Summary
Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.
Abstract
El ritmo circadiano es un proceso fisiológico fundamental presente en todos los organismos que regula los procesos biológicos que van desde la expresión del gen a dormir comportamiento. En los vertebrados, el ritmo circadiano es controlado por un oscilador molecular que funciona en el núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasos central) y las células individuales que comprende los tejidos más periféricos. Lo más importante, alteración del ritmo circadiano por la exposición a la luz en la noche, estresores ambientales o sustancias tóxicas es asociado con mayor riesgo de enfermedades crónicas y el envejecimiento. La capacidad para identificar agentes que pueden perturbar Relojes biológicos central o periféricas y que pueden prevenir o mitigar los efectos de la disrupción circadiana, tiene implicaciones importantes para la prevención de enfermedades crónicas. Aunque modelos de roedores se pueden utilizar para identificar riesgos y agentes que inducen o evitarán/mitigación la disrupción circadiana, estos experimentos requieren de grandes cantidades de animales. Estudios in vivo también requieren infraestructura y recursos importantes y requieren los investigadores trabajar toda la noche. Así, hay una necesidad urgente de un tipo de células apropiadas en vitro sistema a pantalla para ambientales disruptores circadianos y potenciadores en tipos de células de diferentes órganos y enfermedades. Construimos un vector que impulsa a transcripción de la luciferase desestabilizada en células eucarióticas bajo el control del promotor humano del gene de periodo 2 . Esta construcción circadiano reportero fue estable transfected en las células epiteliales mamarias humanas y células circadiano sensible reportero fueron seleccionadas para desarrollar el ensayo de bioluminiscencia en vitro . Aquí, presentamos un protocolo detallado para establecer y validar el análisis. Ofrecemos más información para la prueba de los experimentos de concepto que demuestra la capacidad de nuestro análisis en vitro para recapitular los efectos en vivo de diversos productos químicos en el reloj biológico celular. Los resultados indican que el ensayo puede ser adaptado a una variedad de tipos de células para detectar disruptores ambientales y chemopreventive potenciadores de los relojes circadianos.
Introduction
El reloj circadiano regula una amplia gama de procesos biológicos de diurna expresión de los genes dormir comportamiento a un ritmo predecible con una periodicidad de aproximadamente 24 h. epidemiológica estudios sugieren fuertemente que alteración crónica de los ritmo aumenta el riesgo de cáncer de mama y próstata en los trabajadores por turnos, incluyendo enfermeras y equipos de vuelo de1,2,3. Estas conclusiones son corroboradas por estudios de roedores, demostrando que la exposición a los ciclos de luz en la noche, o de la luz la luz constante, que imitan la incidencia de tumor aumento de jet-lag y acelera el crecimiento de tumor4,5. Basado en datos de estudios humanos y roedores, la Agencia Internacional para investigación del cáncer clasifica turnos de trabajo como un probable carcinógeno humano (tipo 2A) en 20106.
Previamente, hemos demostrado que una sola dosis cancerígena de la carcinógeno específico de tumor mamario, N- nitroso-N- Metilurea (NMU), interrumpe la expresión circadiana de genes circadianos mayores (CGs) (p. ej., 2 periodo , Per2) y varios genes circadianos controlados (CCGs), incluyendo clave de respuesta del daño de la DNA y reparación de genes (DDRR) en la glándula mamaria de destino (pero no en el hígado). Por otra parte, para reiniciar la expresión circadiana de genes Per2 y desmovilización hacia la normal, un régimen quimiopreventivo dietético L-metil-selenocisteína (MSC) reduce la incidencia de tumores en un 63%. Estos hallazgos fueron los primeros en mostrar un enlace mecánico entre el ritmo circadiano, carcinogénesis química y quimioprevención7,8. Exposición a otros tóxicos medioambientales demostrados para interrumpir la expresión de genes circadianos en vivo también se asocian con mayor riesgo de enfermedades ambientales9,10. Comprensión de los mecanismos que vinculan la disrupción circadiana por tóxicos ambientales y patogenia puede llevar al mecánico los enfoques para la prevención de enfermedades. Sin embargo, estudios encaminados a definir las interacciones entre la exposición y del ritmo circadiano se realizan generalmente en vivo. Un típico en vivo experimento investiga que el impacto en el ritmo circadiano requiere grandes cantidades de animales, como controlan de los tejidos de al menos tres y tres animales expuestos deben ser recogidos cada 3-4 h durante 24 o 48 h. Desarrollo de un sistema validado en vitro que recapitula en vivo observaciones y mecanismos por lo tanto, no sólo reducir el número de animales requeridos, pero reducir dramáticamente los costos experimentales y el requisito de que los investigadores trabajan continuamente durante un período de 24-48 h. Por otra parte, un sistema validado en vitro podría utilizarse para el cribado de alto rendimiento de compuestos o alteración genética que afecta el ritmo circadiano, o su respuesta a estresores ambientales o sustancias tóxicas. Por lo tanto, la combinación estratégica de modelos in vitro e in vivo y los experimentos son necesarios para obtener diferentes perspectivas con enfoque diferente.
En los mamíferos, osciladores circadianos existen no sólo en neuronas especializadas de la escena, sino también en tipos de células más periféricos. Estos relojes moleculares son similares a ésos en líneas celulares de fibroblastos establecidos y en fibroblastos primarios de embriones o animales adultos; sin embargo, hay una necesidad de tejido tipo-específica de modelos celulares11. En consecuencia, estudio de la actividad locomotriz en vivo, SCN explantes ex vivo, y basado en la célula en vitro ensayos en células inmortalizadas fibroblastos son ampliamente utilizados para estudiar defectos circadianos celular autónoma. Sin embargo, no existe evidencia que indica que una en vitro fibroblastos celular ensayo puede recapitular mecanismos circadianos y respuestas presentan en células de otros órganos periféricos en vivo. Diferentes tipos de células pueden tener distintos patrones de expresión génica, metabolismo xenobiótico y desmovilización, y la relación entre toxicidad y expresión de genes circadianos puede ser tipo de la célula específica o modulado por diferentes parámetros fisiológicos. Además, osciladores circadianos en sistemas basados en fibroblastos no hayan sido completamente evaluados para respuestas a sustancias tóxicas ambientales, factores de estrés y agentes preventivos que vinculan la exposición a los mecanismos de prevención y desarrollo de la enfermedad. Por lo tanto, hay una necesidad de facile, validados-tipo de células específicas, en vitro ensayos de bioluminiscencia para estudiar disruptores circadiano ambientales específicas de órgano. Aunque una variedad de modelos de celular reloj (p. ej., en hígado, queratinocitos y células de grasa, así como una línea celular de osteosarcoma) han desarrollado en estos últimos años12,13,14, 15, el ensayo descrito aquí es el primer modelo de reloj celular en células epiteliales de mama y la primera demostración para recapitular en vivo respuesta a estresores ambientales, tóxicos, fármacos y agentes quimiopreventivos.
Renilla LUCIFERASA (rLuc) y luciferasa de la luciérnaga son proteínas monoméricas de 61 30 kDa que no requieren postraduccional de procesamiento para la actividad enzimática y pueden funcionar como un reportero genético inmediatamente después de la traducción. Una vez que el sustrato se asocia con la enzima luciferasa, la reacción bioquímica catalizada genera un destello de luz. Por lo tanto, construcciones de luciferase son ampliamente utilizadas como gene expresión reportero sistema en vitro y en vivo. Sin embargo, en estudios del ritmo circadiano, la utilidad del reportero de luciferasa está limitada por la vida media relativamente larga de la proteína luciferase (T1/2 = 3,68 h) en relación con el período (especialmente a corto plazo) cambios en el gen circadiano expresión; sin embargo, numerosos estudios sobre los años han utilizado con éxito el gen de luciferasa en el vector pGL3, indicando que el luciferase rápidamente degradable puede no ser necesario para denunciar los ritmos circadianos, especialmente para los ritmos con un período más largo, como 24 h. Por lo tanto, un plásmido reportero usando vector luciferase desestabilizada, pGL [Luc2P/Neo], que contiene hPEST (una secuencia de la desestabilización de la proteína) se ha desarrollado, lo que nos permite utilizarlo como un vector reportero circadiano para nuestro actual in vitro ensayo de bioluminiscencia. La proteína codificada por Luc2P tiene una mucho más corta vida media (T1/2 = 0,84 h) y por lo tanto, responde más rápidamente y con una magnitud mayor a los cambios en la actividad transcripcional de tipo silvestre,indicar que puede ser utilizado para monitorizar la expresión rítmica de luciferase regulado por el promotor PER2 exactamente en tiempo real16.
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Protocol
1. construcción del PER2 promotor conducido desestabilizado Luciferase Reporter Vector
- comprar un modificado para requisitos particulares, pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contiene el cDNA que codifican rLuc y humanos Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) en el sitio entre Sac I y Hind III en la región clonación múltiple 17.
- Cortar el fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) por el vector no.
Buffer de enzima de la restricción
- añadir 2.5 μl, 10 μl (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector y 1 μl de cada una de las enzimas de restricción, Sac I (unidad 10/μl) y Hind III (unidad 10/μl), en un DNA/RNA/nucleótido libre tubo de microcentrífuga. Añadir suavemente agua ultrapura (10.5 μl) hasta 25 μl y mezclar mediante pipeteo.
- Incubar a 37 ° C durante 90 minutos en un bloque calefactor.
- Ejecutar el volumen entero (25 μl) de la reacción de la enzima de la restricción en gel de agarosa de 0,7% que contiene 0,0001% bromuro de etidio (EtBr) para separar el vector de la hPER2P.
Nota: EtBr, bromuro de 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (número de registro CAS: 1239-45-8), es un líquido rojo de olor. Es un agente intercalante que es comúnmente usado como un fluorescente de etiqueta (tinción de ácidos nucleico) en electroforesis en gel de agarosa y visible como un color naranja bajo luz UV. Se han producido posibles riesgos irreversibles efectos mutagénicos en animales de experimentación, aunque ninguna de las agencias reguladoras había clasificado como un carcinógeno 18. Por lo tanto, se recogieron agarosa utilizado gel y electroforesis tampón que contiene EtBr como residuos de riesgo químico y pidió a Rutgers salud ambiental & seguridad (REHS) para recoger y eliminar con seguridad. - Cortar un trozo de gel de agarosa que contiene una banda de fluorescencia de EtBr en 941 bp y purificar los hPER2P fragmentos del gel con un kit de extracción de ADN gel, seguido de la cuantificación en un espectrofotómetro midiendo densidad de absorción (OD) en longitud de onda de 260 nm.
- Alinear 1.0 μL (1 μg) del vector de expresión de luciferasa firefly desestabilizada, pGL [Luc2P / Neo] con el mismo método que se describe en pasos 1.2.1-1.2.2. Extraiga el vector con un kit de limpieza de ADN seguido de cuantificación descrita usando un espectrofotómetro.
- Ligar el hPER2P en el pGL vector linearizado [Luc2P / Neo].
Nota: por el fabricante ' s instrucción, la relación molar ideal del inserto y el vector es 2:1. Vector de ng 50, se calcula la cantidad ideal de inserción como 23.6 ng con un fórmula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vector] x (2/1) = 23.6 ng insert]. Basado en las concentraciones de hPER2P (7,26 ng/μL) y pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/μL), los volúmenes de 50 ng pGL [Luc2P / Neo] y 23.6 ng hPER2P se calcula como 1 μl y 3,26 μl, respectivamente.- Añadir 2 μl T4 ADN ligasa reacción tampón (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, ATP de 1 mM y 10 mM DTT), 3,26 μl (23.6 ng) hPER2P, 1 μl (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], y 13.74 μl hasta 20 μl de agua , mezclar suavemente.
- Agregar 1 μl T4 ADN ligasa (unidad de 400/μL), mezcle suavemente e incubar a 16 ° C durante la noche en un termociclador y luego enfriar el vector ligado en el hielo por el fabricante ' instrucción s.
- Transformar el pGL ligados vector [hPer2P / Luc2P / Neo] químicamente competentes de e. coli 19.
- Configurar el baño de agua a 42 ° C, caliente Super caldo óptimo medio de represión (novedosa) de catabolito (2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl 2, 10 mM MgSO 4 y 20 mM de glucosa) a temperatura ambiente , calentar la placa de agar Luria-Bertani (LB) (contiene ampicilina μg/mL 100, 80 μg/mL X-gal e IPTG de 0.5 μm) en incubadora de 37 ° C y descongelar el hielo un vial de competente e. coli las células para cada transformación.
- Añadir 6 μl (21 ng) ligarse vector o 1 μl (30 ng) Vacíe el vector (control negativo) a un tubo de químicamente competentes de e. coli (50 μL) y luego voltear suavemente el tubo para mezclar. Incubar en hielo durante 30 minutos
- Calor de choque en un baño de agua de 42 ° C durante 30 s sin agitar y luego volver a hielo.
- Seleccionar una colonia de e. coli transformada con un vector ligado con azul/blanco cribado.
- Añadir 250 μl de medio de novedosa en la transformada de e. coli del tubo e incubar durante 1 h a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- Esparza uniformemente 10-50 μl de transformadas de e. coli en la superficie de la placa de agar LB. Colocar la placa invertida en incubadora de 37 ° C durante la noche.
Nota: Una eficiente reacción de clonación debería producir varias cientos colonias. Dos volúmenes diferentes de la galjanoplastia se recomienda para asegurar que al menos una placa de color blanco o azul grande, clara y colonias bien espaciadas. Cuando las colonias son muy pequeñas y el color no es distinguible, es útil usar un microscopio (10 X ó 50 X). - Pick 3-6 colonias blancas de las placas con palillos de diente esterilizado y suelte cada colonia en tubo de una cultura que contiene 4 mL de medio de cultivo LB con ampicilina 50 de μg/mL.
- Incubar los tubos a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche. Extraer el ADN usando 2 mL de 4 mL cultivadas e. coli con plásmidos DNA extracción mini prep kit por el fabricante ' instrucción s.
- Verificar y analizar la inserción (hPER2P, 941 bp)
- digerir el ADN del plásmido con enzimas de restricción y correr la electroforesis como se describe en pasos 1.2.1-1.2.3 para confirmar si hay una inserción.
Nota: Control positivo (hPER2P purificada a paso 1.2.4) y control negativo (e. coli transformadas con un vector vacío) eran incluido. - La secuencia de la DNA del plasmid seleccionado usando M13 adelante y M13 reverso cartillas para confirmar la orientación y la secuencia del inserto en el plásmido 19.
Nota: Sólo una colonia que tenía un inserto con el tamaño correcto de hPER2P en la electroforesis y la orientación correcta y la secuencia en el resultado de la secuencia fue seleccionada. - Analizar el fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) de la secuencia de los elementos reguladores circadianos, incluyendo motivo de E-box (sitio de la Unión de Bmal1, gato/CGTG), CCAATC, GC la caja y transcripción inicio del sitio (CAGCGG) 20.
- digerir el ADN del plásmido con enzimas de restricción y correr la electroforesis como se describe en pasos 1.2.1-1.2.3 para confirmar si hay una inserción.
- Amplificar el seleccionado e. coli mediante la adición de lo 2 mL restante cultivadas e. coli en medio de cultivo de 200 mL LB que contiene 50 ampicilina μg/mL y a continuación, incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- Extracto de ADN con un maxi de plásmido libre de endotoxina prep kit por el fabricante ' instrucciones de s y luego cuantificarlo mediante la medición de OD en longitud de onda de 260 nm con un espectrofotómetro. Alícuota y almacenar el ADN plásmido pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], en el congelador de-80 ° C para su uso futuro.
2. Transitorios de la transfección
- compra y cultura MCF10A células Banco
- compra una inmortalizado, no transforma humanos mamaria epitelial línea celular normal (MCF10A) de un comercial, donde las células son citogenéticamente repetición en tándem corta prueba y autenticado con análisis antes de congelarlos. Descongelar y mantener cada frasco de las células en la cultura para un máximo de 8 semanas.
Nota: A diferencia de otras células, estas células tienen inhibición de contacto una vez que llegan a la confluencia de ~ 70%. Requiere eso subcultivo se lleva a cabo en ~ 70%.
Las células con medio de crecimiento de la célula epitelial mamaria (MEGM), que contiene la toxina del cólera en una incubadora de cultivo celular en 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2, medio basal epitelial mamaria (MEBM) y suplementos de crecimiento de la cultura de - .
Nota: Compra lista para usar factores de crecimiento proporcionados en SingleQuot (SQ) y obtener por separado la toxina del cólera. Concentraciones finales de crecimiento suplementos son 0.4% Extracto de pituitaria bovina, insulina 0.1%, hidrocortisona 0.1%, 0.1% factores de crecimiento epidérmico humano, toxina del cólera de 100 ng/mL y 0.05% de sulfato de gentamicina y 0.05% anfotericina B. - Disociar las células de la placa de cultivo de 10 cm por la incubación con 10 mL de tripsina/EDTA para ~ 20 min y luego neutralizar la tripsina añadiendo tripsina 10 mL una solución que neutraliza. Recoge todas las células con HEPES tamponada con solución salina (HBSS).
- Contar las células con un hemocitómetro bajo un microscopio invertido y calcular la concentración de la suspensión de la célula y entonces la semilla un cierto número de células según sea necesario. Remolino de las placas a fin de obtener una distribución uniforme de las células en cada plato. Incubar las células en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2.
Nota: Comprar un paquete de reactivo de subcultura que contiene tripsina/EDTA, solución neutralizante tripsina y HBSS usar.
- compra una inmortalizado, no transforma humanos mamaria epitelial línea celular normal (MCF10A) de un comercial, donde las células son citogenéticamente repetición en tándem corta prueba y autenticado con análisis antes de congelarlos. Descongelar y mantener cada frasco de las células en la cultura para un máximo de 8 semanas.
- Transitorios de la transfección de células con el vector circadiano construido.
- Semilla 2 x 10 5 MCF10A células uniformemente en la cultura de 35 mm plato con MEGM y crecen hasta 20-30% confluencia (día siguiente).
- Caliente hasta el reducido suero los medios de comunicación (por ejemplo, Opti-MEM) en 37 ° C agua baño y transfección reactivo a temperatura ambiente durante 30 min diluir el plásmido ADN construido (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng/μl con endo toxina libre Tampón Tris-EDTA (TE) y mantener a temperatura ambiente.
- Preparar la mezcla de transfección de plásmidos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL agregar 63,6 μl suero reducido caliente medios primero y luego añadir 33,4 los ADN de plásmido de (0.1 μg) μl y mezclar suavemente por pipeteo y luego por último agregar 3 μl de la transfección reactivo directamente en el centro del tubo sin tocar la pared. Después de mezclar suavemente mediante pipeteo, mantener a temperatura ambiente durante 30 min
- La mezcla de plásmido completo (100 μL) de la gota directamente sobre la superficie del centro del medio de la placa y luego mezclar suavemente agitando el plato. Las células en una incubadora de CO 2 para adicional 48-72 h. de la cultura
Nota: Se prevé que sea la más alta eficiencia de transfección en confluencia de 40-70% de estas células debido a su inhibición de contacto en ~ 70%. Por lo tanto, la transfección trabaja mejor a partir de ~ 20% y parada en ~ 70% confluencia.
3. Establecimiento del ensayo In Vitro de bioluminiscencia en MCF10A transfectadas transitoriamente las células
- mueren de hambre las células cultivadas en confluencia de ~ 70% (después de transfección para 48-72 h) en MEBM sin factores de crecimiento para 24 h.
- Tratar las células con el agente de sincronización (por ejemplo, 50% de suero de caballo (TA)) en MEBM de 1,5 h en un incubador de CO 2.
Nota: Para la selección de un agente de sincronización ideal, 10 μm forskoline, melatonina nM 1, dexametasona 0.1 μm, 50% HS y 100% SQ se compararon en términos de amplitud circadiana y período en las células de los vectores transfectadas. Las células vacías vector transfectada son tratadas con 100% SQ como control negativo. - Medio de grabación de pre-prepare 20 mL (para 10 platos de 30-mm cultura) añadiendo 5 mL de MEGM, 15 mL de MEBM 150 bicarbonato de sodio μl, 200 μL de HEPES y luciferin 40 μl de stock (50 mM) de solución en un tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado.
Nota: Las concentraciones finales de cada componentes: 20% SQ y toxina del cólera de 20 ng/mL, bicarbonato de sodio 0.06%, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 mM HEPES. Calentar previamente preparado medio de grabación y esterilizadas de 1 x PBS por 30 min en baño de agua de 37 ° C. Añadir 100 luciferin μm inmediatamente antes del uso. - Lavar las células con caliente 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered salina (D-PBS) para 3 veces después de la incubación con el agente de sincronización y luego agregar 2 mL de medio de grabación.
- Selle el plato con una clase de esterilizada cubierta con grasa de silicona para evitar la evaporación y luego la etiqueta en el lado.
- Colocar el plato sellado en el asiento en el luminómetro y activar la opción para guardar la ubicación del archivo en la carpeta (para detalles, ver sección 6).
4. Selección de células Transfected estable
- optimizar una concentración ideal de G418 (800 μg/mL) con un análisis de curva de muerte según el fabricante ' instrucción de s para la selección de las células transfected estable.
- Después de transfección transitoria para 48 h o 72 h, subcultura y semillas las células con MEGM en platos más grandes en 5.000 células/plato (100 mm). Después de 24 h la cultura en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2), tratar las células con 800 μg/mL de G418 sustituyendo el medio viejo con el nuevo medio que contiene 800 μg/mL G418 cada 3-4 días durante 2 semanas.
- Subcultivo el sobrevivir estable transfected colonias para los pasos 1-3 con el MEGM que contiene 500µg/mL G418 para mantener la expresión estable de hPer2P/Luc2P y congelar en nitrógeno líquido para su uso futuro.
- Tratar 500µg/mL G418 después de subcultura general volver a seleccionar la población estable transfected las células, si la intensidad de la bioluminiscencia en el resultado del ensayo de bioluminiscencia en vitro se convierte progresivamente más baja después de su uso en muchos pasajes.
5. Tratamiento con productos químicos
- en 48 h o 72 h post-transfección, mueren de hambre las células de factores de crecimiento en MEBM de 24 h.
- Después de la sincronización con el 50% HS por 2 h, tratar las células con 0,25 o 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 o cambinol de 1 μm para 1 h en MEBM que contiene 20% sq
- Después de lavar 1 x D-PBS, añadir grabación medio μm 12,5 contiene MSC solos o en combinación con 20 nM EX527 o cambinol de 1 μm, las células. Monitoreo de la bioluminiscencia con el luminómetro.
- Tratar la MCF10A estable transfected / PER2-células dLuc con NMU en 0,5, 1 o 2 mM, EX527 a 40 nM, o Cambinol a 2.0 μm, durante 1 h después de la sincronización con el 50% HS y luego incubar las células en el registro medio que contiene 12,5 μm de MSC o (5, 10 y 20 μm) de diferentes dosis de n-acetilcisteína (NAC). Coloque las placas en el luminómetro, expediente y guardar la bioluminiscencia por luminómetro para 4-8 días, como se describe en la sección 3.6.
Nota: NMU es una nitrosourea metilado compuesto con propiedades mutagénicos, carcinogénicos y teratogénicos. NMU es un agente alquilante de acción directa y tiene una corta vida media (T 1/2 = ~ 30 min). Es estable en condiciones ácidas (pH 4-5), pero inestable en condiciones alcalinas (pH 9-10) y a temperaturas más allá de 20 ° C. Por lo tanto, lejía al 10% puede utilizarse como un eficaz agente de desactivación para limpiar superficies de banco y laboratorio productos potencialmente contaminados por NMU len. Solución stock restos recogidos y eliminado con seguridad por REHS. Basado en el modo de acción de productos químicos, las células sincronizadas pueden tratarse para tiempos más cortos antes de cultivo en medio de la grabación. Las células también pueden ser tratadas en el medio de grabación por más tiempo (varios días).
6. Recolección de datos, análisis y presentación
Nota: viabilidad celular debe determinarse utilizando métodos estándar (por ejemplo, ensayo MTT) después del tratamiento de las células en las mismas concentraciones de la misma hora indicada. Todas las concentraciones de tratamiento utilizadas en el ensayo de bioluminiscencia en vitro fueron menores que la concentración letal del 30% (LC30). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se presentaron resultados representativos.
- Después de sellar el plato (paso 3.5), cargue los platos sobre los asientos en el luminómetro, que se mantiene dentro de una incubadora a 37 ° C sin H 2 O y CO 2 y conectado a un ordenador.
- Clic " guardar " y escriba los nombres de la carpeta y el archivo donde se guardará la señal de luminiscencia grabado de la fuente correspondiente.
Nota: El sistema detecta la señal de luminiscencia en tiempo real de las células en el plato en posiciones individuales. Las señales son transferidas a la computadora a través de recuento de fotones de 4 tubos de fotomultiplicador, guardadas y aparece en la computadora por el software de colección de datos. - Analizar las señales después de grabar de 4-7 días, que podría ser seguido por medio cambio y grabación continua por segunda semana si es necesario.
Nota: Para obtener parámetros circadianos, incluyendo longitud de período, fase, amplitud del ritmo y amortiguación tipo, utilizamos el software de análisis de luminómetro para analizar los datos de bioluminescence. - Detrend datos raw con un promedio de marcha y analizar el mejor se adapta a una onda sinusoidal, período, fase, amplitud y amortiguación tipo 21 , 22.
- Debido a la alta bioluminiscencia transitoria al tratamiento y el cambio de medio, excluir el primer ciclo de los datos de análisis.
- Para la presentación de los datos, trama de datos (bioluminiscencia, cuenta/s) contra el tiempo (hora o día). Cuando sea necesario, se pueden trazar la resta de línea de base de datos para comparar la amplitud y fase.
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Representative Results
Vector de reportero de bioluminiscencia circadiano: PER2 humano impulsado por el promotor la expresión de variante de luciferase desestabilizada
La secuencia de ADN que comprende un fragmento de bp 941 deriva el promotor humano de PER2 utilizado para construir el vector reportero circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primero se analizó la presencia de elementos reguladores que regulan expresión de genes circadianos. Bioinformática análisis demostraron que dentro de este fragmento de promotor, son tres diferentes sitios de Unión Bmal1 (E-box) (CAT/CGTG), dos sitios aumento de transcripción circadiano (CCAATG), dos cajas de GC y un sitio de inicio de transcripción (figura 1). Por lo tanto, este vector reportero fue anticipada para reflejar la expresión de genes circadianos.
Optimización de agente de sincronización
Varios agentes se han utilizado para sincronizar o afectan el ritmo circadiano autónomo de células del fibroblasto en vitro estudios de bioluminiscencia. Para seleccionar un agente de sincronización específica de tipo celular eficiente y rentable en células epiteliales mamarias, comparamos 10 μm forskoline melatonina nM 1, dexametasona 0.1 μm, 50% HS y 100% SQ en células epiteliales mamarias (MCF10A) transfectadas transitoriamente con el vector reportero circadiano. Las células sincronización con 50% capítulo mostró el mejor ritmo circadiano, con 3 picos de circadiano inducidas por luminiscencia, comparado con sólo uno o dos picos en células sincronizadas con otros agentes. Además, los perfiles de bioluminiscencia de células sincronizadas con 50% HS producido aceptable periodo, amplitud y valor de Best-fit durante el análisis de los datos (figura 2). Basado en estos resultados, hemos seleccionado este método rentable como el agente de sincronización celular para todos los experimentos posteriores.
Interrupción y restauración celular ritmo circadiano por exposiciones químicas
En este modelo en vitro , células transfected transitorio no tratadas (grupo control) presentaron al menos dos ciclos completos de luminiscencia señalización después de sincronización (Figura 3A). Las células expuestas a la acción directa mutágeno, NMU, mostraron una alteración dependiente de la dosis de expresión de genes circadianos tal y como refleja la pérdida de los picos de luminiscencia. Mientras que el tratamiento con 0,25 mM NMU no interrumpir el ritmo circadiano celular, una dosis de 0,5 mM NMU inicialmente había retrasado y suprimido más adelante ritmo circadiano, según lo indicado por la desaparición del segundo pico de luminiscencia después del tratamiento ~ 72 h. Inhibición de la actividad de SIRT1 con 20 nM Ex257 o 1 μm cambinol semejantemente había interrumpido ritmo circadiano por humedecimiento del subsecuente ciclo circadiano (Figura 3A-1). Lo importante es la adición de MSC (12.5 μm) al medio de cultivo restaurado hacia normales primer y segundo ciclos de la expresión de genes circadianos en células tratadas con NMU. MSC no sólo restauró el ritmo perturbado por NMU, sino también prevenir los efectos perturbadores de los la SIRT1 inhibidores, Ex257 y cambinol (Figura 3A-2).
En las células transfected estable, inhibidores de la NMU y SIRT1 interrumpen ritmo circadiano, aunque a concentraciones más altas que el observado en transfectants transitoria (figura 3B-1). MSC (12.5 μm) restaura los ritmos circadianos en las células pretratadas con 1 mM NMU (figura 3B-2). Más importante aún, MSC también restaura los ritmos circadianos en las células tratadas con inhibidores de la SIRT1, incluyendo EX257 (40 nM) (figura 3B-3) y cambinol (2 μm) (figura 3B(4)), respectivamente.
En la comparación entre la Figura 3A y 3B de la figura, la intensidad de la bioluminiscencia fue mucho mayor, pero el ritmo fue sostenido por un tiempo más corto en las células transfected transitorio vs estable transfected las células (~ 10 veces más alto, más corto 2 veces) en general, incluso después del tratamiento de células con NMU o MSC. Además, el ritmo circadiano celular era 2 más sensible a la exposición a sustancias químicas en las células transfected transitorio en comparación con las células transfected estable.
Cuantitativo cambio dependiente de la dosis del celular ritmo circadiano por productos químicos
Del mismo modo, el alteración ritmo circadiano celular de las células transfected estable tratados con 1 mM NMU fue restaurado por el tratamiento de la NAC en forma dosis dependiente (0-20 μm) (Figura 4A) como se observa en los cambios de período circadiano (Figura 4B ) y fase (figura 4).
Figura 1: Secuencia de humano PER2 promotor fragmento y del vector reportero circadiano. (A) fragmento de promotor humano PER2 (941 bp) fue secuenciado, y se analizó la secuencia de los elementos del promotor circadiano funcional. E-box, CACGTT / CATGTG; circadiano transcripción mejorando el sitio, CCAATG; Caja de la GC, CGCCCC / GGGGCGGG; transcripción a partir de sitio (SAT): CAGCGG. (B) esquema del vector reportero de luciferasa desestabilizada, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. La transcripción de luciferase desestabilizada (dLuc) está bajo control directo del promotor hPER2 . Un gen de resistencia a neomicina Co expresado (Neo) facilita la selección de las células infectadas por G418. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: sincronización de en vitro del ritmo circadiano celular por agentes de sincronización diferentes. Después de hambre de 24 h, MCF10A en células transfectada transitoriamente por vector reportero circadianos fueron tratado con cada agente de sincronización por 2 h, seguido por la grabación de la señal de luminiscencia. Azul, 10 μm la forskoline; rojo, 1 melatonina nM; verde, dexametasona 0.1 en μm; púrpura; 50% de suero equino (HS); Teal, 100% SingleQuot (SQ); amarillo, vacío, vector (control negativo). Eje x, tiempo (día); Eje, bioluminiscencia (cuenta/min). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: MSC restaurado celular circadiano alterado por los inhibidores de la NMU y la SIRT1 en las células epiteliales mamarias en vitro. Se realizaron ensayos de bioluminiscencia en MCF10A /PER2-dLuc reportero células después de la sincronización con el 50% HS. Eje x, tiempo (h) (tiempo de tratamiento post-NMU); Eje, bioluminiscencia (cuenta/min). (A) el resultado de células transfected transitorio. (1) las células fueron tratadas con 0, 0.25 o 0.5 mM NMU, 20 nM EX527 o cambinol de 1 μm durante 1 h después de sincronización. Amarillo: control; rojo: 0,25 mM NMU; verde: 0,5 mM NMU; azul: 20 nM EX527; amarillo verde: cambinol de 1μm. (2) las células fueron tratadas con 12.5 μm MSC solos o en combinación con 20 nM EX527 o cambinol de 1 μm en el registro de la exposición siguiente medio a 0,5 mM NMU. Amarillo: Control; rojo: 0,25 mM NMU; verde: 0,5 mM NMU; azul: 0,5 mM NMU + 12,5 μm MSC; amarillo verde: 0,5 mM NMU + 12,5 μm MSC + 20 nM EX527; púrpura: 0,5 mM NMU + 12,5 μm MSC + cambinol de 1 μm. (B) resultados de células transfected estable. La 3rd- 5 picos deth que limpia y clara diferencias entre grupos se presentan como un resultado representativo. (1) las células fueron tratadas con 0, 0.5, 1.0 o 2.0 mM NMU, 40 nM EX527 o cambinol de 2 μm para 1 h después de la sincronización. Amarillo: Control; rojo: 0,5 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU; azul: 2,0 mM NMU; amarillo verde: 40 nM EX527; morado: 2 μm cambinol. (2) células fueron tratadas con 12.5 μm MSC en grabación medio siguiente exposición a 1,0 mM NMU. Amarillo: Control; rojo: 1,0 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU + 12,5 μm MSC. (3) las células fueron tratadas con siguiente de MSC de 12,5 μm exposición a 40 nM EX257. Amarillo: Control; rojo: 40 nM EX257; verde: 40 nM EX257 + 12,5 μm MSC. (4) las células fueron tratadas con siguiente de MSC de 12,5 μm exposición a 2 μm cambinol. Amarillo: Control; rojo: 2 μm cambinol; verde: 2 μm cambinol + 25 μm MSC. Este resultado fue divulgado previamente y está licenciado bajo CC por 2.022. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: dosis-dependiente de NAC restaura el ritmo circadiano celular interrumpido por NMU. Las células fueron tratadas con 1,0 mM NMU o control del vehículo por 1 h después de sincronización. (A) resultado representativo de bioluminiscencia (cuenta/min) contra tiempo (h). Amarillo: Control; rojo: 1,0 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU, 5 μm NAC; azul: 1,0 mM NMU, 10 μm NAC; amarillo verde: 1,0 mM NMU, 20 μm NAC. (B) periodo (horas). (C) (horas) de la fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En células de mamífero, periodicidad del reloj circadiano está regulada por retroalimentación transcripcional/traslacional interconectados. Heterodímeros de Bmal1 y reloj o Npas2 regular circadiano transcripción de unión a elementos de E-box en los promotores de núcleo CGs, incluyendo Per2 y gritoy numerosos CCGs4. Medida que se acumulan en la célula, heterodímeros de por: Cry postraduccional se modifican y transportados al núcleo para reprimir la actividad transcripcional de Clock: Bmal1. Este bucle de retroalimentación negativa permite núcleo CGs para regular su propia transcripción y configurar la expresión rítmica de CGs y CCGs23. Aunque las células mamíferas más tienen un reloj circadiano intrínseco, se pueden sincronizar los relojes en células individuales por ambas condiciones intrínsecas(por ejemplo, el potencial redox) y los estímulos ambientales externos24. Expresión de genes circadianos en vivo se puede sincronizar por la melatonina, una hormona producida por la glándula pineal en respuesta a las señales recibidas de los marcapasos central (SCN). El SCN integra las señales de luz que inciden en melanospin especializado-expresar las células ganglionares de la retina fotosensible en la retina. Melatonina de la glándula pineal entra en la circulación y regula el ritmo circadiano de SCN y la mayoría periférico las células in vitro e in vivode25,26. También se puede regular el ritmo circadiano por estrés hormonas (p. ej., cortisol y catecolaminas)27,28 y factores de crecimiento29,30. Desregulación de los factores de crecimiento se sabe para ser asociado con la interrupción circadiana de crecimiento y la diferenciación de célula31.
El vector reportero circadiano construimos explota este mecanismo de retroalimentación bioquímicos negativos. El bucle de retroalimentación negativa circadiano base consiste de activadores transcripcionales, BMAL1 y reloj, que se unen a los motivos de Unión E´/E-box circadianos en PER2 promotor y represores PERs y CRYs, que regulan negativamente la expresión de BMAL1. En el actual sistema de reportero, la activación rítmica del promotor PER2 por BMAL1 y reloj facilita la expresión circadiana de luciferase desestabilizado, lo que permite una más exacta periodicidad circadiana de las señales de luminiscencia. La construcción de un plásmido reportero incluye el sitio de unión de BMAL1, el sitio aumento de ritmo circadiano, la caja GC y el sitio de inicio de transcripción del promotor hPER2 . El vector permite la visualización en tiempo real para celular autonómica del ritmo circadiano en las células transfected y puede utilizarse para identificar condiciones o agentes específicos que alteran este patrón circadiano endógeno de la expresión génica. Sin embargo, cuando las células son cultivadas en vitro o ex vivo, sus osciladores circadianos rápidamente se convierten en inconvenientes. Por lo tanto es necesario volver a sincronizar sus ritmos antes de cualquier análisis circadianos pueden ser realizado en vitro. En células epiteliales mamarias, se encontró que 50% HS, melatonina y 100% SQ cada uno pudieron inducir sincronización eficiente del ritmo circadiano en vitro. Dexametasona y forskoline producen sólo sincronización parcial. Pruebas dependiente de la dosis sería necesarias para el desarrollo y selección de nuevos agentes sincronización en futuros estudios. Dado el bajo costo, eficiencia y su amplio uso como el agente de sincronización, 50% HS fue encontrado para ser un agente de sincronización eficaz que produjo robusto y reproducible celular ritmo circadiano en células epiteliales mamarias y de los nervios de las células, como ya registrados en muchos otros tipos de células y diferentes configuraciones experimentales24.
Para validar el modelo en vitro de regulación circadiana, preguntamos a continuación que si la respuesta del ritmo circadiano a estresores ambientales en vitro recapitular los efectos se observaron en vivo. Previamente, hemos demostrado que una sola dosis cancerígena de NMU interrumpe la expresión circadiana de CGs principales (p. ej., Per2) y varios CCGs en la glándula mamaria de destino. Por otra parte, un régimen quimiopreventivo de MSC restablece la expresión circadiana de genes Per2 y CCGs hacia la normal. Hemos demostrado además que la exposición a sustancias tóxicas de las células y factores de estrés pueden alterar la expresión de genes circadianos a través de sus efectos sobre NAD+-dependiente de SIRT1 actividad7,8,22. Los resultados obtenidos con el ensayo de reportero circadiano en vitro demostrado que la exposición a NMU causaron trastornos de la expresión génica de los celulares, y que más interesante, MSC no sólo es capaz de restablecer el ritmo circadiano celular interrumpen por NMU, sino también reiniciar el ritmo circadiano alterado por los inhibidores de la SIRT1. Estos resultados indicaron que el ensayo in vitro no sólo reproduce los efectos de la NMU sobre expresión de genes circadianos, sino que también reproduce los efectos de la maestría en el ritmo circadiano interrumpida en vivo a través de mecanismos dependientes de SIRT1. El sistema de reportero circadiano en vitro así tiene el potencial para detectar una variedad de sustancias tóxicas y factores estresantes que alteran los niveles de /NADH NAD+en la célula, incluyendo inhibidores directos y moduladores de redox celular ciclismo así como genotóxico agentes que pueden agotar NAD+ via poli ADP-ribosa ADN dependiente reparación de32. Estos resultados sugieren que el sistema de reportero in vitro proporciona una herramienta útil para pantalla celular condiciones y agentes químicos que pueden interrumpir o restablecer la regulación circadiana genes en vivo.
Aunque el ensayo en vitro se puede configurar usando las células transfectadas transitorio o estable con la construcción de reportero, se observaron algunas diferencias en la respuesta al tratamiento de productos químicos entre las células transfected transitorio y estable. Las estable transfected las células eran más resistentes al tratamiento de productos químicos, particularmente NMU SIRT1 inhibidores y, que las células transfected transitorio. Estas diferencias podrían reflejar diferencias sutiles en la regulación del promotor vector en transfectants estables debido a las influencias de las secuencias alrededor de sitios de integración específica. Por lo tanto, la selección de transfectants estables por el tratamiento antibiótico también puede seleccionar clones que son más resistentes a la interrupción circadiana. Por lo tanto, individuales en vitro modelos celulares usando transfectants estables o transitorios deben estar validados por su capacidad para recapitular en vivo las respuestas. Métodos de transfección diferentes también inducen niveles variables de estrés genotóxico y toxicidad en las células y en su diferente susceptibilidad a los efectos tóxicos de sustancias químicas. Por lo tanto, experimentos de prueba y piloto de citotoxicidad se requieren para la selección de las condiciones de la transfección y tratamiento. A pesar de la diferencia en su sensibilidad, los resultados obtenidos con las células de nuestro reportero circadiano epiteliales mamarias de interrupción y restauración del ritmo circadiano celular por los productos químicos eran compatibles y comparables entre transitorio las células transfected y estable transfected y los resultados recapitulan los efectos que observamos en vivo.
Para determinar si el vector reportero circadiano podría utilizarse en otros tipos celulares, las células de glioblastoma humano/astrocytoma (U-87 MG) fueron estable transfected con este vector circadiano. Los resultados preliminares usando el ensayo de bioluminiscencia celular en vitro mostraron que tras la sincronización, estas células neuronales derivadas del tumor tienen un regular y fuerte celular circadiano ritmo comparable a la observada en humanos mamaria células epiteliales. Las células trataron con IC261, un conocido inhibidor de la quinasa de la caseína 1 δ (CK1δ) y CK1 ε, demostró un prolongado período circadiano, pero menor amplitud como b reportadoy otros (datos no mostrados)33. Estos resultados indican que el circadiano luciferase reporter vector y en vitro bioluminiscencia celular ensayo son aplicables en otras células específicas del órgano, incluyendo las células neuronales.
El sistema celular reportero desarrollado aquí puede por tanto utilizarse ampliamente como un ensayo en vitro para la determinación de la expresión de genes circadianos en diferentes tipos celulares en general. El procedimiento experimental es simple, rápido y seguro. Sin embargo, no puede ser fácilmente adaptado este sistema reportero celular en células que son difíciles de transfectar, no dividiendo las células (p. ej., células neuronales), puesto que tienen eficacias de transfección notoriamente baja. Métodos de transfección basada en virus (p. ej., transfección de lentivirus) pueden ofrecer una solución de eficiencia más alta para estas células34. Sin embargo, el tiempo y la dificultad asociados con la producción lentivirales hace este método difícil y desperdiciador de tiempo. Por otra parte, un laboratorio de nivel de seguridad adecuado es necesario para la producción y uso de los virus. Además, podrían utilizarse detectores de luminiscencia de célula alta resolución para la determinación de ritmos persistentes, fases independientemente de los genes en las células no se dividen35.
Estudios de mamíferos del ritmo circadiano en vivo son no sólo mano de obra intensiva y costosa, pero también requieren el uso de grandes cantidades de animales. La disponibilidad de sistemas in vitro podría reducir significativamente el número de animales requeridos para probar la asociación entre la interrupción de la expresión de genes circadianos y el desarrollo de enfermedades crónicas, incluyendo carcinogénesis y metabólicas síndrome. Datos cuantitativos sobre los parámetros, incluyendo período, amplitud y fase, pueden informar a dosis o tiempo efectos de productos químicos en el ritmo circadiano celular. Por ejemplo, observamos antioxidantes que NAC dosis dependiente puede restaurar el período y fase de celular ritmo circadiano alterado por NMU. El modelo de vitro también podría utilizarse y clasificar ambientales disruptores circadianos e investigar el impacto de la alteración del ritmo circadiano en el deterioro de la función celular, proporcionando penetraciones mecánicas para el desarrollo de estrategias de intervención para cohortes en el riesgo creciente para el cáncer de mama, Síndromes metabólicos y trastornos neurofisiológicos, debido a horarios de trabajo anormal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la sociedad de Toxicología de 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant de investigación alterativa (M. Fang) y la investigación de colaboración internacional fondo de Animal y de la Agencia de cuarentena de planta, República de Corea (M. Fang), y conceder el NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nos gustaría agradecer al Dr. Zheng Chen (McGovern Facultad de medicina de la Universidad de Texas Health Science Center Houston) para su discusión útil, el Sr. Juan Shao-An por su ayuda experimental y la Sra. Kimi Nakata para su lectura de prueba.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
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