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Genetics

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

Abstract

Circadian 리듬 동작 자 유전자 발현에서 배열 하는 생물 학적 과정을 조절 하는 기본적인 생리 과정 모든 생물에 존재 이다. 척추 동물, circadian 리듬 (SCN, 중앙 맥 박 조정기) suprachiasmatic 핵 및 가장 주변 조직을 구성 하는 개별 셀 기능 분자 발진기에 의해 제어 됩니다. 더 중요 한 것은, 밤에 빛, 환경 스트레스 또는 유독 하 여 circadian 리듬의 만성 질환과 노화의 위험 증가와 연결 됩니다. 중앙 및 주변 생물 학적 시계를 중단 시킬 수 있는 에이전트와 에이전트 방지 또는 circadian 중단의 효과 완화 수 있는 식별 수 만성 질환의 예방에 중요 한 의미를 갖는다. 설치류 모델 노출 및 유도 또는 circadian 중단 방지/완화 하는 에이전트를 식별 하는 데 수 있습니다, 비록이 실험 동물의 많은 수를 필요 합니다. Vivo에서 연구는 또한 중요 한 자원과 인프라를 요구 하 고 밤새 일 하는 연구원을 필요로. 따라서, 있다 시스템 적절 한 체 외에서 세포 형에 대 한 긴급 한 필요 환경 circadian 분리기 및 강화 셀 형식에 대 한 화면을 다른 기관과 질병 상태에서. 우리는 인간 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 진 핵 세포에서 정한 luciferase의 전사를 구동 하는 벡터를 건설 한다. 이 circadian 기자 구조는 안정적으로 인간 유 방 상피 세포로 페 그리고 circadian 응답 기자 세포 생체 외에서 생물 발광 분석 결과 개발 하기 위해 선정 됐다. 여기, 우리는 상세한 프로토콜을 설정 하 고 분석 결과 제시. 우리는 더는 vivo에서 다양 한 화학 물질의 효과 세포 생물 학적 시계에 정리 분석 결과 생체 외에서 우리의 수를 보여주는 개념 실험의 증거에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 결과 분석 결과 다양 한 종류의 세포에 대해 환경 분리기 및 circadian clock의 chemopreventive 강화를 적용할 수 있습니다 나타냅니다.

Introduction

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Circadian 시계 넓은 범위 조절 유전자 약 24 h. 역학의 주기 예측 가능한 리듬 동작 자를 일주 식에서 생물 학적 과정의 연구 좋습니다 circadian 그 만성 장애 리듬의 유 방 및 교대 근로자, 간호사, 항공 승무원1,2,3등 전립선 암 위험을 증가 시킵니다. 이러한 결과 지속적인 빛, 밤에 빛, 또는 빛 사이클-시차 증가 종양 발생률을 모방 하 고 종양 성장을4,5가속을 노출을 보여주는 설치류 연구에 의해 뒷받침 됩니다. 인간과 설치류 학문에서 데이터를 바탕으로, 암 연구에 대 한 국제 기구의 분류는 가능성이 인간의 발암 물질 (유형 2A) 20106교대 작업.

우리는 설명 하는 이전에 유 방 종양 특정 발암 물질, Nnitroso의 단일 발암 복용량-N-methylurea (NMU) 중단 circadian 표현의 주요 circadian 유전자 (CGs) (예를 들어, 기간 2 , Per2) 여러 circadian 제어 유전자 (CCGs), 포함 한 DNA 손상 응답 키 및 대상 유선 (에 간) (DDRR) 유전자를 복구. 또한, 정상을 향해 Per2 와 DDRR 유전자의 circadian 식 식이 L의 chemopreventive 처방에 의해 다시 설정-메 틸-셀레노시스테인 (MSC) 63%로 종양의 발생률을 감소. 이러한 연구 결과 circadian 리듬, 화학 발암 및 자성7,8간의 기계적 링크를 표시 하는 첫번째 이었다. 기타 환경 유독 circadian 유전자 식에 vivo에서 방해를 표시 하는 노출 환경 질병9,10의 증가 위험과 관련 된 있습니다. 환경 유독 병 인 여 circadian 중단 연결 메커니즘을 이해 질병 예방에 mechanistically 기반 접근을 이어질 수 있습니다. 그러나, 연구는 노출 사이 상호 작용을 정의 목적 및 circadian 리듬은 일반적으로 수행 vivo에서. 24 또는 48 h 동안 모든 3-4 h를 수집는 전형적인 vivo에서 실험 조사 circadian 리듬에 미치는 영향 필요, 동물의 많은 수에서 3 개 이상 조직 제어 및 3 노출된 동물 되어야 합니다. Vivo에서 관찰 및 메커니즘이 검증 된 시험관에 시스템의 개발 따라서 뿐만 아니라, 동물의 수를 줄일 것 이라고 하지만 실험 비용 및 요구 사항 또한 극적으로 감소 하는 연구팀은 24-48 h 동안 지속적으로 작동합니다. 또한, 시스템 검증 된 시험관에 circadian 리듬, 또는 환경 스트레스 또는 유독 그것의 응답에 영향을 주는 유전 변경 화합물의 높은 처리량 검열 사용 될 수 있습니다. 따라서, 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델과 실험의 협력 조합 다른 초점으로 다른 통찰력을 얻기 위해 필요 합니다.

포유류에서 circadian 발진기는 SCN의 특수 신경 뿐만 아니라 가장 주변 셀 형식에 존재 한다. 이 분자 시계는 비슷합니다 설립된 fibroblast 세포 선 및 기본 섬유 아 세포에서 배아 또는 성인 동물; 그러나, 조직 유형 특정 휴대 전화 모델11에 대 한 필요가 있다. 따라서, 운동 활동에서 vivo에서, SCN의 전통적인 연구 explants 비보 전, 그리고 불멸 하 게 fibroblast 세포의 체 외에서 세포 기반 분석은 널리 셀 자치 circadian 결함을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 fibroblast 세포 기반 분석 결과 circadian 메커니즘을 정리 수 있습니다 나타내는 증거가 없다 하 고 다른 주변 장기에 vivo에서의 셀에 응답 제시. 다른 세포 유형 유전자 발현, xenobiotic 물질 대사, 및 DDRR, 독특한 패턴을 가질 수 있으며 독성과 circadian 유전자 발현 사이의 링크 셀 형 수 있습니다 특정 및 다른 생리 적인 매개 변수에 의해 변조. 또한, 섬유 기반 시스템에서 circadian 발진기는 하지 되었습니다 완전히 평가 환경 유독, 스트레스 및 질병 개발 및 예방의 메커니즘에 노출 링크 예방 에이전트에 대 한 응답에 대 한. 따라서, 손쉬운, 유효한 셀 유형 전용, 생체 외에서 생물 발광 분석 실험 연구 기관 특정 환경 circadian 분리기에 대 한 필요가 있다. 다양 한 세포 시계 모델 (예를 들어, 간, keratinocytes, 지방 세포 뿐만 아니라 다리 셀 선)는 최근 몇 년 동안12,,1314, 에서 개발 되었습니다. 15, 여기서 설명 하는 분석 결과 유 방 상피 세포, 그리고 vivo에서 환경 스트레스, 유독, 마약과 chemopreventive 대리인 응답을 정리를 첫 번째 데모에서 첫 번째 세포 시계 모델입니다.

Renilla luciferase (rLuc) 및 반딧불 luciferase 30-61 kDa 단위체 단백질 효소 활동에 대 한 처리 posttranslational 필요 하지 않은 및 번역 즉시 유전 기자로 서 기능을 할 수 있습니다. 일단 기판 연결 luciferase 효소, 생 화 확 적인 반응을 촉매 빛의 플래시를 생성 합니다. 따라서, luciferase 구문은 진 식 기자 시스템에서 생체 외에서 그리고 에 비보로 널리 사용 됩니다. 그러나, circadian 리듬 연구, luciferase 기자의 유틸리티 luciferase 단백질의 상대적으로 긴 반감기에 의해 제한 됩니다 (T1/2 = 3.68 h) 기간 (특히 짧은 기간) circadian 유전자에 변화에 대 한 상대적인 식; 그러나, 수많은 연구 년 동안 성공적으로 사용 luciferase 유전자 빠르게 분해 luciferase 같은 circadian 리듬, 특히 오랜 기간 함께 리듬에 대 한 보고를 위해 필요 하지 않을 수 있음을 나타내는 pGL3 벡터에 24 h입니다. 따라서, 기자 플라스 미드 정한 luciferase 벡터를 사용 하 여,: pGL [Luc2P/Neo] hPEST (단백질 불안 시퀀스)를 포함 하는 개발 되었습니다, 현재 체 외 circadian 기자 벡터로 사용 하 수 있도록 생물 발광 분석 결과. Luc2P 에 의해 단백질은 훨씬 더 짧은 반감기 (T1/2 = 0.84 h) 따라서, 응답 보다 신속 하 고 더 큰 크기와 변화에 야생-타입 보다 transcriptional 활동에 나그것은 될 수 있는 ndicating luciferase 실시간16에 정확 하 게 PER2 발기인에 의해 규제의 리듬 표현 모니터링 하는 데 사용.

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Protocol

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1. PER2 발기인 구동 불안정 Luciferase 기자 벡터의 건설

  1. pLS 사용자 정의 구입 [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 인코딩 rLuc 및 인간 cDNA를 포함 하는 벡터 PER2 발기인 조각 (hPER2P, 941 bp) Sac 사이 사이트에서 나 고 뒷 다리 여러 복제 지역 17에 III.
  2. 인간의 PER2 발기인 조각 잘라 (hPER2P, 941 bp)는 벡터에서.
    1. 추가 2.5 µ L 제한 효소 버퍼, 10 µ L (180 기) pLS [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 벡터 및 1 µ L 각 금지 효소, Sac의 I (10 단위 / µ L) 및 뒷 다리 III (10 단위 / µ L)는 DNA/RNA/뉴클레오티드-무료에 microcentrifuge 튜브입니다. 부드럽게 pipetting으로 초순 (10.5 µ L) 25 µ L와 믹스를 추가.
    2. 난방 블록에 90 분 동안 37 ° C에서 품.
    3. 0.7 %agarose 젤 0.0001 %ethidium 평범한 사람 (EtBr) 벡터에서는 hPER2P을 포함 하는 제한 효소 반응의 전체 볼륨 (25 µ L) 실행.
      참고: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium 브 로마 이드 (CAS 등록 번호: 1239-45-8)은 무 취 붉은 액체. 그것은 일반적으로 사용 되는 형광 태그 (핵 산 얼룩) agarose 젤 전기 이동 법으로 및 UV 빛에서 오렌지 색상으로 표시 하는 intercalating 에이전트입니다. 규제 기관 중 발암 물질 18로 분류 하지만 돌이킬 수 없는 돌연변이 효과의 가능한 위험 실험 동물에서 발생 합니다. 따라서, 우리가 포함 된 화학 위험 폐기물로 EtBr 사용된 agarose 젤과 전기 이동 법 버퍼 수집과 Rutgers 환경 건강 요청 & 안전 (REHS)를 선택 하 고 안전 하 게 처분 하.
    4. Agarose 젤 941에 EtBr 형광 밴드를 포함 하는 한 조각 잘라 bp, 260 nm 파장에서 흡수 밀도 (OD)를 측정 하 여 정량화는 분 광 광도 계에 따라 DNA 젤 추출 키트, 젤에서 hPER2P 조각 정화.
  3. 정한 반딧불 luciferase 식 벡터: pGL의 선형화 1.0 µ L (1 µ g) [Luc2P / 네오] 단계 1.2.1-1.2.2에 설명 된 대로 동일한 방법으로. 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 위에서 설명한 뒤 DNA 정리 키트는 벡터를 추출.
  4. 선형화 벡터: pGL에는 hPER2P 선 [Luc2P / 네오].
    참고: 제조 업체 당 ' s 명령, 삽입 및 벡터의 이상적인 어 금 니 비율 2:1입니다. 50 ng 벡터, 삽입의 이상적인 금액은 23.6로 계산 수식, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb 벡터와 ng] (2/1) x 23.6 ng 삽입 =]. HPER2P의 농도에 따라 (7.26 ng / µ L) 및: pGL [Luc2P / 네오] (50 ng / µ L), 50 ng: pGL의 볼륨 [Luc2P / 네오] 23.6 ng hPER2P 각각 1 µ L 3.26 µ L로 계산 됩니다.
    1. 추가 2 µ L T4 DNA 리가 반응 버퍼 (10 배) (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl 2, 1 mM ATP, 그리고 10 mM DTT), 3.26 µ L (23.6 ng) hPER2P, 1 µ L (50 기): pGL [Luc2P / 네오], 13.74 µ L 물 최대 20 µ L 부드럽게 혼합.
    2. 1 µ L T4 DNA 리가 (400 단위 / µ L) 추가 부드럽게 혼합 고 thermocycler, 하룻밤 사이에 16 ° C에서 품 어, 다음 제조 업체 마다 얼음에 합자 벡터 진정 ' s 지시.
  5. 합자 벡터: pGL 변환 [hPer2P / Luc2P / 네오] 화학적으로 유능한 대장균 19.
    1. 42 ° c, catabolite 억압 (S.O.C.) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 따뜻한 물 목욕을 설정 (2 %Tryptone, 0.5% 효 모 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl 2, 10 m m MgSO 4 및 20 m m 포도 당) 실 온에서 Luria Bertani (파운드) 한 천 배지 (100 µ g/mL 암 피 실린, 80 µ g/mL X gal 및 0.5 µ M IPTG 포함) 37 ° C 배양 기에서 따뜻하게 하 고 얼음에 녹여 각 변환에 대 한 세포의 유능한 대장균 한 유리병.
    2. 추가 6 µ L (21 기) 벡터 또는 1 µ L 출혈 (30 ng) 화학적 유능한 대장균 (50 µ L)에의 한 튜브를 벡터 (부정적인 제어)을 다음 부드럽게 혼합 튜브를 플립. 30 분에 대 한 얼음에 품 어
    3. 30 42 ° C 물 욕조에 충격 열 동요 없이 하 고 얼음을 반환 s
  6. 블루/화이트 심사를 사용 하 여 합자 벡터와 변형 대장균 식민지 선택.
    1. 변환 된 대장균에 추가 250 µ L S.O.C. 매체 튜브 및 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.
    2. 10-50 µ L의 변형된 대장균 파운드 한 천 격판덮개의 표면에 균일 하 게 확산. 넣어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.
      참고: 효율적인 복제 반응 몇 백 식민지를 생산 한다. 두 개의 다른 볼륨을 도금 적어도 하나의 접시 큰, 분명 흰색 또는 파란색 색상과 잘 간격된 식민지 해야한다 되도록 것이 좋습니다. 식민지는 너무 작은 때 색상은 구별할 수 10 배 (50 X) 현미경을 사용 하 여 도움이 됩니다.
    3. 소독된 치아 막대기, 격판덮개에서 3-6 백색 식민지를 선택 하 고 50 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 문화 매체의 4 mL를 포함 하는 하나의 문화 관으로 각 식민지를 놓습니다.
    4. 200 rpm에서 밤새 흔들어 37 ° C에서 튜브를 품 어. 4 mL의 2 개 mL를 사용 하 여 DNA를 추출 플라스 미드 DNA 추출 미니 준비 키트 제조 업체 당 대장균 배양 ' s 지시.
  7. 확인 하 고 삽입을 분석 (hPER2P, 941 bp)
    1. 플라스 미드 DNA 제한 효소로 소화 하 고 삽입 확인 하십시오 단계 1.2.1-1.2.3에 설명 된 대로 전기 이동 법을 실행.
      참고: 긍정적인 제어 (hPER2P 단계 1.2.4에서 정화) 부정적인 제어 (대장균 빈 벡터와 변형)에 포함 된 및.
    2. 방향 19 플라스 미드 삽입의 순서를 확인 하려면 M13 앞으로 및 역방향 M13 뇌관을 사용 하 여 선택 된 플라스 미드 DNA 시퀀스.
      주: 전기 및 올바른 방향에 hPER2P 및 시퀀싱 결과에서 시퀀스의 정확한 크기와 삽입을 했다 단 하나 식민지가 선정 됐다.
    3. 인간의 PER2 발기인 조각 분석 (hPER2P, 941 bp) CCAATC, 전자 상자 모티브 (Bmal1 바인딩 사이트, 고양이/CGTG)를 포함 하 여 circadian 규제 요소에 대 한 시퀀싱 GC 상자, 및 녹음 방송 시작 사이트 (CAGCGG) 20.
  8. 증폭 추가 하 여 선택 된 대장균 남은 2 mL 200 mL 파운드 문화 매체 50 µ g/mL 암 피 실린 포함 하 고 다음 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 하룻밤 배양으로 대장균 배양.
  9. 추출 DNA 플라스 미드도 없는 맥시와 당 키트 준비 제조 업체 ' s 명령 후는 분 광 광도 계와 OD 260 nm 파장에서 측정 하 여 계량 하는 고. 약 수와 저장소 플라스 미드 DNA: pGL [hPer2P/Luc2P/네오], 나중에 사용-80 ° C 냉장고.

2. 일시적인 Transfection

  1. 구매 문화 MCF10A 셀
    1. 구입 상업에서 불멸 하 게 하 고, 변형 비 정상적인 인간 유 방 상피 세포 라인 (MCF10A) 세포 은행, 셀 cytogenetically는 어디 테스트와 함께 인증 된 짧은 탠덤 반복 동결 하기 전에 분석. 해 동 하 고 유지 하는 최대 8 주 문화에 냉동된 셀의 각 유리병.
      참고: 다른 세포와 달리이 세포 있다 접촉 금지 그들은 ~ 70% 합류에 도착. 그 하위 ~ 70%에서 실시는 필요 합니다.
    2. 유 방 상피 기저 매체 (MEBM), 성장 보조 제, 그리고 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2에서 셀 문화 인큐베이터에서 콜레라 독 소 유 방 상피 세포 성장 매체 (MEGM), 셀 문화.
      참고: 준비-사용 성장 요인 제공 하는 SingleQuot (SQ)를 구매 하 고 별도로 콜레라 독 소를 얻을. 성장 보충의 최종 농도 0.4% 소 뇌 하 수 체 추출, 0.1% 인슐린, 0.1% 하이드로 코 티 손, 0.1% 인간 표 피 성장 인자, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 0.05 %gentamycin 황산 및 0.05% 암포 B.
    3. 10 mL 트립 신/대 한 EDTA를 가진 외피에 의해 10 cm 배양 접시에 셀 해리 ~ 20 분 다음 10 mL trypsin 중화 솔루션을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 모든 셀 HEPES 소금물 (HBSS)를 버퍼링 하는 수집.
    4. 거꾸로 현미경 hemocytometer와 셀 단일 세포 현 탁 액의 농도 계산 하 고 필요에 따라 셀의 특정 숫자를 씨앗. 각 접시에 셀의 동등한 배급을 얻기 위해 철저 하 게 접시를 소용돌이 친다. 셀에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 품 어.
      참고: 포함 된 트립 신/EDTA, 트립 신 중화 솔루션 및 사용 HBSS subculture 시 약 팩 구입.
  2. 건설 circadian 벡터에 포함 된 셀의 과도 transfection.
    1. 35mm 문화에 균등 하 게 시드 2 x 10 5 MCF10A 세포 MEGM와 접시와 20-30% 합류 (다음 날)에 성장.
    2. 따뜻한은 감소를 혈 청 미디어 (예를 들어, Opti 메모리) 37 ° C 물 목욕과 transfection 시 약 30 분에 대 한 실 온에서 희석 플라스 미드 DNA 건설 (: pGL [hPer2P / Luc2P / 네오])와 엔도-독 소 무료 30 ng / µ L를 트리 스-EDTA (테) 버퍼 및 실내 온도 유지.
    3. 63.6 µ L 따뜻한 감소 된 혈 청 미디어를 먼저 추가한 다음 추가 33.4 µ L (0.1 µ g) 플라스 미드 DNA, 플라스 미드 transfection 혼합물 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서를 준비 하 고 pipetting, 하 transfection의 3 µ L에 마지막으로 추가 하 여 부드럽게 혼합 벽을 건드리지 않고 튜브의 센터에 직접 시 약. 부드럽게 pipetting으로 혼합, 후 30 분에 대 한 실 온에서 계속
    4. 접시에 매체의 센터 표면에 직접 전체 플라스 미드 혼합물 (100 µ L)를 삭제 하 고 요리를 떨고 하 여 부드럽게 섞는다. 추가 48-72 헤에 대 한 CO 2 배양 기에서 셀 문화
      참고: 그것은 최고의 transfection 효율 그들의 접촉 저해에 때문에이 세포의 40-70% 합류에 있을 것을 예상은 ~ 70%. 따라서, transfection 작품에서 최고의 시작 ~에서 20% ~ 70% 합류.

3. 뚜렷이 페 MCF10A 세포의 체 외에 생물 발광 분석 결과의 설립

  1. 24 h. 위한 성장 인자 없이 MEBM에서 (후 48-72 h transfection) 합류 점 ~ 70%에서 경작된 한 세포를 굶 어
  2. 동기화 에이전트 (예를 들어, 50% 말 혈 청 (HS)) MEBM에 CO 2 배양 기에서 1.5 h에 대 한 세포 치료.
    참고: 이상적인 동기화 에이전트, 10 µ M 산림, 1 nM 멜 라 토 닌, dexamethasone 0.1 µ M, 50 %HS, 및 100%의 선택을 위한 SQ 비교 되었다 circadian 진폭 및 기간 circadian 벡터 transfected 세포에. 100% 빈 벡터 transfected 세포 처리 됩니다 부정적인 컨트롤로 SQ.
  3. Pre-prepare 20 mL 녹음 매체 (10-30mm 문화 요리)에 대 한 MEGM의 5 mL, 15 mL MEBM, 150 µ L 나트륨 중 탄산염, 200 µ L HEPES, 및 40 µ L 소를 추가 하 여 재고 솔루션 (50 mM) 50 mL 소독 원심 분리기 튜브에서.
    참고: 각 부품의 최종 농도: 20% 광장 및 20 ng/mL 콜레라 독 소, 0.06% 나트륨 중 탄산염, 1% 페니실린/스, 그리고 10 mM HEPES. 따뜻하게 미리 준비 된 매체를 기록 하 고 37 ° C 물 욕조에 30 분 동안 1 x PBS를 소독. 사용 직전 100 µ M 소 추가.
  4. 씻어 따뜻한 1 셀 Dulbecco x ' s Phosphate-Buffered 염 분 (D-PBS) 3에 대 한 동기화 에이전트와 함께 부 화 후 시간과 기록 매체 2 mL를 추가 합니다.
  5. 증발을 방지 하기 위해 다음 측에 레이블을 실리콘 윤활제를 사용 하 여 멸 균된 커버 클래스와 접시를 봉인.
  6. 밀폐 접시 루미 노, 안쪽 자리에 놓고 폴더에 파일 위치를 저장 하기 위한 옵션 (세부 사항, 섹션 6을 참조).

4. 안정적으로 페 셀 선택

  1. 최적화 제조 업체에 따라 죽 일 곡선 분석 결과와 이상적인 G418 농도 (800 µ g/mL) ' 안정적 transfected 세포의 선택에 대 한 지침 s.
  2. 48 h 또는 72 h에 대 한 과도 transfection, 후 subculture와 씨 5000 큰 요리에서 MEGM 셀 셀/접시 (100 mm). 24 시간 후 문화 (37 ° C, 습도 95%, 및 5% CO 2), 셀 문화 인큐베이터에서 매 3-4 일 2 주 동안 800 µ g/mL G418를 포함 하는 새로운 매체 오래 된 매체를 대체 하 여 G418의 800 µ g/mL로 세포 치료.
  3. Subculture 안정적으로 살아남은 500µg/mL G418 hPer2P/Luc2P의 안정적인 식 유지 하 고 차후 사용을 위해 액체 질소에서 동결을 포함 하는 MEGM와 함께 1-3 구절에 대 한 식민지 transfected.
  4. 생물 발광 분석 결과 생체 외에서의 결과에 생물 발광 강도 많은 구절에서 사용 후 점차적으로 낮은 경우 일반 subculture 셀의 안정적 transfected 인구를 다시 선택 후 500µg/mL G418 치료.

5. 화학 물질과 치료

    에서
  1. 48 h 또는 72 h 후 transfection 24 헤에 대 한 MEBM에 성장 요인에서 세포를 굶 어
  2. 50% 동기화 후 2 시간에 대 한 HS 치료 0.25 m m 또는 0.5 m m nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527, 또는 MEBM 포함 하는 20 %1 h 1 µ M cambinol 셀 평방
  3. 1 세척 후 x D-PBS, 혼자, 또는 20 EX527 또는 셀에 1 µ M cambinol와 함께 중간 포함 12.5 µ M MSC 기록 추가. 모니터링은 루미 노와 생물 발광.
  4. 치료 안정적 transfected MCF10A / PER2-0.5, 1 또는 2 m m, 40 nm, EX527 또는 2.0 µ M, 50% 동기화 후 1 시간에 Cambinol에서 NMU dLuc 셀 HS, MSC의 중간 포함 12.5 µ M 기록에서 세포를 품 어 고 또는 n-진 (NAC)의 다른 복용량 (5, 10, 또는 20 µ M). 루미 노, 기록에에서 접시를 놓고 3.6 절에 설명 된 대로 4-8 일에는 생물 발광 루미 노에 의해 저장.
    참고: NMU methylated nitrosourea 화합물, 발암 성, 변이 원 성 및 않았음 속성입니다. NMU는 직접 연기 alkylating 에이전트 있으며 짧은 반감기 (T 1/2 = ~ 30 분). 그것은 알칼리 성 상태 (pH 9-10)와 온도 20 ° c. 이상에서 불안정 하지만 산 성 상태 (pH 4-5)에서 안정 양측 검정 청소 벤치 표면 및 NMU soluti에 의해 잠재적으로 오염 하는 랩 실력에 대 한 효율적인 비활성화 요원으로 10%에서 표 백제를 사용 하는 따라서,. 남은 재고 솔루션은 선택 하 고 REHS에 의해 안전 하 게 폐기. 화학 물질의 행동의 모드에 따라, 동기화 된 세포는 녹음 매체에서 경작 하기 전에 짧은 시간에 대 한 치료 수 있습니다. 있으 나 셀 긴 시간 (몇 일) 녹화 매체에서 또한 대우 될 수 있다.

6. 데이터 수집, 분석, 및 프레 젠 테이 션

참고: 세포 생존 능력 표시 같은 시간에 대 한 동일한 농도에서 세포의 치료 후 표준 방법 (예: MTT 분석 결과)를 사용 하 여 결정 해야. 생체 외에서 생물 발광 분석 결과에서 사용 하는 모든 치료 농도 30% 치 사 농도 (LC30) 보다 낮은 했다. 모든 실험은 3 중에서 실시 됐다 그리고 대표 결과 발표 됐다.

  1. 로드 없이 H 2 O와 CO 2, 37 ° C에서 설정 하 고 컴퓨터에 연결 하는 인큐베이터 안에 유지 되는 루미 노에 좌석에 요리 접시 (3.5 단계) 씰링, 후.
  2. 클릭 " 저장 " 폴더 및 해당 요리에서 기록 된 발광 신호 저장할 파일 이름을 입력 하 고.
    참고: 시스템에 발광 신호를 감지 개별 위치에서 접시에 셀에서 실시간. 신호 광 전 증폭 관 관 4-광자-카운트를 통해 컴퓨터에 전송 및 저장 및 데이터 수집 소프트웨어에 의해 컴퓨터에 표시 됩니다.
  3. 4-7 일, 중간 변경 및 필요한 경우 두 번째 주에 대 한 지속적인 기록에 따라 수에 대 한 녹음 후 신호 분석.
    참고: circadian 매개 변수, 위상, 기간 길이, 및 포함 한 리듬 진폭, 속도, 댐핑을 우리 루미 노 분석 소프트웨어를 사용 생물 발광 데이터를 분석.
  4. 실행 평균, 원시 데이터를 detrend 하 고 기간, 위상, 진폭, 고 속도 21 , 22 감쇠를 사인파에 최고 맞는 분석.
  5. 치료 및 중간 변경 시 높은 과도 생물 발광으로 인해 분석에서 데이터의 첫 번째 사이클 제외.
  6. 데이터 프레 젠 테이 션에 대 한 플롯 시간 (h 또는 주)에 대 한 원시 데이터 (생물 발광, 수/s). 필요한 경우 데이터 기준선을 뺍니다 진폭 및 위상 비교를 그릴 수 있습니다.

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Representative Results

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Circadian 생물 발광 기자 벡터: 인간의 PER2 발기인 기반 표현의 정한 luciferase 변종

941 bp 조각으로 구성 된 DNA 순서: pGL circadian 기자 벡터를 생성 하는 데 사용 하는 인간의 PER2 발기인에서 파생 된 [hPer2P/Luc2P/Neo, 처음 규제 요소 규제 알려진 존재에 대 한 분석 circadian 진 식입니다. 생물 정보학 분석이 보여주었다이 발기인 조각 내는 3 개의 다른 Bmal1 바인딩 사이트 (E 상자) (고양이/CGTG), 두 circadian 전사 강화 사이트 (CCAATG), 두 개의 GC 상자 및 녹음 방송 시작 위치 (그림 1). 따라서이 기자 벡터 circadian 유전자 발현을 반영 하기 위해 예상 했다.

동기화 에이전트의 최적화

여러 에이전트가 동기화 또는 생물 발광 연구 생체 외에서 fibroblast 세포의 자치 circadian 리듬에 영향을 사용 되었습니다. 유 방 상피 세포에서 효율적이 고 비용 효율적인 셀 타입 특정 동기화 에이전트를 선택, 우리는 10 µ M 산림, 1 nM 멜 라 토 닌, dexamethasone 0.1 µ M, 50 %HS, 및 100% 비해 뚜렷이 페 유 방 상피 세포 (MCF10A) 광장 함께 circadian 기자 벡터입니다. 셀 HS 최고의 circadian 리듬, 3 봉우리 circadian의 발광을 유도, 셀에만 하나 또는 두 개의 봉우리에 비해 50%와 동기화 다른 에이전트와 동기화. 또한, 셀 데이터 분석 (그림 2) 중 50 %HS 생산 허용 기간, 진폭와 최적된 값 동기화의 생물 발광 프로필. 우리 모든 후속 실험에 대 한 셀 동기화 에이전트로이 비용 효율적인 방법을 선택이 결과에 따라.

장애 및 화학 물질 노출에 의해 셀룰러 circadian 리듬의 복원

생체 외에서 모델에서 치료, 뚜렷이 transfected 세포 (제어 그룹) 동기화 (그림 3A) 후 신호 발광의 적어도 2 개의 완전 한 주기를 보여주었다. 직동식 등재, NMU, 노출 셀 발광 봉우리의 손실에 의해 반영 circadian 유전자 발현의 복용량 의존 장애를 보였다. 0.25 m m NMU 치료 세포 circadian 리듬을 방해 하지 않았다, 0.5 m m NMU의 복용량 처음 지연 고 발광 ~ 72 h 후 처리에서의 두 번째 피크의 실종에 의해 표시 된 대로 나중 circadian 리듬을 폐지. 20 nM Ex257 또는 1 µ M cambinol SIRT1 활동의 저해는 마찬가지로 후속 circadian 주기 (그림 3A-1) 꺾 여 circadian 리듬을 중단. 중요 한 것은, MSC의 추가 (12.5 µ M) NMU 취급 셀에 circadian 유전자 발현의 일반적인 첫 번째 및 두 번째 사이클 향해 복원 문화 매체에. MSC는 NMU에 의해 중단 하는 리듬을 복원 뿐만 아니라 또한 SIRT1 억제제, Ex257, cambinol (그림 3A-2)의 파괴 효과 방해.

안정적 transfected 세포, NMU 및 SIRT1 억제제 과도 transfectants (그림 3B-1)에서 관찰 하는 보다 높은 농도에서 쓰 신 circadian 리듬을 방해 합니다. MSC (12.5 µ M) 복원 셀 1 m NMU (그림 3B-2) 청소용 circadian 리듬. MSC circadian 리듬 등 EX257 SIRT1 억제제로 치료 하는 세포에를 복원 하는 더 중요 한 것은,에 (40 nM) (그림 3B-3) 및 cambinol (2 µ M) (그림 3B(4)), 각각.

그림 3A그림 3B사이 비교, 생물 발광 강도 훨씬 높은 했지만 리듬 정도 transfected 세포에 짧은 시간 vs 안정적 transfected 세포에 대 한 지속 되었다 (~ 10 배, 2 배 더 짧은)에 일반, NMU 또는 MSC 세포의 치료 후에. 또한, 세포 circadian 리듬 2-fold 더 안정적으로 transfected 세포에 비해 뚜렷이 transfected 세포에 화학 물질에 노출에 민감 했다.

화학 물질에 의해 세포 circadian 리듬의 양적 복용량 의존 변경

마찬가지로, 안정적 transfected 세포의 교란된 셀룰러 circadian 리듬 1mm NMU는 복용량-의존 방식 (0-20 µ M) NAC의 처리에 의해 복원 된 치료 (그림 4A) circadian 기간 (그림 4B의 변화에서 관찰 )과 위상 (그림 4C).

Figure 1
그림 1: 일련의 인간의 PER2 발기인 조각와 circadian 기자 벡터. (A) 인간의 PER2 발기인 조각 (941 bp) 시퀀스는 시퀀스 기능 circadian 발기인의 요소에 대 한 분석 했다. 전자 상자, CACGTT / CATGTG; circadian 전사 강화 사이트, CCAATG; GC 상자, CGCCCC / GGGGCGGG; 녹음 시작 사이트 (TSS): CAGCGG. 정한 luciferase 기자 벡터,: pGL의 (B) 회로도 [hPer2P/Luc2P/Neo]. 정한 luciferase (dLuc)의 녹음은 hPER2 발기인의 직접 제어. 공동 표현된 네오 마이 신 저항 유전자 (네오) G418에 의해 감염 된 세포의 선택 용이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 동기화 다른 동기화 에이전트에서 셀룰러 circadian 리듬 생체 외에서 . 24 시간 기아 후 MCF10A 셀 정도 circadian 기자 벡터 페 2 h, 발광 신호를 기록 하 여 다음에 대 한 각 동기화 에이전트와 함께 치료 했다. 블루, 10 µ M 산림; 레드, 1 nM 멜 라 토 닌; 녹색, 0.1 µ M dexamethasone; 자주색; 50% 말 혈 청 (HS); 청록, 100 %SingleQuot (SQ); 노란색, 빈 벡터 (부정적인 제어)입니다. X 축, 시간 (하루); Y의 생물 발광 (수/분) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: MSC 복원 셀룰러 circadian 리듬 NMU 및 SIRT1 억제제 유 방 상피 세포에 의해 중단 생체 외에서. 생물 발광 분석 MCF10A에서 수행한PER2 dLuc 기자 50% 동기화 후 세포 / HS. X 축, 시간 (h) (게시물 NMU 치료 시간); Y의 생물 발광 (수/분) (A) 정도 transfected 세포에서 결과. (1) 세포 0, 0.25 0.5 m m NMU, 20 nM EX527, 또는 다음 동기화는 1 시간에 1 µ M cambinol 대우 되었다. 노란색: 제어; 빨간색: 0.25 mM NMU; 녹색: 0.5 m m NMU; 블루: 20 nM EX527; 옐로우 그린: 1µM cambinol. (2) 셀 12.5 µ M, MSC 또는 20 EX527 또는 0.5 mm NMU 중간 다음 노출을 기록에 1 µ M cambinol와 함께 치료를 했다. 노란색: 제어; 빨간색: 0.25 mM NMU; 녹색: 0.5 m m NMU; 블루: 0.5 m m NMU + 12.5 µ M MSC; 그린 옐로우: 0.5 m m NMU + 12.5 µ M MSC + 20 nM EX527; 보라색: 0.5 m m NMU + 12.5 µ M MSC + 1 µ M cambinol. (B) 결과 안정적으로 transfected 세포에서. 3rd-5번째 봉우리 그룹 간의 깨끗 하 고 명확한 차이 보여준 대표적인 결과로 표시 됩니다. (1) 세포 0, 0.5, 1.0로 치료 했다 또는 2.0 m m NMU, 40 nM EX527, 또는 동기화 후 1 시간에 2 µ M cambinol. 노란색: 제어; 빨간색: 0.5 m m NMU; 녹색: 1.0 m m NMU; 블루: 2.0 m m NMU; 그린 옐로우: 40 nM EX527; 보라색: 2 µ M cambinol. (2) 세포는 1.0 mm NMU 중간 다음 노출을 기록에 12.5 µ M MSC로 대우 되었다. 노란색: 제어; 빨간색: 1.0 m m NMU; 녹색: 1.0 m m NMU + 12.5 µ M MSC. (3) 셀 12.5 µ M MSC 다음으로 치료 했다 노출 40 nM EX257. 노란색: 제어; 빨간색: 40 nM EX257; 녹색: 40 nM EX257 + 12.5 µ M MSC. (4) 세포는 12.5 µ M MSC 다음으로 치료 했다 2 µ M cambinol에 노출. 노란색: 제어; 빨간색: 2 µ M cambinol; 녹색: 2 µ M cambinol + 25 µ M MSC. 이 결과 이전에 보고 된 및 CC에 의해 2.022. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: NAC 복용량 의존 NMU에 의해 중단 셀룰러 circadian 리듬을 복원. 셀은 동기화 후 1.0 m NMU 또는 1 시간에 대 한 차량 제어 치료 했다. (A) 시간 (h)에 대 한 생물 발광 (수/min)의 대표적인 결과입니다. 노란색: 제어; 빨간색: 1.0 m m NMU; 녹색: 1.0 m m NMU, 5 µ M NAC; 블루: 1.0 m m NMU, 10 µ M NAC; 그린 옐로우: 1.0 m m NMU, 20 µ M NAC. (B) 기간 (시간). (C) (시간) 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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포유류 세포 주기 circadian 클록의 상호 transcriptional/변환 피드백 루프에 의해 통제 된다. Heterodimers의 Bmal1 시계 및 Npas2 코어 CGs, Per2 , 외침및 수많은 CCGs4등의 발기인의 E 상자 요소에 바인딩하여 circadian 전사 조절. 그들은 셀, heterodimers의 축적으로 당: 외침 post-translationally 수정 및 시계: Bmal1 transcriptional 활동을 억 누르기 위해 핵 수송. 이 부정적인 피드백 루프 코어를 CGs 자신의 녹음 방송 규제와 CGs와 CCGs23의 리듬 표현 설정 수 있습니다. 개별 셀에 시계 두 기본 조건 (예를 들면, 산화 환 원 잠재력)에 의해 동기화 할 수 있습니다 비록 대부분 포유류 세포는 본질적인 circadian 시계, 및 외부 환경 자극24. Circadian 유전자 식에 vivo에서 멜 라 토 닌, 중앙 맥 박 조정기 (SCN)에서 받은 신호에 대 한 응답에서의 송과선에 의해 생성 한 호르몬에 의해 동기화 될 수 있습니다. SCN 통합 전문 melanospin-표현에 impinging 빛에서 신호 망막에 감광 성 망막 신경 절 세포. 송과선에서 출시 멜 라 토 닌 순환을 들어간다 SCN의 circadian 리듬을 조절 하 고 대부분 주변 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서25,26. Circadian 리듬 또한 스트레스 호르몬 (예:코 티 솔, catecholamines)27,28 및 성장 요인29,30에 의해 조정할 수 있습니다. 성장 요인의 규제 완화 관련 세포 성장과 분화31의 circadian 중단 된 것으로 알려져 있다.

우리 건설 circadian 기자 벡터가 부정적인 생 화 확 적인 피드백 메커니즘을 이용 한다. Transcriptional 활성 제, BMAL1 및 시계, PER2 발기인 및 repressors 인용 및 우 셨다, 부정적인 BMAL1 식 조절 circadian 전자/E´-상자 바인딩 주제에 묶는 코어 circadian 부정적인 피드백 루프에 의하여 이루어져 있다. 현재 기자 시스템에서 BMAL1 및 클록 PER2 발기인의 리듬 활성화 circadian 표현의 정한 luciferase, 발광 신호의 더 정확한 circadian 주기 위한 수 있도록 지원 합니다. 기자 플라스 미드의 건설 BMAL1 바인딩 사이트, circadian 리듬 향상 사이트, GC 상자 및 hPER2 발기인의 녹음 방송 시작 위치를 포함합니다. 벡터 transfected 세포에 세포 자율 circadian 리듬에 대 한 실시간 판독 가능 하며 조건 또는 유전자 발현의이 생 circadian 패턴을 변경 하는 특정 에이전트를 식별 하는 데 수 있습니다. 그러나, 세포는 경작에 생체 외에서 또는 vivo, 전 그들의 circadian 발진기 신속 하 게 될 비통. 그것은 그러므로 전에 어떤 circadian 분석 수행 시험관에수 그들의 리듬을 다시 동기화 하는 데 필요한입니다. 유 방 상피 세포에서 우리가 발견 하는 50 %HS, 멜 라 토 닌, 그리고 100% SQ circadian 리듬 체 외의 효율적인 동기화 유도 각 못했습니다. Dexamethasone와 산림 부분 동기화만 생산. 복용량-의존 테스트 개발 및 미래의 연구에 새로운 동기화 에이전트의 선택에 필요한 것입니다. 동기화 에이전트, 50 %HS 효과적인 동기화 에이전트는 강력 하 고 재현할 수 셀룰러 circadian 리듬 신경 및 유 방 상피 세포에서 생산 된다는 것을 발견 되었다 세포, 이전으로 저렴 한 비용, 효율성 및 그것의 넓은 사용을 감안할 때 다른 많은 세포 유형 및 다른 실험 설정24보고.

Circadian 규제의 생체 외에서 모델의 유효성을 검사 하려면 우리 다음 에 비보관찰 circadian 리듬 체 외에서 환경 스트레스에 대 한 응답 효과 정리 것 경우 물었다. 이전에 우리는 NMU의 단일 발암 투여 중단 circadian 표현의 주요 CGs (예를 들어, Per2) 시연 및 여러 CCGs 대상 유선에서. 또한, MSC의 chemopreventive 처방 circadian 표현의 Per2 와 CCGs 유전자를 정상으로 다시 설정합니다. 우리 다시 한번 입증 유독에 세포의 노출 스트레스 circadian 유전자 발현 나드+에 그들의 효과 통해 변경할 수 있습니다-종속 SIRT1 활동7,,822. 생체 외에서 circadian 기자 분석 결과 NMU에 노출을 보여을 사용 하 여 얻은 결과 세포 circadian 유전자 발현의 중단 발생 하 고에 의해 중단 더 흥미롭게도, MSC가 뿐만 아니라 세포 circadian 리듬을 다시 설정할 수 NMU, 또한 SIRT1 억제제에 의해 중단 circadian 리듬을 다시 설정. 이러한 결과 표시 에 체 외 분석 결과 뿐만 아니라 circadian 유전자 발현에 NMU의 효과 재현 하지만 또한 방해 circadian 리듬에는 vivo에서 SIRT1 종속 메커니즘을 통해에 MSC의 효과 재현. 유독 고 직접 저 해제 및 변조기를 포함 하 여 셀에 나드+/NADH 레벨을 변경 하는 스트레스의 다양 한 검색 잠재력이 따라서 circadian 기자 시스템 체 외에서 세포 산화 차적인 뿐만 아니라 자전거의 나드+ 많은 ADP ribose 종속 DNA 통해 고갈 수 에이전트32복구. 이러한 결과 체 외 기자 시스템 중단 또는 circadian 유전자 규칙에서 vivo에서복원할 수 있는 화학 에이전트 및 셀 조건 화면에 유용한 도구를 제공 합니다 것이 좋습니다.

생체 외에서 시험 정도 또는 안정적으로 기자 구조와 페 셀을 사용 하 여 설정할 수 있습니다, 비록 차이가 계속적이 고 뚜렷이 transfected 세포 사이 화학 물질의 취급에 대 한 응답에 주목 했다. 안정적으로 transfected 세포 더 많은 화학 물질의 치료에 내성을 했다 특히 NMU 및 SIRT1 억제제, 뚜렷이 transfected 세포 보다. 이러한 차이 수 특정 통합 사이트를 둘러싼 시퀀스에서 규제 영향으로 인해 안정적인 transfectants에서 벡터 발기인의 미묘한 차이 반영 하 고. 따라서, 항생제 치료에 의해 안정적인 transfectants의 선택 또한 저항 circadian 중단 하는 클론을 선택할 수 있습니다. 따라서, 일시적 또는 transfectants를 사용 하 여 셀 모델 개별 생체 외에서 vivo에서 응답을 정리 하는 능력에 대 한 확인 해야 합니다. 다른 transfection 방법 또한 그들의 다른 화학 물질의 독성 효과 민감성에 차적인 스트레스와 셀에 결과 독성의 다양 한 레벨을 유도. 따라서 세포 독성 테스트와 파일럿 실험 transfection 및 치료 조건의 선택에 대 한 필요는. 그들의 감도에 차이도 불구 하 고 전반적인 결과 중단 및 셀룰러 circadian 리듬의 복원에 대 한 우리의 유 방 상피 circadian 기자 세포와 화학 물질은 일관 되 고 사이 비교 정도 transfected 안정적 transfected 세포, 그리고 결과 비보관찰 효과 지.

다른 세포 유형에서 circadian 기자 벡터를 사용할 수 있는지 확인 하려면 인간의 세포종/astrocytoma 셀 (U-87 MG)이 circadian 벡터와 페 안정적으로 했다. 체 외에서 세포 생물 발광 분석 결과 사용 하 여 예비 결과 보였다 동기화 후 이러한 신경 파생 된 종양 세포는 정기적이 고 강한 세포 circadian 리듬 인간에서 유 방 관찰 비교 상피 세포입니다. 셀 1 δ (CK1δ) IC261, 카 세 인 니의 유명한 억제제로 치료 및 CK1 ε, 보고 b로 낮은 진폭 그러나 circadian 장기간을 보였다y 다른 (데이터 표시 되지 않음)33. 이러한 결과 circadian luciferase 기자 벡터 및 체 외에서 세포 생물 발광 분석 결과 신경 세포를 포함 하 여 다른 기관 특정 셀에 적용 됩니다 나타냅니다.

여기에 개발 된 셀룰러 기자 시스템 따라서 사용할 수 광범위 하 게 생체 외에서 시험으로 다른 세포 유형에 circadian 유전자 발현의 결정에 대 한 일반적. 실험 절차는 간단 하다, 빨리, 그리고 안전. 그러나,이 세포 기자 시스템 쉽게 적응 하실 수 없습니다 transfect 하기 어려운 세포 비 분할 세포 (예를들면, 신경 세포), 악명 낮은 transfection 효율 있기 때문. 바이러스에 기초를 둔 transfection 방법 (예를 들어, lentivirus transfection)34이 셀 대 한 높은 효율 솔루션을 제공할 수 있습니다. 그러나, 시간과 lentiviral 생산과 관련 된 어려움을 만든다이 방법은 어렵고 시간이 소요 또한, 적절 한 안전 수준 연구소는 생산 및 바이러스의 사용에 필요 합니다. 또한, 고해상도 단일 셀 발광 검출기 영구, 독립적으로 단계적 리듬 circadian 유전자 발현 세포 비 분할35에의 지 사용 될 수 있습니다.

포유류 circadian 리듬에 vivo에서 학문은 뿐만 아니라 노동 집약, 고 비용이 많이 드는, 하지만 그들은 또한 동물의 큰 숫자의 사용을 필요로. 체 외에 시스템의 가용성 circadian 유전자 발현의 장애 및 만성 질환의 개발 사이 연결을 테스트 하는 데 필요한 동물의 수를 크게 줄일 수 있는 등 발암 및 대사 증후군입니다. Circadian 매개 변수, 기간, 진폭, 위상, 등에 양적 데이터 복용량-및 셀룰러 circadian 리듬에 화학 물질의 시간에 따른 효과 알릴 수 있습니다. 예를 들어 우리는 그 항 산화 NAC 기간 및 NMU에 의해 중단 하는 셀룰러 circadian 리듬의 위상에 복용량 독립적으로 복원할 수 있습니다 관찰. 생체 외에서 모델 또한 사용할 수 및 환경 circadian 분리기를 분류 하 고 방해 circadian 리듬의 개발에 대 한 기계적 인 사이트를 제공 하는 세포질 기능 장애에 미치는 영향을 조사 하 유 방 암, 대사 증후군 및 신경 생리학 장애, 비정상적인 작업 일정 때문에 증가 위험이 동료에 대 한 개입 전략.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품으로는 2012 사회의 독성 (SOT) 지원 되었다-그렇지 연구 (M. 팡) Colgate Palmolive 그랜트와 국제 협력 연구 기금 동물 및 식물 검역 기관, 한국 공화국 (M. 팡), 그리고는 NIEHS 부여 P30ES005022 (H. Zarbl). 우리는 그의 도움이 토론, 씨 Shao-An 후안 그의 실험적인 지원을, 및 그녀의 증거 독서에 대 한 양 키 미 나카타 첸 청 (맥 거 번의과 대학 대학에서 휴스턴에서 건강 과학 센터 택 사스의) 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

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References

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<em>생체 외에서</em> 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광
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Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

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