Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In Vitro Bioluminescens Assay at karakterisere døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/55832
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

Summary

En in vitro- bioluminescens analyse til at bestemme cellulære døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller er præsenteret. Denne metode udnytter pattedyr celle reporter plasmider udtrykker destabiliseret luciferase under kontrol af periode 2 gen promotor. Det kan tilpasses til andre celletyper til at evaluere orgel-specifikke virkninger på døgnrytme.

Abstract

Døgnrytme er en grundlæggende fysiologiske proces findes i alle organismer, der regulerer biologiske processer lige fra genekspression at sove adfærd. I hvirveldyr, er døgnrytme kontrolleret af en molekylær oscillator, der fungerer i både suprachiasmatic kernen (SCN, centrale pacemaker) og individuelle celler bestående af mest perifere væv. Endnu vigtigere, er afbrydelse af døgnrytme ved udsættelse for lys om natten, miljømæssige stressfaktorer og/eller giftige stoffer forbundet med øget risiko for kroniske sygdomme og aldring. Evnen til at identificere stoffer, der kan forstyrre central og/eller perifere biologiske ure og agenter, der kan forhindre eller mildne virkningerne af døgnrytmen forstyrrelser, har stor betydning for forebyggelse af kroniske sygdomme. Selv om gnavere modeller kan bruges til at identificere engagementer og agenter, der fremkalde eller forhindre/afhjælpe døgnrytmen forstyrrelser, kræver disse eksperimenter stort antal dyr. In vivo undersøgelser også kræver betydelige ressourcer og infrastruktur, og kræver forskere til at arbejde hele natten. Således er der et presserende behov for en celletype egnede in vitro- system til at screene for miljømæssige døgnrytmen disruptorer og smagsforstærkere i celletyper fra forskellige organer og sygdomstilstande. Vi konstrueret en vektor, der driver transskription af den destabiliseret luciferase i eukaryote celler under kontrol af den menneskelige periode 2 gen promotor. Denne døgnrytmen reporter konstruktion var stabilt transfekteret i humane brystkirtler epitelceller, og døgnrytmen lydhør reporter celler blev udvalgt til at udvikle in vitro- bioluminescens assay. Vi præsenterer her, en detaljeret protokollen for at oprette og validere analysen. Vi giver yderligere detaljer om bevis for konceptet eksperimenter viser vores i vitro assay evne til at sammenfatte i vivo -virkningerne af forskellige kemikalier på det cellulære biologiske ur. Resultaterne viser, at analysen kan tilpasses til en lang række celletyper til at screene for både miljømæssige disruptorer og chemopreventive smagsforstærkere af døgnrytmen ure.

Introduction

Døgnrytmen uret regulerer en bred vifte af biologiske processer fra temperaturprofil udtryk af gener at sove adfærd i en forudsigelige rytme med en hyppighed på ca 24 h. Epidemiological undersøgelser stærkt tyder på, at kronisk afbrydelse af døgnrytmen rytme øger risikoen for brystkræft og prostatakræft i skifteholdsarbejde, herunder sygeplejersker og flight besætninger1,2,3. Disse fund er bekræftet af gnaver undersøgelser, viser, at eksponering for konstant lys, lys om natten, eller lys-cyklusser, der efterligner jetlag stigning tumor forekomsten og accelererer tumor vækst4,5. Baseret på data fra undersøgelser af både menneskelige og gnaver, klassificeret den internationale agentur for kræftforskning Skift-arbejde som en sandsynlig kræftfremkaldende (Type 2A) i 20106.

Tidligere var vi vist, at en enkelt kræftfremkaldende dosis af brystkirtler tumor specifikke kræftfremkaldende, N- nitroso-N- methylurea (NMU), forstyrret døgnrytmen udtryk for store døgnrytmen gener (CGs) (fx, periode 2 , Per2) og flere døgnrytmen-kontrollerede gener (samlekortspil), herunder key DNA skader lydhør og reparation (DDRR) gener i mælkekirtlen mål (men ikke i leveren). Derudover nulstille døgnrytmen udtryk for både Per2 og DDRR gener mod normale ved en chemopreventive regime af kosten L-methyl-selenocystein (MSC) reduceret forekomsten af tumor med 63%. Disse resultater var først til at vise en mekanistisk link mellem døgnrytme, kemiske carcinogenese og naturstoffers7,8. Engagementer med andre miljømæssige giftige stoffer vist sig at forstyrre døgnrytmen gen udtryk i vivo er også forbundet med øget risiko for miljømæssige sygdomme9,10. Forstå de mekanismer, der knytter døgnrytmen forstyrrelser af miljømæssige giftstoffer og patogenese kan føre til mekanisk baserede tilgange til sygdomsforebyggelse. Men undersøgelser sigter mod at definere interaktioner mellem engagementer og døgnrytme er normalt udføres in vivo. En typisk i vivo eksperiment undersøger indvirkningen på døgnrytme kræver stort antal dyr, som væv fra mindst tre kontrollere og tre udsatte dyr skal være indsamlet hver 3-4 h en 24 eller 48 h periode. Udvikling af et valideret in vitro- system, der sammenfatter i vivo observationer og mekanismer ville derfor ikke blot reducere antallet af dyr kræves, men også dramatisk reducere eksperimentelle omkostningerne og kravet om at forskere arbejder kontinuerligt over en periode på 24-48 h. Derudover kunne en valideret in vitro- system anvendes til high throughput screening af forbindelser og/eller genetisk ændring, der påvirker døgnrytme, eller dens reaktion på miljømæssige stressfaktorer eller giftige stoffer. Derfor, den strategiske kombination af in vitro- og i vivo modeller og eksperimenter er nødvendig for at opnå forskellige indsigter med forskelligt fokus.

I pattedyr findes døgnrytmen oscillatorer ikke kun i specialiserede neuroner i SCN, men også i mest perifere celletyper. Disse molekylære ure er svarende til de fastlagte fibroblast cellelinjer og primære fibroblaster fra embryoner eller voksne dyr; der er imidlertid behov for væv type-specifikke cellulære modeller11. Derfor, traditionelle undersøgelser af bevægeapparatet aktivitet i vivo, SCN explants ex vivo, og celle-baserede in vitro- assays i udødeliggjort fibroblastceller er meget udbredt at studere celle-selvstændig døgnrytmen defekter. Men der er ingen tegn på, at en in vitro- fibroblast celle-baserede analyse kan sammenfatte døgnrytmen mekanismer og svar til stede i celler af andre perifere organer i vivo. Forskellige celletyper kan have forskellige mønstre af genekspression, xenobiotiske metabolisme og DDRR, og forbindelserne mellem toksicitet og døgnrytmen genekspression kan være celletype specifikke og/eller moduleret af forskellige fysiologiske parametre. Derudover er døgnrytmen oscillatorer i fibroblast-baserede systemer ikke blevet fuldt vurderet for svar til miljømæssige giftstoffer, stressfaktorer og forebyggende agenter, der linker engagementer med mekanismer for udvikling af sygdom og forebyggelse. Der er således behov for letkøbt, validerede celletype specifikke, in vitro- bioluminescens assays til at studere orgel specifikke miljømæssige døgnrytmen disruptorer. Selv om en række forskellige cellulære ur modeller (f.eks.i leveren, keratinocytter, og fedtceller samt en osteosarkom cellelinje) er blevet udviklet i de seneste år12,13,14, 15, analysen beskrevet her er den første cellulære ur model i bryst epitelceller, og den første demonstration at sammenfatte i vivo svar til miljømæssige stressfaktorer, giftstoffer, stoffer og chemopreventive agenter.

Renilla luciferase (rLuc) og firefly luciferase er 30-61 kDa monomere proteiner, der ikke kræver posttranslationelle behandling for enzymatisk aktivitet og kan fungere som en genetiske reporter straks efter oversættelse. Når substratet associates med enzymet luciferase, genererer biokemiske reaktionen katalyseret et lysglimt. Således er luciferase konstruktioner almindeligt anvendt som en gene expression reporter system in vitro- og in vivo. Dog i døgnrytme undersøgelser, nytten af luciferase reporter er begrænset af den relativt lange halveringstid af luciferase protein (T1/2 = 3.68 h) i forhold til perioden (især til den korte periode) for ændringer i døgnrytmen gen udtryk; men talrige undersøgelser over årene har med held brugt luciferase gen i pGL3 vektor, der angiver, at de hurtigt nedbrydeligt luciferase ikke må være nødvendig for at rapportere døgnrytmen, især for rytmer med en længere periode, som 24 h. Derfor, en reporter plasmid bruger destabiliseret luciferase vektor, pGL [Luc2Pneo], der indeholder hPEST (et protein destabilisering sekvens) er blevet udviklet, tillader os at bruge det som en døgnrytmen reporter vektor for vores nuværende in vitro- bioluminescens assay. Protein kodet af Luc2P har en meget kortere halveringstid (T1/2 = 0.84 h) og derfor reagerer hurtigere og med en større styrke på ændringer i transcriptional aktivitet end vildtype, jegndicating, at det kan bruges til at overvåge den rytmiske udtryk for luciferase reguleret af PER2 initiativtageren præcist i real-time16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion af PER2 promotor drevet destabiliseret Luciferase Reporter vektor

  1. købe en tilpassede pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vektor, der indeholder cDNA kodning rLuc og menneskelige PER2 promotor fragment (hPER2P, 941 bp) på webstedet mellem Sac jeg og Hind III i flere kloning region 17.
  2. Cut menneskelige PER2 projektleder fragment (hPER2P, 941 bp) ud fra vektor.
    1. Tilføje 2.5 µL begrænsning enzym buffer, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] 1 µL af restriktionsenzymer, Sac og vektor I (10 enhed/µL) og Hind III (10 enhed/µL), ind i en DNA/RNA/nukleotid-gratis microcentrifuge rør. Tilsættes ultrarent vand (10,5 µL) op til 25 µL og bland forsigtigt af pipettering.
    2. Incubate ved 37 ° C i 90 min i en varme blok.
    3. Køre hele mængden (25 µL) begrænsning enzym reaktion på 0,7% agarosegel indeholdende 0,0001% ethidiumbromid (EtBr) til at adskille hPER2P fra vektoren.
      Bemærk: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium bromid (CAS registreringsnummer: 1239-45-8), er en lugtfri rød væske. Det er en intercalating agent, som er almindeligt brugt som en fluorescerende tag (nucleic acid pletten) i Agarosen gelelektroforese og synlig som en orange farve under UV-lys. Mulige risici for uoprettelige mutagene virkninger har fundet sted i forsøgsdyr, selv om ingen af reguleringsorganerne kategoriseret det som en kræftfremkaldende 18. Derfor, vi indsamlede brugte Agarosen gel og elektroforese buffer som indeholder EtBr som kemiske fare affald, og anmodede om Rutgers miljøsundhed & sikkerhed (REHS) at samle op og bortskaffes sikkert.
    4. Skære et stykke af agarosegel indeholdende en EtBr fluorescens band på 941 bp, og rense hPER2P fragmenter fra gel med en DNA gel udvinding kit, efterfulgt af kvantificering på et spektrofotometer ved at måle absorption densitet (OD) på 260 nm bølgelængde.
  3. Linearize 1,0 µL (1 µg) af destabiliseret firefly luciferase udtryk vektor, pGL [Luc2P / Neo] med den samme metode som beskrevet i trin 1.2.1-1.2.2. Uddrag vektoren med en DNA oprensning kit efterfulgt af kvantificering som beskrevet ovenfor, der bruger et spektrofotometer.
  4. Ligate hPER2P i lineariseret vektor pGL [Luc2P / Neo].
    Bemærk: pr. fabrikanten ' s instruktion, ideel kindtand forholdet mellem Indsæt og vektor er 2:1. 50 ng vektor, Indsæt ideelle mængde beregnes som 23,6 ng med en formel, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vektor] x (2/1) = 23,6 ng insert]. Baseret på koncentrationerne af hPER2P (7.26 ng/µL) og pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), mængden af 50 ng pGL [Luc2P / Neo] og 23,6 ng hPER2P beregnes som 1 µL og 3,26 µL, henholdsvis.
    1. Tilføje 2 µL T4 DNA ligase reaktion buffer (10 X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP og 10 mM DTT) 3,26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], og 13.74 µL vand op til 20 µL , blandes forsigtigt.
    2. Tilføje 1 µL T4 DNA ligase (400 enhed/µL), blandes forsigtigt og inkuberes ved 16 ° C natten over i en thermocycler og derefter chill den sammenskrevne vektor på is per fabrikanten ' s instruktion.
  5. Omdanne den sammenskrevne vektor pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] til kemisk kompetente E. coli 19.
    1. Sæt i vandbad på 42 ° C, varme op Super Optimal bouillon med catabolite undertrykkelse (S.O.C.) medium (2% trypton, 0,5% gær-ekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 og 20 mM glukose) ved stuetemperatur , varme op Luria-Bertani (LB) agar plade (indeholdende 100 µg/mL ampicillin, 80 µg/mL X-gal og 0,5 µM IPTG) i 37 ° C inkubator, og tø på is et hætteglas med kompetente E. coli celler for hver transformation.
    2. Tilføje 6 µL (21 ng) forbundet vektor eller 1 µL (30 ng) Tom vektor (negativ kontrol) til et rør af kemisk kompetente E. coli (50 µL) og derefter forsigtigt flip røret til mix. Der inkuberes i isbad i 30 min.
    3. Varme chok i en 42 ° C vandbad til 30 s uden rysten og derefter vende tilbage til ice.
  6. Vælg en E. coli koloni forvandlet med en sammenskrevne vektor bruger blå/hvid screening.
    1. Tilføje 250 µL S.O.C. medium i den transformerede E. coli tube og Inkuber i 1 time ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
    2. Jævnt 10-50 µL af transformerede E. coli på overfladen af LB agar plade. Sætte pladen op og ned i 37 ° C inkubator natten.
      Bemærk: En effektiv kloning reaktion skal producere flere hundrede kolonier. Plating to forskellige mængder anbefales at sikre, at mindst én plade har stor, klar hvid eller blå farve, og tilstrækkelig godt fordelte kolonier. Når kolonierne er for små, og farven er ikke adskiller sig ved hjælp af et mikroskop (10 X eller 50 X) er nyttige.
    3. Pick 3-6 hvide kolonier fra plader med steriliseret tand pinde, og frigive hver koloni i én kultur rør indeholdende 4 mL af LB næringssubstratet med 50 µg/mL ampicillin.
    4. Ruger rør ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm natten over. Uddrag DNA med 2 mL 4 mL kulturperler E. coli med et plasmid DNA udvinding mini prep kit per fabrikanten ' s instruktion.
  7. Kontroller og analysere indsatsen (hPER2P, 941 bp)
    1. fordøje plasmid DNA med restriktionsenzymer og køre elektroforese, som beskrevet i trin 1.2.1-1.2.3 at bekræfte, hvis der er et indstik.
      Bemærk: Positiv kontrol (hPER2P renset på trin 1.2.4) og negativ kontrol (E. coli forvandlet med en tom vektor) blev inkluderet.
    2. Sekvens valgte plasmid DNA bruge M13 frem og M13 omvendt primere til at bekræfte orientering og rækkefølgen af insertet i plasmid 19.
      Bemærk: Kun én koloni, der havde et indstik med den korrekte størrelse af hPER2P i elektroforese og korrekte orientering og rækkefølgen i sekventering resultatet blev valgt.
    3. Analysere menneskelige PER2 projektleder fragment (hPER2P, 941 bp) sekvens for de døgnrytmen regulerende elementer, herunder E-box motiv (Bmal1 bindingssted, kat/CGTG), CCAATC, GC boks og transskription starte site (CAGCGG) 20.
  8. Uddyber den valgte E. coli ved at tilføje den sidesten 2 mL kulturperler E. coli i 200 mL LB næringssubstratet indeholdende 50 µg/mL ampicillin og derefter inkubere det natten over ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
  9. Uddrag DNA med en endotoxin-fri plasmid maxi prep kit per fabrikanten ' s instruktion, og derefter sætte tal på det ved at måle OD på 260 nm bølgelængde med et spektrofotometer. Alikvot og butik plasmid DNA, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo] på-80 ° C fryser til fremtidig brug.

2. Forbigående Transfektion

  1. Køb og kultur MCF10A celler
    1. Køb en udødeliggjort, ikke-transformeret normale humane brystkirtler epitelcelle linje (MCF10A) fra en kommerciel celle bank, hvor celler er cytogenetically testet og godkendt med korte tandem gentage analyse før frysning. Tø og vedligeholde hvert hætteglas med frosne celler i kultur til et maksimum på 8 uger.
      Bemærk: I modsætning til andre celler, disse celler har kontakt hæmning når de kommer til ~ 70% sammenløb. Det kræver, at subkultur er udført på ~ 70%.
    2. Kultur celler med brystkirtler epitelcelle vækstmediet (MEGM), der indeholder brystkirtler epitelial basal medium (MEBM), vækst kosttilskud og kolera toksin i en celle kultur inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO 2.
      Bemærk: Købe klar-til-brug vækstfaktorer forudsat i SingleQuot (SQ) og få kolera toksin separat. Endelige koncentrationer af vækst kosttilskud er 0,4% kvæg hypofyse ekstrakt, 0,1% insulin, 0,1% hydrocortison, 0,1% human epidermal vækstfaktor, 100 ng/mL kolera toksin, og 0,05% phosphatbufferet sulfat og 0,05% amphotericin B.
    3. Afstand celler i 10 cm kultur fad ved inkubering med 10 mL trypsin/EDTA for ~ 20 min og derefter neutralisere trypsin ved at tilføje 10 mL trypsin neutralisere løsning. Indsamle alle celler med HEPES bufferet saltvand løsning (HBSS).
    4. Tælle celler med en hemocytometer under en inverteret mikroskop og beregne koncentrationen af enkelt cellesuspension, og derefter frø en række celler efter behov. Swirl plader grundigt for at opnå en jævn fordeling af celler i hver tallerken. Inkuber celler i celle kultur inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO 2.
      Bemærk: Køb en subkultur reagens pack indeholder trypsin/EDTA, trypsin neutraliserende løsning og HBSS bruge.
  2. Forbigående Transfektion af celler med døgnrytmen vektoren konstrueret.
    1. Frø 2 x 10 5 MCF10A celler jævnt i 35 mm kultur fad med MEGM og vokse til 20-30% sammenløbet (næste dag).
    2. Varme op den reducerede serum medier (f.eks. Opti-MEM) i 37 ° C vand bad og Transfektion reagens ved stuetemperatur i 30 min. fortyndes plasmid DNA konstrueret (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) til 30 ng/µL med endo-toksin gratis Tris-EDTA (TE) buffer og holde ved stuetemperatur.
    3. Forbered plasmid Transfektion blanding i 1,5 mL microcentrifuge rør ved først at tilføje 63,6 µL varm nedsat serum medier og derefter tilføje 33.4 µL (0,1 µg) plasmid DNA, og bland forsigtigt af pipettering, og derefter endelig tilføje 3 µL af Transfektion reagens direkte ind i midten af røret uden at røre væggen. Efter blandingen forsigtigt af pipettering, holde ved stuetemperatur i 30 min.
    4. Slip hele plasmid blanding (100 µL) direkte på center overfladen af medium i pladen og derefter blandes forsigtigt ved at ryste fadet. Kultur celler i en CO 2 inkubator for yderligere 48-72 h.
      Bemærk: Det forudses, at den højeste Transfektion effektivitet ville være på 40-70% sammenløbet af disse celler som følge af deres kontakt hæmning på ~ 70%. Derfor Transfektion virker bedste starter ved ~ 20% og stop på ~ 70% sammenløbet.

3. Etablering af In Vitro bioluminescens Assay i forbigående transfekteret MCF10A celler

  1. sulte de kulturperler celler på ~ 70% confluence (efter Transfektion for 48-72 h) i MEBM uden vækstfaktorer for 24 h.
  2. Behandling af celler med synkronisering agent (f.eks. 50% hest serum (HS)) i MEBM for 1,5 h i en CO 2 inkubator.
    Bemærk: For udvælgelse af en ideel synkronisering agent, 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0,1 µM dexamethason, 50% HS, og 100% SQ blev sammenlignet med hensyn til døgnrytmen amplitude og varighed i døgnrytmen vektor transfekteret celler. Tom vektor transfekteret celler behandles med 100% SQ som en negativ kontrol.
  3. Pre-prepare 20 mL optagemediet (for 10 af 30-mm kultur retter) ved at tilføje 5 mL af MEGM, 15 mL MEBM, 150 µL natriumbikarbonat, 200 µL HEPES og 40 µL luciferin lager løsning (50 mM) i en 50 mL steriliseret centrifugeglas.
    NOTE: De endelige koncentrationen af enkelte komponenter: 20% SQ og 20 ng/mL kolera toksin, 0,06% natriumbikarbonat, 1% penicillin/streptomycin og 10 mM HEPES. Varme op forberedte optagelse medium og steriliseret 1 x PBS for 30 min i 37 ° C vandbad. Tilføj 100 µM luciferin umiddelbart før anvendelsen.
  4. Cellerne vaskes med varmt 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered saltvand (D-PBS) for 3 gange efter inkubation med synkronisering agent, og derefter tilsættes 2 mL optagelse medium.
  5. Seal skålen med en steriliseret dække klasse bruger silicium fedt at forhindre fordampning og derefter mærke det på siden.
  6. Placere den forseglede parabol på plads inde i luminometrisk, og aktivere indstillingen for at redde filplaceringen i mappen (for detaljer, se afsnit 6).

4. Udvalg af stabilt transfekteret celler

  1. optimere en ideel G418 koncentration (800 µg/mL) med en kill kurve assay ifølge producenten ' s instruktion til valg af stabilt transfected cellerne.
  2. Efter forbigående Transfektion for 48 h eller 72 h, subkultur og frø celler med MEGM i større retter på 5.000 celler/parabol (100 mm). Efter 24 timer behandling kultur i celle kultur inkubator (37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO 2) celler med 800 µg/mL af G418 ved at erstatte den gamle medium med nyt medie som indeholder 800 µg/mL G418 hver 3-4 dage til 2 uger.
  3. Subkultur den overlevende stabilt transfekteret kolonier for 1-3 passager med MEGM indeholdende 500µg/mL G418 at opretholde stabile udtryk for hPer2P/Luc2P, og fryse i flydende nitrogen til fremtidig brug.
  4. Behandler 500µg/mL G418 efter generelle subkultur igen vælge den stabilt transfected befolkning af celler, hvis bioluminescens intensiteten i resultatet af in vitro- bioluminescens assay bliver gradvist lavere efter brug i mange passager.

5. Behandling med kemikalier

  1. på 48 h eller 72 h efter Transfektion, sulte celler fra vækstfaktorer i MEBM for 24 h.
  2. Efter synkronisering med 50% HS til 2 h, behandling af celler med 0,25 eller 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol for 1 h i MEBM indeholdende 20 sq
  3. Efter vask med 1 x D-PBS, tilføje optagelse medium indeholdende 12,5 µM MSC, alene eller i kombination med 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol til cellerne. Overvågning bioluminescens med luminometrisk.
  4. Behandler den stabilt transfected MCF10A / PER2-dLuc celler med NMU på 0,5, 1 eller 2 mM, EX527 på 40 nM eller Cambinol på 2,0 µM i 1 time efter synkronisering med 50% HS, og derefter inkuberes celler i optagelse medium indeholdende 12,5 µM af MSC eller forskellige doser (5, 10 eller 20 µM) af n-acetylcystein (NAC). Læg pladerne i luminometrisk, optage og gemme bioluminescens af luminometrisk for 4-8 dage som beskrevet i afsnit 3.6.
    Bemærk: NMU er en methylerede nitrosourea stof med mutagene, kræftfremkaldende og fosterskadende egenskaber. NMU er en direkte virkende alkylating agent og har en kort halveringstid (T 1/2 = ~ 30 min). Det er stabilt på sure tilstand (pH 4-5), men ustabile på basisk tilstand (pH 9-10) og ved temperaturer over 20 ° C. Derfor, blegemiddel på 10% kan bruges som en effektiv deaktivering agent for rengøring bænk overflader og lab bagværk potentielt kontamineret af NMU solutipå. Sidesten stamopløsning er hentet op og sikkert bortskaffes ved REHS. Baseret på virkningsmekanisme af kemikalier, kan synkroniseret celler blive behandlet for kortere tid før dyrkning i optagemediet. Celler kan også behandles i optagemediet i længere tid (flere dage).

6. Dataindsamling, analyse og præsentation

Bemærk: cellernes levedygtighed skal bestemmes ved hjælp af standard metoder (fx MTT assay) efter behandling af celler på samme koncentrationer for samme tidspunkter angivet. Alle behandling koncentrationerne anvendes i in vitro- bioluminescens analysen var lavere end de 30% dødelig koncentration (LC30). Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og repræsentative resultater blev præsenteret.

  1. Efter forsegling parabol (trin 3.5), indlæses retterne op på pladserne i luminometrisk, som holdes i en inkubator, indstillet på 37 ° C uden H 2 O og CO 2, og er tilsluttet en computer.
  2. Klik " Gem " og indtaste navne for denne mappe og fil hvor optaget luminescence signalet fra den tilsvarende parabol vil blive gemt.
    Bemærk: Systemet registrerer luminescence signalet i realtid fra cellerne i parabol på individuelle positioner. Signalerne er overført til computeren via 4-photon-tælle photomultiplier rør, og gemmes og vises i computeren data collection software.
  3. Analysere signalerne efter optagelse i 4-7 dage, som kunne blive efterfulgt af medium forandring og kontinuerlig optagelse i en anden uge om nødvendigt.
    Bemærk: For at opnå døgnrytmen parametre, herunder fase, periodelængden, rytme amplitude og damping sats, brugte vi luminometrisk analyse software til at analysere bioluminescens data.
  4. Detrend rå data med et løbende gennemsnit, og analysere de bedste-passer til en sinusbølge at få periode, fase, amplitude og damping sats 21 , 22.
  5. På grund af den høje forbigående bioluminescens ved behandling og medium forandring, udelukke den første cyklus af data fra analysen.
  6. Til præsentation af data, plot rådata (bioluminescens, count/s) mod tiden (h eller dag). Når det er nødvendigt, trækkes fra baseline data kan afbildes at sammenligne amplitude og fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Døgnrytmen bioluminescens reporter vektor: menneskelige PER2 projektleder-drevet udtryk for destabiliseret luciferase variant

DNA-sekvens bestående af en 941 bp fragment stammer fra menneskelige PER2 initiativtageren bruges til at konstruere døgnrytmen reporter vektor, pGL [hPer2P/Luc2Pneo, blev først analyseres for forekomst af regulerende elementer kendt for at regulere døgnrytmen genekspression. Bioinformatik analyse viste, at inden for denne promotor fragment, der er tre forskellige Bmal1 bindingssteder (E-box) (kat/CGTG), to døgnrytmen transskription styrke websteder (CCAATG), to GC kasser og en transskription startstedet (figur 1). Derfor var denne reporter vektor forventet for at afspejle døgnrytmen genekspression.

Optimering af synkronisering agent

Flere agenter har været brugt til at synkronisere eller påvirke det autonome døgnrytme af fibroblastceller for in vitro- bioluminescens undersøgelser. For at vælge en effektiv og omkostningseffektiv celletype bestemt synkronisering agent i Brystkirtlerne epitelceller, vi sammenlignede 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0,1 µM dexamethason, 50% HS og 100% SQ i Brystkirtlerne epitelceller (MCF10A) forbigående transfekteret med døgnrytmen reporter vektor. Celler synkroniseret med 50% HS viste de bedste døgnrytme, med 3 toppe af døgnrytmen induceret luminescens, sammenlignet med kun én eller to toppe i celler synkroniseret med andre agenter. Derudover bioluminescens profiler af celler synkroniseres med 50% HS produceret acceptabel periode, amplitude og passer bedst værdi under dataanalyse (figur 2). Baseret på disse resultater, vi har valgt denne omkostningseffektive metode som celle synkronisering agent for alle efterfølgende forsøg.

Afbrydelse og genoprettelse af cellulære døgnrytme af kemiske eksponeringer

I dette in vitro- model, ubehandlet, forbigående transfekteret celler (kontrolgruppen) viste mindst to komplette cyklusser af luminescence signalering efter synkronisering (figur 3A). Celler udsat for direkte virkende mutagen, NMU, viste en dosisafhængig afbrydelse af døgnrytmen genekspression, som afspejles af tabet af luminescence toppe. Mens behandling med 0,25 mM NMU ikke forstyrre den cellulære døgnrytme, en dosis på 0,5 mM NMU forsinket oprindeligt og senere afskaffet døgnrytme, som angivet af forsvinden af andet toppen af luminescence på ~ 72 h efter behandling. Hæmning af SIRT1 aktivitet med 20 nM Ex257 eller 1 µM cambinol ligeledes forstyrret døgnrytme af dæmpning den efterfølgende døgnrytmen cyklus (figur 3A-1). Vigtigere, tilsætning af MSC (12,5 µM) til næringssubstratet restaureret mod normale første og anden cyklusser af døgnrytmen genekspression i NMU-behandlede celler. MSC ikke kun restaureret rytme forstyrres af NMU, men også forhindret de forstyrrende effekter af SIRT1-hæmmere, Ex257 og cambinol (figur 3A-2).

I stabilt transfekteret celler forstyrret både NMU og SIRT1 hæmmere døgnrytme, omend ved højere koncentrationer end det observerede i forbigående transfectants (figur 3B-1). MSC (12,5 µM) restaureret døgnrytmen i cellerne forbehandlet med 1 mM NMU (figur 3B-2). Endnu vigtigere, MSC også restaureret døgnrytmen i cellerne behandles med SIRT1-hæmmere, herunder EX257 (40 nM) (figur 3B-3) og cambinol (2 µM) (figur 3B(4)), henholdsvis.

Til sammenligning mellem figur 3A og figur 3Bbioluminescens intensitet var meget højere, men rytmen var lidt for en kortere tid i forbigående transfekteret celler vs stabilt transfekteret celler (~ 10 gange højere, 2 gange kortere) i General, selv efter behandling af celler med NMU eller MSC. Derudover var det cellulære døgnrytme 2-fold mere følsomme over for eksponering for kemikalier i forbigående transfekteret celler i forhold til de stabilt transfected celler.

Kvantitative dosisafhængig ændring af cellulære døgnrytme af kemikalier

Ligeledes, den forstyrrede cellulære døgnrytme stabilt transfected celler behandles med 1 mM NMU blev restaureret af behandling af NAC i en dosisafhængig måde (0-20 µM) (figur 4A) som bemærket i ændringer af døgnrytmen periode (figur 4B ) og fase (fig. 4 c).

Figure 1
Figur 1: Sekvens af menneskelige PER2 projektleder fragment og døgnrytmen reporter vektor. (A) menneskelige PER2 projektleder fragment (941 bp) blev sekventeret, og sekvensen blev analyseret for elementerne af funktionelle døgnrytmen promotor. E-boks, CACGTT / CATGTG; døgnrytmen transskription forbedre site, CCAATG; GC boks, CGCCCC / GGGGCGGG; transskription starter site (TSS): CAGCGG. (B) skematisk diagram over destabiliseret luciferase reporter vektor, pGL [hPer2P/Luc2Pneo]. Transskription af destabiliseret luciferase (dLuc) er under direkte kontrol af hPER2 promotor. En co udtrykt neomycin resistens gen (Neo) letter udvælgelsen af inficerede celler ved G418. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: synkronisering af in vitro- cellulære døgnrytme af forskellige synkronisering agenter. Efter 24 h sult, blev MCF10A celler forbigående transfekteret af døgnrytmen reporter vektor behandlet med hver synkronisering agent til 2 h, efterfulgt af optagelse luminescence signal. Blå, 10 µM forskolin; rød, 1 nM melatonin; grøn, 0,1 µM dexamethason; lilla; 50% hest serum (HS); krikand, 100% SingleQuot (SQ); gul, Tom vektor (negativ kontrol). X-aksen, tid (dag); Y-aksen, bioluminescens (count/min). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: MSC restaureret cellulære døgnrytmen forstyrret af NMU og SIRT1 hæmmere i Brystkirtlerne epitelceller in vitro-. Bioluminescens assays blev udført på MCF10A /PER2-dLuc reporter celler efter synkronisering med 50% HS. X-aksen, tid (h) (post-NMU indvirkningstid); Y-aksen, bioluminescens (count/min). (A) resultater fra forbigående transfekteret celler. (1) celler blev behandlet med 0, 0,25 eller 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol for 1 time efter synkronisering. Gul: kontrol; rød: 0,25 mM NMU; grøn: 0,5 mM NMU; blå: 20 nM EX527; gul grøn: 1µM cambinol. (2) celler blev behandlet med 12,5 µM MSC alene eller i kombination med 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol i optagelse medium efter eksponering for 0,5 mM NMU. Gul: Kontrol; rød: 0,25 mM NMU; grøn: 0,5 mM NMU; blå: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC; gul grøn: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 20 nM EX527; lilla: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 1 µM cambinol. (B) resultater fra stabilt transfekteret celler. De 3rd- 5th toppe, som viste rene og klare forskelle mellem grupper er præsenteret som et repræsentativt resultat. (1) celler blev behandlet med 0, 0.5, 1.0 eller 2,0 mM NMU, 40 nM EX527 eller 2 µM cambinol for 1 time efter synkronisering. Gul: Kontrol; rød: 0,5 mM NMU; grøn: 1.0 mM NMU; blå: 2,0 mM NMU; gul grøn: 40 nM EX527; lilla: 2 µM cambinol. (2) celler blev behandlet med 12,5 µM MSC i optagelse medium efter eksponering for 1.0 mM NMU. Gul: Kontrol; rød: 1.0 mM NMU; grøn: 1.0 mM NMU + 12,5 µM MSC. (3) celler blev behandlet med 12,5 µM MSC følgende eksponering til 40 nM EX257. Gul: Kontrol; rød: 40 nM EX257; grøn: 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) celler blev behandlet med 12,5 µM MSC følgende eksponering for 2 µM cambinol. Gul: Kontrol; rød: 2 µM cambinol; grøn: 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Dette resultat var tidligere rapporteret og er licenseret under CC af 2.022. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: NAC dosis-afhængigt restaureret den cellulære døgnrytme forstyrret af NMU. Celler blev behandlet med 1,0 mM NMU eller køretøjet kontrol for 1 time efter synkronisering. (A) repræsentative resultatet af bioluminescens (count/min) mod tiden (h). Gul: Kontrol; rød: 1.0 mM NMU; grøn: 1.0 mM NMU, 5 µM NAC; blå: 1.0 mM NMU, 10 µM NAC; gul grøn: 1.0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) periode (timer). (C) fase (timer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I pattedyrceller, er hyppighed af døgnrytmen uret reguleret af sammenkoblede transcriptional/translationel feedback-sløjfer. Heterodimers af Bmal1 og enten uret eller Npas2 regulere døgnrytmen transskription af binding til E-box elementer i initiativtagerne til core CGs, herunder Per2 og grædeog talrige samlekortspil4. Som de ophobes i cellen, heterodimers af Per: Cry er post-translationally ændret og transporteres til kernen til at undertrykke uret: Bmal1 transcriptional aktivitet. Denne negative feedback loop tillader core CGs at regulere deres egen transskription og konfigureret rytmiske udtryk for CGs og samlekortspil23. Selv om de fleste mammale celler har en iboende døgnrytmen ur, ure i enkelte celler kan synkroniseres ved begge iboende betingelser (fx, redox potentiale) og eksterne miljømæssige stimuli24. Døgnrytmen gen udtryk i vivo kan samtidighed af melatonin, et hormon der produceres af pinealkirtlen i reaktion på signaler modtaget fra det centrale pacemaker (SCN). SCN integrerer signaler fra lys plejeafhængige specialiserede melanospin-udtrykker lysfølsomme retinal ganglion celler i nethinden. Melatonin frigives fra pinealkirtlen træder omsætning og regulerer døgnrytme af SCN og mest perifere celler in vitro og i vivo25,26. Døgnrytme kan også reguleres ved stress hormoner (f.eks., kortisol og katekolaminer)27,28 og vækstfaktorer29,30. Deregulering af vækstfaktorer er kendt for at være forbundet med døgnrytmen forstyrrelser af celle vækst og differentiering31.

Døgnrytmen reporter vektor vi konstrueret udnytter denne negative biokemiske feedback-mekanisme. Core døgnrytmen negativ feedback loop består af transcriptional aktivatorer, BMAL1 og ur, som binder sig til døgnrytmen E/E´-box bindende motiver i PER2 promotor og repressors PERs og krystal, som negativt regulerer BMAL1 udtryk. I den nuværende reporter system letter den rytmiske aktivering af PER2 promotor af BMAL1 og ur døgnrytmen udtryk for destabiliseret luciferase, giver mulighed for en mere præcis døgnrytmen hyppighed af luminescence signaler. Opførelsen af en reporter plasmid omfatter BMAL1 bindingssted, døgnrytme forbedre webstedet, GC boks og transskription startstedet for hPER2 . Vektor giver mulighed for real-time udlæsning til cellulære autonome døgnrytme i transfekteret celler og kan bruges til at identificere betingelser eller specifikke agenser, der ændrer dette endogene døgnrytmen mønster af genekspression. Men når cellerne er kulturperler i in vitro eller ex vivo, deres døgnrytmen oscillatorer hurtigt blive desynchronized. Det er derfor nødvendigt at synkronisere deres rytmer, før nogen døgnrytmen assays kan være udført i vitro. I Brystkirtlerne epitelceller, fandt vi, at 50% HS, melatonin og 100% SQ var hver stand til at inducere effektiv synkronisering af døgnrytme in vitro. Dexamethason og forskolin produceret kun delvis synkronisering. Dosisafhængig tests ville være nødvendige for udvikling og udvælgelse af nye synkronisering agenter i fremtidige undersøgelser. Givet den lave omkostninger, effektivitet og sin omfattende brug som synkronisering agent, 50% HS blev fundet for at være effektiv synkronisering agent, produceret robust og reproducerbare cellulære døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller og neurale celler, som tidligere rapporterede i mange andre celletyper og forskellige eksperimentelle indstillinger24.

For at validere i vitro model af døgnrytmen forordning, spurgte vi næste, hvis døgnrytme reaktion på miljømæssige stressfaktorer i vitro ville sammenfatte effekterne vi observeret in vivo. Tidligere, vi viste, at en enkelt kræftfremkaldende dosis af NMU forstyrret døgnrytmen udtryk for store CGs (f.eks. Per2) og flere samlekortspil i mælkekirtlen mål. Desuden nulstille en chemopreventive regime af MSC døgnrytmen udtryk for både Per2 og samlekortspil gener til normalitet. Vi yderligere vist, at udsættelse af celler for giftige stoffer og stressfaktorer kan ændre døgnrytmen genekspression gennem deres virkninger på NAD+-afhængige SIRT1 aktivitet7,8,22. Resultaterne ved hjælp af in vitro- døgnrytmen reporter Analysen viste, at eksponering for NMU forårsagede afbrydelse af cellulære døgnrytmen genekspression, og at mere interessant, MSC ikke er kun mulighed for at nulstille den cellulære døgnrytme forstyrret af NMU, men også nulstille døgnrytme forstyrret af SIRT1-hæmmere. Disse resultater viste, at in vitro assay ikke kun reproducerer virkningerne af NMU på døgnrytmen genekspression, men også gengiver virkningerne af MSC på den forstyrrede døgnrytmen rytme i vivo via SIRT1-afhængige mekanismer. In vitro- døgnrytmen reporter system har derfor potentialet til at opdage en række giftstoffer og stressfaktorer, der ændrer NAD+/NADH niveauer i cellen, herunder direkte hæmmere og modulatorer af cellulære redox cykling samt genotoksiske agenter, der kan nedbryder NAD+ via Poly ADP-ribose afhængig DNA reparation32. Disse resultater tyder på, at in vitro reporter system giver et nyttigt redskab til skærmen til celle betingelser og kemiske agenser, der kan forstyrre eller gendanne døgnrytmen gen forordning i vivo.

Selv om i vitro assay kan konfigureres ved hjælp af celler forbigående eller stabilt transfekteret med journalist konstruere, blev der konstateret nogle forskelle i respons til behandling af kemikalier mellem forbigående og stabilt transfekteret celler. Stabilt transfected cellerne var mere resistente over for behandling af kemikalier, især NMU og SIRT1 hæmmere, end forbigående transfekteret celler. Disse forskelle kunne afspejle subtile forskelle i reguleringen af vektor promotor i stabil transfectants på grund af påvirkninger fra de sekvenser omkring specifikke integration websteder. Udvalg af stabil transfectants af antibiotisk behandling kan derfor også vælge kloner, som er mere modstandsdygtige over for døgnrytmen forstyrrelser. Således skal individuelle in vitro- cell modeller ved hjælp af forbigående eller stabil transfectants valideres for deres evne til at sammenfatte i vivo svar. Forskellige Transfektion metoder også fremkalde varierende niveauer af genotoksisk stress og toksicitet på celler og resultat i deres forskellige følsomhed over for giftige virkninger af kemikalier. Cytotoksicitet test og pilot forsøg er derfor påkrævet for udvælgelse af Transfektion og behandlingsbetingelser. Trods forskellen i deres følsomhed var de samlede resultater med vores brystkirtler epitelial døgnrytmen reporter celler for afbrydelse og genoprettelse af cellulære døgnrytme kemikalier sammenhængende og sammenlignelige mellem forbigående transfekteret og stabilt transfekteret celler, og resultaterne, sammenfattet de vi observerede in vivovirkninger.

For at bestemme, hvis døgnrytmen reporter vektor kunne bruges i andre celletyper, var menneskelige glioblastom/astrocytoma celler (U-87 MG) stabilt transfekteret med denne døgnrytmen vektor. De foreløbige resultater ved hjælp af in vitro- cellulære bioluminescens Analysen viste, at efter synkronisering, disse neurale-afledte tumorceller har en regelmæssig og stærk cellulære døgnrytme svarende til den konstaterede i menneskelige brystkirtler epitelceller. Celler behandles med IC261, en velkendt hæmmer af kasein kinase 1 δ (CK1δ) og CK1 ε, viste en langvarig døgnrytmen periode, men lavere amplitude som rapporteret by andre (data ikke vist)33. Disse resultater viser, at døgnrytmen luciferase reporter vektor og i vitro cellulære bioluminescens assay er gældende i andre orgel specifikke celler, herunder neurale celler.

Cellulære reporter system udviklet her kunne derfor bruges bredt som en i vitro assay for bestemmelse af døgnrytmen genekspression i forskellige celletyper i almindelighed. Den eksperimentelle proceduren er enkel, hurtig og sikker. Men denne cellulære reporter system kan ikke være let tilpasses i celler, der er vanskeligt at transfect, ikke-dividere celler (f.eks.neuronale celler), da de har notorisk lav Transfektion effektivitetsgevinster. Virus-baseret Transfektion metoder (fx, lentivirus Transfektion) kan tilbyde en højere effektivitet løsning for disse celler34. Men tid og besvær forbundet med lentiviral produktion gør denne metode, vanskeligt og tidskrævende. Desuden er et passende sikkerhedsniveau lab nødvendige for fremstilling og anvendelse af virus. Høj opløsning enkelt celle luminescence detektorer kan desuden anvendes til bestemmelse af persistente, uafhængigt gradvis rytmer af døgnrytmen genekspression i ikke-dividere celler35.

Studier af pattedyr døgnrytme i vivo er ikke kun arbejdskraft intensiv og bekostelig, men de kræver også brug af et stort antal dyr. Tilgængeligheden af in vitro- systemer kan reducere antallet af dyr skal teste sammenslutninger mellem afbrydelse af døgnrytmen genekspression og udvikling af kroniske sygdomme, herunder carcinogenese og metaboliske syndrom. Kvantitative data på døgnrytmen parametre, herunder periode, amplitude og fase, kan underrette dosis - og/eller tidsafhængig virkninger af kemikalier på cellulære døgnrytme. For eksempel, observeret vi at antioxidant NAC kan dosis-afhængigt gendanne periode og fase af cellulære døgnrytme forstyrret af NMU. In vitro- modellen kunne også bruges, at skærmen og klassificere miljømæssige døgnrytmen disruptorer og undersøge virkningen af forstyrret døgnrytme på værdiforringelse af cellulære funktion, giver mekanistiske indsigt for udvikling af interventionsstrategier for kohorter øget risiko for brystkræft, metaboliske syndromer og neurofysiologiske forstyrrelser, på grund af unormale arbejdsplaner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af 2012 samfund af toksikologi (SOT)-Colgate Palmolive Grant for Alterative forskning (M. Fang) og den internationale samarbejde forskning finansiere fra dyr og plante karantæne agentur, Republikken Korea (M. Fang), og NIEHS yde P30ES005022 (H. Zarbl). Vi vil gerne takke Dr. Zheng Chen (McGovern medicinsk School ved University of Texas Health Science Center i Houston) for hans hjælpsomme diskussion, Mr. Shao-An Juan for hans eksperimentelle bistand og Ms. Kimi Nakata for hendes korrekturlæsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).

Tags

Genetik sag 127 Circadian rhythm periode 2 promoter aktivitet, in vitro- real-time bioluminescens assay luciferase udtryk vektor destabiliseret firefly luciferase plasmid Transfektion.
<em>In Vitro</em> Bioluminescens Assay at karakterisere døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y.,… More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter