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एक अनुकूलित Hemagglutination अवरोध (हाय) परख के लिए इंफ्लूएंजा यों तो विशिष्ट एंटीबॉडी Titers

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/55833
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,4
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Clinical Microbiology, University Hospital Basel
* These authors contributed equally

Summary

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक hemagglutination अवरोध परख प्रदर्शन के लिए इंफ्लूएंजा-विशिष्ट एंटीबॉडी titers इंफ्लूएंजा वैक्सीन प्राप्तकर्ताओं के सीरम के नमूनों से । पहली परख hemagglutination द्वारा इष्टतम वायरल प्रतिजन सांद्रता निर्धारित करता है । दूसरी परख quantifies इंफ्लूएंजा-hemagglutination निषेध द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी titers ।

Abstract

एंटीबॉडी titers सामांयतः इंफ्लूएंजा और अंय रोगजनकों के खिलाफ सीरम संरक्षण के लिए किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है । एंटीबॉडी उत्पादन पूर्व और बाद टीकाकरण की विस्तृत जानकारी के लिए वैक्सीन प्रेरित प्रतिरक्षा समझ की आवश्यकता है । इस लेख का वर्णन एक विश्वसनीय बिंदु द्वारा-point प्रोटोकॉल इंफ्लूएंजा-विशिष्ट एंटीबॉडी titers निर्धारित करने के लिए । पहले प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए antigen hemagglutination, जो दूसरे प्रोटोकॉल (hemagglutination परख, हा परख) में बाद के उपयोग के लिए सांद्रता मानकीकरण के लिए आवश्यक मात्रा निर्दिष्ट करें । दूसरा प्रोटोकॉल का वर्णन इंफ्लूएंजा के ठहराव-विशिष्ट एंटीबॉडी titers अलग वायरल उपभेदों के खिलाफ मानव सीरम या सेल संस्कृति supernatants (hemagglutination अवरोध परख, हाय परख) के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करके ।

एक लागू उदाहरण के रूप में, हम एक स्वस्थ पलटन, जो एक त्रिसंयोजक निष्क्रिय इंफ्लूएंजा वैक्सीन प्राप्त की एंटीबॉडी प्रतिक्रिया दिखाते हैं । इसके अतिरिक्त, विभिंन इंफ्लूएंजा वायरस के बीच पार जेट दिखाया गया है और तरीकों पशु लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) के विभिंन प्रकार का उपयोग करके पार जेट कम करने के लिए समझाया जाता है । चर्चा के लाभों और प्रस्तुत की परख के नुकसान पर प्रकाश डाला गया और कैसे इंफ्लूएंजा के निर्धारण विशिष्ट एंटीबॉडी titers टीका से संबंधित प्रतिरक्षा की समझ में सुधार कर सकते हैं ।

Introduction

इंफ्लूएंजा वायरस के साथ संक्रमण काफी रुग्णता, मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, और उच्च स्वास्थ्य देखभाल लागत1,2,3,4। विशेष रूप से, बुजुर्ग, नवजात शिशुओं, गर्भवती महिलाओं, और पुराने रोग के साथ रोगियों और अधिक गंभीर नैदानिक परिणामों के लिए जोखिम में हैं । इसलिए, टीकाकरण इंफ्लूएंजा वायरस उपभेदों परिसंचारी के खिलाफ इन उच्च जोखिम आबादी में रोग के बोझ को कम करने के लिए प्राथमिक उपाय है । टीकाकरण के बाद व्यक्तिगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की वृद्धि, जैसे, इंफ्लूएंजा एक सुरक्षात्मक सीमा से ऊपर विशिष्ट एंटीबॉडी, संक्रमण के व्यक्तिगत जोखिम और सामांय में एक जनसंख्या के भीतर वायरल संचरण की संभावना कम कर देता है 5. वैक्सीन की एक विस्तृत समझ अलग आबादी और विभिंन आयु समूहों में प्रेरित विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक प्रश्नों का उत्तर देने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है6,7,8 , 9, जैसे: क्यों कुछ बुजुर्ग रोगियों पिछले टीकाकरण के बावजूद संक्रमण है? एक "अच्छा" और "पर्याप्त" वैक्सीन-प्रेरित संरक्षण क्या है? कितनी बार एक टीका एक immunosuppressed रोगी के लिए लागू किया जाना चाहिए सुरक्षात्मक titers तक पहुंचने के लिए? सबसे प्रभावी खुराक क्या है? एक उपंयास सहायक के बाद टीकाकरण एंटीबॉडी titers पर क्या प्रभाव है? टीका-विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन की माप इन महत्वपूर्ण सवालों के जवाब मदद और टीकाकरण परिणामों में सुधार हो सकता है ।

विषाणु-विशिष्ट एंटीबॉडी titers के ठहराव विभिन्न प्रतिरक्षा विधियों के साथ किया जा सकता है । यह भी शामिल है ठोस चरण10 या मनका आधारित एलिसा11 परख, हाय परख12, और13परख बेअसर । एलिसा आधारित विधियों सीरम नमूनों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में विभिंन एंटीजन के खिलाफ स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, रोगज़नक़-विशिष्ट Immunoglobulin (़) एम और आईजीजी अलग से पता लगाया जा सकता है । हालांकि एक प्रतिजन की विशेषताओं, उदा, रैखिक एमिनो एसिड अनुक्रम या वायरस की तरह कण एंटीबॉडी के बंधन को प्रभावित कर सकते हैं, संभावित epitopes के स्पेक्ट्रम बहुत व्यापक है और क्या एक एंटीबॉडी के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है प्रतिक्रिया कार्यात्मक प्रासंगिकता है ।

इसके विपरीत, बेअसर परख एंटीबॉडी की क्षमता को कार्यात्मक कोशिकाओं के संक्रमण को बाधित करने के लिए निर्धारित करता है और इसलिए बेअसर क्षमता को दर्शाता है । हालांकि, इस विधि बहुत गहन श्रम है, विशिष्ट सेल लाइनों और लाइव वायरस के संवर्धन की आवश्यकता है, और इसलिए, यह समय लेने वाली है, महंगा है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है ।

इस लेख का वर्णन एक कदम दर कदम विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ)-आधारित हाय प्रोटोकॉल12 इंफ्लूएंजा-विशिष्ट एंटीबॉडी titers यों तो । Hemagglutination कुछ वायरस एरिथ्रोसाइट्स के समूहन के लिए अग्रणी का एक विशिष्ट प्रभाव है । रोगी सीरा के साथ इस आशय के निषेध निरोधात्मक एंटीबॉडी सांद्रता, जो एक बेअसर प्रभाव को दर्शाता है की माप की अनुमति देता है ।

हमने एक ही समय में एकाधिक नमूनों की अधिक कुशल हैंडलिंग और इस प्रकार आवश्यक समय को कम करने की अनुमति देने के लिए डब्ल्यूएचओ-प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को संशोधित किया है । पहली प्रोटोकॉल एक विशेष इंफ्लूएंजा प्रतिजन के समूहन क्षमता के निर्धारण का वर्णन । ऐसा करने में, सही इंफ्लूएंजा प्रतिजन एकाग्रता दूसरे प्रोटोकॉल के लिए निर्धारित किया जाता है । यह हिस्सा हर नई वायरल प्रतिजन के साथ दोहराया जाना चाहिए, साथ ही रक्त के प्रत्येक बैच ।

दूसरा प्रोटोकॉल इंफ्लूएंजा के निर्धारण-विशिष्ट एंटीबॉडी titers का वर्णन । प्रस्तुत प्रोटोकॉल इंफ्लूएंजा वायरस और मानव सीरम नमूनों की जांच के लिए अनुकूलित कर रहे है तथापि, यह भी माउस सीरम नमूने या कोशिका संस्कृति supernatants के लिए प्रेरित प्रतिरक्षा कोशिकाओं से लागू किया जा सकता है, जैसे, वायरस-विशिष्ट बी कोशिकाओं । परिणाम निरपेक्ष मापा titers के रूप में निर्धारित किया जा सकता है । कई वैक्सीन अध्ययन में, ज्यामितीय माध्य titers और ९५% विश्वास अंतराल प्रत्येक विशेष जनसंख्या के लिए दिखाए जाते हैं । व्याख्या के लिए, seroprotection या seroconversion अक्सर एक निश्चित वायरस के लिए एक जनसंख्या की संवेदनशीलता का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाता है । Seroprotection ≥ 1:40 के एक titer के रूप में परिभाषित किया गया है, और seroconversion दो समय अंकों के बीच titer seroprotective की उपलब्धि के साथ एक से अधिक 4 गुना titers वृद्धि के रूप में (सबसे अधिक पूर्व टीकाकरण और 30 दिनों के बाद टीकाकरण का इस्तेमाल कर रहे हैं) ।

दोनों प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे है और वे अनुसंधान के सवालों का एक व्यापक रेंज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । विशेष रूप से, वे hemagglutination, जैसे खसरा, polyomaviruses, कण्ठमाला, या रूबेला के रूप में क्षमता के साथ विभिन्न अन्य वायरसों के खिलाफ एंटीबॉडी titers मज़बूती से और जल्दी से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है14,15,16 .

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Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल स्थानीय एथिकल रिव्यू बोर्ड (www.EKNZ.ch) के माध्यम से अनुमोदित किया गया था और लिखित सूचित सहमति सभी सहभागियों से प्राप्त की गई थी ।

1. सीरम संग्रह

  1. ब्याज की समय अंक पर मनुष्यों से सीरम नमूने ले लीजिए । इस अध्ययन के लिए, हम 0 दिनों में सीरा एकत्र (इंफ्लूएंजा टीकाकरण के समय), + 7, + 30, + ६०, और + १८० टीकाकरण के बाद ।
  2. सीरम प्राप्त करने के लिए, कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए १,२०० x g पर नमूना ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    नोट: गैर-केंद्रापसारक रक्त के नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, और अब से 24 घंटे के लिए ।
  3. Aliquot अलग ट्यूबों में सीरम (क्रायो-शीशियों) और फ्रीज में-८० ° c उपयोग तक ।
  4. एक रोगी के भीतर परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक व्यक्ति के सभी समय अंक सहित बाद परख बैच वार, प्रदर्शन.

2. एंटीजन की तैयारी

चेतावनी: पांच विभिंन एंटीजन ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जाता है । एंटीजन को एक सी-सेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल-2) प्रयोगशाला में तैयार करें ।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, आसुत पानी की १.० मिलीलीटर के साथ एक lyophilized इंफ्लूएंजा प्रतिजन शीशी की कुल सामग्री का पुनर्गठन और भंग प्रतिजन की अनुमति के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट की एक ंयूनतम के लिए खड़े हो जाओ ।
  2. Aliquot १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए प्रतिजन समाधान और अधिक उपयोग जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।

3. हैजा छानने की तैयारी

नोट: हैजा निस्पंदन एक रिसेप्टर नष्ट एंजाइम के रूप में प्रयोग किया जाता है (रडे) डब्ल्यूएचओ प्रोटोकॉल के अनुसार12। इस सीरम जो परख17के साथ हस्तक्षेप होता से जंमजात अवरोधकों हटा ।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार lyophilized रडे का पुनर्गठन किया जाए ।
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रडे समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे का उपयोग तक स्टोर ।

4. हा परख

नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि हाय परख कई प्लेटों के बीच तुलनीय हैं, वायरस कणों की एक ही राशि प्रत्येक थाली के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हा परख (भी कहा जाता हा अनुमापन) वायरस hemagglutination के लिए आवश्यक कणों यों तो किया जाता है, और हा इकाइयों में दर्ज की गई है । hemagglutination की एक इकाई "" एक परिचालन इकाई हा अनुमापन के लिए इस्तेमाल किया विधि पर निर्भर है और वायरस का एक निरपेक्ष राशि का एक माप नहीं है । इस प्रकार, एक हा इकाई एक मानकीकृत आरबीसी निलंबन के एक बराबर मात्रा agglutinate करने के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है । डब्ल्यूएचओ के अनुसार, मानक राशि का उपयोग हाय परख के लिए 25 µ एल प्रति 4 हेक्टेयर इकाइयों है । हा परख के सिद्धांत के एक उदाहरण के लिए चित्रा 1देखें ।

Figure 1
चित्र 1 : hemagglutination और hemagglutination निषेध के सिद्धांत । कोई hemagglutination वायरस और एंटीबॉडी (बाएं कॉलम) के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण स्थिति में होता है, और एरिथ्रोसाइट्स hemagglutinate केवल इंफ्लूएंजा वायरस (मध्य कॉलम) की उपस्थिति में । हालांकि, जब इंफ्लूएंजा वायरस के hemagglutinin वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा अवरुद्ध है तो कोई hemagglutination (सही कॉलम) हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नोट: कोशिकाओं इस्तेमाल किया परख (1 तालिका) में इंफ्लूएंजा वायरस के प्रकार पर निर्भर हैं । इसके अलावा, के विभिंन प्रकार के लिए ९६-अच्छी तरह से माइक्रो titer प्लेटें, मशीन समय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर agglutinated कोशिकाओं की उपस्थिति अलग (तालिका 2) ।

इंफ्लूएंजा प्रतिजन A/कैलिफोर्निया/7/09 (H1N1) A/स्विट्ज़रलैंड/9715293/2013 (H3N2) A/टेक्सास/50/2012 (H3N2) B/ब्रिस्बेन/60/08 B/मैसाचुसेट्स/02/2012
आरबीसी प्रजातियों चिकन गिनी पिग गिनी पिग तुर्कस्तान तुर्कस्तान

तालिका 1: इंफ्लूएंजा एंटीजन और कोशिकाओं की इसी प्रजाति। निर्माता के निर्देश (NIBSC) के अनुसार ।

आरबीसी प्रजातियों चिकन तुर्कस्तान गिनी पिग मानवी प्रकार हे
कोशिकाओं की एकाग्रता (v/ ०.७५% ०.७५% 1% 1%
microtiter प्लेट का प्रकार V नीचे V नीचे यू बॉटम यू बॉटम
मशीन समय, RT 30 min 30 min 1 घंटा 1 घंटा
गैर-agglutinated कक्षों की दिखावट बटन* बटन* हेलो हेलो

तालिका 2: कोशिकाओं की विभिंन प्रजातियों के साथ परख शर्तों । डब्ल्यूएचओ प्रोटोकॉल के अनुसार । (* बहती है जब झुका) ।

  1. आरबीसी निलंबन की तैयारी
    1. आरबीसी शेयर निलंबन पतला (10%, वी/मानव प्रकार के अलावा ओ) (देखें सामग्री की तालिका) फास्फेट के साथ बफर खारा (पंजाब) एवियन और ०.७५% और 1% की स्तनधारी कोशिकाओं के लिए उचित सांद्रता बनाने के लिए, क्रमशः ।

Figure 2
चित्र 2 : थाली की डिजाइन हा परख । हा अनुमापन डुप्लिकेट्स में किया जाता है । कोई antigen नियंत्रण पंक्तियाँ करने के लिए जोड़ा गया था । इसके अलावा सबसे अच्छा प्रतिजन एकाग्रता के निर्धारण के लिए चित्रा 4 देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. ९६-खैर माइक्रो Titer प्लेट की तैयारी
    नोट: प्लेट डिजाइन के अवलोकन के लिए चित्रा 2 देखें ।
    1. एक मल्टीचैनल पिपेट (चित्रा 2) का उपयोग करके एक ९६-अच्छी तरह से माइक्रो titer प्लेट की प्रत्येक प्रयुक्त पंक्ति के कुओं के लिए 1 से 12 पंजाबियों के 25 µ एल जोड़ें । बर्ड कोशिकाओं के साथ काम करते समय वी के आकार का माइक्रो titer प्लेट का प्रयोग करें, जैसे चिकन और टर्की । स्तनधारी कोशिकाओं के साथ काम करते समय यू के आकार का माइक्रो titer प्लेट का उपयोग करें, जैसे गिनी पिग और ह्यूमन टाइप ओ (तालिका 2) ।
    2. 25 µ के एल जोड़ें इंफ्लूएंजा प्रतिजन के पहले अच्छी तरह से प्रतिजन-पंक्तियों, जो डुप्लिकेट में व्यवस्था कर रहे हैं । कोई antigen नियंत्रण पंक्तियाँ करने के लिए जोड़ा गया है । नियंत्रण पंक्तियों में कोई hemagglutination प्रभाव नहीं दिखाना चाहिए और ऋणात्मक नियंत्रणों (आरेख 2) के रूप में कार्य करना चाहिए ।
    3. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके एक धारावाहिक 2-गुना कमजोर पड़ने से 25 µ l को antigen-पंक्तियों की पहली अच्छी तरह से क्रमिक कुओं में स्थानांतरित करके निष्पादित करें । pipetting ऊपर और नीचे धीरे से 10 बार से प्रत्येक कमजोर पड़ने कदम मिश्रण ।
    4. अंतिम कुओं के अंतिम २५ µ एल को त्यागें.
    5. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक प्रयुक्त पंक्ति के 1 से 12 कुओं को पंजाब के 25 µ एल जोड़ें, क्रम में अच्छी तरह से प्रति ५० µ एल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए ।
    6. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से इस्तेमाल किया प्रत्येक के लिए आरबीसी निलंबन के ५० µ एल जोड़ें ।
    7. थाली ध्यान से सभी चार पक्षों पर 10 बार मिश्रण करने के लिए टैप करें ।
    8. एक ढक्कन के साथ प्लेट को कवर और समय की उचित राशि आरबीसी प्रजातियों के आधार पर इस्तेमाल के लिए कमरे के तापमान पर ( तालिका 2देखें) की मशीन. मशीन लगाते समय थाली न ले जाएं ।

Figure 3
चित्र 3 : एवियन और स्तनधारी कोशिकाओं के समूहन पैटर्न । वी के आकार का माइक्रो titer प्लेटें जब एवियन कोशिकाओं के साथ काम कर रहे थे । readout एक झुका प्लेट की स्थिति में किया जाता है, और गैर agglutinated कोशिकाओं के आकार की तरह एक आंसू बनाने के नीचे चलाने के लिए शुरू करते हैं । यू के आकार का microtiter प्लेटें स्तनधारी कोशिकाओं के साथ काम करते समय इस्तेमाल किया जाता है । readout तो एक गैर झुका स्थिति में किया जाता है, और गैर agglutinated कोशिकाओं एक छोटे से हेलो फार्म । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. थाली पढ़ना
    नोट: readout थोड़ा अलग है जब एवियन कोशिकाओं का उपयोग कर स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में, क्योंकि अलग आकार का माइक्रो titer वेल्स (चित्र 3) ।
    1. एवियन कोशिकाओं की Readout
      1. थाली झुकाव 25 एस के लिए ९० ° ।
        ध्यान दें: प्लेट झुकाव एवियन पैटर्न के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि सभी तीन समूहन पैटर्न के विभिंन प्रकार (पूरी तरह से agglutinated, आंशिक रूप से agglutinated, और गैर agglutinated) एक बटन के रूप में दिखाई जब झुका नहीं ।
      2. मार्क तुरंत परिणाम है, जबकि प्लेट एक झुका स्थिति में अभी भी है, ९६-अच्छी तरह से थाली की एक मुद्रित योजना पर । एवियन कोशिकाओं के समूहन पैटर्न चित्रा 3में दिखाए जाते हैं ।
    2. Readout ऑफ स्तनधारी कोशिकाओं
      1. ९६-खैर प्लेट की एक मुद्रित योजना पर परिणाम चिह्नित करें, प्लेट झुकाव के बिना (पीठ पर क्षैतिज स्थिति) ।
        नोट: जब hemagglutination होती है, तो agglutinated कक्षों को नीचे की ओर व्यवस्थित नहीं करते हैं, जबकि गैर-agglutinated कक्ष अच्छी तरह से नीचे एक halo के रूप में दिखाई देते हैं । आंशिक रूप से agglutinated कोशिकाओं के हेलो कम तीव्र है और एक बड़ा व्यास है (चित्रा 3).
    3. 4 हेक्टेयर इकाइयों का निर्धारण ।
      नोट: हा अनुमापन अंत बिंदु है पिछले अच्छी तरह से जहां पूरा hemagglutination होता है । यह अच्छी तरह से वायरस के 1 हेक्टेयर इकाई शामिल हैं । प्रतिजन के 2 गुना कमजोर पड़ने के कारण, दो कुओं हा अनुमापन समापन बिंदु से आगे अच्छी तरह से है कि वायरस (चित्रा 4) के 4 हेक्टेयर इकाइयों शामिल है ।

Figure 4
चित्र 4 : एवियन कोशिकाओं के साथ हा अनुमापन का Readout 4 हा इकाइयों के titer का निर्धारण. इष्टतम प्रतिजन hemagglutination के लिए आवश्यक राशि hemagglutination परख द्वारा मापा जाता है (प्रतिजन अनुमापन परख) । पिछले अच्छी तरह से जहां पूरा hemagglutination होता है हा अनुमापन समापन बिंदु है और 1 हेक्टेयर इकाई शामिल है । प्रतिजन के 2 गुना कमजोर पड़ने की वजह से, दो कुओं के आगे हा अनुमापन समापन बिंदु, titer 4 हेक्टेयर इकाइयों के लिए संगत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. हाय परख

नोट: प्रोटोकॉल के कार्य प्रवाह पीसीआर ट्यूब धारियों और एक थर्मामीटर साइकिल चालक का उपयोग करके एक ही समय में कई नमूनों की एक अधिक कुशल हैंडलिंग की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है (नीचे देखें) ।

  1. सीरम के नमूनों की तैयारी
    नोट: एक बीएसएल-2 प्रयोगशाला में सीरम नमूने तैयार करें ।
    1. हर व्यक्ति के प्रत्येक समय बिंदु के जमे हुए सीरम नमूने गल (चरण १.२ देखें) कमरे के तापमान पर ।
    2. एक पीसीआर ट्यूब पट्टी की एक ट्यूब के लिए प्रत्येक गल सीरम नमूने के 10 µ एल के एक aliquot जोड़ें (एक पट्टी में 10 ट्यूबों) ।
      नोट: पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स का उपयोग करने का बड़ा लाभ यह है कि एक मल्टीचैनल पिपेट हाय परख में निंनलिखित चरणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; यह समय की एक बहुत बचाता है जब सीरम नमूनों की एक बड़ी राशि का परीक्षण और जब अलग वायरस उपभेदों के खिलाफ एंटीबॉडी titers के लिए एक ही नमूने के दोहराया उपाय प्रदर्शन ।
    3. aliquoted सीरम नमूने पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स में-८० ° c उपयोग तक संग्रहीत करें ।
    4. एक दिन पहले हाय परख किया जाता है, गल कमरे के तापमान पर ब्याज की सीरम नमूना aliquots ।
    5. एक खाली पीसीआर ट्यूब के लिए उपयुक्त विरोधी सीरम के 10 µ एल जोड़ें ।
      नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, एक विशिष्ट वायरस के खिलाफ विरोधी सीरम इस्तेमाल किया वायरस से मेल खाना चाहिए । सकारात्मक नियंत्रण कई प्लेटों पर प्लेट प्रदर्शन के मानकीकरण के लिए अनुमति देता है ।
    6. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके हैजे की 30 µ एल जोड़ें प्रत्येक सीरम aliquot और विरोधी सीरम के लिए समाधान छानने का (3 मात्रा के लिए सीरम के 1 मात्रा छानने का प्रयोग) ।
    7. पीसीआर ट्यूब में एक पीसीआर ९६-खैर रैक या एक खाली टिप-बॉक्स और भंवर के लिए 5 एस रखो ।
    8. एक थर्मामीटर साइकिल चालक का उपयोग कर ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात नमूने की मशीन ।
    9. 30 मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन को निष्क्रिय करने के लिए एक थर्मामीटर साइकिल चालक का उपयोग छानने का प्रयोग निस्पंदन ।
      नोट: थर्मामीटरों साइकिल चालक के आधार पर, इस कदम को और प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है ।
    10. पीसीआर ट्यूब में एक पीसीआर ९६-खैर रैक या एक खाली टिप-बॉक्स और भंवर के लिए 5 एस रखो ।
    11. फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान जब तक हाय परख के लिए उपयोग करें ।

Figure 5
चित्र 5 : थाली डिजाइन और हाय परख के कार्यप्रवाह । दो लोगों के पांच समय अंक एक प्लेट पर मापा जा सकता है । हाय titer पर्वतमाला 8 से १,०२४ करने के लिए । एक विरोधी सीरम का इस्तेमाल किया प्रतिजन एक सकारात्मक नियंत्रण और एक वापस अनुमापन के रूप में सेवा की जांच करने के लिए किया गया था यदि प्रतिजन कमजोर पड़ने के बराबर 4 हेक्टेयर इकाइयों । सीरम नमूना के सीरियल कमजोर पड़ने 2 व्यक्तिगत वैक्सीन प्राप्तकर्ताओं के लिए दिखाया गया है ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. हाय परख
    नोट: हाय परख के सिद्धांत का एक उदाहरण के लिए चित्रा 1देखें । वायरस पर निर्भर करता है, कोशिकाओं की विभिन्न प्रजातियों परख (तालिका 1) के लिए उपयोग किया जाता है । कोशिकाओं की विभिन्न प्रजातियों ९६-अच्छी तरह से प्लेटों के विभिन्न प्रकार में उपयोग किया जाता है, और मशीन समय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर agglutinated कोशिकाओं की उपस्थिति अलग है (तालिका 2) । हाय परख के लिए, 4 वायरस या प्रतिजन के हेक्टेयर इकाइयों के नमूनों की 2 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला में जोड़ा जाता है ।
    1. antigen समाधान की तैयारी
      1. ९६ की संख्या के अनुसार आवश्यक प्रतिजन समाधान की मात्रा की गणना-अच्छी तरह से इस्तेमाल किया प्लेटों (25 µ l प्रतिजन प्रति अच्छी तरह से × ९६ = २,४०० µ l प्रतिजन प्रति ९६-अच्छी तरह से थाली; मल्टीचैनल पिपेट के लिए एक जलाशय के उपयोग के कारण अतिरिक्त प्रति प्लेट १०० µ एल जोड़ें; एंटीज के एक कुल २.५ मिलीलीटर प्रति प्लेट n) ।
        नोट: उदाहरण के लिए, यदि माप १०० सीरम नमूने तो 10 प्लेटों की जरूरत है (10 नमूने प्लेट प्रति): २.५ मिलीलीटर x 10 = 25 एमएल के प्रतिजन कुल में जरूरत समाधान ।
      2. पंजाबियों का उपयोग कर परिकलित मात्रा के लिए 4 हेक्टेयर इकाइयों के उचित कमजोर पड़ने तैयार ।
        नोट: 4 हा इकाइयों के लिए हा परख निर्धारित कर रहे हैं । antigen की उचित मात्रा के लिए, परिकलित वॉल्यूम titer 4 HA इकाइयों के लिए संगत द्वारा विभाजित करें । उदाहरण के लिए, 4 हा इकाइयों 1/64 के कमजोर पड़ने के अनुरूप है, और हम की जरूरत १५,००० µ एल के प्रतिजन समाधान की जरूरत है: 15000/64 = भंग lyophilized इंफ्लूएंजा प्रतिजन के २३४.४ µ एल जोड़ा जाता है ।
    2. आरबीसी निलंबन की तैयारी
      1. ९६ की संख्या के अनुसार आवश्यक आरबीसी निलंबन की मात्रा की गणना-अच्छी तरह से माइक्रो titer प्लेटों का इस्तेमाल किया (५० µ एल आरबीसी निलंबन के अनुसार अच्छी तरह से × ९६ = ४,८०० µ एल आरबीसी निलंबन प्रति ९६-खैर प्लेट; मल्टीचैनल पिपेट के लिए एक जलाशय के उपयोग के कारण अतिरिक्त प्रति प्लेट २०० µ एल जोड़ें) .
      2. (सामान्य रूप से 10%, वी/मानव प्रकार को छोड़कर) आरबीसी शेयर निलंबन पतला पंजाब के साथ ०.७५% और 1% के एवियन और स्तनधारी कोशिकाओं के लिए उचित सांद्रता बनाने के लिए, क्रमशः ।
    3. ९६-खैर माइक्रो titer प्लेट की तैयारी
      1. ९६-अच्छी तरह से माइक्रो titer प्लेट्स लेबल (नमूना आईडी, सकारात्मक नियंत्रण, और वापस अनुमापन). ध्यान से चित्रा 5 में प्लेट अभिविन्यास की जाँच करें.
      2. "वापस अनुमापन" पंक्ति (चित्रा 5, 12वीं पंक्ति) मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर के पहले अच्छी तरह से छोड़कर हर तरह के लिए पंजाब के 25 µ एल जोड़ें ।
        नोट: एक वापस अनुमापन अगर इस्तेमाल किया प्रतिजन कमजोर पड़ने की जांच करने के लिए किया गया था 4 हेक्टेयर इकाइयों के बराबर है । यदि hemagglutination "वापस अनुमापन" पंक्ति के पहले तीन कुओं में होता है, लेकिन चौथे कुआं में नहीं है, तो 4 हेक्टेयर इकाइयों का एक प्रतिजन titer संकेत दिया है ।
      3. "वापस अनुमापन" पंक्ति (12th पंक्ति) के पहले well करने के लिए तैयार antigen समाधान (5.2.1 में वर्णित) के ५० µ l जोड़ें ।
      4. रडे के 25 µ एल-1 पंक्तियों के पहले कुओं के लिए इलाज सीरम नमूने के प्रत्येक प्लेट पर 10 करने के लिए, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर जोड़ें ।
      5. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 11वें पंक्ति के पहले अच्छी तरह से उपयुक्त विरोधी सीरम के 25 µ एल जोड़ें ।
      6. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके क्रमिक कुओं के लिए प्रत्येक पंक्ति (1-12) के पहले अच्छी तरह से 25 µ एल स्थानांतरित द्वारा धारावाहिक 2 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन । प्रत्येक कमजोर पड़ने वाले कदम के लिए ऊपर और नीचे 10-15 बार pipetting द्वारा मिश्रण । एक ही सुझाव नमूना प्रति एक कमजोर पड़ने कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      7. अंतिम कुओं के अंतिम २५ µ एल को त्यागें.
      8. 1 से 11 (सीरम नमूने और एंटी-सीरम) पंक्तियों की प्रत्येक well करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके antigen समाधान के 25 µ l जोड़ें । यदि कुएँ को न छुआ जाए तो उन्हीं युक्तियों का उपयोग किया जा सकता है.
      9. "वापस अनुमापन" पंक्ति (12th पंक्ति) के प्रत्येक well को antigen के बजाय पंजाब के 25 µ l जोड़ें ।
      10. थाली ध्यान से सभी चार पक्षों पर 10 बार मिश्रण करने के लिए टैप करें ।
      11. एक ढक्कन के साथ प्लेट को कवर और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । मशीन लगाते समय थाली न ले जाएं ।
      12. हर कुआं को आरबीसी सस्पेंशन के ५० µ एल जोड़ें ।
      13. थाली ध्यान से सभी 4 पक्षों पर 10 बार मिश्रण करने के लिए टैप करें ।
      14. एक ढक्कन के साथ प्लेट को कवर और समय की उचित राशि आरबीसी प्रजातियों के आधार पर इस्तेमाल के लिए कमरे के तापमान पर ( तालिका 2देखें) की मशीन. मशीन लगाते समय थाली न ले जाएं ।
    4. थाली पढ़ना
      नोट: हाय titer के पिछले कमजोर पड़ने के पारस्परिक (विरोधी) सीरम है कि पूरी तरह से hemagglutination रोकता है । इस बात पर गौर करना जरूरी है कि रडे का इलाज करने वाला सीरा पहले से ही पतला 1:4 था और सीरियल कमजोर पड़ने के कदम के बाद पहले कुएं में सीरा 1:8 पतला किया जाता है, जो 8 के एक HI titer के अनुरूप होता है ।
      1. एवियन कोशिकाओं की Readout
        1. थाली झुकाव 25 एस के लिए ९० ° ।
          ध्यान दें: प्लेट झुकाव एवियन पैटर्न के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि सभी तीन समूहन पैटर्न के विभिंन प्रकार (पूरी तरह से agglutinated, आंशिक रूप से agglutinated, और गैर agglutinated) एक बटन के रूप में दिखाई जब झुका नहीं ।
        2. मार्क तुरंत परिणाम है, जबकि प्लेट एक झुका स्थिति में अभी भी है, ९६-अच्छी तरह से थाली की एक मुद्रित योजना पर । एवियन कोशिकाओं के समूहन पैटर्न चित्रा 3में दिखाए जाते हैं ।
      2. Readout ऑफ स्तनधारी कोशिकाओं
        1. ९६-खैर प्लेट की एक मुद्रित योजना पर परिणाम चिह्नित, प्लेट झुका के बिना ।
          नोट: जब hemagglutination होती है, तो गैर-agglutinated कक्ष well के नीचे एक halo के रूप में प्रकट होते हैं, जबकि agglutinated कक्ष व्यवस्थित नहीं हैं । आंशिक रूप से agglutinated कोशिकाओं के हेलो कम तीव्र है और एक बड़ा व्यास है (चित्रा 3).
        2. प्रत्येक नमूने के HI का निर्धारण करें और इसे कंप्यूटर-आधारित तालिका में स्थानांतरित करें (चित्र 6)
        3. नोट: आंशिक रूप से agglutinated कुओं एक कम titer के रूप में निर्धारित किया गया । उदाहरण के लिए, यदि एक सीरम नमूना पूरी तरह से 4 hemagglutination (1:64 कमजोर पड़ने) को रोकता है और 5गु अच्छी तरह से (1:128 कमजोर पड़ने) आंशिक रूप से agglutinated है, तो हाय titer अंतिम विश्लेषण के लिए कम titer ६४ के लिए सेट है (चित्रा 6, 4गु पंक्ति) ।

Figure 6
चित्र 6 : एवियन कोशिकाओं के साथ हाय परख के Readout । पूर्व और बाद में टीकाकरण इंफ्लूएंजा विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्रेरित हाय परख द्वारा निर्धारित होता है । इस उदाहरण में, व्यक्ति एक व्यक्ति दो से अधिक उच्च titers है । दोनों व्यक्ति टीकाकरण के बाद एक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया दिखाते हैं; टीकाकरण के १८० दिन बाद दोनों व्यक्तियों की एंटीबॉडी titers फिर से घटी हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

पूर्व और बाद टीकाकरण प्रेरित इंफ्लूएंजा एक H3N2 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया
टीका-प्रेरित एंटीबॉडी प्रतिक्रिया 26 स्वस्थ स्वयंसेवकों में मूल्यांकन किया गया था जो एक निष्क्रिय त्रिसंयोजक उप इकाई इंफ्लूएंजा टीका युक्त इंफ्लूएंजा एक/H1N1/कैलिफोर्निया/2009, ए/H3N2/टेक्सास/2012, और B/मैसाचुसेट्स/02/2012 से पहले 2014/ २०१५ इंफ्लूएंजा के मौसम । चित्रा 6 2 वैक्सीन प्राप्तकर्ताओं के एक प्रतिनिधि उदाहरण से पता चलता है । दिलचस्प है, कि विशेष रूप से इंफ्लूएंजा के मौसम, एक/H3N2/टेक्सास/2012 के दौरान परिचालित नहीं था, और बदले मौसम में कुछ अलग वायरल तनाव शामिल: A/H3N2/स्विट्ज़रलैंड/2013 । a/H3N2/टेक्सास/2012 और a/H3N2/स्विट्ज़रलैंड/2013 के वायरल hemagglutinin ९७% अनुक्रम पहचान दिखाने के लिए और केवल ग्यारह अमीनो एसिड में अलग ( तालिका 4देखें), जिनकी स्थितियां चित्रा 7में हाइलाइट की गई हैं.

Figure 7
चित्र 7 : एक/H3N2 इंफ्लूएंजा उपभेदों के Hemagglutinin तुलना । हम वायरल उपभेदों के hemagglutinin की तुलना में एक/टेक्सास/50/2012 और a/स्विट्जरलैंड/9715293/2013 । के बाद से वहां कोई hemagglutinin इन उपभेदों के क्रिस्टल संरचनाओं रहे हैं, हम इंफ्लूएंजा तनाव के अत्यधिक समान hemagglutinin की क्रिस्टल संरचना का इस्तेमाल किया/विक्टोरिया/361/201118, जो टेक्सास तनाव और ९५% के साथ ९८% अनुक्रम पहचान दिखाता है स्विट्जरलैंड तनाव के साथ अनुक्रम पहचान । एमिनो एसिड पदों जिसमें टेक्सास और स्विट्जरलैंड उपभेदों अलग उजागर कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हम एक क्रॉस-प्रतिक्रियाशील वायरल उपभेदों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मनाया/H3N2/स्विट्जरलैंड/2013 और एक/H3N2/टेक्सास/2012 । titers के खिलाफ हाय इंफ्लूएंजा a/H3N2/स्विट्जरलैंड/2013 के संदर्भ में काफी कम थे ज्यामितीय माध्य titers और प्रेरित seroprotection (चित्रा ८अ) की तुलना में इंफ्लूएंजा a/H3N2/टेक्सास/2012 (चित्रा 8B) ।

Figure 8
चित्र 8 : ज्यामितीय माध्य एंटीबॉडी-स्वस्थ दाताओं के titers । 25 स्वस्थ दाताओं पूर्व और बाद टीकाकरण के ज्यामितीय माध्य एंटीबॉडी-titers (GMTs) दो अलग प्रतिजनों का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं । a/H3N2/स्विटज़रलैंड/2013 (a) और a/H3N2/टेक्सास/2012 (B) का माध्य titers दिखाया गया है । टीकाकरण के कारण एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (d7-d60) टीकाकरण के बाद बढ़ती titers के रूप में मनाया जा सकता है, टीकाकरण (d0) से पहले GMTs की तुलना में । टीकाकरण के १८० दिन बाद फिर से GMTs घट गया । नोट की, केवल एक/H3N2/टेक्सास/2012 (जो वैक्सीन में था) सुरक्षात्मक titers तक पहुंचता है । सलाखों के ज्यामितीय मतलब titers संकेत मिलता है, और मूंछ ९५% विश्वास अंतराल संकेत मिलता है । डैश्ड रेखा seroprotection थ्रेशोल्ड को इंगित करती है । seroprotected लोगों का% (titer > 1:40) ग्राफ में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

टीकाकरण के बाद, एंटीबॉडी titers के विरूद्ध एक/H3N2/टेक्सास/2012 अधिकांश विषयों में वृद्धि हुई; हालांकि एक/H3N2/स्विट्ज़रलैंड/2013 तनाव वैक्सीन में मौजूद नहीं था, एक के खिलाफ titer/H3N2/स्विट्जरलैंड/2013 के रूप में अच्छी तरह से कुछ विषयों में वृद्धि हुई. चित्र 9 एक रेखीय प्रतीपगमन मॉडल के लिए ०.७४५ के एक R2 के साथ सभी समय बिंदुओं पर दोनों titers के बीच सहसंबंध दिखाता है । के रूप में एक उंमीद करेंगे, एक/H3N2/स्विट्ज़रलैंड/2013 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की प्रेरण कम शक्तिशाली था ।

Figure 9
चित्र 9 : एक/H3N2 इंफ्लूएंजा उपभेदों के बीच परस्पर प्रतिक्रिया । हर व्यक्ति और समय बिंदु के एक/H3N2/टेक्सास titers के खिलाफ साजिश रची है इसी A/H3N2/स्विट्जरलैंड titers । एक रेखीय प्रतीपगमन मॉडल ०.७४५ का एक R2 दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Hemagglutination क्षमता इस्तेमाल रक्त के प्रकार पर आधारित है
वायरल hemagglutinin hemagglutinate एरिथ्रोसाइट्स के लिए विभिन्न प्रजातियों पर निर्भर क्षमता से पता चलता है । इस प्रजाति पर निर्भर प्रभाव भी hemagglutination अवरोध परख प्रभावों । मापा विरोधी वायरल titers की विशिष्टता में सुधार करने के लिए, हम पांच वायरल एंटीजन के लिए एरिथ्रोसाइट्स का सबसे उपयुक्त प्रकार का मूल्यांकन (इंफ्लूएंजा b//60/2008 और b/केककेेके/02/2012, इंफ्लूएंजा a/H1N1/कैलिफोर्निया/2009, a/H3N2/टेक्सास/2012, और एक/ H3N2/स्विट्जरलैंड/2013) अधिकतम hemagglutination प्राप्त करने के लिए लेकिन यह भी सबसे कम पार जेट । हम इन परख प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक प्रतिजन के खिलाफ जैविक मानकों और नियंत्रण (NIBSC) के लिए राष्ट्रीय संस्थान से सकारात्मक नियंत्रण सीरा का इस्तेमाल किया ।

इंफ्लूएंजा बी के लिए, हम निरीक्षण कर सकते है कि b/मैसाचुसेट्स/02/2012 प्रेरित एंटीबॉडी प्रतिक्रिया सुरक्षा प्रदान नहीं करता है b/ब्रिस्बेन/60/2008 के खिलाफ । इसके विपरीत, b/ब्रिस्बेन/60/2008 के विरुद्ध एंटीबॉडी ने b/केककेेके/02/2012 के विरुद्ध विभिन्न एरिथ्रोसाइट्स में 4-गुना कम titer पर क्रॉस-रिजेट दिखाया ( तालिका 3देखें) । ब्याज की, गिनी पिग रक्त इंफ्लूएंजा बी तुर्की रक्त के साथ ठीक से hemagglutinate नहीं था hemagglutinate की क्षमता दिखाने में सबसे अच्छा था और रिश्तेदार कम पार के साथ उच्चतम titers-जेट के अलावा पहले उल्लेख किया एक/H3N2/टेक्सास और/ स्विट्जरलैंड उपभेदों ।

तुर्कस्तान गिनी पिग चिकन मानवी प्रकार हे
B ब्रिस्बेन/ १०२४ - १०२४ १०२४
बी मैसाचुसेट्स/ १०२४ ३८४ ७६८ १०२४
A/H3N2/स्विट्ज़रलैंड १०२४ १०२४ - १०२४
A/H3N2/टेक्सास १०२४ १०२४ ५१२ १०२४
A/H1N1/कैलिफोर्निया १०२४ १०२४ ७६८ ७६८

तालिका 3: सकारात्मक नियंत्रण विभिंन प्रजातियों के पार संबंधित इंफ्लूएंजा हा प्रतिजन के खिलाफ titers ।

नहीं A/H3N2/टेक्सास/2012 तनाव A/H3N2/स्विट्ज़रलैंड/2013 तनाव स्थिति
1 Asparagine (N) Alanine (क) १२८
2 Alanine (क) Serine (S) १३८
3 Isoleucine (सातारा) Arginine (नि.) १४०
4 Arginine (नि.) Glycine (छ) १४२
5 Asparagine (N) Serine (S) १४५
6 फेनिलएलनिन (F) Serine (S) १५९
7 Glycine (छ) वैलिन (V) १८६
8 रेखा (P) Serine (S) १९८
9 Serine (S) फेनिलएलनिन (F) २१९
10 Asparagine (N) Aspartate (D) २२५
11* Lysine (कश्मीर) Arginine (नि.) ३२६
* चित्र 8 में क्रिस्टल संरचना में नहीं दिखाया गया है, क्योंकि hemagglutinin ३२५ अवशेषों पर cutted था ।

तालिका 4: एक/H3N2/टेक्सास/2012 और a/H3N2/स्विट्जरलैंड/2013 उपभेदों के बीच hemagglutinin के विभिन्न अमीनो एसिड की सूची

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Discussion

पूर्व के ठहराव और बाद टीकाकरण इंफ्लूएंजा वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी titers एक महत्वपूर्ण वैक्सीन अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण है । इस तरह के seroprotection के रूप में वायरस के संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा के किराए के उपायों पर आधारित है, (> 1:40) या seroconversion (4 गुना titer वृद्धि), टीकाकरण रणनीतियों9अनुकूलित किया जा सकता है । प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग कर निर्धारित कर सकते हैं: (i) किसी विशेष वायरस की hemagglutination क्षमता, और (ii) ब्याज के वायरस के लिए एंटीबॉडी titers ।

संशोधन और समस्या निवारण:

यह प्रोटोकॉल डब्ल्यूएचओ मानक12पर आधारित है । हम सीरम तैयार करने के लिए पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स का उपयोग करके प्रोटोकॉल संशोधित (चरण 5 देखें). इस संशोधन के लिए महत्वपूर्ण कार्यभार कम करने और परख का प्रवाह बढ़ाने में मदद की । इसके अलावा, हम antigen अनुमापन चरण में एक चौथाई से कम, जो लागत प्रभावी ओवरटाइम है । सीरम की एक कम राशि (10 µ एल) रडे उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो विशेष रूप से जब नमूना राशि सीमित है में मदद करता है (उदा., माउस सीरा) । पीठ अनुमापन और सकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी माप प्लेट में एक उचित आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए और एरिथ्रोसाइट्स की उंर बढ़ने की निगरानी में शामिल हैं ।

इसके अलावा, हम एक अच्छा दृश्य readout के लिए एरिथ्रोसाइट थक्का के इष्टतम आकार सेट करने के लिए जो मानक12 में उन लोगों से अलग एरिथ्रोसाइट सांद्रता का इस्तेमाल किया. यह गारंटी हम परख से पहले एरिथ्रोसाइट एकाग्रता की जांच का सुझाव देते हैं । हालांकि, हम हमारे प्रोटोकॉल में इस भाग को अनुकूलित नहीं किया है, इस तरह के आयुध डिपो या सेल गिनती के साथ अवशोषण माप के रूप में तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यदि रडे पूरी तरह से निष्क्रिय नहीं है, कोशिकाओं कमरे के तापमान पर मापा जाता है जब hemagglutination desialylated और रिवर्स हा पॉजिटिव वेल्स किया जा सकता है । हालांकि हम इस समस्या को कभी नहीं देखा, इस मामले में, हम 4 डिग्री सेल्सियस पर हाय प्रदर्शन सुझाव है, के बाद से रडे गतिविधि काफी कम है 4 डिग्री सेल्सियस. हालांकि, 4 डिग्री सेल्सियस पर हाय परख प्रदर्शन धीमी है ।

तकनीक की सीमाएं:

उच्च परख के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं निंनलिखित अंक शामिल हैं: दिलचस्प है, hemagglutination दृढ़ता से एरिथ्रोसाइट के विशेष प्रकार पर निर्भर है (उदा, टर्की या गिनी पिग आरबीसी) । रक्त के इष्टतम प्रकार के एक विशेष वायरस तनाव से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए मूल्यांकन और रक्त की एक ही प्रकार की परख भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हालांकि वायरस के बीच क्रॉस-जेट की प्रेरण एक थोड़ा नया वायरस19,20के मामले में एक प्रतिरक्षा लाभ उत्पन्न कर सकता है, यह कम विशिष्टता के कारण देखने का एक नैदानिक बिंदु से कुछ समस्याओं का कारण हो सकता है. इसलिए, इस तरह के वायरस के बीच क्रॉस जेट सावधानी से संबोधित किया जाना चाहिए और अध्ययन में चर्चा की । किसी विशिष्ट प्रजाति से एरिथ्रोसाइट्स चुनकर, क्रॉस-रिजेट की मात्रा कुछ कम हो सकती है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:

हाय एक अच्छी तरह से स्थापित सोने के मानक अत्यधिक प्रतिलिपि और विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने की विधि है । एलिसा के रूप में अंय तकनीकों गैर-बेअसर एंटीबॉडी का पता लगा सकता है, जबकि हाय केवल एंटीबॉडी जो हा स्टेम पाश को बांध और इस तरह बेअसर के साथ सहसंबंधी का पता लगाता है ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम:

सबसे महत्वपूर्ण कदम रडे के साथ सीरम उपचार को निष्क्रिय करने के लिए विशिष्ट अवरोधकों और वायरस के हा करने के लिए बाध्यकारी शामिल हैं । एक और महत्वपूर्ण कदम के लिए एरिथ्रोसाइट्स के hemolysis के लिए नियंत्रण के रूप में वे समय के साथ उंर है ।

भविष्य अनुप्रयोगों:

प्रोटोकॉल hemagglutination क्षमता के साथ अन्य वायरस के लिए उपयोग किया जा सकता है । हालांकि हम केवल मानव सीरा नमूनों पर परिणाम यहां दिखाया गया है, परख भी माउस सीरा में या सेल संस्कृति supernatant में उत्तेजित बी कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी titers मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (नहीं दिखाया डेटा) । सारांश में, हाय टीका प्रेरित एंटीबॉडी titers के एक तेजी से और प्रतिलिपि आकलन की अनुमति देता है ।

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Disclosures

A.E. "SNSF Ambizione स्कोर" कार्यक्रम (PZ00P3_154709) से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" बेसल के विश्वविद्यालय, Stiftungsinfektionskrankheiten बेसल, और Bangeter Rhyner Stiftung. लालकृष्ण चराई, ऑस्ट्रिया के तकनीकी विश्वविद्यालय के अनुदान से समर्थन किया था । जीएल प्रणाली जीवविज्ञान कार्यक्रम में SystemsX.ch पहल की एक iPhD फैलोशिप द्वारा समर्थन स्वीकार करता है (9वें कॉल) ।

Acknowledgments

कोई.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs Integra 4312
8-well PCR tubes Brand GMBH 781332 For serum aliquots
96-well microtiter plate, U-shaped TPP 92097 For HI assay when using mammalian RBCs
96-well microtiter plate, V-shaped Corning Costar 3897 For HI assay when using avian RBCs
Aqua ad iniect. Steril Bichsel AG 1000004 For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions
Chicken RBC (10%) Cedarlane CLC8800 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution
Cholera filtrate Sigma-Aldrich C8772 Used as receptor destroying enzyme (RDE)
Dulbecco's PBS Sigma-Aldrich D8537 For diluting the serum samples, RBCs and antigens
Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl Sigma-Aldrich Z683949
Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl Sigma-Aldrich Z683930
Guinea Pig RBC (10%) Cedarlane CLC1800 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution
Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum  NIBSC 14/134  Used as positive control at the HI assay
Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum  NIBSC 14/272 Used as positive control at the HI assay
Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum  NIBSC 13/178 Used as positive control at the HI assay
Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum  NIBSC 13/254  Used as positive control at the HI assay
Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum  NIBSC 13/182 Used as positive control at the HI assay
Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)  NIBSC 12/168 Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)  virus (ca. 46µgHA/ml)
Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) NIBSC 14/254 Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml)
Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) NIBSC 13/112 Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml)
Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 NIBSC 13/234 Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml)
Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 NIBSC 13/134 Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml)
Serum-Tubes S-Monovette, Sardstedt 01.1601.100 For serum extraction with clotting activator
Single Donor Human RBC, Type 0 Innovative Research IPLA-WB3  Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%)
Turkey RBC (10%) Cedarlane CLC1180 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco

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References

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चिकित्सा १३० अंक Hemagglutination अवरोध परख स्क्रीनिंग titer एंटीबॉडी इंफ्लूएंजा ए इंफ्लूएंजा बी H1N1 H3N2 क्रॉस-जेट अनुमापन प्रतिजन
एक अनुकूलित Hemagglutination अवरोध (हाय) परख के लिए इंफ्लूएंजा यों तो विशिष्ट एंटीबॉडी Titers
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Kaufmann, L., Syedbasha, M., Vogt,… More

Kaufmann, L., Syedbasha, M., Vogt, D., Hollenstein, Y., Hartmann, J., Linnik, J. E., Egli, A. An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers. J. Vis. Exp. (130), e55833, doi:10.3791/55833 (2017).

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