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Genetics

体外生物荧光法对乳腺上皮细胞昼夜节律的表征

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

一个体外生物荧光法测定乳腺上皮细胞的细胞昼夜节律。该方法利用哺乳动物细胞报告质粒表达不稳定的荧光在周期 2基因启动子的控制下。它可以适应其他细胞类型, 以评估器官特定的影响昼夜节律。

Abstract

昼夜节律是所有生物体中的基本生理过程, 它们调节着从基因表达到睡眠行为等生物过程。在脊椎动物中, 昼夜节律由一个分子振荡器控制, 它在交叉核 (SCN; 中央起搏器) 和包括大多数外围组织的单个细胞中起作用。更重要的是, 暴露于 light-at 夜间、环境压力源和/或毒物的昼夜节律的破坏与慢性疾病和衰老的风险增加有关。能够识别能扰乱中枢和/或周边生物生物钟的药物, 以及能预防或减轻昼夜节律紊乱影响的药物, 对预防慢性病具有重要意义。虽然啮齿类动物模型可以用来识别诱发或预防/减轻昼夜节律紊乱的暴露和药物, 但这些实验需要大量的生物。在体内研究还需要大量的资源和基础设施, 并要求研究人员整夜工作。因此, 迫切需要一个细胞类型的适当的体外系统, 以筛选环境昼夜干扰和细胞类型的促进剂从不同的器官和疾病状态。我们构建了一个向量, 驱动转录的不稳定的荧光在真核细胞的控制下的人的周期 2基因启动子。这种昼夜节律的报告结构被稳定地转染为人乳腺上皮细胞, 并选择了昼夜节律性的记者细胞来发展体外生物荧光检测。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 建立和验证的化验。我们进一步提供详细的概念实验证明的能力, 我们的体外化验, 以重述的体内的影响, 各种化学品的细胞生物钟。结果表明, 该方法可以适应各种细胞类型, 以筛选的环境干扰和化学促进剂的昼夜节律时钟。

Introduction

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生物钟昼夜节律调节着一系列的生物学过程, 从昼夜的基因表达到睡眠行为, 周期约24小时. 流行病学研究强烈表明慢性扰乱昼夜节律节奏增加了轮班工作人员的乳腺癌和前列腺癌的风险, 包括护士和空勤人员1,2,3。这些发现得到了啮齿动物研究的证实, 证明暴露在恒定的光照、light-at 夜间或模拟时差的光周期会增加肿瘤发病率并加速肿瘤的生长4,5。根据人类和啮齿类研究的数据, 国际癌症研究机构在 2010年6将轮班工作归类为可能的人类致癌物 (类型 2A)。

此前, 我们证明, 一个单一的致癌剂量的乳腺肿瘤特异性致癌物, n-硝基-n-脲 (NMU), 扰乱了主要昼夜节律基因 (厘米) 的昼夜表达 (,期间2, Per2) 和几个昼夜节律控制的基因 (CCGs), 包括靶乳腺 (但不是肝脏) 中的关键 DNA 损伤应答和修复 (复员) 基因。此外, 通过化学饮食的膳食L-甲基胱氨酸 (MSC), 将Per2和复员基因的昼夜节律表达复位为正常, 将肿瘤发病率降低63%。这些发现首次显示了昼夜节律, 化学致癌和化学7,8之间的机械联系。暴露于其他环境毒物显示扰乱昼夜基因表达在体内也与增加环境疾病的风险相关9,10。了解环境毒物和致病机制将昼夜节律紊乱联系起来的机理, 可能导致 mechanistically-based 的疾病预防方法。然而, 旨在确定暴露和昼夜节律之间相互作用的研究通常在体内进行.一个典型的体内实验研究对昼夜节律的影响需要大量的动物, 因为至少有三控制的组织和三暴露的动物必须在24或48小时内每3-4 小时收集一次。开发一个验证的体外系统, 重述在体内的观察和机制, 因此不仅减少了所需的动物数量, 而且大大降低了实验成本, 并要求研究人员在24-48 小时内连续工作。此外, 经验证的体外系统可用于高吞吐量的化合物筛选和/或影响昼夜节律的基因改变, 或对环境压力源或毒物的反应。因此, 需要对体外体内模型和实验的策略性结合, 以获得不同焦点的不同见解。

在哺乳动物中, 昼夜节律振荡器不仅存在于 SCN 的专门神经元中, 而且还出现在大多数外围细胞类型中。这些分子钟类似于已建立成纤维细胞系和从胚胎或成年动物的原代成细胞;但是, 需要组织类型特定的蜂窝模型11。因此, 传统的运动活动的研究在体内, SCN外植体ex 体内, 和细胞的在永生化成纤维细胞中的检测被广泛应用于研究自主性的昼夜生理缺陷。然而, 没有证据表明, 一个体外成纤维细胞的检测可以重述其他周边器官的细胞中的昼夜节律机制和反应,体内。不同的细胞类型可以有不同的基因表达模式, 异代谢, 和复员, 以及毒性和昼夜基因表达之间的联系可能是细胞类型的具体和/或不同的生理参数调制。此外, fibroblast-based 系统中的昼夜振荡器尚未得到充分评估, 以应对环境毒物、压力源和预防性药物, 它们将暴露与疾病发展和预防机制联系起来。因此, 需要简便、有效的细胞类型特异性、体外生物荧光检测来研究器官特定的环境昼夜干扰物。虽然各种细胞时钟模型 (例如, 在肝脏, 角质形成细胞, 和脂肪细胞, 以及骨肉瘤干细胞线) 已发展在最近几年12,13,14,15, 这里所描述的是乳腺上皮细胞中的第一个细胞时钟模型, 也是第一次在体内对环境压力源、毒物、药物和化学剂的反应进行复述的示范。

Renilla 荧光 (rLuc) 和萤火虫荧光是 30-61 kDa 单体蛋白, 不需要后处理酶活性, 并可以作为一个遗传学记者后立即翻译。一旦基体与荧光酶相关联, 生物化学反应就会产生闪光。因此, 荧光结构被广泛应用于基因表达报告系统体外体内。然而, 在昼夜节律研究中, 荧光记者的效用受荧光蛋白 (T1/2 = 3.68 h) 相对较长的半衰期的限制, 因为它相对于昼夜节律基因的变化 (特别是短周期)。表达;然而, 多年来许多研究成功地使用了荧光基因在 pGL3 传染媒介, 表明快速地可降解的荧光可能不是必要的为报告昼夜节律, 特别是为节奏以较长的期间, 例如24小时因此, 一个记者质粒使用不稳定的荧光载体, pGL [Luc2P/Neo], 其中包含 hPEST (蛋白质失稳序列) 已经开发, 使我们可以使用它作为一个昼夜报告矢量我们目前的体外生物荧光测定法。由Luc2P编码的蛋白质具有更短的半衰期 (T1/2 = 0.84 h), 因此, 对转录活性的变化比对野生类型的反应更快和更大的程度, 我ndicating 可用于监视PER2启动器在 real-time16中精确调节的荧光的节律表达式。

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Protocol

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1. 构建 PER2 启动器驱动的不稳定荧光报告矢量

  1. 购买自定义的 pLS [ hPER2P / rLuc /普洛] 向量, 其中含有 cDNA 编码 rLuc 和人类 PER2 启动子片段 (hPER2P, 941 bp) 在多个克隆区域 17 中的 Sac I 和 III 之间的站点上.
  2. 将人类的 PER2 启动子片段 (hPER2P, 941 bp) 从向量中剪切出来.
    1. 添加2.5 和 #181; 限制酶缓冲, 10 和 #181; l (180 ng) 请 [ hPER2P / rLuc /普洛] 向量, 1 和 #181; l 每一个限制酶, Sac I (10 单位/和 #181; l) 和后 III (10 单位/和 #181; l), 成 DNA/RNA/无核苷酸离心管。添加超纯水 (10.5 和 #181; l) 最多25和 #181; 我轻轻地混合移.
    2. 在加热块中孵育37和 #176; C 为90分钟.
    3. 运行整卷 (25 #181; L) 的限制酶反应对0.7% 琼脂糖凝胶含有0.0001% 溴溴 (EtBr) 分离 hPER2P 从矢量.
      注: EtBr, 38-氨基-1-乙基 6-phenylphenantridinium 溴化铵 (CAS 注册号: 1239-45-8), 是一种无嗅的红色液体。它是一种插剂, 通常用作琼脂糖凝胶电泳中的荧光标记 (核酸染色), 在紫外光下可见为桔色。虽然没有任何管理机构将其归类为致癌物质, 但在实验动物中发生了不可逆转的诱变效应的可能风险 (18 。因此, 我们收集了含有 EtBr 的琼脂糖凝胶和电泳缓冲剂, 作为化学危险废物, 并要求罗格斯大学环境健康和 #38; 安全 (REHS), 以便能够安全地拾取和处置.
    4. 在 941 bp 切割一条含有 EtBr 荧光带的琼脂糖凝胶, 并用 DNA 凝胶萃取试剂盒从凝胶中提纯 hPER2P 片段, 然后通过测量 260 nm 波长的吸收密度 (OD) 对分光光度计进行量化.
  3. 线性1.0 和 #181; 不稳定的萤火虫荧光表达载体的 L (1 和 #181; g), pGL [ Luc2P /Neo] 使用与步骤 1.2. 1-1. 2.2 中所述相同的方法。提取的载体与 DNA 清除试剂盒后, 量化如上所述使用分光光度计.
  4. 结扎 hPER2P 到线性化向量 pGL [ Luc2P /Neo].
    注: 根据制造商和 #39 的指示, 理想的摩尔比的插入和矢量是2:1。对于 50 ng 向量, 理想的插入量是计算为 23.6 ng 与公式, [(50 ng 向量 x 1.0 kb 插入)/4.242 kb 向量] x (2/1) = 23.6 ng 插入]。根据 hPER2P 的浓度 (7.26 ng/和 #181; l) 和 pGL [ Luc2P /新] (50 ng/和 #181; l), 50 ng pGL [ Luc2P /新] 和 23.6 ng hPER2P 的体积计算为1和 #181; l 和3.26 和 #181; 分别。
    1. 添加2和 #181; L T4 DNA 连接反应缓冲器 (10X) (50 毫米三-HCl, 10 mm 氯化镁 2 , 1 毫米 ATP, 和10毫米的德勤), 3.26 和 #181; l (23.6 ng) hPER2P, 1 和 #181; l (50 ng) pGL [ Luc2P /新尼], 13.74 和 #181; l 水高达20和 #181;, 轻轻地混合.
    2. 添加1和 #181; T4 DNA 连接 (400 单位/和 #181; l), 轻轻地混合, 孵育在16和 #176; C 隔夜在 thermocycler, 然后冷却的结扎向量冰每制造商和 #39 的指示.
  5. 将已结扎的矢量 pGL [ hPer2P / Luc2P /Neo] 转换为具有化学能力的 大肠杆菌 19 .
    1. 设置42和 #176 的水浴; C、加热超级优选汤与物镇压 (soc) 中等 (2% 胰, 0.5% 酵母提取物, 10 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁 2 , 10 毫米 MgSO 4 和20毫米葡萄糖) 在室温, 预热 Luria-Bertani (LB) 琼脂板 (含100和 #181; 氨苄西林, 80 和 #181; g/毫升 X gal, 0.5 和 #181; M IPTG) 在37和 #176; C 孵化器, 解冻在冰上每一个转换的一个合格的 大肠杆菌 细胞.
    2. 添加6和 #181; (21 ng) 结扎向量或1和 #181; l (30 ng) 空向量 (负控制) 到一管化学合格的大肠杆菌 (50 和 #181; l) 然后轻轻地翻转管混合。在冰上孵育30分钟.
    3. 42 #176 热冲击; C 水浴三十年代不摇晃, 然后返回冰.
  6. 选择一个 大肠杆菌 菌落, 使用蓝/白筛选器将其与结扎的向量进行转换.
    1. 添加250和 #181; 在转换后的 大肠杆菌 管中 soc 培养基, 在37和 #176 中孵育1小时; C 以 200 rpm 晃动.
    2. 传播10-50 和 #181; 转换 大肠杆菌 均匀地在 LB 琼脂板的表面上。把盘子倒过来放在37和 #176; C 恒温箱过夜.
      注意: 有效的克隆反应应该产生几百个菌落。电镀两个不同的卷建议, 以确保至少有一个板块将有大, 清晰的白色或蓝色的颜色, 和匀整的殖民地。当殖民地太小, 颜色是不可区分的, 使用显微镜 (10X 或 50X) 是有帮助的.
    3. 从板上取3-6 白色的菌落, 用无菌的牙棒, 并将每个菌落释放到一个含有4毫升培养基的培养基中, 50 和 #181; g/毫升氨苄西林.
    4. 在37和 #176 上孵育管, 在夜间以 200 rpm 晃动。用2毫升的4毫升培养的 大肠杆菌 提取的 dna 质粒 dna 提取迷你准备试剂盒, 每个制造商和 #39 的指令.
  7. 验证并分析插入 (hPER2P, 941 bp)
    1. 以限制性酶消化质粒 DNA, 并按照步骤1.2 中的描述运行电泳. 1-1. 2.3 确认是否有插入.
      注: 阳性对照 (hPER2P 纯化的步骤 1.2.4) 和负控制 ( 大肠杆菌 转化为空向量) 包括在内.
    2. 使用 M13 前向和 M13 反转引物序列选定的质粒 DNA, 以确认在质粒中插入的方向和顺序 19 .
      注: 在测序结果中, 只有一个具有正确尺寸的 hPER2P 在电泳和正确的方向和顺序的一个菌落被选中.
    3. 分析人类 PER2 启动子片段 (hPER2P, 941 bp) 序列的昼夜调节元素, 包括电子盒主题 (Bmal1 绑定网站, 猫/CGTG), CCAATC, GC 框, 转录开始网站 (CAGCGG) 20
  8. 通过将剩余的 2 ml 培养的 大肠杆菌 添加到包含50和 #181 的200毫升培养基中, 从而放大所选的 大肠杆菌
  9. 提取 DNA 与无内毒素质粒最大准备试剂盒每制造商和 #39 的指令, 然后用分光光度计测量 260 nm 波长的外径来量化。分和存储质粒 DNA, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], 在-80 和 #176; C 冷冻以备将来使用.

2。瞬态转染

  1. 购买和区域性 MCF10A 单元格
    1. 从商业细胞库中购买一个永生的、non-transformed 正常的人类乳腺上皮细胞系 (MCF10A), 其中细胞 cytogenetically在冻结前对短串联重复分析进行测试和验证。解冻和保持每瓶冷冻细胞在文化中最多8周.
      注意: 与其他细胞不同, 这些细胞一旦到达 ~ 70% 汇合点, 就会有接触抑制。它要求亚文化在 ~ 70% 进行.
    2. 培养细胞与乳腺上皮细胞生长培养基 (MEGM), 含有乳腺上皮基底培养基 (MEBM), 生长补充剂和霍乱毒素在37和 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 .
      注: 购买 SingleQuot (平方米) 提供的即食生长因子, 并分别获得霍乱毒素。最后的生长补充剂是0.4% 牛垂体提取物, 0.1% 胰岛素, 0.1% 可的松, 0.1% 人表皮生长因子, 100 ng/毫升霍乱毒素, 0.05% 硫酸庆大霉素和0.05% 两性霉素 B.
    3. 将 10 cm 培养皿中的细胞与10毫升胰蛋白酶/EDTA 分离为20分钟, 然后通过加入10毫升胰蛋白酶中和溶液来中和胰蛋白酶。收集所有细胞与 HEPES 缓冲盐水溶液 (HBSS).
    4. 在倒置显微镜下将例计数, 计算单个细胞悬浮液的浓度, 然后根据需要对细胞进行一定数量的种子。将板材彻底旋转, 以获得均匀分布在每个板块中的细胞。孵育细胞培养池在37和 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 .
      注: 购买含有胰蛋白酶/EDTA 的亚文化试剂包, 胰蛋白酶中和溶液, 并 HBSS 使用.
  2. 瞬态转染细胞与构建的昼夜矢量。
    1. 种子 2 x 10 5 MCF10A 细胞均匀地在35毫米培养皿与 MEGM 并且增长到20-30% 汇合 (次日).
    2. 预热降低的血清介质 ( 例如 , 优化) 在37和 #176; C 水浴和转染试剂在室温下30分钟稀释的质粒 DNA (pGL [ hPer2P / Luc2P /Neo]), 以 30 ng/和 #181; 我与内毒素免费三 EDTA (TE) 缓冲并保持室温.
    3. 在1.5 毫升离心管中制备质粒转染混合物, 加入63.6 和 #181; 先加热还原血清培养基, 然后加入33.4 和 #181; l (0.1 和 #181; g) 质粒 DNA, 然后轻轻移, 最后加入3和 #181; 转染试剂直接进入管中心, 不接触墙壁。用移轻轻搅拌后, 在室温下保持30分钟.
    4. 将整个质粒混合物 (100 和 #181; L) 直接放到盘中介质的中心表面, 然后通过摇动盘子轻轻地混合。将 CO 2 孵化器中的单元格培养为额外的 48-72 h.
      注: 据预测, 由于其在 ~ 70% 的接触抑制, 其转染效率最高为40-70%。因此, 转染工作最好从〜20% 开始, 并停止在〜70% 汇合.

3。瞬时转染 MCF10A 细胞中的 体外生物荧光检测法的建立

  1. 在 MEBM 70% 汇合处 (在 48-72 h) 中, 在没有生长因子的情况下, 将培养的细胞饿死在 24 h.
  2. 在 CO 2 孵化器中, 使用同步代理 ( (如 , 50% 马血清 (HS)) 在 MEBM 中处理 1.5 h 的单元格.
    注: 对于理想的同步剂的选择, 10 和 #181; m 佛司可林, 1 nM 褪黑素, 0.1 和 #181; m 地塞米松, 50% HS, 100% 平方在昼夜节律向量转染细胞中的昼夜振幅和周期进行比较。空矢量转染细胞处理100% 平方为负控制.
  3. 预准备20毫升记录介质 (10 的 30 mm 培养皿), 加入5毫升的 MEGM, 15 毫升的 MEBM, 150 和 #181; 碳酸氢钠, 200 和 #181; l HEPES, 40 和 #181; l 素库存解决方案 (50 毫米) 在50毫升灭菌离心管.
    注: 每个成分的最终浓度: 20% 平方和 20 ng/毫升霍乱毒素, 0.06% 碳酸氢钠, 1% 青霉素/链霉素, 和10毫米 HEPES。预热准备记录介质和灭菌的 1x PBS 30 分钟, 在37和 #176; C 水浴。在使用前立即添加100和 #181; M 素.
  4. 在与同步代理进行孵育后, 用温热的 1x Dulbecco #39 的磷酸缓冲盐水 (D-PBS) 清洗电池3次, 然后添加2毫升记录介质.
  5. 用硅脂来密封这道灭菌的盖子, 防止蒸发, 然后将其贴在侧面.
  6. 将密封盘放在计内的座位上, 并打开保存文件夹中文件位置的选项 (有关详细信息, 请参阅6节).

4。稳定转染细胞的选择

  1. 根据制造商和 #39 对稳定转染细胞的选择, 优化理想的 G418 浓度 (800 和 #181; g/毫升), 并采用 kill 曲线法.
  2. 在瞬时转染48小时或72小时后, 亚文化和种子细胞与 MEGM 在更大的盘子在5000细胞或盘 (100 毫米)。24 h 培养在细胞培养孵化器 (37 和 #176; C, 95% 湿度, 5% CO 2 ), 用800和 #181 对单元格进行处理; 用含有800和 #181 的新介质替换旧介质, G418; 克/毫升 G418 每3-4 天2周.
  3. 亚文化生存稳定转染的殖民地1-3 通道与 MEGM 包含500和 #181; g/毫升 G418 保持 hPer2P/Luc2P 的稳定表达, 并在液氮中冷冻以供将来使用.
  4. 治疗500和 #181; 在一般亚文化 G418 后, 重新细胞的稳定转染量, 如果在体外的结果中的生物发光强度在许多段落使用后, 生物荧光检测逐渐降低.

5。使用化学药剂处理

  1. 在48小时或72小时 post-transfection, 将 MEBM 中的细胞从生长因子中饿死24小时.
  2. 同步后与 50% HS 2 小时, 治疗0.25 毫米或0.5 毫米 nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527, 或1和 #181; M cambinol 为 1 h, 在 MEBM 含有20% 平方米的细胞.
  3. 使用 1x D PBS 冲洗后, 添加包含12.5 和 #181 的记录介质; 单独或与 20 nM EX527 或 1 #181; m cambinol, 对细胞。用计监测生物发光.
  4. 将稳定转染的 MCF10A/ PER2 - dLuc 单元格处理为 0.5, NMU 1, 或2毫米, EX527 在 40 nM, 或 Cambinol 在2.0 和 #181; m, 在与 1 HS 同步后 50% h, 然后在含有12.5 和 #181 的记录介质中孵育细胞; MSCn-乙酰半胱氨酸 (NAC) 的不同剂量 (5, 10, 或20和 #181; M)。将印版放在计中, 记录并保存计4-8 天的生物发光, 如3.6 节所述.
    注: NMU 是一种甲基化-n-化合物, 具有致突变、致癌和致畸性质。NMU 是一种直接作用的烷剂, 半衰期很短 (T 1/2 = ~ 30 min)。在酸性条件下 (ph 值为 4-5), 但在碱性条件下 (ph 9-10) 不稳定, 温度在20和 #176 ° C 以上;因此, 10% 的漂白剂可以作为一种有效的停用剂, 用于清洁可能被 NMU 方案污染的工作台面和实验室用具。上.剩余的库存解决方案是提取和安全处置的 REHS。根据化学药剂的作用方式, 在记录培养基培养前, 同步细胞可以进行较短时间的处理。细胞也可以在记录介质中处理较长时间 (几天).

6。数据收集、分析和演示文稿

注意: 需要使用标准方法 (如 "MTT 法") 在相同浓度的相同时间内对细胞进行治疗后确定细胞活力。在 体外 生物荧光检测中使用的所有治疗浓度均低于30% 的致死浓度 (LC30)。所有实验均进行了三份, 并提出了有代表性的结果.

  1. 在密封盘 (步骤 3.5) 后, 将盘子装在计的座椅上, 并将其放在37和 #176 的恒温箱内; C 没有 H 2 O 和 CO 2 , 并连接到计算机.
  2. 单击和 #34; 保存和 #34; 并输入文件夹和文件的名称, 从相应的盘中记录的发光信号将被保存.
    注意: 系统检测 real-time 中的发光信号来自于单个位置的盘中的细胞。信号通过4光子计数光电倍增管传输到计算机, 并通过数据采集软件保存并显示在计算机中.
  3. 在录制4-7 天后对信号进行分析, 如果需要, 可以在第二周进行中等变化和连续录制.
    注意: 为了获得昼夜节律参数, 包括相位、周期长度、节律振幅和阻尼率, 我们利用计分析软件对生物发光数据进行了分析.
  4. Detrend 原始数据的运行平均值, 并分析 best-fits 到正弦波以获得周期、相位、振幅和阻尼率 21 22 .
  5. 由于处理和介质变化时的高瞬态生物发光, 排除了分析数据的第一个循环.
  6. 用于数据演示, 根据时间 (h 或天) 绘制原始数据 (生物发光、计数/秒)。必要时, 可以绘制基线减去数据来比较振幅和相位.

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Representative Results

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昼夜生物发光报告载体: 人的PER2不稳定荧光变体的启动子驱动表达式

DNA 序列包括一个 941 bp 片段从人类的PER2启动器, 用于构建的昼夜报告矢量, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, 首先分析了存在的监管元素已知的调节昼夜基因表达。生物信息学分析表明, 在这个启动子片段, 有三不同的 Bmal1 结合位点 (电子盒) (猫/CGTG), 两个昼夜转录增强网站 (CCAATG), 两个 GC 盒, 和转录开始网站 (图 1)。因此, 这个记者的媒介预计反映了昼夜基因表达。

同步代理优化

一些药物已被用于同步或影响成纤维细胞的自主昼夜节律的体外生物发光研究。为了在乳腺上皮细胞中选择一种高效、cost-effective 的细胞型特异同步剂, 我们比较了10µM 佛司可林、1 nM 褪黑素、0.1 µM 地塞米松、50% HS 和100% 平方乳腺上皮细胞 (MCF10A) 瞬时转染与生理报告媒介。与 50% HS 同步的细胞表现出最佳的昼夜节律, 3 峰值的昼夜诱导发光, 而与其他药物的细胞中只有一两个峰值同步。此外, 与 50% HS 同步的细胞的生物发光剖面在数据分析期间产生了可接受的周期、振幅和最佳值 (图 2)。基于这些结果, 我们选择了这种 cost-effective 方法作为所有后续实验的细胞同步剂。

化学照射对细胞昼夜节律的破坏与恢复

在这个体外模型中, 未经处理的瞬时转染细胞 (控制组) 在同步后显示至少两个完整的发光信号循环 (图 3A)。细胞暴露在直接作用诱变, NMU, 显示了剂量依赖性的破坏, 昼夜基因的表达, 反映了发光峰的损失。当治疗与0.25 毫米 NMU 没有打乱细胞的昼夜节律时, 一剂量0.5 毫米 NMU 最初延迟了和以后取消了昼夜节律, 表明由第二高峰的消失发光在 ~ 72 h 后处理。抑制 SIRT1 活动与 20 nM Ex257 或1µM cambinol 同样打乱了昼夜节律, 抑制随后的昼夜节律周期 (图 3A-1)。重要的是, 添加 MSC (12.5 µM) 的培养基恢复到正常的第一次和第二周期的昼夜基因表达在 NMU 治疗细胞。MSC 不仅恢复了 NMU 中断的节奏, 而且还防止了 SIRT1 抑制剂、Ex257 和 cambinol (图 3A-2) 的破坏性影响。

在稳定转染的细胞中, NMU 和 SIRT1 抑制剂都扰乱了昼夜节律, 尽管浓度高于瞬态转 (图 3B-1)。MSC (12.5 µM) 恢复了被预处理的细胞的昼夜节律1毫米 NMU (图 3B-2)。更重要的是, MSC 也恢复了 SIRT1 抑制剂治疗的细胞的昼夜节律, 包括 EX257 (40 nM) (图 3B-3) 和 cambinol (2 µM) (图 3B(4)), 分别。

相比之下,图 3A图 3B相比, 生物发光强度要高得多, 但在短暂转染的细胞与稳定转染的细胞 (~ 10 倍高, 2 倍短) 的节奏持续时间较短一般, 即使在治疗后的细胞与 NMU 或 MSC。此外, 与稳定转染细胞相比, 细胞昼夜节律在瞬时转染细胞中对化学物质的接触更敏感2倍。

化学物质对细胞昼夜节律的定量剂量依赖性变化

同样, 1 mM NMU 治疗的稳定转染细胞的细胞昼夜节律被破坏, 以剂量依赖性的方式 (0-20 µM) (图 4A), 在生理周期变化 (图4B) 和阶段 (图 4C)。

Figure 1
图 1: 人类的PER2启动子片段序列和生物钟报告向量.(A) 对人类的PER2启动子片段 (941 bp) 进行了测序, 并对功能性昼夜启动子的元素序列进行了分析。电子箱, CACGTT/CATGTG;昼夜转录增强部位, CCAATG;GC 盒, CGCCCC/GGGGCGGG;转录起始点: CAGCGG。(B) 不稳定的荧光报告矢量的原理图, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]。不稳定的荧光 (dLuc) 的转录受hPER2启动子的直接控制。co-expressed 新霉素抵抗基因 (Neo) 促进了 G418 细胞的选择。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 通过不同同步剂的体外细胞昼夜节律同步24小时饥饿后, MCF10A 细胞瞬时转染的昼夜节律报告载体处理每同步代理2小时, 其次是记录发光信号。蓝色, 10 µM 佛司可林;红色, 1 纳米褪黑素;绿色, 0.1 µM 地塞米松;紫色;50% 马血清 (HS);青色, 100% SingleQuot (平方);黄色, 空向量 (负控制)。X 轴, 时间 (天);Y 轴, 生物发光 (计数/分钟)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: MSC 恢复了乳腺上皮细胞中 NMU 和 SIRT1 抑制剂对细胞昼夜节律的破坏. 在与 50% HS 同步后, 对 MCF10A/PER2-dLuc记者细胞进行了生物发光测定。X 轴、时间 (h) (后 NMU 处理时间);Y 轴, 生物发光 (计数/分钟)。(A) 由瞬时转染的细胞产生。(1) 在同步后将单元格处理为0、0.25 或 0.5 mM NMU、20 nM EX527 或1µM cambinol。黄色: 控制;红色: 0.25 毫米 NMU;绿色: 0.5 毫米 NMU;蓝色:20 nM EX527;黄绿色: 1µM cambinol。(2) 单独处理12.5 µM MSC, 或与 20 nM EX527 或1µM cambinol 在记录介质中接触 0.5 mM NMU。黄色: 控制;红色: 0.25 毫米 NMU;绿色: 0.5 毫米 NMU;蓝色: 0.5 毫米 NMU + 12.5 µM MSC;黄绿色: 0.5 毫米 NMU + 12.5 µM 理学硕士 + 20 nM EX527;紫色: 0.5 毫米 NMU + 12.5 µM 理学硕士 + 1 µM cambinol。(B) 由稳定转染的细胞产生。3rd-5th峰值显示了各组之间的清晰和明确的差异, 这是一个具有代表性的结果。(1) 在同步后处理0、0.5、1.0 或 2.0 mM NMU、40 nM EX527 或2µM cambinol 1 h。黄色: 控制;红色: 0.5 毫米 NMU;绿色: 1.0 毫米 NMU;蓝色: 2.0 毫米 NMU;黄绿色:40 nM EX527;紫色: 2 µM cambinol。(2) 在接触到 1.0 mM NMU 后, 在记录介质中使用12.5 µM MSC 处理细胞。黄色: 控制;红色: 1.0 毫米 NMU;绿色: 1.0 毫米 NMU + 12.5 µM MSC。(3) 在接触 40 nM EX257 后, 用12.5 µM MSC 处理细胞。黄色: 控制;红色:40 nM EX257;绿色:40 nM EX257 + 12.5 µM MSC。(4) 在接触到2µM cambinol 后, 用12.5 µM MSC 处理细胞。黄色: 控制;红色: 2 µM cambinol;绿色: 2 µM cambinol + 25 µM 理学硕士。此结果以前已报告, 并在 CC 下获得 2.022许可。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: NAC 剂量依赖性恢复了 NMU 中断的细胞昼夜节律.在同步后, 用1.0 毫米 NMU 或车辆控制对细胞进行1小时的治疗。(A) 代表生物发光 (计数/分钟) 与时间 (h) 的结果。黄色: 控制;红色: 1.0 毫米 NMU;绿色: 1.0 毫米 NMU, 5 µM NAC;蓝色: 1.0 毫米 NMU, 10 µM NAC;黄绿色: 1.0 毫米 NMU, 20 µM NAC。(B) 期间 (小时)。(C) 阶段 (小时)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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在哺乳动物细胞中, 昼夜节律时钟的周期性由相互关联的转录/平移反馈回路调节。Heterodimers 的 Bmal1 和时钟或 Npas2 调节昼夜转录通过绑定到电子盒元素的推动者的核心厘米, 包括Per2, 和许多 CCGs4。当它们在细胞中堆积时, heterodimers 的每一个: 哭 post-translationally 被修饰并传送到细胞核以抑制 Clock:Bmal1 的转录活性。这个负反馈回路允许核心厘米调节自己的转录, 并建立了 CCGs 的韵律表达和23。虽然大多数哺乳动物细胞都有固有的生物钟, 但单个细胞中的生物钟可以通过内在条件 (例如、氧化还原电位) 和外部环境刺激24来同步。昼夜节律基因表达在体内可以同步的褪黑激素, 一种荷尔蒙产生的松果体响应信号从中央心脏起搏器 (SCN)。该 SCN 集成了光撞击的信号, 在视网膜上专门 melanospin 表达感光性视网膜神经节细胞。褪黑激素从松果体中释放进入循环和调节的昼夜节律的 SCN 和大多数外围细胞在试管在体内25,26。昼夜节律也可以调节的压力荷尔蒙 (, 皮质醇和儿茶酚胺)27,28和生长因子29,30。对生长因子的放松管制已知与细胞生长和分化的昼夜破坏有关31

我们构建的昼夜节律报告媒介利用这种负生化反馈机制。核心昼夜负反馈回路包括转录激活剂, BMAL1 和时钟, 它绑定到在PER2启动子, 抑制人和哭的昼夜的电子/E´盒结合图案, 这对 BMAL1 表达负调节。在目前的记者系统, 通过 BMAL1 和时钟的节奏激活的PER2启动器促进了不稳定的荧光的昼夜节律表达, 使发光信号的昼夜周期性更加精确。报告质粒的构建包括 BMAL1 结合位点、昼夜节律增强站点、GC 盒和hPER2启动子的转录起始点。该向量允许 real-time 读出细胞自主昼夜节律在转染的单元, 并可用于确定条件或特定的代理人, 改变这种内源性昼夜模式的基因表达。然而, 当细胞被培养在体外ex 体内,他们的昼夜节律迅速成为同步。因此, 有必要重新同步他们的节奏之前, 任何昼夜测试可以执行体外。在乳腺上皮细胞中, 我们发现 50% HS、褪黑素和100% 平方的每一个都能有效地同步体外的昼夜节律。地塞米松和佛司可林只产生部分同步。在未来的研究中, 对新的同步剂的开发和选择必须进行剂量依赖性试验。由于低成本, 效率和作为同步代理广泛使用, 50% HS 被发现是一种有效的同步剂, 产生强健和重现性细胞昼夜节律的乳腺上皮细胞和神经细胞, 如前在许多其他单元格类型和不同的实验设置中报告24

为了验证的体外模型的昼夜节律调节, 我们接下来问, 如果生理节律的反应, 环境压力源体外将重述我们观察到的效果体内。以前, 我们证明, 一个单一的致癌剂量的 NMU 扰乱了主要的厘米 (, Per2) 和几个 CCGs 在目标乳腺的昼夜表达。此外, 化学方案的 MSC 复位的昼夜表达的Per2和 CCGs 基因走向正常。我们进一步证明, 细胞暴露于毒物和应激源可以改变昼夜的基因表达, 通过其影响与+相关的 SIRT1 活动7,8,22。使用体外的昼夜节律分析结果表明, 暴露于 NMU 引起细胞昼夜节律基因表达的紊乱, 更有趣的是, MSC 不仅能够重置细胞的昼夜节律, 扰乱NMU, 但也复位 SIRT1 抑制剂干扰的昼夜节律。这些结果表明,体外试验不仅重现了 NMU 对昼夜节律基因表达的影响, 而且还通过 SIRT1-dependent 机制重现了 MSC 对被破坏的昼夜节律的影响. 因此,体外昼夜节律报告系统有可能检测到在细胞中改变 NADH 水平的各种毒物和压力源, 包括细胞氧化还原循环的直接抑制剂和调节剂以及毒性通过聚 ADP-核糖依赖性 DNA 修复可以耗尽+的代理32。这些结果表明,体外报告系统提供了一个有用的工具, 以筛选的细胞条件和化学剂, 可以扰乱或恢复昼夜节律基因调节体内

虽然体外检测可以通过瞬时或稳定地转染记者的结构来建立, 但在对瞬态和稳定转染细胞的化学处理反应中也存在一些差异。稳定转染的细胞比瞬态细胞更能抵抗化学物质的治疗, 特别是 NMU 和 SIRT1 抑制剂。这些差异可以反映在稳定转中的矢量启动子的调节的微妙差异, 这是由于在特定积分点周围的序列的影响。因此, 通过抗生素治疗选择稳定的转也可以选择更能抵御昼夜节律紊乱的克隆。因此, 必须对使用瞬态或稳定转的单个体外单元模型进行验证, 以使其能够复述体内响应。不同的转染方法也能引起不同程度的毒性应激和对细胞的毒性, 导致其对化学物质毒性作用的敏感性。因此, 在选择转染和治疗条件时, 需要进行细胞毒性试验和试验试验。尽管它们的灵敏度不同, 但我们的乳腺上皮昼夜节律报告细胞对化学物质的细胞昼夜节律的破坏和恢复的总体结果是一致的, 瞬时转染和稳定转染细胞, 结果扼要的效果, 我们观察在体内

为了确定昼夜节律报告载体是否可以用于其他细胞类型, 人类胶质瘤/星形细胞瘤 (U-87 MG) 被稳定转染为这种昼夜节律向量。使用体外细胞生物发光检测的初步结果表明, 在同步后, 这些神经源性肿瘤细胞具有与人类乳腺中观察到的正常和强的细胞昼夜节律相媲美。上皮细胞。细胞治疗 IC261, 一个众所周知的抑制剂酪蛋白激酶1δ (CK1δ) 和 CK1 ε, 显示了一个长期的昼夜周期, 但低振幅报告 by 其他 (未显示数据)33。这些结果表明, 昼夜荧光报告载体和体外细胞生物发光测定法适用于其他器官特异细胞, 包括神经细胞。

因此, 在这里开发的细胞记者系统可以广泛应用于体外测定不同细胞类型的昼夜节律基因表达。实验过程简单、快速、安全。然而, 这个细胞的记者系统不能很容易地适应的细胞很难染, non-dividing 细胞 (例如, 神经细胞), 因为他们有众所周知的低转染效率。Virus-based 转染方法 (例如, 慢转染) 可以为这些细胞提供更高的效率解决方案34。然而, 与慢生产相关的时间和困难使得这种方法很难和耗时。此外, 一个适当的安全级别实验室是必要的生产和使用的病毒。此外, 高分辨率单细胞发光探测器可用于测定 non-dividing 细胞的持续、独立相节律的昼夜节律基因表达35

哺乳动物昼夜节律的研究在体内不仅耗费劳力, 而且成本高昂, 而且还需要使用大量的动物。体外系统的可用性可以显著减少在生理基因表达中断和慢性疾病 (包括致癌和新陈代谢) 的发展之间测试关联所需的动物数量。综合.定量数据的昼夜参数, 包括周期, 振幅, 和阶段, 可以通知剂量和/或时间的影响, 化学物质的细胞昼夜节律。例如, 我们观察到, 抗氧化剂 NAC 可以依赖于恢复 NMU 的细胞昼夜节律的周期和阶段。体外模型还可用于筛选和分类环境昼夜干扰物, 并研究被打乱的昼夜节律对细胞功能损害的影响, 为发展由于工作时间不正常, 对患乳腺癌、代谢综合征和神经紊乱的人群的干预策略增加。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了2012毒理学学会的支持--高露洁榄替代研究基金 (m) 和大韩民国动植物检疫机构国际合作研究基金会 (m. 方) 和 NIEHS 赠款P30ES005022 (h. Zarbl)。我们要感谢 Dr. (在休斯敦德克萨斯健康科学中心的麦戈文医学院) 为他的有益的讨论, Mr. 绍-一个胡安为他的实验协助, 和 Ms. 基米中田为她的校对阅读。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

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<em>体外</em>生物荧光法对乳腺上皮细胞昼夜节律的表征
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Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

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