Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/55832
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

Summary

וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג'ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.

Abstract

שעון ביולוגי הוא היסוד תהליך פיזיולוגי נוכח כל האורגניזמים מווסת תהליכים ביולוגיים החל ביטוי גנים לישון התנהגות. גולגולת, שעון ביולוגי נשלטת על ידי מתנד מולקולרית המתפקד הן תצלובתי (SCN; קוצב הלב המרכזית) והן תאים בודדים הכוללת רקמות היקפיים ביותר. חשוב מכך, שיבוש בשעון הביולוגי על ידי חשיפה לאור בלילה, לחצים סביבתיים ו/או חשיפה לרעלים משויך סיכון מוגבר של מחלות כרוניות והזדקנות. היכולת לזהות סוכנים יכול לשבש שעונים ביולוגיים מרכזי ו/או ציוד היקפי, וסוכני שניתן למנוע או להקטין את ההשפעות של שיבוש היממה, השלכות משמעותיות לצורך מניעת מחלות כרוניות. אף על פי מודלים מכרסמים יכול לשמש כדי לזהות חשיפות וסוכנים לגרום או למנוע/לצמצם שיבושים היממה, ניסויים אלה מחייבים מספרים גדולים של בעלי חיים. מחקרים in vivo גם דורשים תשתיות ומשאבים רבים, והן דורשות לחוקרים לעבוד כל הלילה. לפיכך, יש צורך דחוף עבור סוג התא המתאים במבחנה מערכת עבור הסביבה משבשים היממה, משפרי סוגי תאים מסך של איברים שונים ועם מצבי מחלה. אנחנו נבנה וקטור שמניע שעתוק של לוציפראז destabilized התאים האיקריוטים תחת השליטה של האמרגן גנים אנושיים פרק 2 . המבנה הזה, כתב היממה היה transfected stably לתוך תאי האפיתל החלב אדם, היממה כתב מגיבים תאים נבחרו כדי לפתח את הבדיקה ביולומינסנציה במבחנה . כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור ולאמת וזמינותו. בהמשך, אנו מספקים פרטים להוכחת ניסויים קונספט להפגין את יכולתם של שלנו assay במבחנה מסכם את הדברים ויוו השפעת כימיקלים שונים על השעון הביולוגי הסלולר. התוצאות מצביעות על כך וזמינותו ניתן להתאים מגוון רחב של סוגי תאים על המסך עבור משבשים סביבתיים והן משפרי chemopreventive משעונים היממה.

Introduction

השעון היממה מווסת את מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים ההשתנות היומית הביטוי של הגנים לשכב התנהגות בקצב צפוי תקופתיות של 24 ח' אפידמיולוגיים מחקרים ממליצים כי הפרעה כרונית של היממה קצב מגביר את הסיכון של השד, סרטן הערמונית אצל עובדי משמרת, כולל אחיות וטיסה קרוז1,2,3. ממצאים אלה הם שחלקית מחקרים מכרסמים, הוכחת חשיפה מתמדת אור, אור בלילה, או אור מחזורים לחקות ג'ט-לג עלייה גידול שכיחות ומאיץ הגידול צמיחה4,5. על סמך נתונים ממחקרים אנושיים וטכנולוגיים מכרסמים, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המסווגים עבודה במשמרת קרצינוגן אדם סביר (סוג 2A) 20106.

בעבר, להדגים זאת מסרטנים מנה אחת של החלב גידול ספציפי מסרטן, N- nitroso-N- methylurea (NMU), שיבשו את הביטוי היממה של הגנים העיקריים היממה (CGs) (למשל, פרק 2 , Per2) ואת מספר היממה מבוקר גנים (CCGs), כולל מפתח נזק לדנ א מגיבים ותיקון גנים (DDRR) בבלוטת החלב היעד (אך לא את הכבד). יתר על כן, איפוס הביטוי היממה של גנים הן Per2 והן DDRR לכיוון הרגיל על-ידי משטר chemopreventive של התזונה L-מתיל-selenocysteine (MSC) מופחת השכיחות של הגידול בשיעור של 63%. ממצאים אלה היו הראשונים כדי להציג קישור מכניסטית בין שעון ביולוגי, כימי carcinogenesis chemoprevention7,8. חשיפות אחרים חשיפה לרעלים סביבתיים שמוצג כדי לשבש את ג'ין היממה ביטוי ויוו קשורים גם עם סיכון מוגבר של מחלות הסביבה9,10. הבנת המנגנונים לקשר שיבוש סדר היום על ידי חשיפה לרעלים סביבתיים ו פתוגנזה עלול להוביל גישות מבוססות mechanistically למניעת מחלות. עם זאת, מחקרים במטרה להגדיר את האינטראקציות בין החשיפות, שעון ביולוגי מבוצעות בדרך כלל ויוו. טיפוסי ויוו ניסוי חוקר שההשפעה על שעון ביולוגי דורשת מספרים גדולים של בעלי חיים, כמו רקמות לפחות שלושה לשלוט וצריך שלוש חיות חשוף אסף h כל 3-4 על פני תקופה h 24 או 48. התפתחות מערכת המאומת במבחנה אשר recapitulates ויוו תצפיות ומנגנונים ולכן לא רק להפחית את מספר בעלי החיים הנדרש, אבל גם באופן דרמטי להפחית עלויות ניסיוני הדרישה כי חוקרים לעבוד ברציפות במשך 24-48 שעות. יתר על כן, ניתן להשתמש במערכת מאומתים במבחנה להקרנה תפוקה גבוהה של תרכובות ו/או שינוי גנטי המשפיעים על שעון ביולוגי, או את תגובתה לחצים סביבתיים או חשיפה לרעלים. לפיכך, שילוב האסטרטגי במבחנה ויוו דגמים וניסויים נדרשים להשיג תובנות שונות עם מיקוד שונה.

ביונקים, מתנדים היממה קיים לא רק נוירונים מיוחדים של SCN, אלא גם בסוגי תא ביותר היקפיים. השעונים מולקולרית דומים לאלה שורות תאים פיברובלסט הוקמה, ראשי fibroblasts עוברי או למבוגרים בעלי חיים; עם זאת, יש צורך רקמה דגמי הסלולר ייחודיים לסוג11. כתוצאה מכך, מחקרים המסורתי של פעילות גינקולוגיות ויוו, SCN explants ex-vivo, מבוססת-תא במבחנה מבחני תאי פיברובלסט מונצחים נמצאים בשימוש נרחב ללמוד פגמים היממה תא-אוטונומי. אולם, אין ראיות המציין כי במבחנה פיברובלסט מבוססת תא assay יכול לסכם מנגנונים היממה, תגובות להציג בתאים של אחרים איברים היקפיים ויוו. סוגי תאים שונים יכול יש דפוסים ברורים של ביטוי גנים, חילוף החומרים xenobiotic ו- DDRR, הקישורים בין רעילות היממה גנים עשויים להיות תא מסוג מסוים ו/או מאופנן על ידי פרמטרים פיזיולוגיים שונים. בנוסף, מתנדים היממה במערכות מבוססות פיברובלסט לא היה מלא להעריך תגובות חשיפה לרעלים סביבתיים, לחצים של סוכני מניעה לקשר חשיפות מנגנוני התפתחות מחלות ומניעה. לפיכך, יש צורך נתיישב, לאמת תאים מסוג ספציפי, במבחנה ביולומינסנציה מבחני ללמוד משבשים היממה סביבתי ספציפי איברים. למרות מגוון דגמים שעון סלולרי (למשל, הכבד, keratinocytes, תאי שומן, כמו גם קו תא אוסטאוסרקומה) פותחו בשנים האחרונות12,13,14, 15, וזמינותו המתוארים כאן הוא המודל שעון סלולרי הראשון תאים אפיתל בשד, ההפגנה הראשונה כדי לסכם תגובות ויוו לחצים סביבתיים, חשיפה לרעלים, סמים של סוכנים chemopreventive.

לוציפראז Renilla (rLuc) גחלילית לוציפראז 30-61 kDa monomeric חלבונים אשר אינם דורשים posttranslational עיבוד אנזימטי לפעילות, יכול לתפקד בתור כתבת גנטי מיד עם תרגום בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. ברגע המצע משייכת האנזים לוציפראז, התגובה הביו מזורז יוצר הבזק של אור. לפיכך, בונה לוציפראז נמצאים בשימוש נרחב ג'ין ביטוי כתב מערכת במבחנה , בתוך vivo. עם זאת, במחקרים שעון ביולוגי, השירות של הכתב לוציפראז מוגבל על ידי מחצית החיים ארוך יחסית של החלבון לוציפראז (T1/2 = 3.68 h) ביחס התקופה (במיוחד כדי לתקופה קצרה) לקראת שינויים ג'ין היממה ביטוי; עם זאת, מחקרים רבים לאורך השנים השתמשו בהצלחה את הגן לוציפראז ב וקטור pGL3, המציין לוציפראז מתכלה במהירות ייתכן שלא יהיה צורך לדיווח מקצבים השעון הביולוגי, במיוחד עבור הקצב עם תקופה ארוכה יותר, כגון h 24 שעות ביממה. לכן, כתב פלסמיד באמצעות וקטור לוציפראז גרם אולי לפגיעה ביציבות, pGL [Luc2P/Neo], המכיל hPEST (חלבון הקשורה רצף) פותחה, ומאפשר לנו להשתמש בו כמו וקטור היממה כתב עבור שלנו זרם במבחנה ביולומינסנציה וזמינותו. החלבון המקודד על ידי Luc2P יש הרבה מחצית חיים קצר יותר (T1/2 = 0.84 h), ומכאן, מגיב מהר יותר, בעוצמה גדולה יותר לשינויים בפעילות תעתיק יותר פראי-סוג, אניndicating כי ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר הביטוי האומנותית של לוציפראז מוסדר על ידי האמרגן PER2 במדויק ב בזמן אמת16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הבנייה של PER2 יזם מונע גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז כתב וקטור

  1. לרכוש מותאם אישית pLS [hPER2P / rLuc / פורו] וקטור שמכיל cDNA קידוד rLuc האדם PER2 יזם פרגמנט (hPER2P, 941 bp) באתר בין שק הינד השלישי ב אזור שיבוט מספר 17 ואני.
  2. חתך השבר האנושי של יזם PER2 (hPER2P, 941 bp) מתוך הווקטור.
    1. µL להוסיף 2.5 אנזים הגבלה מאגר, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / פורו] וקטור, 1 µL כל של אנזימים ההגבלה, Sac I (יחידה 10/µL) ו- III הינד (10 יחידות/µL), לתוך ה-DNA/RNA/נוקלאוטיד ללא צינור microcentrifuge. להוסיף מים הנדסה גנטית (10.5 µL) 25 µL, לערבב בעדינות על-ידי pipetting.
    2. Incubate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות בתוך גוש חימום.
    3. להפעיל כל אמצעי האחסון (25 µL) התגובה אנזים הגבלה על 0.7% agarose ג'ל המכיל 0.0001% אתידיום ברומיד (EtBr) כדי להפריד את hPER2P וקטור.
      הערה: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium ברומיד (מספר רישום CAS: 1239-45-8), הוא נוזל אדום חסר ריח. זה סוכן intercalating זה נפוץ בשימוש כמו פלורסנט שאצרף (הכתם חומצה nucleic) agarose בג'ל ונראה לעין כמו צבע כתום תחת אור UV. סיכונים אפשריים של תופעות בלתי הפיך מוטגניות התרחשו בחיות ניסוי, למרות כל הסוכנויות הרגולטוריות כידידותיים זה מסרטן 18. לכן, אנחנו שנאספו בשימוש agarose ג'ל ו אלקטרופורזה מאגר המכיל EtBr כפסולת סיכון כימי, וביקש בריאות וסביבה רוטגרס & בטיחות (REHS) כדי להרים והיפטרו בבטחה.
    4. לחתוך חתיכה של agarose ג'ל המכיל להקה. זריחה EtBr 941 bp, ולטהר את שברי hPER2P הג'ל עם ערכת חילוץ של ג'ל DNA ואחריו כמת על ספקטרופוטומטרים על ידי מדידת צפיפות הקליטה (OD)-260 ננומטר גל-
  3. µL linearize 1.0 (1 µg) של גרם אולי לפגיעה ביציבות גחלילית לוציפראז ביטוי וקטור, pGL [Luc2P / ניאו] באותה שיטה כפי שמתואר שלבים 1.2.1-1.2.2. לחלץ את הווקטור עם ערכת ניקיון DNA ואחריו כימות כמתואר לעיל באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  4. מאתרים ומפסיקים את hPER2P לתוך pGL וקטור ליניארית [Luc2P / ניאו].
    הערה: לכל היצרן ' s הוראה, היחס טוחנת אידיאלי של insert ווקטור הוא 2:1. עבור 50 ng וקטור, מידת אידיאלי הוספה מחושבת כעבודה 23.6 ng עם הנוסחה, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb וקטור] x (2/1) = הוספה ng 23.6]. מבוסס על ריכוז hPER2P (7.26 ng/µL), pGL [Luc2P / ניאו] (50 ng/µL), הכרכים של 50 ng pGL [Luc2P / ניאו], 23.6 ng hPER2P מחושבים 1 µL, 3.26 µL, בהתאמה. התגובה
    1. להוסיף 2 µL T4 DNA ליגאז מאגר (10 X) (50 מ מ טריס-HCl 10 מ מ MgCl 2, 1 מ מ ATP, 10 מ מ DTT), 3.26 µL (23.6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / ניאו], 13.74 µL מים µL עד 20 , מערבבים בעדינות.
    2. להוסיף µL 1 T4 DNA ליגאז (400 יחידות/µL), מערבבים בעדינות דגירה ב 16 ° C לילה ב- thermocycler ואני אז תירגע הווקטור מחוברים על הקרח לכל היצרן ' הוראה s.
  5. להפוך את pGL וקטור מחוברים [hPer2P / Luc2P / ניאו] כדי כשיר מבחינה כימית e. coli 19.
    1. להגדיר את האמבט במים-42 ° C, לחמם מרק אופטימלית סופר בינונית הדיכוי (S.O.C.) catabolite (2% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 10 מ מ NaCl, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl 2, MgSO 10 מ מ 4 וגלוקוז 20 מ מ) בטמפרטורת החדר , לחמם לוריא-Bertani (LB) אגר צלחת (המכיל אמפיצילין µg/mL 100, 80 µg/mL X-גל ו- 0.5 מיקרומטר IPTG) ב- 37 מעלות צלזיוס חממה, להפשיר על הקרח בקבוקון אחד של המוסמכים e. coli בתאי לשינוי כל.
    2. µL להוסיף 6 (21 ng) מאתרים וקטוריים או 1 µL (30 נג) לרוקן וקטור (בקרה שלילית) שפופרת אחת של כשיר מבחינה כימית e. coli (50 µL) ולאחר מכן להפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. דגירה על קרח במשך 30 דקות
    3. חום הלם בתוך אמבט מים 42 ° C ל 30 s מבלי לרעוד, ואז לחזור קרח
  6. בחר של המושבה e. coli טרנספורמציה עם וקטור מחוברים באמצעות הקרנה כחול/לבן-
    1. µL S.O.C. להוסיף 250 במדיום טרנספורמציה e. coli צינור, תקופת דגירה זה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
    2. נמרח בקלות 10-50 µL של טרנספורמציה e. coli על פני השטח של צלחת אגר ליברות. להכניס את הצלחת הפוך חממה 37 º C למשך הלילה.
      הערה: לתגובה שכפול יעיל צריך לייצר מספר מושבות מאות. ציפוי שני כרכים שונים, מומלץ להבטיח כי צלחת אחת לפחות יהיה צבע גדול, ברור לבן או כחול, ועל מושבות היטב במרווחים. כאשר המושבות קטנות מדי, הצבע אינו ניתן להבחנה, באמצעות מיקרוסקופ (10 X או 50 X) שימושית.
    3. לבחור 3-6 מושבות לבן של הצלחות עם מקלות השן מעוקר, ולשחרר את כל המושבה לתוך תרבות אחת שפופרת המכילה 4 מ ל LB בינוני תרבות עם 50 אמפיצילין µg/mL.
    4. דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל"ד למשך הלילה. לחלץ את הדנ א באמצעות 2 מ של 4 mL תרבותי e. coli עם פלסמיד DNA החילוץ מיני ההכנה ערכת לכל היצרן ' הוראה s.
  7. אימות ולנתח את תותב (hPER2P, 941 bp)
    1. לעכל את פלסמיד DNA עם אנזימי הגבלה ולהפעיל אלקטרופורזה כפי שמתואר 1.2.1-1.2.3 צעדים כדי לאשר אם יש מוסף.
      הערה: בקרת חיובי (hPER2P טהור בשלב 1.2.4) שליטה שלילי (e. coli טרנספורמציה עם וקטור ריק) היו כלולים.
    2. רצף ה-DNA פלסמיד שנבחר באמצעות M13 קדימה M13 תחל הפוכה כדי לאשר את הכיוון ואת רצף של הוספה פלסמיד 19.
      הערה: מושבה היחידה היו מוסף עם הגודל הנכון של hPER2P אלקטרופורזה, לתקן את הכיוון ואת רצף בתוצאה רצף נבחר.
    3. לנתח השבר האנושי של יזם PER2 (hPER2P, 941 bp) רצף עבור הרכיבים רגולטוריות היממה, כולל מוטיב E-box (Bmal1 אתר קישור, החתול/CGTG), CCAATC, תיבת GC, תמלול להתחיל באתר (CAGCGG) 20-
  8. Amplify e. coli שנבחר על-ידי הוספת mL 2 שאריות תרבותי e. coli לתוך תרבות 200 מ ל LB בינוני המכיל אמפיצילין µg/mL 50, אז המקננת אותו בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  9. DNA לחלץ עם מקסי ללא אנדוטוקסין פלסמיד תכינו ערכת לכל היצרן ' s הוראה, ולכמת אז זה על ידי מדידת OD-260 ננומטר גל עם ספקטרופוטומטרים. Aliquot וחנות הדנ א פלסמיד, pGL [hPer2P/Luc2P/ניאו], ב- 80 ° C מקפיא לשימוש עתידי.

2. תרביות תאים ארעית

  1. רכישה ואת התרבות תאים MCF10A
    1. רכישה קו מונצחים, שאינו משתנה נורמלי החלב אפיתל תאי אדם (MCF10A) מפרסומת תא הבנק, איפה תאים cytogenetically טנדם קצר בדוקה ומאומתת עם חזור על ניתוח לפני ההקפאה. הפשרת ולשמור על כל בקבוקון של תאים קפוא בתרבות לתקופה מקסימלית של 8 שבועות.
      הערה: בניגוד לתאים אחרים, תאים אלה יש סימן דיכוי ברגע שהיה להם את הנהרות ~ 70%. זה דורש את תת-תרבות הוא ניצח ב ~ 70%-
    2. התרבות התאים עם החלב תאים אפיתל צמיחה בינוני (MEGM), המכילים החלב בינוני הבזליים אפיתל (MEBM), תוספי צמיחה ו רעל כולרה חממה תרבות תא 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO 2.
      הערה: לרכוש גורמי גדילה מוכן לשימוש מסופקים ב- SingleQuot (SQ) ולקבל טוקסין הכולרה בנפרד. ריכוז סופי של תוספי צמיחה הן 0.4% תמצית יותרת המוח שור, 0.1% אינסולין, הידרוקורטיזון 0.1%, גורמים אנושיים 0.1% גדילה עוריות, רעלן 100 ננוגרם למ"ל כולרה, ואת סולפט gentamycin 0.05% 0.05% שהוא גוסס B.
    3. מביצועם התאים בצלחת ס מ-10 התרבות על ידי דגירה עם 10 מ"ל טריפסין/EDTA עבור ~ 20 דקות, ואז ולנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 10 מ"ל טריפסין נטרול פתרון. לאסוף כל התאים עם HEPES buffered תמיסת מלח (HBSS).
    4. לספור את התאים עם hemocytometer תחת מיקרוסקופ הפוכה לחשב את הריכוז של התליה תא בודד ו ואז זרע מספר מסוים של תאים לפי הצורך. מערבולת הלוחות ביסודיות כדי להשיג ריפודי כתופיים של תאים בכל צלחת. דגירה תאים בחממה תרבות תא 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO 2.
      הערה: לרכוש חבילת ריאגנט תת-תרבות המכילה EDTA/טריפסין, פתרון נטרול טריפסין, HBSS להשתמש.
  2. תקנים ארעית של תאים עם וקטור היממה נבנה.
    1. זרע 2 x 10 תאים 5 MCF10A אחיד בתרבות 35 מ מ צלחת עם MEGM ולגדול הנהרות 20-30% (למחרת).
    2. חם למעלה מופחת סרום מדיה (למשל, Opti-מ) ב- 37 מעלות צלזיוס המים ריאגנט טורקי, תרביות תאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לדלל את פלסמיד DNA נבנה (pGL [hPer2P / Luc2P / ניאו]) כדי 30 ng/µL עם אנדו-הרעלן חינם מאגר טריס-EDTA (TE) ולשמור בטמפרטורת החדר.
    3. להכין את התערובת תרביות תאים פלסמיד צינור microcentrifuge 1.5 mL על-ידי הוספת מדיה חמים מופחת סרום µL 63.6 תחילה, ולאחר מכן הוספת µL 33.4 (0.1 µg) פלסמיד ה-DNA, ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting ולאחר מכן ולבסוף הוספת 3 µL של תרביות תאים ריאגנט ישירות למרכז של הצינור מבלי לגעת בקיר. לאחר ערבוב בעדינות על-ידי pipetting, לשמור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות
    4. תוריד את התערובת כולה פלסמיד (100 µL) ישירות על גבי משטח מרכז של המדיום בצלחת, ואז מערבבים בעדינות ע י ניעור המנה. התרבות התאים חממה 2 CO עבור ה 48-72 נוספים
      הערה: הוא ניבא כי היעילות הגבוהה של תרביות תאים תהיה זרימה 40-70% של תאים אלה עקב בלימת הקשר שלהם ב ~ 70%. לכן, תרביות תאים עובד הכי טוב החל ~ 20% ולהפסיק ב ~ 70% הנהרות.

3. הקמת וזמינותו ביולומינסנציה ב Vitro תאים Transiently Transfected MCF10A

  1. להרעיב את התאים בתרבית על הנהרות ~ 70% (לאחר תקנים עבור 48-72 שעות) ב- MEBM ללא גורמי גדילה עבור 24h.
  2. לטיפול תאי עם סינכרון של סוכן (לדוגמה, 50% הסוס סרום (HS)) ב- MEBM 1.5 ש ח בחודש חממה 2 CO.
    הערה: עבור מבחר של סוכן סינכרון אידיאלי, 10 מיקרומטר forskolin, מלטונין nM 1, דקסמתזון מיקרומטר 0.1, 50% HS ו- 100% SQ הושוו במונחים של משרעת היממה ותקופת בתאים וקטור היממה transfected. תאים ריקים וקטור transfected מטופלים עם 100% ר כפקד שלילי.
  3. Pre-prepare 20 מ"ל ההקלטה בינוני (עבור 10 של מאכלים תרבות 30-מ מ) על-ידי הוספת 5 מ של MEGM, 15 מ"ל של MEBM, 150 µL סודיום ביקרבונט, 200 µL HEPES luciferin 40 µL במניה פתרון (50 מ מ) בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל עיקור.
    הערה: הריכוזים הסופי של כל הרכיבים: 20% קמ ר ו 20 ng/mL כולרה הרעלן, 0.06% סודיום ביקרבונט, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו 10 מ מ HEPES. חמם מראש מוכן הקלטה בינוני של עיקור PBS x 1 למשך 30 דקות באמבט מים של 37 ° C. להוסיף 100 מיקרומטר luciferin מיד לפני השימוש.
  4. לרחוץ את התאים עם חם 1 x Dulbecco ' s מלוחים Phosphate-Buffered (D-PBS) עבור 3 פעמים אחר הדגירה עם הסוכן סינכרון ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל הקלטה בינונית.
  5. חותם את המנה עם מחלקה כיסוי סטיריליים באמצעות סיליקון גריז כדי למנוע אידוי, אז לתייג את זה בצד.
  6. למקם את המנה אטום במושב בתוך luminometer, הפעל את האפשרות לשמירת מיקום הקובץ בתיקיה (לפרטים, ראה סעיף 6).

4. בחירת התאים Transfected Stably

  1. מיטוב של ריכוז G418 אידיאלי (800 µg/mL) עם assay עקומה להרוג לפי היצרן ' s הדרכה לבחירה של התאים stably transfected.
  2. לאחר ארעי תרביות תאים עבור 48 h או 72 h, תת-תרבות של הזרע התאים עם MEGM במנות גדולות יותר ב- 5,000 תאים/צלחת (100 מ מ). לאחר 24 שעות תרבות בחממה תא תרבות (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, ו- 5% CO 2), מתייחסים התאים עם 800 µg/mL של G418 על-ידי החלפת המדיום הישן בינוני חדש המכיל 800 µg/mL G418 כל 3-4 ימים לשבועיים.
  3. תת-תרבות ההישרדות stably transfected מושבות על פסוקים 1-3 עם MEGM המכיל 500µg/mL G418 כדי לשמור על הביטוי יציב של hPer2P/Luc2P, להקפיא במצב חנקן נוזלי לשימוש עתידי.
  4. מתייחסים 500µg/mL G418 לאחר תת-תרבות הכללית לבחירת מחדש את האוכלוסייה stably transfected של תאים, אם עוצמת ביולומינסנציה בתוצאה של במבחנה ביולומינסנציה assay המקפיצים בהדרגה לאחר השימוש קטעים רבים.

5. טיפול בכימיקלים

  1. ב-48 h או 72 h שלאחר תרביות תאים, להרעיב את התאים של גורמי גדילה ב- MEBM עבור 24h.
  2. לאחר סינכרון עם 50% HS כבר שעתיים, יטפל בתאים nitrosomethylurea 0.25 מ"מ או 0.5 מ מ (NMU), nM EX527 20 או cambinol 1 מיקרומטר עבור h 1 ב MEBM המכיל 20% מ ר
  3. אחרי כביסה עם 1 x D-PBS, הוספת הקלטת בינוני המכיל מיקרומטר 12.5 MSC לבד, או בשילוב עם 20 ננומטר EX527 או cambinol 1 מיקרומטר, על התאים. ניטור של ביולומינסנציה עם luminometer.
  4. מתייחסים את MCF10A stably transfected / PER2-תאים dLuc עם NMU 0.5, 1 או 2 מ מ, EX527-40 ננומטר, או Cambinol-מיקרומטר 2.0, עבור h 1 לאחר סינכרון עם 50% HS, ואז דגירה התאים ההקלטה בינוני מיקרומטר 12.5 המכיל של MSC או מינונים שונים (5, 10 או 20 מיקרומטר) של n-אסטילסיסטיין (NAC). למקם את לוחיות הרישוי luminometer, שיא ולשמור את ביולומינסנציה מאת luminometer 4-8 ימים כמתואר בסעיף 3.6.
    הערה: NMU הוא nitrosourea מפוגל מתחם עם מאפיינים מוטגן, מסרטנים ו- teratogenic. NMU הוא סוכן ישיר-משחק מסוכן ויש לו מחצית חיים קצר (T 1/2 = ~ 30 דקות). זה יציב במצב חומצי (pH 4-5), אבל לא יציב במצב אלקליין (pH 9-10), בטמפרטורה מעבר 20 º C. לכן, אקונומיקה ב-10% יכול לשמש כסוכן deactivating יעיל עבור ניקוי משטחים ספסל, משטיחים מעבדה זיהום פוטנציאלי מאת NMU solutiב. פתרון מניות שאריות הרים למעלה, בבטחה מסולק על ידי REHS. בהתבסס על מצב הפעולה של חומרים כימיים, תאים מסונכרן יכולים להיות מטופלים לזמנים קצרים יותר לפני culturing ההקלטה בינוני. התאים ניתן גם לטפל המדיום הקלטה למשך זמן ארוך יותר (מספר ימים).

6. איסוף נתונים, ניתוח, מצגת

הערה: תא הכדאיות צריך להיקבע תוך שימוש בשיטות הרגילות (למשל, MTT assay) אחרי טיפול של תאים בריכוזים אותו באותם הזמנים שצוין. כל טיפול ריכוזי בשימוש וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה היו נמוכות יותר מאשר הריכוז קטלני 30% (LC30). כל הניסויים נערכו שהפקידים ואת תוצאות נציג הוצגו.

  1. לאחר שחתמת את המנה (שלב 3.5), לטעון את המנות אל המושבים בשורה luminometer, אשר נשמר בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 ° C ללא H 2 O ו CO 2 ומחובר למחשב.
  2. לחץ " להציל " והזן את השמות עבור התיקיה ושם הקובץ שבו האות המוקלט הפריה חוץ גופית מן המנה המתאימה יישמרו.
    הערה: המערכת מזהה את האות הארה ב בזמן אמת את התאים בצלחת-תפקידים בודדים. האותות הם מועברים למחשב דרך צינורות האופטיקה 4-פוטון-סומך, הציל ואת המוצגים במחשב על-ידי התוכנה אוסף נתונים.
  3. לנתח את האותות לאחר ההקלטה 4-7 ימים, אשר אחריו על-ידי שינוי בינוני, הקלטה רציפה במשך שבוע נוסף במידת הצורך.
    הערה: כדי לקבל פרמטרים היממה, כולל שלב, אורך התקופה, קצב משרעת ולאחר דעיכת קצב, השתמשנו בתוכנה ניתוח luminometer לנתח את הנתונים ביולומינסנציה.
  4. Detrend נתונים גולמיים עם ממוצע של פועל, ולנתח את הטוב ביותר-מתאים לגל סינוס כדי לקבל מחזור, שלב, משרעת ו דעיכת שיעור 21 , 22-
  5. עקב ביולומינסנציה ארעי גבוהה בעת טיפול ושינוי בינוני, אל תכלול את המחזור הראשון של נתוני ניתוח.
  6. עבור תצוגת נתונים, להתוות נתונים גולמיים (ביולומינסנציה, ספירה/s) נגד הזמן (h או יום). בעת הצורך, ניתן להתוות נתונים יופחת הבסיס להשוואה בין משרעת ושלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביולומינסנציה היממה כתב וקטור: PER2 מונחה יזם הביטוי האנושי לוציפראז גרם אולי לפגיעה ביציבות משתנה

רצף הדנ א הכוללת קטע bp 941 נגזר האמרגן PER2 האדם נהגו לבנות הווקטור כתב היממה, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, נותחו לראשונה לנוכחות של הרגולציה מרכיבים הידועים לווסת ביטוי גנים היממה. ביואינפורמטיקה ניתוח הראה כי בתוך שבר זה יזם, ישנם שלושה Bmal1 מחייב אתרים שונים (E-box) (החתול/CGTG), שני שעתוק היממה וחלוקתו (CCAATG), שתי תיבות GC אתרי אתר התחלת שעתוק (איור 1). ומכאן וקטור הכתב הזה היה הצפוי משקפים ביטוי גנים היממה.

אופטימיזציה של הסוכן סינכרון

מספר סוכנים שימשו לסינכרון או להשפיע על ביולוגי האוטונומי של תאי פיברובלסט ללימודי ביולומינסנציה ' במבחנה . לבחירת סוכן ספציפי סינכרון יעילה וחסכונית -סוג התא בתאי אפיתל החלב, השווינו 10 מיקרומטר forskolin, מלטונין nM 1, מיקרומטר 0.1 דקסאמתאזון, 50% HS ו- 100% ר החלב תאי אפיתל (MCF10A) transiently transfected עם וקטור כתב היממה. תאים מסונכרן עם 50% HS הראה את שעון ביולוגי הטוב ביותר, עם 3 שיאים של היממה המושרה הפריה חוץ גופית, בהשוואה לפסגות אחד או שניים בתאים מסונכרן עם סוכנים אחרים. בנוסף, הפרופילים ביולומינסנציה של תאים מסונכרן עם 50% HS הפיק תקופה מקובל, משרעת וערך מיטבית במהלך ניתוח נתונים (איור 2). על סמך ממצאים אלה, בחרנו בשיטה חסכונית זו כסוכן סינכרון תא כל הניסויים הבאים.

הפרעה ושחזור של הסלולר שעון ביולוגי על-ידי חשיפות כימי

במודל זה במבחנה , ללא טיפול, transiently transfected תאים (קבוצת הביקורת) הראה לפחות שני מחזורים מלאה של הפריה חוץ גופית איתות לאחר הסינכרון (איור 3 א). התאים חשופים של מוטגן מתנהג ישירה, NMU, הראה הפרעה למינון של ביטוי גנים היממה כפי שהיא משתקפת האובדן של פסגות הפריה חוץ גופית. בזמן הטיפול עם 0.25 mM NMU לא הביאה את הסלולר שעון ביולוגי, מנה של 0.5 מ מ NMU בתחילה מושהית וביטל לאחר מכן שעון ביולוגי, כמצוין על-ידי היעלמותו של הפסגה השנייה של הפריה חוץ גופית-~ 72 h שלאחר הטיפול. עיכוב של פעילות SIRT1 עם 20 ננומטר Ex257 או cambinol 1 מיקרומטר משובשות באופן דומה שעון ביולוגי על-ידי לשבור את מחזור היממה שלאחר מכן (איור 3 א-1). חשוב לציין, התוספת של MSC (12.5 מיקרומטר) למדיום תרבות שוחזר לכיוון נורמלי מחזורים הראשון והשני של היממה גנים בתאים שטופלו NMU. MSC לא רק לשחזר את הקצב על-ידי NMU, אלא גם מנעו את ההשפעות משובש של מעכבי SIRT1, Ex257 cambinol (איור 3 א-2).

בתאים stably transfected, מעכבי הן NMU והן SIRT1 משובשות שעון ביולוגי, אמנם בריכוזים גבוהים יותר נצפתה transfectants ארעי (איור 3B-1). MSC (12.5 מיקרומטר) שוחזר השעון הביולוגי מקצבים בתאים מיוחדים עם 1 מ NMU (איור 3B-2). וחשוב מכך, MSC שוחזר גם השעון הביולוגי מקצבים בתאים טיפול עם מעכבי SIRT1, כולל EX257 (40 ננומטר) (3B באיור-3) ו cambinol (2 מיקרומטר) (איור 3B(4)), בהתאמה.

לשם השוואה בין דמות 3A ו- 3B איור, עוצמת ביולומינסנציה היה גבוה בהרבה אבל הקצב ניזונה במשך זמן קצר יותר בתאים transiently transfected vs stably transfected תאים (~ 10 פעמים גבוה יותר, קצרות יותר מפי 2) ב- כללי, גם לאחר טיפול של תאים עם NMU או MSC. בנוסף, שעון ביולוגי הסלולר היה קיפול כפול יותר רגיש לחשיפה לחומרים כימיים בתאים transiently transfected לעומת התאים stably transfected.

שינוי כמותי למינון של הסלולר שעון ביולוגי על ידי כימיקלים

באופן דומה, בשעון הביולוגי הסלולר שיבשו התאים stably transfected מטופלים עם 1 מ NMU שוחזר על ידי הטיפול של NAC באופן תלוי מינון (0-20 מיקרומטר) (איור 4A) כפי שנצפתה השינויים בתקופת היממה (איור 4B ) ושלב (איור 4C).

Figure 1
איור 1: רצף של האדם PER2 יזם המקטע וגם הווקטור כתב היממה. (א) האנושי PER2 יזם פרגמנט (941 bp) היה רציף, וניתח הרצף היה עבור הרכיבים של יזם היממה פונקציונלי. E-תיבת, CACGTT / CATGTG; תמלול היממה לשיפור האתר, CCAATG; GC תיבת, CGCCCC / GGGGCGGG; תמלול החל האתר (TSS): CAGCGG. (B) תרשים סכמטי של גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז כתב וקטור, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. שעתוק של גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז (dLuc) נמצא תחת שליטה ישירה של האמרגן hPER2 . גן עמידות neomycin ביטוי במשותף (ניאו) מקלה על הבחירה של תאים נגועים על ידי G418. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סינכרון של במבחנה הסלולר שעון ביולוגי על-ידי סינכרון שונה סוכנים. לאחר 24 שעות, הרעב, תאים MCF10A transiently transfected על ידי וקטור כתב היממה טופלו כל סוכן סינכרון עבור 2 h, ואחריו הקלטת אותות הפריה חוץ גופית. כחול, 10 מיקרומטר forskolin; אדום, מלטונין 1 ננומטר; ירוק, דקסמתזון מיקרומטר 0.1; סגול; 50% הסוס סרום (HS); כחול-ירקרק, 100% SingleQuot (SQ); צהוב, ריק וקטור (בקרה שלילית). ציר ה-x, זמן (יום); ציר ה-y, ביולומינסנציה (ספירה/דקה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: MSC שוחזר הסלולר מקצבים השעון הביולוגי על-ידי מעכבי NMU ו- SIRT1 בתאי אפיתל החלב במבחנה. ביולומינסנציה מבחני בוצעו על MCF10A /PER2-dLuc כתב תאים לאחר סינכרון עם 50% HS. ציר ה-x, זמן (h) (זמן טיפול פוסט-NMU); ציר ה-y, ביולומינסנציה (ספירה/דקה). (א) תוצאות מתאי transiently transfected. (1) תאי טופלו 0, 0.25 או 0.5 מ מ NMU, 20 ננומטר EX527 או cambinol 1 מיקרומטר עבור h 1 ביצוע סינכרון. צהוב: שליטה; אדום: 0.25 mM NMU; ירוק: 0.5 מ מ NMU; כחול: 20 ננומטר EX527; צהוב ירוק: 1µM cambinol. (2) תאים טופלו עם 12.5 מיקרומטר MSC לבד, או בשילוב עם 20 ננומטר EX527 או cambinol 1 מיקרומטר ההקלטות בינוני עקב חשיפה 0.5 מ מ NMU. צהוב: שליטה; אדום: 0.25 mM NMU; ירוק: 0.5 מ מ NMU; כחול: 0.5 מ מ NMU + 12.5 מיקרומטר MSC; צהוב ירוק: 0.5 מ מ NMU + 12.5 מיקרומטר MSC + 20 ננומטר EX527; סגול: 0.5 מ מ NMU + 12.5 מיקרומטר MSC + cambinol 1 מיקרומטר. תוצאות (B) מתאי stably transfected. 3rd- פסגותth 5 אשר הראו הבדלים נקי וברור בין קבוצות מוצגים כתוצאה מכך נציג. (1) תאים שטופלו 0, 0.5, 1.0 או 2.0 מ מ NMU, 40 ננומטר EX527 או 2 מיקרומטר cambinol לשעה לאחר הסינכרון. צהוב: שליטה; אדום: 0.5 מ מ NMU; ירוק: 1.0 מ מ NMU; כחול: 2.0 מ מ NMU; צהוב ירוק: 40 ננומטר EX527; סגול: 2 מיקרומטר cambinol. (2) תאים טופלו על-12.5 מיקרומטר MSC ההקלטות בינוני עקב חשיפה 1.0 מ מ NMU. צהוב: שליטה; אדום: 1.0 מ מ NMU; ירוק: 1.0 מ מ NMU + 12.5 מיקרומטר MSC. (3) תאים שטופלו 12.5 מיקרומטר MSC בעקבות חשיפה ל- 40 ננומטר EX257. צהוב: שליטה; אדום: 40 ננומטר EX257; ירוק: 40 ננומטר EX257 + 12.5 מיקרומטר MSC. (4) תאים שטופלו 12.5 מיקרומטר MSC בעקבות חשיפה 2 מיקרומטר cambinol. צהוב: שליטה; אדום: 2 מיקרומטר cambinol; ירוק: 2 מיקרומטר cambinol + מיקרומטר 25 MSC. תוצאה זו דווחה בעבר, הוא בעל רישיון CC מאת 2.022. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: NAC מינון-dependently לשחזר את הסלולר שעון ביולוגי ע י NMU. תאים טופלו 1.0 מ מ NMU או בקרת הרכב לשעה לאחר הסינכרון. (א) נציג תוצאת ביולומינסנציה (ספירה/דקה) נגד הזמן (h). צהוב: שליטה; אדום: 1.0 מ מ NMU; ירוק: 1.0 מ מ NMU, 5 מיקרומטר NAC; כחול: 1.0 מ מ NMU, 10 מיקרומטר NAC; צהוב ירוק: 1.0 מ מ NMU, 20 מיקרומטר NAC. תקופה (B) (שעות). (ג) שלב (בשעות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בתרבית של תאים, תקופתיות של שעון היממה מוסדר על ידי לולאות משוב תעתיק/translational מחובררים. Heterodimers של Bmal1, שעון או Npas2 לווסת שעתוק היממה על-ידי איגוד E-box רכיבי ב היזמים של ליבה הרמטכ ל, כולל Per2 לבכות, ואני CCGs רבים4. ככל שהם צוברים בתא, heterodimers של כל: לבכות post-translationally שונה, מועבר לגרעין להדחיק פעילות גנים ברמת השעתוק השעון: Bmal1. לולאת משוב שלילי זה מאפשר הליבה סג ש לווסת את תמלול שלהם ולהגדיר את הביטוי האומנותית של הרמטכ ל, CCGs23. למרות ביותר בתרבית של תאים יש שעון היממה מהותי, ניתן לסנכרן השעונים בתאים בודדים על-ידי שני תנאי מהותי (למשל, חמצון-חיזור פוטנציאליים) לגירויים סביבתיים חיצוניים24. ג'ין היממה ביטוי ויוו ניתן לסנכרן באמצעות מלטונין, הורמון המיוצר על ידי בלוטת האצטרובל בתגובה לאותות שהתקבלו קוצב הלב המרכזית (SCN). SCN משלב אותות אור על melanospin-ביטוי מיוחדות גנגליון פוטוסנסיטיבית תאים ברשתית. מלטונין שוחררו בלוטת האצטרובל מזין את זרימת הדם ומסדיר שעון ביולוגי של SCN, ציוד היקפי רוב תאי במבחנה , ויוו25,26. שעון ביולוגי יכול גם להיות מוסדר על ידי מתח הורמונים (למשל, קורטיזול, catecholamines)27,28 ו פקטורי גדילה29,30. הסרת הפיקוח של גורמי גדילה ידוע להיות מזוהה עם הפרעה היממה של התא בהתפתחותם31.

הווקטור כתב היממה שואנחנו נבנה מנצלת את מנגנון משוב שלילי הביוכימי זה. Core הלופ משוב שלילי היממה מורכבת מפעילים תעתיק, BMAL1 ושעון, אשר לאגד המוטיבים היממה של איגוד E/E´-תיבת PER2 יזם, repressors אנשים, קרי, המסדירה באופן שלילי BMAL1 הביטוי. במערכת הכתב הנוכחי, ההפעלה קצבית של האמרגן PER2 על ידי BMAL1 ושעון ומקילה על ההתבטאות היממה של לוציפראז גרם אולי לפגיעה ביציבות, המאפשרות תקופתיות היממה מדויקת יותר של הפריה חוץ גופית אותות. הבנייה של פלסמיד כתב כולל באתר איגוד BMAL1, האתר עבור שיפור שעון ביולוגי, GC תיבת האתר התחלה שעתוק של האמרגן hPER2 . וקטור מאפשר לבדיקה בזמן אמת עבור הסלולר ביולוגי אוטונומי בתאים transfected והוא יכול לשמש כדי לזהות מצבים או סוכנים ספציפי לשנות תבנית זו היממה אנדוגני של ביטוי גנים. עם זאת, כאשר תאים בתרבית במבחנה או ex-vivo, מתנדים היממה שלהם במהירות להפוך desynchronized. לכן, יש לסנכרן מחדש את המקצבים שלהם לפני כל מבחני היממה ניתן שבוצעו במבחנה. בתאי האפיתל החלב, מצאנו כי 50% HS, מלטונין ו 100% ר הצליחו כל זירוז סינכרון יעיל של שעון ביולוגי בתוך חוץ גופית. דקסאמתאזון, forskolin מיוצר רק חלקית סינכרון. בדיקות למינון יהיה הכרחי עבור פיתוח, מבחר של סוכנים חדשים המסנכרן במחקרים עתידיים. בהתחשב בעלות נמוכה, ויעילות השימוש רחב כפי הסוכן סינכרון, 50% HS נמצאה להיות סוכן יעיל סינכרון שהפיקה לשחזור ועמיד סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב והעצבים תאים, כאמור דיווח רבות סוגי תאים אחרים, הגדרות שונות ניסיוני24

לאימות המודל במבחנה של תקנה היממה, הבא שאלנו שאם התגובה של שעון ביולוגי לחצים סביבתיים במבחנה לסכם את ההשפעות הבחנו בתוך vivo. בעבר, הפגנו מסרטנים מנה אחת של NMU שיבשו את הביטוי היממה של מרכזי הרמטכ ל (למשל, Per2), CCGs מספר בבלוטת החלב היעד. יתר על כן, משטר chemopreventive של MSC לאפס את הביטוי היממה של גנים הן Per2 והן CCGs לכיוון הרגיל. עוד יותר להדגים כי החשיפה של תאים חשיפה לרעלים, לחצים יכול לשנות ביטוי גנים היממה דרך השפעתם על NAD+-תלוי SIRT1 פעילות7,8,22. התוצאות המתקבלות באמצעות במבחנה כתב היממה וזמינותו הראה כי החשיפה NMU נגרמת הפרעה של ביטוי גנים בחברת הסלולר, כי יותר מעניין, MSC לא רק מסוגל לאפס את שעון ביולוגי הסלולר מופרת על ידי NMU, אך גם לאפס את שעון ביולוגי על-ידי את מעכבי SIRT1. תוצאות אלו ציינו כי וזמינותו חוץ גופית בתוך מתרבה לא רק את ההשפעות של NMU על ביטוי גנים היממה, אבל גם מתרבה השפעת MSC על ה קצב היממה שיבשו ויוו באמצעות מנגנונים תלויי-SIRT1. מערכת הכתב היממה במבחנה ולכן יש פוטנציאל לזהות מגוון של חשיפה לרעלים, לחצים לשנות רמות /NADH NAD+בתא, כולל מעכבי ישירה מאפננים של הסלולר חמצון-חיזור רכיבה על אופניים, כמו גם genotoxic סוכנים המדלדלים NAD+ ויה Poly ADP-ריבוז התלויים DNA תיקון32. תוצאות אלו מראים כי מערכת כתב חוץ גופית בתוך מספקת כלי שימושי למסך עבור התא והתנאים בחומרים כימיים שיכולים לשבש או לשחזר גנים היממה תקנה ויוו.

למרות וזמינותו במבחנה ניתן להגדיר באמצעות תאים transiently או stably transfected עם הבונה כתב, כמה הבדלים נרשמו התגובה לטיפול כימיקלים בין transiently ו stably transfected תאים. התאים stably transfected היו עמידים יותר בפני הטיפול של כימיקלים, במיוחד NMU ו- SIRT1 מעכבי, מאשר transiently transfected תאים. הבדלים אלה יכול לשקף את ההבדלים הדקים בוויסות של האמרגן וקטור ב transfectants יציבה בשל ההשפעות של הרצפים סביב אתרי אינטגרציה ספציפית. לכן, הבחירה של transfectants יציב על ידי טיפול אנטיביוטי עשוי גם לבחור שיבוטים עמידים יותר שיבושים היממה. לפיכך, בודדים במבחנה מודלים התא באמצעות transfectants ארעי או יציבה יש לאמת עבור היכולת שלהם להתרכז ויוו תגובות. תרביות תאים שונים שיטות לגרום גם רמות משתנות של מתח genotoxic רעילות על תאים והתוצאה שלהם רגישות שונה להשפעות רעילות של כימיקלים. לכן, cytotoxicity, בדיקה של טייס הניסויים נדרשים עבור הבחירה של תקנים ותנאי הטיפול. למרות ההבדל את רגישותם, התוצאות שהושגו עם תאים החלב כתב היממה אפיתל שלנו עבור הפרעה ושחזור של הסלולר שעון ביולוגי על ידי כימיקלים היו עקביים השוואה בין transiently תאים transfected ו stably transfected, ואת התוצאות recapitulated ההשפעות הבחנו בתוך vivo.

כדי לקבוע אם ניתן להשתמש הווקטור כתב היממה סוגי תאים אחרים, היו תאים גליובלסטומה האנושי/אסטרוציטומה (מ ג של U-87) stably transfected עם וקטור היממה הזאת. תוצאות ראשוניות באמצעות וזמינותו ביולומינסנציה הסלולר במבחנה הראו כי לאחר הסינכרון, אלו תאים עצביים נגזר הגידול יש רגיל וחזק הסלולר שעון ביולוגי דומה לזה שנצפה-אנוש החלב תאים אפיתל. תאים שטופלו IC261, מעכב ידועים של קזאין קינאז אלפא 1 (CK1δ) ו- CK1 חדוה, הראה היממה תקופה ממושכת, אבל משרעת נמוכה כפי שדווח by אחרים (נתונים לא מוצג)33. תוצאות אלו מצביעות על היממה לוציפראז כתב וקטוריים וגם במבחנה ביולומינסנציה הסלולר וזמינותו חלים תאים מסוימים אחרים איברים, כולל תאים עצביים.

מערכת הכתב הסלולר פותח כאן יכול ולכן ניתן להשתמש בהרחבה כמו assay במבחנה לקביעת גנים היממה סוגי תאים שונים באופן כללי. הנוהל ניסיוני הוא פשוט, מהיר ובטוח. עם זאת, מערכת זו כתב הסלולר לא ניתן להתאימם בקלות תאים שקשה transfect, ללא חלוקת תאים (למשל, תאים עצביים), שכן הם בעלי יעילות נמוכה לשמצה תרביות תאים. שיטות מבוססות-וירוס תרביות תאים (למשל, תרביות תאים lentivirus) עשוי להציע פתרון יעילות גבוהה יותר עבור תאים אלה34. אולם, הזמן ואת קושי המשויך lentiviral הפקה הופך שיטה זו קשה וצורכת זמן. יתר על כן, מעבדה ברמת בטיחות נאותה הוא הכרחי עבור ייצור ושימוש של הנגיף. בנוסף, ניתן להשתמש ברזולוציה גבוהה תא בודד הפריה חוץ גופית גלאי מצפני המקצבים מתמשך, בהדרגה באופן עצמאי של ביטוי גנים היממה ללא חלוקת תאים35.

מחקרים של יונקים שעון ביולוגי ויוו הם לא רק עבודה אינטנסיבית, ויקר, אבל הם גם דורשים שימוש מספר גדול של בעלי חיים. הזמינות של מערכות במבחנה יכול להקטין משמעותית את מספרם של בעלי חיים נדרש לבחון את השיוכים בין הפרעה של ביטוי גנים היממה לבין התפתחות מחלות כרוניות, כולל carcinogenesis וחילוף תסמונת. נתונים כמותיים על פרמטרים היממה, כולל התקופה, משרעת שלב, יכול להודיע מינון - ו/או תלויי-זמן ההשפעות של כימיקלים על הסלולר שעון ביולוגי. לדוגמה, הבחנו כי נוגדי חמצון ש-NAC מינון-dependently לשחזר את התקופה ואת שלב של הסלולר שעון ביולוגי על-ידי NMU. המודל במבחנה יכול לשמש גם מסך ולסווג משבשים היממה סביבתית וכדי לחקור את ההשפעה של שיבשו שעון ביולוגי על ירידת ערך של תפקוד התאים, לספק תובנות מכניסטית לפיתוח אסטרטגיות התערבות גדודים בסיכון מוגבר לסרטן השד, תסמונות מטבולית של הפרעות neurophysiological, בגלל לוחות זמני עבודה חריג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי 2012 החברה של רעלים (אויל)-קולגייט פלמוליב מענק למחקר Alterative (פאנג מ') ועל המחקרים שיתוף פעולה בינלאומי קרן חיה, צמח הסגר סוכנות, הרפובליקה של קוריאה (פאנג מ'), ולהעניק NIEHS P30ES005022 (ה Zarbl). ברצוננו להודות ג'נג ד ר צ'ן (מקגוורן הספר לרפואה של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון) לדיון מועיל שלו, מר חואן Shao-An על עזרתו ניסיוני, גב' נקאטה Kimi לקריאה הוכחה שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).

Tags

גנטיקה גיליון 127 קצב היממה פרק 2 יזם פעילות, במבחנה assay ביולומינסנציה בזמן אמת לוציפראז ביטוי וקטור גרם אולי לפגיעה ביציבות גחלילית לוציפראז תרביות תאים פלסמיד.
<em>במבחנה</em> ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y.,… More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter