel van de vector met een DNA-opschonen kit gevolgd door kwantificering, zoals eerder beschreven met behulp van een spectrofotometer.
- De hPER2P in de pGL gelineariseerde vector ligate [Luc2P / Neo].
Let op: Per de fabrikant ' s instructie, de ideale molaire verhouding van donormateriaal en vector is 2:1. Voor 50 ng vector, de ideale hoeveelheid invoegen wordt berekend als 23,6 ng met een formule, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vector] x (2/1) = 23.6 ng invoegen]. Op basis van de concentraties van hPER2P (7.26 ng/µL) en pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), de hoeveelheid 50 ng pGL [Luc2P / Neo] en 23.6 ng hPER2P zijn berekend als 1 µL en 3.26 µL, respectievelijk.- Toevoegen 2 µL T4 DNA ligase reactie buffer (10 X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 1 mM ATP en 10 mM DTT), 3.26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], en 13.74 µL water maximaal 20 µL , meng voorzichtig.
- Voeg 1 µL T4 DNA ligase (400 eenheid/µL), meng zachtjes en Incubeer bij 16 ° C's nachts in een thermocycler en vervolgens koelen de ligaturen vector op ijs per de fabrikant ' s instructie.
- Transformeren de pGL ligaturen vector [hPer2P / Luc2P / Neo] te chemisch bevoegde E. coli 19.
- Het waterbad vastgesteldop in 42 ° C, opwarmen Super optimale bouillon met omzettingsproducten onderdrukking (S.O.C.) medium (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 en 20 mM glucose) bij kamertemperatuur , Luria Bertani (LB) agarplaat (met 0,5 µM IPTG, 100 µg/mL ampicilline en 80 µg/mL X-gal) in 37 ° C incubator opwarmen en ontdooien op ijs een flacon van bevoegde E. coli cellen voor elke transformatie.
- Toevoegen 6 µL (21 ng) afgebonden vector- of 1 µL (30 ng) lege vector (negatieve controle) naar één buis van chemisch bevoegde E. coli (50 µL) en dan zachtjes flip de buis te mengen. Incubeer op ijs voor 30 min.
- Heat shock in een waterbad van 42 ° C voor 30 s zonder schudden en vervolgens terug te keren naar ice.
- Selecteer een kolonie van de E. coli getransformeerd met een ligaturen vector met blauw/wit screening.
- Toevoegen 250 µL S.O.C. medium in het getransformeerde E. coli tube en het Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm.
- 10-50 µL van getransformeerde E. coli op het oppervlak van de LB-agarplaat gelijkmatig gespreid. Zet de plaat ondersteboven in de incubator 37 ° C's nachts.
Opmerking: Een efficiënte klonen reactie moet produceren verschillende honderd kolonies. Twee verschillende volumes plating wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat ten minste één plaat zal grote, duidelijke witte of blauwe kleur en goed verdeelde kolonies. Wanneer de kolonies te klein zijn en de kleur niet te onderscheiden is, met behulp van een microscoop (10 X of 50 X) is het handig. - Kies 3-6 witte kolonies van de platen met gesteriliseerde tand stokken, en vrij van elke kolonie in één cultuur buis met 4 mL LB kweekmedium met 50 µg Mo/mL ampicilline.
- Broeden de buizen bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm's nachts. Uitpakken van het DNA met behulp van 2 mL van de 4 mL E. coli gekweekt met een plasmide DNA extractie mini prep kit per de fabrikant ' s instructie.
- Controleren en analyseren van de insert (hPER2P, 941 bp)
- de plasmide DNA met enzymen van de beperking te verteren en voer de elektroforese zoals beschreven in stappen 1.2.1-1.2.3 bevestigen als er een insert.
Opmerking: Positieve controle (hPER2P gezuiverd bij stap 1.2.4) en negatieve controle (E. coli getransformeerd met een lege vector) waren inbegrepen. - Volgorde van de geselecteerde plasmide-DNA met behulp van M13 vooruit en M13 omgekeerde inleidingen te bevestigen de oriëntatie en de volgorde van invoegen in de plasmide 19.
Opmerking: Slechts één kolonie, die had een insert met de juiste grootte van hPER2P in elektroforese en correcte oriëntatie en volgorde in het rangschikken resultaat werd geselecteerd. - Analyseren het menselijke PER2 promotor fragment (hPER2P, 941 bp) volgnummer voor de circadiane regelgevende elementen, met inbegrip van E-box motief (Bmal1 binding site, CAT/CGTG), CCAATC, vak GC en transcriptie starten website (CAGCGG) 20.
- de plasmide DNA met enzymen van de beperking te verteren en voer de elektroforese zoals beschreven in stappen 1.2.1-1.2.3 bevestigen als er een insert.
- De geselecteerde E. coli door toevoeging van de overgebleven 2 mL E. coli in 200 mL LB kweekmedium met 50 µg Mo/mL ampicilline en 's nachts incuberen bij 37 ° C gekweekte met schudden bij 200 rpm Amplify.
- DNA uitpakken met een endotoxine-vrije plasmide maxi prep kit per de fabrikant ' s instructie, en het vervolgens te kwantificeren door OD bij 260 nm golflengte meten met een spectrofotometer. Aliquot en winkel het plasmide-DNA, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], op-80 ° C vriezer voor toekomstig gebruik.
2. Voorbijgaande Transfectie
- aankoop en cultuur van de cellen van de MCF10A
- aankoop een vereeuwigd, niet-omgezet normale menselijke borstklier epitheliale cellijn (MCF10A) van een commerciële cel bank, waar cellen cytogenetically worden geteste en geverifieerde met korte tandem herhaalde analyse vóór het invriezen. Ontdooien en onderhouden van elke flacon van bevroren cellen in cultuur voor een maximum van 8 weken.
Opmerking: In tegenstelling tot andere cellen, deze cellen hebben contact remming zodra zij aan de samenvloeiing van ~ 70%. Het vereist dat subcultuur is uitgevoerd op ~ 70%. - Cultuur de cellen met het groeimedium borstklier epitheliale cel (MEGM), met borstklier epitheliale Basaal medium (MEBM), groei supplementen en cholera-toxine in een cel cultuur incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2.
Opmerking: Koop kant-en-klare groeifactoren geboden in SingleQuot (SQ) en cholera-toxine afzonderlijk te verkrijgen. Eindconcentraties van groei supplementen zijn 0,4% boviene hypofyse extract, 0,1% insuline, 0,1% hydrocortison, 0,1% menselijke epidermale groeifactoren, 100 ng/mL cholera-toxine, 0.05% gentamycine sulfaat en 0,05% amfotericine B. - De cellen in de cultuur van de 10-cm schotel distantiëren door incubatie met 10 mL trypsine/EDTA voor ~ 20 min en vervolgens de trypsine te neutraliseren door toevoeging van 10 mL trypsine oplossing te neutraliseren. Verzamel alle cellen met HEPES gebufferde zoutoplossing (HBSS).
- Tellen de cellen met een hemocytometer onder een omgekeerde Microscoop en bereken de concentratie van de schorsing van één cel en vervolgens het zaad van een bepaald aantal cellen zo nodig. Swirl de platen grondig met het oog op een gelijkmatige verdeling van cellen in elke plaat. Incubeer de cellen in de cel cultuur incubator bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2.
Opmerking: Koop een subcultuur reagens verpakking met trypsine/EDTA, trypsine neutraliserende oplossing en HBSS gebruiken.
- aankoop een vereeuwigd, niet-omgezet normale menselijke borstklier epitheliale cellijn (MCF10A) van een commerciële cel bank, waar cellen cytogenetically worden geteste en geverifieerde met korte tandem herhaalde analyse vóór het invriezen. Ontdooien en onderhouden van elke flacon van bevroren cellen in cultuur voor een maximum van 8 weken.
- Voorbijgaande transfectie van cellen met de circadiane vector gebouwd.
- Zaad 2 x 10 5 MCF10A cellen gelijkmatig in 35 mm cultuur schotel met MEGM en groeien tot 20-30% samenkomst (volgende dag).
- Warm up het verlaagde serum media (bijvoorbeeld Opti-MEM) in 37 ° C water bad en transfectie reagens bij kamertemperatuur voor 30 min. verdunnen het plasmide DNA opgebouwd (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) tot 30 ng/µL met endo-toxine vrij Tris-EDTA (TE) buffer en houden bij kamertemperatuur.
- Bereiden het plasmide transfectie mengsel in een tube van 1,5 mL microcentrifuge door 63.6 µL warme verminderde serum media eerst moet worden toegevoegd en vervolgens toe te voegen 33.4 µL (0,1 µg) plasmide DNA, en meng zachtjes door pipetteren, en dan tot slot het toevoegen van 3 µL van transfectie reagens rechtstreeks in het midden van de buis zonder aan te raken van de muur. Na het mengen zachtjes door pipetteren, houden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten
- Drop de hele plasmide mengsel (100 µL) rechtstreeks op het oppervlak van de center van het medium in de plaat en meng zachtjes door schudden van de schotel. Cultuur van de cellen in een CO 2 incubator voor extra 48-72-h.
Opmerking: Er wordt voorspeld dat de hoogste efficiëntie van de transfectie zou zijn op de samenvloeiing van de 40-70% van deze cellen als gevolg van de remming van hun contact op ~ 70%. Daarom werkt de transfectie beste basisgewicht ~ 20% en stop bij ~ 70% samenvloeiing.
3. Vaststelling van de In Vitro bioluminescentie Assay in Transient Transfected MCF10A cellen
- verhongeren de gekweekte cellen aan ~ 70% samenvloeiing (na transfectie gedurende 48-72 uur) in MEBM zonder groeifactoren voor 24 h.
- Behandeling van de cellen met synchronisatie agent (b.v., 50% paard serum (HS)) in MEBM voor 1,5 h in een incubator CO 2.
Opmerking: Voor de selectie van een ideale synchronisatie-agent, 10 µM forskolin 1 nM melatonine, 0.1 µM dexamethason, 50% HS en 100% SQ werden vergeleken in termen van circadiane amplitude en periode in de circadiane vector transfected cellen. Lege vector transfected cellen worden behandeld met 100% SQ als negatieve controle. - Pre-prepare 20 mL opnamemedium (voor 10 van de 30-mm cultuur gerechten) door toevoeging van 5 mL van MEGM, MEBM, 150 µL natriumbicarbonaat 200 µL HEPES en 40 µL luciferine 15 mL stockoplossing (50 mM) in een centrifugebuis 50 mL gesteriliseerd.
Opmerking: De eindconcentraties van elke componenten: 20% SQ en 20 ng/mL cholera-toxine, 0,06% natriumbicarbonaat, 1% penicilline/streptomycine en 10 mM HEPES. Opwarmen vooraf bereid opname medium en gesteriliseerd 1 x PBS gedurende 30 minuten in het waterbad 37 ° C. Toevoegen van 100 µM luciferine onmiddellijk vóór gebruik. - Wassen van de cellen met warme 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) voor 3 keer na de incubatie met de synchronisatie-agent en voeg vervolgens 2 mL opname medium.
- Zegel van de schotel met een klasse van de gesteriliseerde cover met siliconen vet ter voorkoming van verdamping en vervolgens het label aan de kant.
- Plaats van de verzegelde schotel in de zetel binnen de luminometer en schakel de optie voor het opslaan van de locatie van het bestand in de map (voor het detail, zie punt 6).
4. Selectie van stabiel Transfected cellen
- optimaliseren van een ideale G418 concentratie (800 µg/mL) met een kill kromme test volgens de fabrikant ' s instructie voor de selectie van stabiel transfected cellen.
- Na voorbijgaande transfectie voor 48u of 72 h, subcultuur en zaad de cellen met MEGM in grotere schotels op 5.000 cellen/schotel (100 mm). Na 24 uur per dag behandelen cultuur in de cel cultuur incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2), de cellen met 800 µg/mL G418 door vervanging van het oude medium met nieuwe medium dat 800 µg/mL G418 elke 3-4 dagen voor 2 weken.
- Subcultuur de overlevende stabiel transfected kolonies voor 1-3 passages met MEGM met 500µg/mL G418 te onderhouden de stabiele uitdrukking van hPer2P/Luc2P en bevriezen in vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.
- 500µg/mL G418 na algemene subcultuur opnieuw selecteren de stabiel transfected bevolking van cellen, behandelen als de intensiteit van de bioluminescentie in het resultaat van de in vitro bioluminescentie assay geleidelijk lager na gebruik in vele passages wordt.
5. Behandeling met chemische stoffen
- op 48 uur of 72 h na transfectie, verhongeren de cellen van groeifactoren in MEBM voor 24 h.
- Na synchronisatie met 50% HS voor 2 h, cellen met 0,25 mM of 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 of 1 µM cambinol gedurende 1 uur in MEBM met 20% behandelen SQ.
- Na het wassen met 1 x D-PBS, toevoegen opname medium met 12,5 µM MSC alleen of in combinatie met 20 nM EX527 of 1 µM cambinol, naar de cellen. Toezicht op de Bioluminescentie met de luminometer.
- Behandelen de stabiel transfected MCF10A / PER2-dLuc cellen met NMU op 0,5, 1 of 2 mM, EX527 bij 40 nM, of Cambinol op 2,0 µM, voor 1 h na synchronisatie met 50% HS, en vervolgens Incubeer de cellen in het opname medium met 12,5 µM voor MSC of verschillende doses (5, 10 of 20 µM) van n-Acetylcysteïne (NAC). Plaats de platen in de luminometer, de record en de Bioluminescentie opslaan door luminometer 4-8 dagen, zoals wordt beschreven in punt 3.6.
Opmerking: NMU is een verbinding met de mutagene, carcinogene en teratogene eigenschappen methylated nitrosourea. NMU is een direct-acting alkylerend agent en heeft een korte halfwaardetijd (T-1/2 = ~ 30 min). Het is stabiel bij zure voorwaarde (pH 4-5), maar unstable alkalische conditie (pH 9-10) en bij temperaturen boven de 20 ° C. Daarom kan bleekmiddel op 10% worden gebruikt als een efficiënte deactiveren agent voor schoonmaak Bank oppervlakken en lab waren mogelijk verontreinigd door NMU solutiop. Overgebleven stockoplossing wordt opgehaald en veilig wordt verwijderd door REHS. Op basis van het werkingsmechanisme van chemische stoffen, kunnen de gesynchroniseerde cellen voor kortere tijden voordat het kweken in opnamemedium worden behandeld. Cellen kunnen ook worden behandeld in het opnamemedium voor een langere tijd (enkele dagen).
6. Verzamelen van gegevens, analyse en presentatie
Opmerking: levensvatbaarheid van de cellen moet worden bepaald met behulp van standaardmethoden (bijvoorbeeld MTT assay) na behandeling van de cellen in dezelfde concentraties voor de dezelfde tijd die zijn aangegeven. Alle concentraties van de behandeling gebruikt in de Bioluminescentie in vitro assay waren lager dan de letale concentratie van 30% (LC30). Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud en representatieve resultaten werden gepresenteerd.
- Na verzegeling van de schotel (stap 3.5), het laden van de gerechten op de zetels in de luminometer, die is gehouden in een broedmachine ingesteld bij 37 ° C zonder H 2 O en CO 2, en aangesloten op een computer.
- Klik " opslaan " en voer de namen voor de map en het bestand waar het signaal van de opgenomen luminescentie van de overeenkomstige schotel moet worden opgeslagen.
Opmerking: Het systeem detecteert het signaal van de luminescentie in real-time uit de cellen in de schotel op individuele posities. De signalen worden overgebracht naar de computer via 4-foton-tellen fotomultiplicator buizen, opgeslagen en door de software van de verzameling van de gegevens in de computer weergegeven. - De signalen na opname voor 4-7 dagen, die kan worden gevolgd door middelgrote verandering en continue opname voor een tweede week indien nodig analyseren.
Opmerking: Om te verkrijgen van circadiane parameters, waaronder fase Periodelengte, ritme amplitude en demping tarief, wij gebruikt de software van de analyse van de luminometer voor het analyseren van de gegevens van de Bioluminescentie. - Detrend van de ruwe gegevens met een slaggemiddelde van lopende en analyseren van de beste-past bij een sinusgolf te krijgen, periode, fase, amplitude en demping tarief 21 , 22.
- Als gevolg van de hoge voorbijgaande bioluminescentie op behandeling en middellange verandering, de eerste cyclus van gegevens van analyse uitsluiten.
- Voor de presentatie van de gegevens, het uitzetten van onbewerkte gegevens (bioluminescentie, graaf/s) tegen de tijd (uur of dag). Indien nodig, basislijn-afgetrokken gegevens kunnen worden uitgezet om te vergelijken amplitude en fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Circadiane bioluminescentie verslaggever vector: menselijke PER2 promotor gestuurde expressie van gedestabiliseerd luciferase variant
De opeenvolging van DNA, bestaande uit een 941 bp-fragment is afgeleid van de menselijke PER2 promotor gebruikt voor de constructie van de circadiane verslaggever vector, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, werd eerst geanalyseerd voor de aanwezigheid van regelgevende elementen bekend te regelen circadiane genexpressie. Bioinformatics analyse toonde aan dat binnen dit fragment van de promotor, er drie verschillende Bmal1 bandplaatsen (E-box) (CAT/CGTG), twee circadiane transcriptie verbetering sites (CCAATG), twee GC vakken en een site start transcriptie (Figuur 1 zijn). Vandaar werd deze vector verslaggever verwacht om na te denken van de circadiane genexpressie.
Optimalisatie van synchronisatie-agent
Verschillende agenten werden gebruikt om te synchroniseren of invloed op het autonome circadiane ritme van cellen van de fibroblast voor in vitro bioluminescentie studies. Om een efficiënte en kosteneffectieve celtype-specifieke synchronisatie-agent in de borstklier epitheliale cellen selecteert, vergeleken we 10 µM forskolin, 1 nM melatonine 0.1 µM dexamethason, 50% HS en 100% SQ in borstklier epitheliale cellen (MCF10A) Transient transfected met de circadiane verslaggever vector. Cellen gesynchroniseerd met 50% HS bleek de beste circadiane ritme, met 3 toppen van circadiane geïnduceerde luminescentie, vergeleken met slechts één of twee pieken in cellen gesynchroniseerd met andere agenten. Bovendien is de Bioluminescentie profielen van cellen die zijn gesynchroniseerd met 50% HS geproduceerd aanvaardbare termijn, amplitude en best-fit waarde tijdens de analyse van de gegevens (Figuur 2). Op basis van deze bevindingen, we deze kosteneffectieve methode geselecteerd als de cel synchronisatie-agent voor alle latere experimenten.
Verstoring en restauratie van cellulaire circadiane ritme door chemische risico 's
In dit model in vitro bleek onbehandeld, Transient transfected cellen (controlegroep) ten minste twee volledige cycli van luminescentie signalering na synchronisatie (figuur 3A). Cellen die zijn blootgesteld aan de directe acteren mutagen, NMU, bleek een dosis-afhankelijke verstoring van circadiane genexpressie, zoals blijkt uit het verlies van luminescentie pieken. Terwijl behandeling met 0,25 mM NMU de cellulaire circadiane ritme niet verstoren deed, wordt een dosis van 0,5 mM NMU aanvankelijk vertraagd en later afgeschaft circadiane ritme, zoals aangegeven door het wegvallen van de tweede piek van luminescentie op ~ 72 uur na de behandeling. Remming van SIRT1 activiteit met 20 nM Ex257 of 1 µM cambinol verstoord ook circadiane ritme door demping van de latere circadiane cyclus (figuur 3A-1). Nog belangrijker is, de toevoeging van MSC (12,5 µM) aan het kweekmedium hersteld naar de normale eerste en tweede cycli van circadiane genexpressie in cellen NMU behandeld. MSC niet alleen het ritme verstoord door NMU hersteld, maar ook voorkomen de vernietigende effecten van SIRT1 remmers, Ex257 en cambinol (figuur 3A-2).
Stabiel transfected cellen verstoord NMU zowel SIRT1 remmers circadiane ritme, zij het op een hogere concentraties dan die is waargenomen in voorbijgaande transfectants (figuur 3B-1). MSC (12,5 µM) hersteld circadiane ritmen in de cellen voorbehandeld met 1 mM NMU (figuur 3B-2). Nog belangrijker, MSC ook hersteld circadiane ritmen in de cellen behandeld met SIRT1 remmers, met inbegrip van EX257 (40 nM) (figuur 3B-3) en cambinol (2 µM) (figuur 3B(4)), respectievelijk.
Ter vergelijking tussen figuur 3A en 3B van de figuur, de intensiteit van de Bioluminescentie was veel hoger maar het ritme was opgelopen voor een kortere tijd in Transient transfected cellen vs stabiel transfected cellen (~ 10 keer hoger, 2 keer kortere) in algemeen, zelfs na de behandeling van cellen met NMU of MSC. Daarnaast was de cellulaire circadiane ritme 2-fold meer gevoelig zijn voor blootstelling aan chemische stoffen in Transient transfected cellen ten opzichte van stabiel transfected cellen.
Kwantitatieve dosisafhankelijk verandering van cellulaire circadiane ritme door chemicaliën
Ook het verstoorde cellulaire circadiane ritme van stabiel transfected cellen behandeld met 1 mM NMU werd hersteld door de behandeling van NAC op een dosis-afhankelijke manier (0-20 µM) (figuur 4A) zoals waargenomen in de veranderingen van circadiane periode (figuur 4B ) en fase (figuur 4C).
Figuur 1: Opeenvolging van menselijke PER2 promotor fragment en de circadiane verslaggever vector. (A) menselijke PER2 promotor fragment (941 bp) werd sequenced, en de volgorde van de elementen van de functionele circadiane promotor was geanalyseerd. E-box, CACGTT / CATGTG; circadiane transcriptie, verbetering van de site, CCAATG; GC vak, CGCCCC / GGGGCGGG; transcriptie starten site (TSS): CAGCGG. (B) schematisch diagram van gedestabiliseerd luciferase verslaggever vector, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. De transcriptie van gedestabiliseerd luciferase (dLuc) is onder directe controle van de promotor van de hPER2 . Een mede uitgedrukt neomycine resistentie gen (Neo) vergemakkelijkt de selectie van geïnfecteerde cellen door G418. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: synchronisatie van in vitro cellulaire circadiane ritme door verschillende synchronisatiescenario agenten. Na 24 uur honger, werden MCF10A cellen Transient transfected door circadiane verslaggever vector behandeld met elke synchronisatie-agent voor 2 h, gevolgd door de opname van luminescentie signaal. Blauw, 10 µM forskolin; rood, 1 nM melatonine; groen, 0.1 µM dexamethason; paars; 50% paard serum (HS); Teal, 100% SingleQuot (SQ); geel, lege vector (negatieve controle). X-as, tijdstip (dag); Y-as, bioluminescentie (graaf/min). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: MSC hersteld cellulaire circadiane ritmen verstoord door NMU en SIRT1 remmers in borstklier epitheliale cellen in vitro. Bioluminescentie tests werden uitgevoerd op MCF10A /PER2-dLuc -verslaggever cellen na synchronisatie met 50% HS. X-as, tijd (h) (post-NMU behandeltijd); Y-as, bioluminescentie (graaf/min). (A) resultaten van Transient transfected cellen. (1) cellen werden behandeld met 0, 0,25 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 of 1 µM cambinol voor 1 h na synchronisatie. Geel: de controle; rood: 0,25 mM NMU; groen: 0,5 mM NMU; blauw: 20 nM EX527; geel groen: 1µM cambinol. (2) cellen werden behandeld met 12,5 µM MSC alleen of in combinatie met 20 nM EX527 of 1 µM cambinol in het opname medium na blootstelling aan 0,5 mM NMU. Geel: De controle; rood: 0,25 mM NMU; groen: 0,5 mM NMU; blauw: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC; geel groen: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC + 20 nM EX527; paars: 0,5 mM NMU + 12.5 MSC µM + 1 µM cambinol. (B) resultaten van stabiel transfected cellen. De 3rd- 5th pieken waaruit bleek schone en duidelijke verschillen tussen de groepen worden gepresenteerd als een representatief resultaat. (1) cellen werden behandeld met 0, 0.5, 1.0 of 2.0 mM NMU, 40 nM EX527 of 2 µM cambinol voor 1 h na synchronisatie. Geel: De controle; rood: 0,5 mM NMU; groen: 1,0 mM NMU; blauw: 2.0 mM NMU; geel groen: 40 nM EX527; paars: 2 µM cambinol. (2) cellen werden behandeld met 12,5 µM MSC in het opname medium na blootstelling aan 1,0 mM NMU. Geel: De controle; rood: 1,0 mM NMU; groen: 1,0 mM NMU + 12.5 µM MSC. (3) cellen werden behandeld met 12,5 µM MSC volgende blootstelling aan 40 nM EX257. Geel: De controle; rood: 40 nM EX257; groen: 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) cellen werden behandeld met 12,5 µM MSC volgende blootstelling aan 2 µM cambinol. Geel: De controle; rood: 2 µM cambinol; groen: 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Dit resultaat werd eerder gemeld en is gelicentieerd onder de CC door 2.022. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: NAC dosis-dependently hersteld de cellulaire circadiane ritme verstoord door NMU. Cellen werden behandeld met 1,0 mM NMU of voertuig controle voor 1 h na synchronisatie. (A) representatieve resultaat van bioluminescentie (graaf/min) tegen de klok (h). Geel: De controle; rood: 1,0 mM NMU; groen: 1,0 mM NMU, 5 µM NAC; blauw: 1,0 mM NMU, 10 µM NAC; geel groen: 1,0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) periode (uren). (C) fase (uren). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij zoogdiercellen wordt periodiciteit van de circadiane klok gereguleerd door onderling verbonden transcriptionele/translationeel feedbacklussen. Heterodimers van Bmal1 en klok of Npas2 reguleren circadiane transcriptie door binding aan E-box elementen in de initiatiefnemers voor core CGs, met inbegrip van Per2 en huilen, en talrijke CCGs4. Als ze in de cel, heterodimers van accumuleren Per: Cry zijn post-translationally bewerkt en vervoerd naar de kern te onderdrukken klok: Bmal1 transcriptionele activiteit. Deze negatieve feedback-lus kunt kern CGs regelen hun eigen transcriptie en instellen van de ritmische expressie van CGs en CCGs23. Hoewel meest zoogdiercellen een intrinsieke circadiane klok hebben, de klokken in afzonderlijke cellen kunnen worden gesynchroniseerd door zowel intrinsieke omstandigheden (bijvoorbeeld, redox potentiële) en externe milieu prikkels24. Circadiane gen expressie in vivo kan worden gesynchroniseerd met behulp van melatonine, een hormoon geproduceerd door de pijnappelklier in reactie op signalen ontvangen van de centrale pacemaker (SCN). De SCN integreert signalen van licht inbreuk op gespecialiseerde melanospin-uiting van lichtgevoelige retinale ganglion cellen in het netvlies. Verlost van de pijnappelklier melatonine treedt de circulatie en regelt circadiane ritme van SCN en meeste perifere cellen in vitro en in vivo25,-26. Circadiane ritme kan ook worden geregeld door stress hormonen (zoalscortisol en catecholamines)27,28 en groeifactoren29,30. Deregulering van groeifactoren is bekend dat gepaard gaan met circadiane verstoring van de groei en differentiatie van de cel31.
De circadiane verslaggever vector die we gebouwd exploiteert deze negatieve biochemische feedback-mechanisme. De kern circadiane negatieve feedback lus bestaat uit transcriptionele activators, BMAL1 en klok, die binden aan de circadiane/E´ e‑Box bindende motieven in PER2 promotor en repressors PERs en CRYs, die negatief BMAL1 expressie regelen. In het huidige systeem van de verslaggever vergemakkelijkt de ritmische activering van de promotor van de PER2 door BMAL1 en klok circadiane uitdrukking van gedestabiliseerd luciferase, waardoor een nauwkeuriger circadiane periodiciteit van luminescentie signalen. De bouw van een verslaggever plasmide bevat de BMAL1 binding site, de circadiane ritme verbetering site, GC vak en de transcriptie start plaats van de promotor van de hPER2 . De vector voorziet in real-time uitlezing voor cellulaire autonome circadiane ritme in transfected cellen en kan worden gebruikt voor het identificeren van de voorwaarden of bepaalde agentia die dit endogene circadiane patroon van genexpressie veranderen. Echter wanneer cellen gekweekt in vitro of ex vivo, geworden hun circadiane oscillatoren snel gedesynchroniseerd. Daarom is het noodzakelijk om te synchroniseren hun ritmes voordat een circadiane testen uitgevoerd in vitro worden kunnen. In de borstklier epitheliale cellen, vonden we dat 50% HS, melatonine en 100% SQ konden elk voor het opwekken van efficiëntere synchronisatie van het circadiane ritme in vitro. Dexamethason en forskolin geproduceerd alleen gedeeltelijke synchronisatie. Dosis-afhankelijke proeven zou nodig zijn voor de ontwikkeling en de selectie van nieuwe synchroniseren agenten in toekomstige studies. Gezien de lage kosten, efficiëntie en het brede gebruik zoals de synchronisatie-agent, 50% HS bleek te zijn een effectieve synchronisatie-agent die robuust en reproduceerbare cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen en neurale, zoals eerder cellen in vele andere celtypes en verschillende experimentele instellingen24gemeld.
Als u wilt valideren de in vitro model van circadiane verordening, we vervolgens gevraagd dat als de reactie van het circadiane ritme op milieustressoren in vitro de gevolgen zou herhalen we waargenomen in vivo. Eerder, we laten zien dat een enkele kankerverwekkende dosis van NMU verstoord de circadiane uitdrukking van grote CGs (bijvoorbeeld Per2) en verschillende CCGs in de melkklier doel. Bovendien is een chemopreventive regime van MSC reset de circadiane expressie van genen die zowel de Per2 als de CCGs naar de normale. We verder aangetoond dat de blootstelling van cellen aan toxische stoffen en stressoren kunnen veranderen circadiane genexpressie via hun effecten op de NAD+-afhankelijke SIRT1 activiteit7,-8,22. De resultaten verkregen met behulp van de in vitro circadiane verslaggever test bleek dat de blootstelling aan NMU veroorzaakt verstoring van cellulaire circadiane genexpressie, en dat meer interessant, MSC is niet alleen kunnen instellen van de cellulaire circadiane ritme verstoord door NMU, maar ook opnieuw het circadiane ritme verstoord door de SIRT1 remmers. Deze resultaten aangegeven dat de in vitro -assay niet alleen de effecten van NMU op circadiane genexpressie reproduceert, maar ook de effecten van MSC op de verstoorde circadiane ritme in vivo via SIRT1-afhankelijke mechanismen reproduceert. De circadiane verslaggever in vitro systeem dus heeft het potentieel om het detecteren van een scala aan toxische stoffen en stressoren die NAD+/NADH niveaus in de cel veranderen, met inbegrip van directe remmers en modulatoren van cellulaire redox fietsen en genotoxische agenten afbrekende NAD+ via Poly ADP-ribose afhankelijke DNA kunnen repareren32. Deze resultaten stellen voor dat de in vitro verslaggever systeem voorziet in een nuttig instrument om scherm cel voorwaarden en chemische agentia die kunnen verstoren of herstellen circadiane gene verordening in vivo.
Hoewel de in vitro -assay kunt worden instellen cuvetten Transient of stabiel transfected met de verslaggever construct, werden enkele verschillen in de reactie op de behandeling van chemicaliën tussen stabiel en Transient transfected cellen vermeld. Stabiel transfected cellen meer resistent zijn tegen de behandeling van chemicaliën, waren met name NMU en SIRT1 remmers, dan Transient transfected cellen. Deze verschillen kunnen subtiele verschillen in de regulering van de promotor van de vector in stabiele transfectants als gevolg van de invloeden van de sequenties rond specifieke integratie sites weerspiegelen. Selectie van stabiele transfectants door behandeling met antibiotica kan daarom ook klonen die meer resistent tegen verstoring van circadiane zijn selecteren. Individuele in vitro cel modellen met behulp van voorbijgaande of stabiele transfectants moeten dus worden gevalideerd voor hun vermogen om te recapituleren reacties- in vivo . Verschillende transfectie methoden veroorzaken ook uiteenlopende niveaus van genotoxische stress en toxiciteit op cellen en resultaat in hun verschillende gevoeligheid voor toxische effecten van chemische stoffen. Cytotoxiciteit test en piloot experimenten zijn dus vereist voor de selectie van de transfectie en behandeling. Ondanks het verschil in hun gevoeligheid werden de algemene resultaten verkregen met onze cellen van de borstklier epitheliale circadiane verslaggever voor de verstoring en restauratie van cellulaire circadiane ritme door chemische stoffen consistente en vergelijkbare tussen Transient transfected en stabiel transfected cellen, en de resultaten gerecapituleerd de we waargenomen in vivoeffecten.
Om te bepalen als de circadiane verslaggever vector kan worden gebruikt in andere celtypes, waren menselijke glioblastoma/astrocytoom cellen (U-87 MG) stabiel transfected met deze circadiane vector. De voorlopige resultaten met behulp van de cellulaire bioluminescentie in vitro assay bleek dat na synchronisatie deze neurale afkomstige tumorcellen een regelmatige en sterke cellulaire circadiane ritme vergelijkbaar is met die waargenomen in mens borstklier hebben epitheliale cellen. Cellen behandeld met IC261, een bekende inhibitor van caseïne kinase 1 δ (CK1δ) en CK1 ε, toonde een langdurige periode van circadiane, maar lagere amplitude als gerapporteerde by anderen (gegevens niet worden weergegeven)33. Deze resultaten wijzen erop dat de circadiane luciferase verslaggever vector en in vitro cellulaire bioluminescentie bepaling gelden in andere orgel specifieke cellen, met inbegrip van neurale cellen.
Het systeem van de cellulaire verslaggever hier ontwikkeld kan daarom worden gebruikt in grote lijnen als een in vitro assay voor bepaling van de circadiane genexpressie in verschillende soorten cellen in het algemeen. De experimentele procedure is eenvoudig, snel en veilig. Echter dit cellulaire verslaggever systeem kan niet worden gemakkelijk aangepast in cellen die moeilijk zijn te transfect, niet-delende cellen (bijvoorbeeldneuronale cellen), omdat ze hebben een notoir lage transfectie efficiëntie. Virus gebaseerde transfectie methoden (bijvoorbeeld, lentivirus transfectie) kunnen een hogere efficiëntie oplossing bieden voor deze cellen34. Echter, de tijd en moeite die samenhangen met lentivirale opwekking maakt deze methode moeilijk en tijdrovend. Bovendien is een goed veiligheidsniveau lab nodig voor de productie en het gebruik van het virus. Hoge resolutie eencellige luminescentie detectoren kunnen daarnaast worden gebruikt voor de bepaling van persistente, onafhankelijk fasen ritmes van circadiane genexpressie in niet-delende cellen35.
Studies van zoogdieren circadiane ritme in vivo zijn niet alleen arbeid intensieve en dure, maar ze vereisen ook het gebruik van grote aantallen dieren. De beschikbaarheid van systemen in vitro aanzienlijk kan verminderen van het aantal dieren testen associaties tussen verstoring van circadiane genexpressie en de ontwikkeling van chronische ziekten, met inbegrip van carcinogenese en metabole syndroom. Kwantitatieve gegevens over circadiane parameters, met inbegrip van de periode, amplitude en fase kunnen informeren dosis - en/of tijdafhankelijke effecten van chemicaliën op cellulaire circadiane ritme. Bijvoorbeeld, vastgesteld we hebben dat antioxidant die NAC dosis-dependently periode en fase van cellulaire circadiane ritme verstoord door NMU kunt herstellen. De in vitro -model kan ook worden gebruikt voor scherm en milieu circadiane verstoorders classificeren en te onderzoeken van het effect van verstoorde circadiane ritme op de bijzondere waardevermindering van cellulaire functie, mechanistische inzichten te voorzien van de ontwikkeling van interventiestrategieën voor cohorten verhoogd risico op borstkanker, metabole syndromen en neurofysiologische stoornissen, wegens abnormale werkplanningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de maatschappij van toxicologie van 2012 (SOT)-Colgate-Palmolive Grant voor alteratief onderzoek (M. Fang) en de internationale samenwerking onderzoek financieren van dier en Plant quarantaine Agentschap, Republiek Korea (M. Fang), en de NIEHS verlenen P30ES005022 (H. Zarbl). We zouden graag bedanken Dr. Zheng Chen (McGovern Medical School aan de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston) voor zijn nuttige discussie, Mr. Shao-An Juan voor zijn experimentele hulp en Ms. Kimi Nakata voor haar bewijs lezing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
