Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In Vitro Bioluminescens analysen som karakteriserer døgnrytmen i Mammary epitelceller

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

Bioluminescens i vitro analysen å bestemme mobilnettet døgnrytmen i mammary epitelceller presenteres. Denne metoden bruker pattedyr celle reporter plasmider uttrykke ustabil luciferase under kontroll av periode 2 gen arrangøren. Det kan tilpasses andre celletyper evaluere organ-spesifikke effekter på døgnrytmen.

Abstract

Døgnrytmen er en grunnleggende fysiologisk prosess i alle organismer som regulerer biologiske prosesser fra genuttrykk sove atferd. I virveldyr, er døgnrytmen kontrollert av en molekylær oscillator som fungerer både i suprachiasmatic kjernen (SCN, sentrale pacemakeren) og individuelle celler som består av mest perifere vev. Enda viktigere, er forstyrrelser i døgnrytmen ved eksponering for lys-på-natt, miljømessige stressfaktorer og/eller giftstoffer assosiert med økt risiko for kroniske sykdommer og aldring. Muligheten til å identifisere agenter som kan forstyrre sentrale og/eller eksterne biologiske klokker og agenter som kan hindre eller dempe virkningene av circadian avbrudd, har viktige implikasjoner for forebygging av kroniske sykdommer. Selv om gnager modeller kan brukes til å identifisere eksponeringer og agenter som induserer eller hindre/redusere circadian avbrudd krever disse eksperimentene stort antall dyr. I vivo studier også krever betydelige ressurser og infrastruktur, og krever forskere å jobbe hele natten. Dermed er det et presserende behov for en celle-type riktig i vitro system til skjermen for miljømessige circadian disruptors og enhancers i celletyper fra ulike organer og sykdomstilstander. Vi bygget en vektor som driver transkripsjon av ustabil luciferase i eukaryote celler under kontroll av menneskelig periode 2 gen arrangøren. Denne circadian reporter konstruksjonen var stabilt transfekterte i menneskelig mammary epitelceller, og circadian forståelsesfull reporter celler ble valgt å utvikle i vitro bioluminescens analysen. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å opprette og validere analysen. Vi gir ytterligere detaljer for bevis på konseptet eksperimenter demonstrere evnen til analysen vår i vitro å recapitulate i vivo effekten av ulike kjemikalier på mobilnettet biologiske klokken. Resultatene indikerer at analysen kan tilpasses til ulike celletyper til skjermen for både miljømessige disruptors og chemopreventive enhancers av circadian klokker.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Circadian klokken regulerer et bredt spekter av biologiske prosesser fra dagaktive uttrykket av gener sove atferd i en forutsigbar rytme med en periodisitet av ca 24 h. Epidemiological studier antyder sterkt at kronisk forstyrrelse av circadian rytme øker risikoen for brystkreft og prostata kreft i skiftarbeidere, inkludert sykepleiere og flight mannskap1,2,3. Disse funnene er bekreftet av gnager studier viser at eksponering for konstant lys, lys-på-natt eller lys sykluser som etterligner jetlag økning svulst forekomsten og akselererer tumor vekst4,5. Basert på data fra både menneskelige og gnager studier, klassifisert International Agency for forskning på kreft shift-arbeidet som en sannsynlig menneskelige carcinogen (typen 2A) i 20106.

Tidligere har vi vist at en enkelt kreftfremkallende dose av mammary svulst bestemt kreftfremkallende, N- nitroso-N- methylurea (NMU), forstyrret circadian uttrykk for store circadian gener (CGs) (f.eks, periode 2 , Per2) og flere circadian-kontrollerte gener (CCGs), inkludert nøkkel DNA skade forståelsesfull og reparere (DDRR) gener i melkekjertlene mål (men ikke i leveren). Videre tilbakestille circadian uttrykk for både Per2 og DDRR gener mot normal en chemopreventive diett kosttilskudd L-metyl-selenocysteine (MSC) reduserte forekomsten av svulst med 63%. Disse funnene var de første til å vise en mekanistisk kobling mellom døgnrytme, kjemiske kreft og chemoprevention7,8. For andre miljømessige giftstoffer vist å forstyrre circadian genet uttrykk i vivo er også forbundet med økt risiko av miljømessige sykdommer9,10. Forstå mekanismene som kobler circadian avbrudd av miljømessige giftstoffer og patogenesen kan føre til mechanistically-baserte tilnærminger til sykdomsforebygging. Men studier for å definere samspillet mellom eksponeringene og døgnrytmen er vanligvis utført i vivo. En typisk i vivo eksperiment undersøker virkningen på døgnrytmen krever mange dyr, som vev fra minst tre kontroll og tre eksponerte dyr må være samlet hver 3-4 h over en 24 eller 48 h periode. Utviklingen av et valideres i vitro system som viser i vivo observasjoner og mekanismer vil derfor ikke bare redusere antall dyr kreves, men også redusere eksperimentelle kostnader og kravet som forskere jobber kontinuerlig over en 24-48 h periode. Videre kan et valideres i vitro system brukes for høy gjennomstrømning screening av forbindelser og/eller genetiske endringer som påvirker døgnrytme, eller sitt svar på miljømessige stressfaktorer eller giftstoffer. Derfor strategiske kombinasjonen i vitro og vivo modeller og eksperimenter for å få ulike innsikt med ulike fokus.

I pattedyr finnes circadian oscillatorer ikke bare i spesialiserte nevroner i SCN, men også i de fleste eksterne celletyper. Disse molekylær klokker er lik de i etablerte fibroblast linjer og primære fibroblaster fra befruktede egg eller voksen dyr; Det er imidlertid behov for vev spesifikk mobilnettet modeller11. Følgelig tradisjonelle studier locomotor aktivitet i vivo, SCN explants ex vivo, og cellen-basert i vitro analyser i udødeliggjort fibroblast celler brukes å studere celle autonome circadian defekter. Men det er ingen bevis som indikerer at en i vitro fibroblast cellebasert analysen kan recapitulate circadian mekanismer og svar finnes i cellene i andre eksterne organer i vivo. Ulike celletyper kan ha ulike mønstre av genuttrykk, xenobiotic oval metabolisme og DDRR, og koblingene mellom giftighet og circadian genuttrykk kan være celle-type bestemt og/eller modulert av ulike fysiologiske parametere. I tillegg har circadian oscillatorer i fibroblast-baserte systemer ikke vært helt vurderes for tiltak mot miljømessige giftstoffer, stressfaktorer og forebyggende agenter som kobler for mekanismer sykdom og forebygging. Dermed er det behov for lettvinte, validert celle-type spesifikke, i vitro bioluminescens analyser å studere orgel bestemt miljømessige circadian disruptors. Selv om en rekke mobilnettet klokke modeller (f.eksi leveren, keratinocytter, og fettceller, samt en osteosarcoma cellen linje) har blitt utviklet i de senere årene12,13,14, 15, analysen beskrevet her er første mobilnettet klokke modell i bryst epitelceller, og den første demonstrasjonen recapitulate i vivo Svar å miljømessige stressorer, giftstoffer, narkotika og chemopreventive agenter.

Renilla luciferase (rLuc) og firefly luciferase er 30-61 kDa monomerisk proteiner som ikke krever posttranslational behandling av enzymatisk aktivitet og kan fungere som en genetisk reporter umiddelbart etter oversettelse. Når underlaget knytter luciferase enzymet, genererer den biokjemiske reaksjonen katalysert et. Dermed er luciferase konstruksjoner mye brukt som gene expression reporter systemet i vitro og i vivo. Men i døgnrytmen studier, nytten av luciferase reporteren er begrenset av relativt lang halveringstiden av luciferase protein (T1/2 = 3.68 h) i forhold til perioden (spesielt til korte perioden) for endringer i circadian genet uttrykk. men har mange studier årene brukt luciferase genet i pGL3 vektoren, som indikerer at den raskt nedbrytbar luciferase ikke er nødvendig for rapportering døgnrytme, spesielt for rytmer med en lengre periode, som 24 h. Derfor har en reporter plasmider med ustabil luciferase vektor, pGL [Luc2P/Neo], som inneholder hPEST (en protein destabilisering sekvens) blitt utviklet, slik at vi kan bruke den som en circadian reporter vektor for våre nåværende i vitro bioluminescens analysen. Protein kodet av Luc2P har en mye kortere halveringstid (T1/2 = 0.84 h) og derfor reagerer raskere og med en større styrke på endringer i transcriptional aktivitet enn vill-type, jegndicating som det kan brukes til å overvåke rytmisk uttrykk for luciferase regulert av PER2 selskapet nøyaktig i sanntid16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. bygging av PER2 Promoter drevet ustabil Luciferase Reporter vektor

  1. kjøpe en tilpasset pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vektor som inneholder cDNA koding rLuc og menneskelige PER2 formidler fragment (hPER2P, 941 bp) på nettstedet mellom Sac jeg og Hind III i de flere kloning region 17.
  2. Kutt menneskelige PER2 promoter fragmentet (hPER2P, 941 bp) ut fra vektoren.
    1. Legge til 2,5 µL begrensning enzym buffer, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vektor og 1 µL hver av begrensning enzymer, Sac I (10 enhet/µL) og Hind III (10 enhet/µL), i en DNA RNA/nukleotid-fri microcentrifuge tube. Legg ultrapure vann (10,5 µL) opptil 25 µL og bland forsiktig av pipettering.
    2. Incubate på 37 ° C i 90 min i en oppvarming blokk.
    3. Kjører hele volumet (25 µL) av begrensning enzym reaksjon på 0,7% agarose gel inneholder 0,0001% ethidium bromide (EtBr) for å skille hPER2P fra vektoren.
      Merk: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium bromide (CAS registreringsnummer: 1239-45-8), er en luktfri røde væske. Det er en intercalating agent som er vanligvis brukt som en fluorescerende koden (nukleinsyre syre flekken) i agarose gel geleelektroforese og synlig som en oransje farge under UV-lys. Mulig fare for uhelbredelig skadevirkning ved mutagene har skjedd i forsøksdyr, selv om ingen av tilsynsorganer kategorisert det som en karsinogen 18. Derfor vi samlet brukte agarose gel og geleelektroforese buffer som inneholder EtBr som kjemisk fare avfall, og forespurt Rutgers miljørettet helsevern & sikkerhet (REHS) å plukke opp og kast trygt.
    4. Klipp et stykke agarose gel inneholder en EtBr fluorescens band på 941 bp, og rense hPER2P fragmenter fra gel med en DNA gel utvinning kit, etterfulgt av kvantifisering på et spektrofotometer ved å måle absorpsjon tetthet (OD) på 260 nm wavelength.
  3. Linearize 1.0 µL (1 µg) av destabilisert firefly luciferase uttrykk vektoren, pGL [Luc2P / Neo] med samme metode som beskrevet i trinn 1.2.1-1.2.2. Ekstra vektor med en DNA oppryddingen kit etterfulgt av kvantifisering som beskrevet ovenfor bruker et spektrofotometer.
  4. Ligate hPER2P i linearisert vektor pGL [Luc2P / Neo].
    Merk: Per produsenten ' s opplæring, ideelle molar forholdet mellom innsettings- og vektor er 2:1. 50 ng vektor, den ideelle mengden sett inn beregnes som 23,6 ng med en formel, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb Vektor] x (2/1) = sett inn 23,6 ng]. Basert på konsentrasjonen av hPER2P (7.26 ng/µL) og pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), volum av 50 ng pGL [Luc2P / Neo] og 23,6 ng hPER2P beregnes som 1 µL og 3.26 µL, henholdsvis.
    1. Legge 2 µL T4 DNA ligase reaksjon buffer (10 X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP og 10 mM DTT), 3.26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], og 13.74 µL vann opptil 20 µL , bland forsiktig.
    2. Legge 1 µL T4 DNA ligase (400 enhet/µL), bland forsiktig og ruge på 16 ° C over natten i en thermocycler og deretter chill ligated vektoren på is per produsenten ' s instruksjon.
  5. Transformere samskrevet vektor pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] til kjemisk kompetent E. coli 19.
    1. Sett vannbad på 42 ° C, varme opp Super Optimal buljong med catabolite undertrykkelse (S.O.C.) medium (2% Tryptone 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 og 20 mM glukose) ved romtemperatur , varme opp Luria-Bertani (LB) agar plate (inneholder 100 µg/mL ampicillin, 80 µg/mL X-gal og 0,5 µM IPTG) i 37 ° C inkubator og tine på is en flaske av kompetente E. coli celler for hver transformasjon.
    2. Legge til 6 µL (21 ng) samskrevet vektor eller 1 µL (30 ng) tom vektor (negativ kontroll) til en tube av kjemisk kompetent E. coli (50 µL) og deretter Vend forsiktig røret å blande. Ruge på is 30 min.
    3. Varme sjokk i et vannbad 42 ° C for 30 s uten risting og deretter tilbake til ice.
  6. Velge en E. coli koloni forvandlet en ligated vektor med blå/hvit screening.
    1. Legge til 250 µL S.O.C. medium i det transformerte E. coli rør og Inkuber det 1t på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
    2. Jevnt 10-50 µL av transformert E. coli på overflaten av LB agar platen. Sette platen opp ned i 37 ° C inkubator natten.
      Merk: En effektiv kloning reaksjon skal produsere flere hundre kolonier. Kontaktflate to ulike volumer anbefales å sikre at minst én plate vil ha store, klare hvit eller blå farge og vel linjeavstand kolonier. Når koloniene er for små, og fargen er ikke skilles ved hjelp av et mikroskop (10 X eller 50 X) er nyttig.
    3. Velg 3-6 hvite kolonier fra platene med sterilisert tann pinner, og slipper hver kolonien i en kultur rør som inneholder 4 mL LB kultur medium med 50 µg/mL ampicillin.
    4. Ruge rørene på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm over natten. Ekstra DNA bruker 2 mL 4 mL kultivert E. coli med en plasmider DNA utvinning mini prep kit per produsenten ' s instruksjon.
  7. Kontroller og analysere innsatsen (hPER2P, 941 bp)
    1. fordøye plasmider DNA med begrensning enzymer og kjøre geleelektroforese som beskrives i trinn 1.2.1-1.2.3 å bekrefte om det er et innstikk.
      Merk: Positiv kontroll (hPER2P renset på trinn 1.2.4) og negativ kontroll (E. coli forvandlet med en tom vektor) ble inkludert.
    2. Rekkefølge valgte plasmider DNA bruker M13 frem og M13 omvendt primere for å bekrefte retning og sekvens av sette i plasmider 19.
      Merk: Bare en koloni som hadde et innstikk med riktig størrelse på hPER2P i gelelektroforese og riktig retning og rekkefølgen sekvensering resultatet ble valgt.
    3. Analysere menneskelig PER2 promoter fragmentet (hPER2P, 941 bp) sekvens for circadian regulatoriske elementene, inkludert E-boksen motiv (Bmal1 binding området, CAT/CGTG), CCAATC, GC-boksen, og transkripsjon starte nettsted (CAGCGG) 20.
  8. Amplify den valgte E. coli ved å legge den leftover 2 mL kultivert E. coli i 200 mL LB kultur medium som inneholder 50 µg/mL ampicillin og deretter rugende den natten på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
  9. Ekstra DNA med en endotoxin-fri plasmider maxi prep kit per produsenten ' s undervisning, og deretter Kvantifisere det ved å måle OD på 260 nm wavelength med et spektrofotometer. Aliquot og lager plasmider DNA, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], på-80 ° C fryseren for fremtidig bruk.

2. Forbigående Transfection

  1. Kjøp og kultur MCF10A celler
    1. Kjøp en udødelighet, ikke-transformert normal menneskelig mammary epithelial celle linje (MCF10A) fra en kommersiell cellen bank, hvor cellene er cytogenetically testet og godkjent med kort tandem gjenta analyse før frysing. Tine og vedlikeholde hvert hetteglass frosne celler i kultur for maksimalt 8 uker.
      Merk: I motsetning til andre celler, disse cellene har kontakt hemming når de kommer til ~ 70% samløpet. Det krever at subkultur utføres på ~ 70%.
    2. Kultur cellene med mammary epithelial celle vekst medium (MEGM), som inneholder mammary epithelial basale medium (MEBM), vekst kosttilskudd og kolera giftstoffer i en celle kultur inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO 2.
      Merk: Kjøp klare til bruk vekstfaktorer gitt i SingleQuot (SQ) og skaffer kolera gift separat. Siste konsentrasjoner av vekst kosttilskudd er 0,4% bovin hypofysen ekstrakt, 0,1% insulin, 0,1% hydrokortison, 0,1% menneskelige epidermal vekstfaktor, 100 ng/mL kolera gift, og utgjør 0,05% gentamycin sulfate og 0,05% amfotericin B.
    3. Dissociate cellene i 10 cm kultur parabol av inkubasjon med 10 mL trypsin/EDTA for ~ 20 min og deretter nøytralisere trypsin ved å legge 10 mL trypsin nøytralisere løsning. Samle alle celler med HEPES bufret saltvannsoppløsning (HBSS).
    4. Telle celler med en hemocytometer under en invertert mikroskop og Beregn konsentrasjonen enkeltcelle suspensjon, og deretter frø et visst antall celler etter behov. Swirl platene grundig for å få en jevn distribusjon av celler i hver plate. Inkuber celler i celle kultur inkubator på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO 2.
      Merk: Kjøpe en subkultur reagens pack inneholder trypsin/EDTA, trypsin nøytraliserende løsning og HBSS bruke.
  2. Forbigående transfection celler med circadian vektoren konstruert.
    1. Frø 2 x 10 5 MCF10A celler i 35 mm kultur parabol med MEGM og vokse til 20-30% samløpet (neste dag).
    2. Varme opp den reduserte serum media (f.eks Opti-MEM) i 37 ° C vann bad og transfection reagens ved romtemperatur for 30 min. fortynne plasmider DNA bygget (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) til 30 ng/µL med endo-toksin gratis Tris-EDTA (TE) bufferen og holde ved romtemperatur.
    3. Forberede plasmider transfection blandingen i en 1,5 mL microcentrifuge rør ved å legge 63.6 µL varm redusert serum media først, deretter legge 33.4 µL (0,1 µg) plasmider DNA, og bland forsiktig av pipettering, og deretter legge til slutt 3 µL av hva reagens direkte i midten av røret uten å berøre veggen. Etter miksing forsiktig av pipettering, holde ved romtemperatur for 30 min.
    4. Slipper hele plasmider blandingen (100 µL) direkte på center overflaten av mediet i platen og bland forsiktig ved å riste parabolen. Kultur cellene i en CO 2 inkubator for ekstra 48-72 h.
      Merk: Det er spådd at den høyeste transfection effektiviteten ville være på 40-70% samløpet av disse cellene på grunn av deres kontakt hemming på ~ 70%. Derfor, hva arbeider best starter på ~ 20% og stopp på ~ 70% samløpet.

3. Etablering av I Vitro bioluminescens analysen i Transiently transfekterte MCF10A celler

  1. sulte kulturperler cellene på ~ 70% samløpet (etter hva 48-72 h) i MEBM uten vekstfaktorer for 24 h.
  2. Behandle cellene med synkronisering agent (f.eks 50% hest serum (HS)) i MEBM for 1,5 t i en CO 2 inkubator.
    Merk: For valg av en ideell synkronisering agent, 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0.1 µM deksametason, 50% HS og 100% SQ ble sammenlignet circadian amplitude og perioden i circadian vektor transfekterte cellene. Tom vektor transfekterte cellene behandles med 100% SQ som en negativ kontroll.
  3. Pre-prepare 20 mL opptaksmediet (for 10 av 30 mm kultur rettene) ved å legge MEGM 5 mL, 15 mL MEBM, 150 µL natriumbikarbonat, 200 µL HEPES og 40 µL luciferin lager løsning (50 mM) i et 50 mL sterilisert sentrifuge rør.
    Merk: De siste konsentrasjonene av hver komponentene: 20% SQ og 20 ng/mL kolera gift, 0,06 prosent natriumbikarbonat, 1% penicillin/streptomycin og 10 mM HEPES. Varme opp ferdig opptak medium og steriliseres 1 x PBS i 30 min i 37 ° C vannbad. Legge til 100 µM luciferin umiddelbart før bruk.
  4. Vask cellene med varme 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered saltvann (D-PBS) for 3 ganger etter inkubasjon med synkronisering agent, og deretter legge 2 mL opptak medium.
  5. Tetning parabolen med en sterilisert dekke klasse bruker silisium fett å hindre fordampning og deretter merke det på side.
  6. Plasser forseglet rett i setet inne luminometer, og slå på alternativet for å lagre filens plassering i mappen (for detaljer, se §6).

4. Stabilt transfekterte celleutvalg

  1. optimalisere en ideell G418 konsentrasjon (800 µg/mL) med en kill kurve analysen ifølge produsenten ' s instruksjon for merkede celleområdet stabilt transfekterte.
  2. Etter forbigående transfection for 48t eller 72 h, subkultur og frø cellene med MEGM i større retter på 5000 celler/rett (100 mm). Etter 24 h kultur i celle kultur inkubator (37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO 2), behandle cellene med 800 µg/mL av G418 ved å erstatte den gamle mediet med nytt medium som inneholder 800 µg/mL G418 hver 3-4 dager i 2 uker.
  3. Transfekterte subkultur den gjenlevende stabilt koloniene for 1-3 passasjer med MEGM som inneholder 500µg/mL G418 å opprettholde stabil uttrykk for hPer2P/Luc2P, og fryse i flytende nitrogen for fremtidig bruk.
  4. Behandle 500µg/mL G418 etter generelle subkultur til re-velge stabilt transfekterte befolkningen av celler, hvis bioluminescens intensiteten i resultatet av i vitro bioluminescens analysen blir gradvis lavere etter bruk mange skriftsteder.

5. Behandling med kjemikalier

  1. på 48 h eller 72 h etter transfection, sulte cellene fra vekstfaktorer i MEBM for 24 h.
  2. Etter synkronisering med 50% HS 2 h, behandle celler med 0,25 mM eller 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol 1t i MEBM som inneholder 20% sq
  3. Etter vask med 1 x D-PBS, legge til opptak middels inneholder 12.5 µM MSC alene eller i kombinasjon med 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol, til cellene. Overvåking bioluminesens med luminometer.
  4. Behandle stabilt transfekterte MCF10A / PER2-dLuc-celler med NMU på 0,5, 1 eller 2 mM, EX527 på 40 nM eller Cambinol på 2,0 µM, 1t etter synkronisering med 50% HS, og deretter Inkuber cellene i innspillingen middels inneholder 12.5 µM av MSC eller forskjellige doser (5, 10 eller 20 µM) av n-acetylcysteine (NAC). Plasser platene i luminometer, posten og spare bioluminesens av luminometer for 4-8 dager som beskrevet i delen 3.6.
    Merk: NMU er en methylated nitrosourea sammensatte med mutagent, kreftfremkallende og teratogene. NMU er en direkte-fungerende alkylating agent og har kort halveringstid (T 1/2 = ~ 30 min). Er det stabilt på Sure tilstand (pH 4-5), men ustabile alkaliske tilstand (pH 9-10) og ved temperaturer over 20 ° C. Derfor kan blekemiddel på 10% brukes som en effektiv deaktivering agent for rengjøring benk overflater og lab varer potensielt forurenset av NMU solutipå. Leftover lagerløsning er plukket opp og trygt solgt REHS. Basert på virkemåte av kjemikalier, kan synkronisert celler behandles for kortere ganger før dyrking i opptaksmediet. Cellene kan også behandles i opptaksmediet i lengre tid (flere dager).

6. Datainnsamling, analyse og presentasjon

Merk: cellen levedyktighet må bestemmes ved å bruke standard metoder (f.eks MTT analysen) etter behandling av celler på samme konsentrasjonen for samme tidene indikert. Alle behandling konsentrasjoner i i vitro bioluminescens analysen var lavere enn 30% dødelig konsentrasjon (LC30). Alle eksperimentene ble gjennomført i tre eksemplarer og representant resultatene ble presentert.

  1. Etter tetting parabolen (trinn 3,5), laste rettene på setene i luminometer, som er holdt i en inkubator satt på 37 ° C uten H 2 O og CO 2, og koblet til en datamaskin.
  2. Klikk " lagre " og angi navnene på mappen og filen hvor innspilte luminescence signalet fra tilsvarende parabolen lagres.
    Merk: Systemet oppdager luminescence signalet i sanntid fra cellene i retten på individuelle stillinger. Signalene overføres til datamaskinen gjennom 4-fotonet-telling photomultiplier rør, og lagres og vises i datamaskinen som den samling programvaren.
  3. Analysere signaler etter opptak i 4-7 dager, som kan være etterfulgt av medium endring og kontinuerlig opptak for en ny uke eventuelt.
    Merk: For å få circadian parametere, inkludert fase, Periodelengde, rytme amplitude og demping rente, vi brukte luminometer analyseprogramvare dataanalyse bioluminescens.
  4. Detrend ømt punkt data med en glidende gjennomsnitt og analysere den beste-passer til en sinuskurve å få periode, fase, amplitude og demping rate 21 , 22.
  5. På grunn av høy forbigående bioluminesens behandling og medium endring, hindre den første syklusen for data analyse.
  6. For datapresentasjon, plot rådata (bioluminescens, teller/s) mot tiden (h eller dag). Når det er nødvendig, baseline-trukket data kan tegnes sammenligne amplitude og fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Circadian bioluminescens reporter vektor: menneskelig PER2 promoter-drevet uttrykk ustabil luciferase variant

DNA sekvensen som består av et 941 bp fragment avledet fra menneskelige PER2 selskapet brukes til å konstruere circadian reporter vektoren, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, ble først analysert for tilstedeværelsen av regulatoriske elementer kjent å regulere circadian genuttrykk. Bioinformatikk analyse viste at i denne promoter fragment, det er tre forskjellige Bmal1 bindende områder (E-boks) (CAT/CGTG), to circadian transkripsjon styrke områder (CCAATG), to GC bokser og en transkripsjon startwebstedet (figur 1). Derfor var denne reporteren vektoren forventet for å reflektere circadian genuttrykk.

Optimalisering av synkronisering agent

Flere agenter har blitt brukt til å synkronisere eller påvirker den autonome døgnrytmen fibroblast celler for i vitro bioluminescens studier. For å velge en effektiv og kostnadseffektiv celle-type bestemt synkronisering agent i mammary epitelceller, vi sammenlignet 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0.1 µM deksametason, 50% HS og 100% SQ i mammary epitelceller (MCF10A) transiently transfekterte med circadian reporter vektoren. Celler synkronisert med 50% HS viste den beste døgnrytmen, med 3 topper på circadian indusert luminescence, sammenlignet med bare én eller to toppene i celler synkronisert med andre agenter. I tillegg bioluminescens profiler av celler synkronisert med 50% HS produsert akseptabel periode, amplitude og tilpasset verdi under dataanalyse (figur 2). Basert på disse resultatene, valgte vi denne kostnadseffektiv metode som cellen synkronisering agent for alle etterfølgende eksperimenter.

Avbrudd og restaurering av mobilnettet døgnrytmen av kjemiske eksponeringer

I dette i vitro modell, ubehandlet, transiently transfekterte celler (kontrollgruppen) viste minst to komplette sykluser luminescence signalering etter synkronisering (figur 3A). Celler som er utsatt for direkte opptre mutagen, NMU, viste en doseavhengig forstyrrelse av circadian genuttrykk som gjenspeiles av tapet av luminescence topper. Mens behandling med 0,25 mM NMU ikke avbryte cellular døgnrytme, en dose av 0,5 mM NMU utsatt først og senere avskaffet døgnrytme, som indikert av forsvinningen av andre toppen luminescence på ~ 72 h etter behandling. Hemming av SIRT1 aktivitet med 20 nM Ex257 eller 1 µM cambinol tilsvarende forstyrret døgnrytmen av dempe påfølgende circadian syklusen (figur 3A-1). Viktigere, tillegg av MSC (12.5 µM) til kultur medium gjenopprettet mot normale første og andre sykluser av circadian genuttrykk i NMU-behandlet celler. MSC ikke bare gjenopprettet rytmen forstyrret av NMU, men også forhindret nedbrytende effekten av SIRT1 hemmere, Ex257 og cambinol (figur 3A-2).

I stabilt transfekterte celler forstyrret både NMU og SIRT1 hemmere døgnrytme, om enn på høyere konsentrasjoner enn observert i forbigående transfectants (figur 3B-1). MSC (12.5 µM) restaurert døgnrytme i cellene forbehandlet med 1 mM NMU (figur 3B-2). Enda viktigere, MSC også restaurert døgnrytme i cellene behandlet med SIRT1 hemmere, inkludert EX257 (40 nM) (figur 3B-3) og cambinol (2 µM) (figur 3B(4)), henholdsvis.

Sammenligning mellom figur 3A og 3B figurbioluminescens intensiteten var mye høyere men rytmen var vedvarende for kortere tid i transiently transfekterte celler vs stabilt transfekterte celler (~ 10 ganger høyere, 2 ganger kortere) i Generelt, selv etter behandling av celler med NMU eller MSC. I tillegg var til mobilnettet døgnrytmen 2-fold mer følsomme for eksponering for kjemikalier i transiently transfekterte celler sammenlignet stabilt transfekterte cellene.

Kvantitativ doseavhengig endring av mobilnettet døgnrytmen av kjemikalier

Tilsvarende den forstyrret mobilnettet døgnrytmen stabilt transfekterte cellene behandlet med 1 mM NMU ble restaurert ved behandling av NAC i en doseavhengig måte (0-20 µM) (figur 4A) som observert i endringene circadian periode (figur 4B ) og fase (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Sekvens av menneskelig PER2 promoter fragmentet og circadian reporter vektoren. (A) Human PER2 promoter fragment (941 bp) ble sekvensert, og sekvensen ble analysert for elementene i funksjonelle circadian promoter. E-box, CACGTT / CATGTG; circadian transkripsjon forbedre området, CCAATG; GC-boksen CGCCCC / GGGGCGGG; transkripsjon starter område (TSS): CAGCGG. (B) skjematisk diagram av ustabil luciferase reporter vektor, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. Transkripsjon av ustabil luciferase (dLuc) er under direkte kontroll hPER2 . Et co uttrykt neomycin motstand gen (Neo) forenkler utvalg av infiserte celler av G418. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: synkronisering av i vitro mobilnettet døgnrytmen av ulike synkronisering agenter. Etter 24 timer sult, ble MCF10A celler transiently transfekterte av circadian reporter vektor behandlet med hver synkronisering agent for 2t, etterfulgt av opptak luminescence signal. Blå, 10 µM forskolin; rød, 1 nM melatonin; Green, 0.1 µM deksametason; lilla; 50% hest serum (HS). Teal, 100% SingleQuot (SQ); gul, tom vektor (negativ kontroll). X-aksen, tid (dag); Y-aksen, bioluminescens (antall/min). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: MSC gjenopprettet mobilnettet døgnrytme forstyrret av NMU og SIRT1 hemmere i mammary epitelceller i vitro. Bioluminescens analyser ble utført på MCF10A /PER2-dLuc reporter celler etter synkronisering med 50% HS. X-aksen, tid (h) (innlegget-NMU behandling tid); Y-aksen, bioluminescens (antall/min). (A) resultater fra transiently transfekterte celler. (1) celler ble behandlet med 0, 0,25 eller 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol 1t etter synkronisering. Gul: kontroll; rød: 0,25 mM NMU; grønn: 0,5 mM NMU; blå: 20 nM EX527; gult grønt: 1µM cambinol. (2) celler ble behandlet med 12.5 µM MSC alene eller i kombinasjon med 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol i inn medium følgende eksponering til 0,5 mM NMU. Gul: Kontroll; rød: 0,25 mM NMU; grønn: 0,5 mM NMU; blå: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC; gul grønn: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC 20 nM EX527; lilla: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC + 1 µM cambinol. (B) resultater fra stabilt transfekterte celler. 3rd- 5th topper som viste rene og klare forskjeller mellom grupper presenteres som et representativt resultat. (1) celler ble behandlet med 0, 0.5, 1.0 eller 2.0 mM NMU, 40 nM EX527 eller 2 µM cambinol 1t etter synkronisering. Gul: Kontroll; rød: 0,5 mM NMU; grønn: 1.0 mM NMU; blå: 2.0 mM NMU; gul grønn: 40 nM EX527; lilla: 2 µM cambinol. (2) celler ble behandlet med 12.5 µM MSC i inn medium følgende eksponering til 1,0 mM NMU. Gul: Kontroll; rød: 1.0 mM NMU; grønn: 1.0 mM NMU + 12.5 µM MSC. (3) celler ble behandlet med 12.5 µM MSC etter eksponering for 40 nM EX257. Gul: Kontroll; rød: 40 nM EX257; grønn: 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) celler ble behandlet med 12.5 µM MSC etter eksponering for 2 µM cambinol. Gul: Kontroll; rød: 2 µM cambinol; grønn: 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Dette resultatet tidligere rapportert, og er lisensiert under CC av 2.022. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: NAC dose-dependently gjenopprettet den cellulære døgnrytmen forstyrret av NMU. Cellene ble behandlet med 1.0 mM NMU eller kjøretøy kontroll 1t etter synkronisering. (A) representant resultatet av bioluminescens (antall/min) mot tiden (h). Gul: Kontroll; rød: 1.0 mM NMU; grønn: 1.0 mM NMU, 5 µM NAC; blå: 1.0 mM NMU, 10 µM NAC; gul grønn: 1.0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) periode (timer). (C) fase (timer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I pattedyrceller, er periodisitet av circadian klokken regulert av sammenkoblede transcriptional/translasjonsforskning tilbakemeldingssløyfer. Heterodimerer av Bmal1 og klokke eller Npas2 regulerer circadian transkripsjon ved binding til E-elementer i arrangørene av kjernen CGs, inkludert Per2 og gråte, og mange CCGs4. Som de akkumuleres i cellen heterodimerer av Per: Cry er post-translationally endret og transportert til kjernen å undertrykke klokke: Bmal1 transcriptional aktivitet. Denne negativ feedback loop lar kjernen CGs til å regulere sine egne transkripsjon og definere rytmisk uttrykket CGs og CCGs23. Selv om de fleste pattedyrceller har en iboende circadian klokke, klokker i enkeltceller kan synkroniseres av både iboende forhold (f.eks, redox potensielle) og eksterne miljømessige stimuli24. Circadian genet uttrykk i vivo kan synkroniseres av melatonin, et hormon som produseres av pinealkjertelen svar på signaler mottatt fra sentrale pacemakeren (SCN). SCN integrerer signaler fra lys impinging på spesialiserte melanospin-uttrykke fotosensitive retinal ganglieceller i netthinnen. Melatonin løslatt fra pinealkjertelen inn sirkulasjonen og regulerer døgnrytmen av SCN og de fleste perifere cellene i vitro og vivo25,26. Døgnrytme kan også være regulert av stress hormoner (f.eks, kortisol og katekolaminer)27,28 og vekstfaktorer29,30. Dereguleringen av vekstfaktorer er kjent for å være knyttet til circadian avbrudd i celle vekst og differensiering31.

Circadian reporter vektoren vi bygget utnytter denne negative biokjemiske feedback mekanisme. Kjernen circadian negativ feedback loop består av transcriptional aktivator, BMAL1 og klokke, som binder seg til de circadian E/E´-box bindende motivene i PER2 arrangøren og repressors PERs og CRYs, som negativt regulerer BMAL1 uttrykk. I dagens reporter system forenkler rytmisk aktivering av PER2 promoter av BMAL1 og klokke circadian uttrykk for ustabil luciferase, gir en mer nøyaktig circadian periodisitet luminescence signaler. Byggingen av en reporter plasmider inkluderer BMAL1 binding området, området døgnrytmen styrke, GC-boksen og transkripsjon startwebstedet til hPER2 promoter. Vektoren gir sanntid avlesning for mobilnettet autonome døgnrytmen i transfekterte celler og kan brukes til å identifisere forhold eller bestemte representanter som endrer dette endogene circadian mønsteret av genuttrykk. Men når celler er kultivert i vitro eller ex vivo, bli deres circadian oscillatorer raskt desynchronized. Det er derfor nødvendig å synkronisere deres rytmer før noen circadian analyser kan utføres i vitro. Mammary epitelceller, vi fant at 50% HS, melatonin og 100% SQ klarte hver å indusere effektiv synkronisering av døgnrytmen i vitro. Dexamethasone og forskolin produsert bare delvis synkronisering. Doseavhengig tester vil være nødvendig for utvikling og utvalg av ny synkronisering agenter i fremtidige studier. Gitt den lave kostnader, effektiviteten og bred bruk som synkronisering agent, 50% HS ble funnet for å være en effektiv synkronisering agent som produserte robust og reproduserbar mobilnettet døgnrytmen mammary epitelceller og neural celler, som tidligere rapportert i mange andre celletyper og eksperimentelle sammenhenger24.

For å validere modellen i vitro circadian regulering, ba vi neste hvis responsen fra døgnrytmen miljømessige stressfaktorer i vitro ville recapitulate effektene vi observert i vivo. Tidligere har vi vist at kreftfremkallende enkeltdoser med NMU forstyrret circadian uttrykk for store CGs (f.eks Per2) og flere CCGs i melkekjertlene mål. Dessuten tilbakestille en chemopreventive diett av MSC circadian uttrykk for både Per2 og CCGs gener mot normal. Vi ytterligere viste at eksponering av celler for giftstoffer og stressfaktorer kan endre circadian genuttrykk gjennom deres effekter på NAD+-avhengige SIRT1 aktivitet7,8,22. Resultatene som oppnås med i vitro circadian reporter analysen viste at eksponering for NMU forårsaket avbrudd av mobilnettet circadian genuttrykk, og at mer interessant, MSC ikke er bare kjøpedyktig restarte mobilnettet døgnrytmen forstyrret av NMU, men også tilbakestilling døgnrytme forstyrret av SIRT1-hemmere. Disse resultatene indikerte at i vitro analysen ikke bare reproduserer effekten av NMU på circadian genuttrykk, men også reproduserer effekten av MSC på den forstyrret circadian rytme i vivo via SIRT1-avhengige mekanismer. I vitro circadian reporter systemet dermed har potensiale til å oppdage en rekke giftstoffer og stressfaktorer som endrer NAD+/NADH nivåer i cellen, inkludert direkte hemmere og modulatorer av mobilnettet redoks sykling og gentoksisk agenter som kan utarme NAD+ via Poly ADP-ribose avhengige DNA reparasjon32. Disse resultatene tyder på at i vitro reporter systemet gir en nyttig verktøyet å skjermen for celle og kjemiske stoffer som kan forstyrre eller gjenopprette circadian genet regulering i vivo.

Selv om i vitro analysen kan settes opp med celler transiently eller stabilt transfekterte med den reporter konstruere, ble forskjeller bemerket i respons på behandling av kjemikalier mellom transiently og stabilt transfekterte celler. Stabilt transfekterte cellene var mer resistente mot behandling av kjemikalier, spesielt NMU og SIRT1 hemmere, enn transiently transfekterte celler. Disse forskjellene kan reflektere subtile forskjeller i regulering av vektor arrangøren i stabile transfectants på grunn av påvirkninger fra sekvensene rundt bestemte integrering nettsteder. Derfor kan utvalg av stabile transfectants av antibiotika behandling også velge kloner som er mer motstandsdyktig mot circadian avbrudd. Dermed må personlige i vitro celle modeller med midlertidig eller stabil transfectants valideres for deres evne til å recapitulate i vivo svar. Forskjellige transfection metoder også føre varierende grad av gentoksisk stress og toksisitet på celler og resultatet i deres forskjellige mottakelighet for toksiske effekter av kjemikalier. Derfor kreves cytotoksisitet test og piloten eksperimenter for valg av hva og behandling. Til tross for forskjellen i deres følsomhet var de samlede resultatene innhentet med våre mammary epithelial circadian reporter celler for avbrudd og restaurering av mobilnettet døgnrytmen av kjemikalier konsekvent og sammenlignbare mellom transiently transfekterte og stabilt transfekterte celler, og resultatene recapitulated effektene vi observert i vivo.

For å fastslå om circadian reporter vektoren kan brukes i andre celletyper, menneskelige glioblastom/astrocytom celler (U-87 MG) var stabilt transfekterte med denne circadian vektoren. Foreløpige resultatene med i vitro mobilnettet bioluminescens analysen viste at etter synkroniseringen disse nevrale-avledet kreftceller har en vanlig og sterk mobilnettet døgnrytmen sammenlignbare som observert i menneskelig mammary epitelceller. Cellene behandlet med IC261, en velkjent inhibitor av kasein kinase 1 ses (CK1δ) og CK1 ε, viste en circadian lengre, men lavere amplituden som rapporterte by andre (data ikke vist)33. Disse resultatene indikerer at circadian luciferase reporter vektor og i vitro mobilnettet bioluminescens analysen er aktuelt i andre organ bestemte celler, inkludert neural celler.

Mobilnettet reporter systemet utviklet her kan derfor brukes bredt som i vitro analysen for fastsettelse av circadian genuttrykk i ulike celletyper generelt. Den eksperimentelle prosedyren er enkel, rask og sikker. Men dette mobilnettet reporter systemet kan ikke være lett tilpasses i celler som er vanskelig å transfect, ikke-dele celler (f.eksneuronal celler), siden de har notorisk lave transfection effektivitet. Virus-basert transfection metoder (f.eks, lentivirus hva) kan tilby en høyere effektivitet løsning for disse cellene34. Men gjør tid og vanskeligheter knyttet lentiviral produksjon denne metoden vanskelig og tidkrevende. Videre, en riktig sikkerhetsnivå lab er nødvendig for produksjon og bruk av viruset. I tillegg kan høyoppløselig enkeltcelle luminescence detektorer brukes for fastsettelse av vedvarende, uavhengig faset rytmer av circadian genuttrykk i ikke-dele celler35.

Studier av pattedyr biologiske rytmer i vivo er ikke bare arbeidskraft intensiv og kostbar, men de krever også bruk av store antall dyr. Tilgjengeligheten av in vitro -systemer kan redusere antall dyr nødvendig å teste assosiasjonene avbrudd av circadian genuttrykk og utvikling av kroniske sykdommer, inkludert kreft og metabolske syndrom. Kvantitative data om circadian parametere, inkludert periode, amplitude og fase, kan informere dose - og/eller tidsavhengige effekter av kjemikalier på mobilnettet døgnrytmen. For eksempel observert vi at antioksidant NAC dose-dependently kan gjenopprette perioden og fase av mobilnettet døgnrytmen forstyrret av NMU. I vitro modellen kan også brukes til skjermen og klassifisere miljømessige circadian disruptors og undersøke virkningen av forstyrret døgnrytmen på svekkelse av cellulære funksjoner, gir mekanistisk innsikt for utvikling av intervensjon strategier for kohorter økt risiko for brystkreft, metabolske syndromer og nevrofysiologiske lidelser, på grunn av unormal arbeidsplaner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av 2012 samfunn av toksikologi (HUSBAND)-Colgate-Palmolive Grant for alternative forskning (M. Fang) og internasjonalt samarbeid forskning fond fra dyre- og plante karantene Agency, Sør-Korea (M. Fang), og NIEHS gi P30ES005022 (H. Zarbl). Vi ønsker å takke Dr. Zheng Chen (McGovern Medical School ved Universitetet i Texas Health Science Center i Houston) for hans nyttig diskusjon, Mr. Shao-An Juan for hans eksperimentell støtte, og Ms. Kimi Nakata hennes bevis lese.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5, (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176, (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39, (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3, (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1, (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3, (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306, (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119, (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10, (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131, (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29, (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22, (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309, (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49, (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295, (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137, (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57, (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107, (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176, (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3, (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8, (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14, (24), 2289-2295 (2004).
<em>In Vitro</em> Bioluminescens analysen som karakteriserer døgnrytmen i Mammary epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter