Summary
示されたプロトコルでは、インフルエンザ ワクチン接種者の血清サンプルからインフルエンザ特異抗体価を定量化する赤血球凝集抑制法を実行する方法について説明します。最初のアッセイは、凝集によって最適なウイルス抗原濃度を決定します。2 番目の分析は, 血球凝集抑制によるインフルエンザ特異抗体価を定量化します。
Abstract
抗体は、インフルエンザや他の病原体に対する血清学的保護のサロゲート マーカーとして使用されます。ワクチンによる免疫を理解する前と後のワクチン接種の抗体の生産の詳細な知識が必要です。この資料では、特定のインフルエンザ抗体価を決定するための信頼性の高いポイントによってプロトコルについて説明します。最初のプロトコルでは、赤血球凝集は、2 番目のプロトコル (赤血球凝集アッセイ、HA アッセイ) その後の使用のための集中を標準化するのに必要な抗原量を指定する方法について説明します。2 番目のプロトコルでは、ひと血清・細胞培養上清 (赤血球凝集抑制法、HI 試験) のシリアル希薄を使用して異なるウイルス株インフルエンザ特異抗体価の定量について説明します。
応用例として 3 価不活化インフルエンザ ワクチンを受けた健康コホートの抗体応答を示す.また、インフルエンザ ウイルスと交差反応を示す、さまざまな種類の動物の赤い血球 (赤血球) を使用して、交差反応を最小限に抑える方法を説明しました。議論は、長所と短所提示法の特定のインフルエンザ抗体価の定量免疫のワクチン関連の理解を改善する方法を強調表示します。
Introduction
インフルエンザ ウイルスによる感染症は、かなりの罹患率、死亡率と高い医療費1,2,3,4に関連付けられます。特に、高齢者、新生児、妊婦、慢性疾患患者より重篤な臨床転帰のリスクです。したがって、循環のインフルエンザ ウイルスに対するワクチン接種ハイリスク集団のこれらの疾患の負担を減少する主な尺度であります。予防接種、例えば、保護しきい値を超えるインフルエンザ特異的抗体の後個々 の免疫応答の増加人口内のウイルスの伝達の可能性感染症と一般的に個々 のリスクが軽減されます。5. ワクチン誘発される体液性免疫応答の別の集団と様々 な年齢グループ間で詳細な理解は重要な臨床質問6,7、8に答えるための重要な要素,9、よう: 一部の高齢患者はなぜ感染症前のワクチン接種にもかかわらずを持って?「良い」と「十分な」ワクチン誘発される保護とは何ですか。どのくらいの頻度ワクチンは保護抗体に到達する免疫抑制患者に適用されるべきですか。最も効果的な投与量とは何ですか。ワクチン接種後の抗体価と新規アジュバントの影響は?ワクチンの抗体産生の測定は、これらの重要な質問に答えるし、予防接種の成果を向上させるに役立つことがあります。
ウイルス特異抗体価の定量は、様々 な免疫学的方法で実行できます。これには、固相10や中和の試金13ビーズに基づく ELISA11試金こんにちは試金12が含まれます。ELISA 法は、様々 な抗原に対する血清の比較的大量のスクリーニングを許可します。また、病原体特定免疫グロブリン (Ig) M および IgG 個別に検討します。抗原、例えば、直線のアミノ酸シーケンスまたはウイルスのような粒子の特性は、抗体の結合に影響を与える可能性があります潜在的なエピトープのスペクトラムは非常に広いと抗体かどうかに関する情報を提供しませんレスポンスは、機能的関連性です。
対照的に、中和法は、機能的細胞の感染を阻害する抗体の可能性を決定し、したがって潜在的な中和が反映されます。ただし、このメソッドは非常に労働集約的、特定の培養細胞し、ウイルスをライブとしたがって、それは時間のかかる、高価なと特別な装置を必要とする必要があります。
この資料は、特定のインフルエンザ抗体価を定量化するこんにちは世界保健機構 WHO ベース プロトコル12ステップバイ ステップの説明します。赤血球凝集は赤血球の凝集につながるいくつかのウイルスの特徴的な効果です。患者血清をこの効果の抑制には、中和効果を反映する抑制性抗体濃度測定が可能します。
同時に複数のサンプルのより効率的な処理と必要な時間を短縮できるように WHO プロトコルのワークフローを変更しました。最初のプロトコルでは、特定のインフルエンザ抗原の凝集反応電位の決定について説明します。そうすることで、正しいインフルエンザ抗原濃度は 2 番目のプロトコルの決定されます。この部分は、血液の各バッチと同様、すべての新しいウイルスの抗原で繰り返す必要があります。
2 番目のプロトコルでは、特定のインフルエンザ抗体価の定量について説明します。示されたプロトコルはしかしインフルエンザ ウイルスとひと血清サンプルの調査用に最適化された、それはも刺激免疫細胞、例えば、ウイルス特異 B 細胞からマウス血清や細胞培養上清中の適用することができます。結果は、絶対測定抗体として算定できます。多くのワクチン研究の幾何平均抗体価と 95% 信頼区間はそれぞれの特定の人口のため表示されます。解釈、seroprotection またはセロコン バージョンは、特定のウイルス集団の感受性を記述するよく使用されます。Seroprotection は、4 倍以上の抗体価を高める 2 つの時間ポイント (ほとんどの一般的予防接種前および 30 日後予防接種を使用) の間の seroprotective 抗体の達成と、≥1:40、および陽転の力価として定義されます。
両方のプロトコルが使いやすいし、彼らの研究の質問の広い範囲に適応することができます。特に、確実かつ迅速を決定する使用できます赤血球凝集反応、麻疹や polyomaviruses、流行性耳下腺炎、風疹14,15,16 などの容量を持つ他の各種のウイルスに対する抗体価.
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Protocol
研究プロトコルはローカル倫理審査委員会 (www.EKNZ.ch) によって承認された、すべての参加者から書面によるインフォームド コンセントを得た。
1. 血清コレクション
- 興味の時点で人間から血清サンプルを収集します。この研究のため、ワクチン接種後 0 (インフルエンザの予防接種の時間)、+7、+30、+60、+180 日で血清を集めました。
- 血清を得るためには、部屋の温度 (20-25 ° C) で 10 分の 1,200 x g でサンプル チューブを遠心します。
メモ: 4 ° c と 24 h 以内、非遠心血液サンプルを保存する必要があります。 - 因数に異なる管 (低温瓶) と使用するまで-80 ° C で凍結血清。
- ポイントを含むすべての時間 - 患者内での変動を減らすために一人の batch-wise、その後の試金を実行します。
2. 抗原の準備
注意: 5 つの異なる抗原を使用 (材料の表を参照してください)。バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 研究室では、抗原を準備します。
- 製造元の指示に従って進む前に室温で 5 分間の最小値のために立つ溶存抗原が 1.0 mL の蒸留水と 1 つの凍結乾燥インフルエンザ抗原アンプルの合計内容を再構成でき。
- 分注 1.5 mL に抗原ソリューションはチューブし、さらに使用まで-80 ° C で凍結します。
3. コレラ濾液の準備
注: コレラの濾液は、WHO プロトコル12によると酵素 (RDE) を破壊する受容体として使用されます。これは血清アッセイ17と邪魔になるから生得的な阻害剤を削除します。
- 製造元の指示に従って凍結乾燥 RDE を再構成します。
- さらに使用するまで 4 ° C で 15 mL チューブに RDE ソリューションを格納します。
4 HA の試金
注:、こんにちの試金、いくつかのプレートの間で比較できるように、同じウイルス粒子量は各プレートの使用する必要があります。赤血球凝集反応に必要なウイルス粒子を定量化に HA の試金 (HA 滴定とも呼ばれます) は、HA 単位に記録されます。赤血球凝集反応の「単位」HA の滴定で使用される方法に依存して運用ユニットし、ウイルスの絶対的な量の測定ではないです。したがって、HA ユニットは、標準化された赤血球懸濁液の等量に凝集するために必要なウイルス量として定義されます。WHO によるとこんにちは試金のための標準量は 4 HA 単位 25 μ L です。HA アッセイの原理図は、図 1を参照してください。
図 1: 凝集性と赤血球凝集抑制の原則です。ウイルスや抗体 (左列)、なしのネガティブ コントロール状況で凝集が発生せず、赤血球は、インフルエンザ ウイルス (中欄) の存在下で hemagglutinate。しかし、インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンがウイルス特異的抗体ない凝集によってブロックされた場合 (右側の列) に発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
注: 使用される赤血球 (表 1) アッセイにおけるインフルエンザ ウイルスの型に依存しています。さらに、96 ウェル マイクロタイター プレートのさまざまな種類の非分離細胞の出現と同様、インキュベーション時間異なります (表 2)。
| インフルエンザ抗原 | A/カリフォルニア/7/09 (H1N1) | A/スイス/9715293/2013 (H3N2) | A/テキサス/50/2012 (H3N2) | B/ブリスベン/60/08 | B/マサチューセッツ/02/2012 | ||
| RBC 種 | チキン | モルモット | モルモット | トルコ | トルコ | ||
表 1: インフルエンザ抗原と対応する種赤血球の。よると製造元の指示 (NIBSC)。
| RBC 種 | チキン | トルコ | モルモット | ヒト型 O |
| 赤血球 (v/v) 濃度 | 0.75% | 0.75% | 1% | 1% |
| マイクロ プレートの種類 | V 底 | V 底 | U 底 | U 底 |
| 培養時間、RT | 30 分 | 30 分 | 1 時間 | 1 時間 |
| 非凝集のセルの外観 | ボタン * | ボタン * | ヘイロー | ヘイロー |
表 2: 赤血球の種を条件アッセイします。WHO のプロトコルによると。(* 傾いているときに流れる)。
-
赤血球懸濁液の準備
- 赤血球在庫懸濁液を希釈 (10%、v/v; O 人間型を除く) (材料の表を参照してください) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) それぞれ適切な 0.75% と 1%、鳥類と哺乳類の赤血球濃度を確認します。
図 2: HA アッセイのデザインをプレートします。重複で HA の滴定を行います。コントロールの行に抗原が追加されませんでした。また最高の抗原濃度の定量のための図 4を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
-
96 ウェル マイクロタイター プレートの準備
注: プレート デザインの概要については図 2を参照してください。- 96 ウェル マイクロタイター プレートの使用される各行の 1 に 12 の井戸に 25 μ L の PBS を追加するには、マルチ チャンネル ピペット (図 2) を使用します。鶏と七面鳥のような鳥の赤血球を操作するときは、V 字マイクロタイター プレートを使用します。哺乳類赤血球、モルモットやヒト型 O (表 2) を操作するときは、U 字マイクロタイター プレートを使用します。
- 重複整理される抗原行の最初の井戸にインフルエンザ抗原の 25 μ L を追加します。コントロールの行には、抗原は追加されません。コントロールの行ない凝集効果を示す、ネガティブ コントロール (図 2) となります。
- シリアル 2 倍希釈を実行するには、マルチ チャンネル ピペットを使用して連続井戸に抗原行の最初の井戸から 25 μ L を転送します。各希釈段階をミックスするには、上下にゆっくり 10 回ピペッティングします。
- 最後のウェルスの最終的な 25 μ L を破棄します。
- 使用される各行の 1 に 12 の井戸に 25 μ L の PBS を追加するには、50 μ L/ウェルの容量に達するためにマルチ チャンネル ピペットを使用します。
- 各マルチ チャンネル ピペットを使用して、よく使用する赤血球懸濁液 50 μ L を追加します。
- タップ プレートを慎重に 10 回四方を混在させることにします。
- 蓋付きプレートをカバーし、RBC 種使用 (表 2参照) に応じて適切な時間室温で孵化させなさい。抱卵中板を移動しないでください。
図 3: 鳥および哺乳類の赤血球の凝集パターン。V 字マイクロタイター プレートは、鳥の赤血球を操作するときに使用されます。傾斜プレート位置の読み出しを実行し、非凝集赤血球が涙のような形を形成して実行を開始します。U 字のマイクロタイター プレートは、哺乳類の赤血球を操作するときに使用されます。読み出しが非傾斜の位置に実行され、非凝集赤血球を形成する小さなハロー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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版を読む
注: 異なる形マイクロタイター井戸 (図 3) ため哺乳類赤血球と比較して鳥の赤血球を使用する場合、読み出しは若干異なります。- 鳥類の赤血球の読み出し
- プレートを 25 の 90 ° 傾け s。
注: は、凝集パターン (完全に付属、一部付属と非凝集) のすべての 3 種類が傾かないときボタンとして表示されるため鳥パターンの分化の重要なプレートを傾斜です。 - プレートの傾斜の位置、96 ウェル プレートの印刷方式の中、すぐに結果をマークします。鳥類の赤血球の凝集パターンは、図 3のとおりです。
- プレートを 25 の 90 ° 傾け s。
- 哺乳類の赤血球の読み出し
- プレート (ベンチの水平位置) で傾くことなし 96 ウェル プレートの印刷方式の結果をマークします。
注: 赤血球凝集が発生すると、付属の細胞に定着しない下、井戸の底でヘイローのような非凝集の細胞に対し。部分的に付属のセルのハローは薄くより大きい直径 (図 3)。
- プレート (ベンチの水平位置) で傾くことなし 96 ウェル プレートの印刷方式の結果をマークします。
- 4 HA 単位の決定。
注: HA 滴定の終点は最後も完全な凝集が発生します。これもウイルスの 1 HA 単位が含まれます。抗原の 2 倍希釈液、HA 滴定終点の前の 2 つの井戸はよくウイルス (図 4) の 4 HA 単位を含む。
- 鳥類の赤血球の読み出し
図 4: 4 HA 単位の力価を決定する鳥の赤血球と HA の滴定の読み出し。赤血球凝集アッセイ (抗原滴定試金) 赤血球凝集反応に必要な最適な抗原量を測定します。完全な凝集が発生した最後の井戸、HA 滴定エンドポイントであり、1 HA ユニットが含まれています。抗原、HA 滴定終点の前の 2 つの井戸の 2 倍希釈のため、力価は 4 HA 単位に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
5. こんにちアッセイ
注: プロトコルの作業フローは、同時に複数のサンプルのより効率的な処理を許可する、pcr 法を用いたチューブ ストライプと熱サイクラー (下記参照) に最適化されています。
-
血清試料の調製
注: は、BSL 2 研究室で血清を準備します。- 一人一人の各時点の冷凍血清サンプルを解凍 (ステップ 1.2 参照) 室温で。
- PCR チューブ ストリップ (1 つのストリップでの 10 管) の管に各解凍血清サンプルの 10 μ L の因数を追加します。
注: PCR チューブ ストリップを使用しての大きな利点は、こんにちの試金; の次の手順でマルチ チャンネル ピペットを使用できることこれは大量の血清サンプルをテスト時に、異なるウイルス株に対する抗体価の同じサンプルの測定を繰り返し実行するときに多くの時間を節約できます。 - 使用するまで-80 ° C で PCR チューブ ストリップに検体の血清サンプルを格納します。
- 1 日こんにちは試金の実行前に、室温で関心の血清サンプル因数を解凍します。
- 空の PCR チューブに適切な抗血清の 10 μ L を追加します。
注: 肯定的な制御として、特定のウイルスに対する抗血清は使用されるウイルスを一致しなければなりません。肯定的な制御により複数の板プレートのパフォーマンスの標準化。 - マルチ チャンネル ピペットを使用して各血清因数と抗血清・血清の 1 ボリュームにコレラ濾液の 3 巻) コレラ濾液ソリューションの 30 μ L を追加します。
- PCR チューブ PCR 96 ウェル ラックまたは空のヒント ボックスと 5 の渦をおいて s。
- 一晩で 37 ° C 熱 cycler を使用してサンプルをインキュベートします。
- 熱 cycler を使用してコレラの濾液を不活化する 30 分の 56 ° C でサンプルをインキュベートします。
注: 熱 cycler によってこのステップはプロセスをさらに自動化するプログラムできます。 - PCR チューブ PCR 96 ウェル ラックまたは空のヒント ボックスと 5 の渦をおいて s。
- こんにちは試金のための使用するまで冷蔵庫で 4 ° C でサンプルを格納します。
図 5: プレート デザインとこんにちはアッセイのワークフロー 。一皿に二人の 5 つの時間ポイントを測定できます。HI 抗体価は 8 から 1,024 を範囲します。肯定的な制御使用される抗原の抗血清と抗原希釈 4 HA 単位に等しいかどうかをチェックする背部滴定を行った。2 個別ワクチン接種者の血清サンプルのシリアル希薄化が表示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
-
こんにちはアッセイ
注: こんにちはアッセイの原理図は、図 1を参照してください。ウイルスによって赤血球の種、(表 1) 試金のために使用されます。96 ウェル プレートの様々 な種類で使用する赤血球の種と非分離細胞の出現と同様、インキュベーション時間が異なります (表 2)。こんにちは試金のためウイルスや抗原の 4 HA 単位はサンプルの 2 倍希釈系列に追加されます。-
抗原溶液の調製
- 96 ウェルのプレート使用数に応じて抗原溶液の体積を計算 (96 ウェル プレートあたりも × 96 = 2,400 μ L 抗原あたり 25 μ L 抗原 100 μ L プレート マルチ チャンネル ピペット; のための貯蔵の使用のために余分な/を追加合計 antige 2.5 mLプレートごと n)。
注: たとえば場合 100 の血清サンプルを測定、10 皿が必要 (10 サンプル プレートごと): 合計で必要な抗原溶液 2.5 mL × 10 = 25 mL。 - PBS を使用する計算された容積の 4 HA 単位の適切な希釈を準備します。
注: HA の試金のため 4 HA 単位が決定されます。抗原の適量 4 HA 単位に対応する抗体によって計算されたボリュームを分割します。たとえば、1/64 の希薄化に対応する 4 HA 単位、15,000 が必要抗原溶液の μ L が必要: 15,000/64 = 234.4 溶存凍結乾燥インフルエンザ抗原の μ L を追加。
- 96 ウェルのプレート使用数に応じて抗原溶液の体積を計算 (96 ウェル プレートあたりも × 96 = 2,400 μ L 抗原あたり 25 μ L 抗原 100 μ L プレート マルチ チャンネル ピペット; のための貯蔵の使用のために余分な/を追加合計 antige 2.5 mLプレートごと n)。
-
赤血球懸濁液の準備
- 96 ウェル マイクロタイター プレート使用数に応じて赤血球懸濁液の体積を計算 (よく × 96 = 4,800 μ L 赤血球懸濁液 96 ウェル プレートあたりあたり 50 μ L の赤血球懸濁液 200 μ L プレート マルチ チャンネル ピペット用の貯水池の使用のために余分な/を追加).
- 赤血球在庫懸濁液を希釈 (通常 10%、v/v; O 人間型を除く) 適切な 0.75% と 1%、鳥類と哺乳類の赤血球濃度をそれぞれする PBS の。
-
96 ウェル マイクロタイター プレートの準備
- (サンプル ID、肯定的な制御、および背部滴定) 96 ウェル マイクロタイター プレートにラベルを付けます。図5 プレートの向きをよく確認ください。
- 25 μ L の PBS を加える「滴定を戻る」行 (図 5、12番目の行) 最初井戸中にを除くすべてのよくマルチ チャンネル ピペットを使用しますします。
注: 使用される抗原希釈 4 HA 単位に等しいかどうかをチェックする背部滴定を行った。4 HA 単位の抗原抗体価を示す赤血球凝集が発生します 4 番目ではなく「戻る滴定」の行の最初の 3 つの井戸でも。 - 「滴定を戻る」行 (12番目の行) 最初井戸に (5.2.1 で説明) 準備された抗原溶液 50 μ L を追加します。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、各プレートの行 1 に 10 の最初の井戸に RDE 治療血清サンプルの 25 μ L を追加します。
- 肯定的な制御として 11番目の行の最初の井戸の中に適切な抗血清を 25 μ l 添加を追加します。
- シリアル 2 倍希釈を実行するには、マルチ チャンネル ピペットを使用して連続井戸に (1-12) の各行の最初の井戸から 25 μ L を転送します。各希釈段階の上下に 10 〜 15 回をピペッティングで混ぜます。サンプルごとの各希釈段階の同じヒントを使用できます。
- 最後のウェルスの最終的な 25 μ L を破棄します。
- 抗原溶液の 25 μ L を追加するには、行 1 に 11 (血清と抗血清) の各ウェルにマルチ チャンネル ピペットを使用します。彼らは井戸を触れないでください場合、同じヒントを使用できます。
- 「滴定を戻る」行 (12番目の行) の各ウェルに抗原ではなく 25 μ L の PBS を追加します。
- タップ プレートを慎重に 10 回四方を混在させることにします。
- 蓋付きプレートをカバーし、30 分間室温でインキュベートします。抱卵中板を移動しないでください。
- 赤血球懸濁液 50 μ L を各ウェルに追加します。
- プレート慎重に 10 倍をタップ 4 四方をミックスします。
- 蓋付きプレートをカバーし、RBC 種使用 (表 2参照) に応じて適切な時間室温で孵化させなさい。抱卵中板を移動しないでください。
-
版を読む
注: HI 抗体価は、(反) 赤血球凝集を完全に阻害する血清の最後の希釈の逆数です。それは、RDE 治療血清 1:4 とシリアル希釈段階後に希釈された既に、最初の井戸で血清希釈 1:8、8 の HI 抗体価に対応するを検討することが重要です。- 鳥類の赤血球の読み出し
- プレートを 25 の 90 ° 傾け s。
注: は、凝集パターン (完全に付属、一部付属と非凝集) のすべての 3 種類が傾かないときボタンとして表示されるため鳥パターンの分化の重要なプレートを傾斜です。 - プレートの傾斜の位置、96 ウェル プレートの印刷方式の中、すぐに結果をマークします。鳥類の赤血球の凝集パターンは、図 3のとおりです。
- プレートを 25 の 90 ° 傾け s。
- 哺乳類の赤血球の読み出し
- プレートを傾けることがなく 96 ウェル プレートの印刷方式の結果をマークします。
注: 赤血球凝集が発生すると、付属の細胞我慢しないでください井戸の底でヘイローのような非凝集の細胞に対し。部分的に付属のセルのハローは薄くより大きい直径 (図 3)。 - 各サンプルの HI を決定し、コンピューター ベースの表 (図 6) に転送
- 注: 低力価として部分的に付属の井戸を求めた。たとえば、血清サンプルを完全に阻害も 4 まで赤血球凝集 (希釈 1: 64)、5thも (1:128 希釈) は部分的に、上水、HI 抗体価は、最終的な分析 (図 6、低価 64 に設定されています。4番目の行)。
- プレートを傾けることがなく 96 ウェル プレートの印刷方式の結果をマークします。
- 鳥類の赤血球の読み出し
-
抗原溶液の調製
図 6: 鳥の赤血球とこんにちはアッセイの読み出し。前と後のワクチン接種によるインフルエンザ抗体応答は、こんにちの試金によって決まります。この例では、1 つ人は 2 人よりも高い HI 抗体を持っています。両方の人はワクチン接種の後抗体応答を表示します。ワクチン接種後 180 日間両方の人の抗体価は再び減少しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Representative Results
前と後のワクチン接種による抗体応答をインフルエンザ A 型 H3N2
ワクチンによる抗体は 2014 年前インフルエンザ A/H1N1/カリフォルニア/2009、A/H3N2/テキサス/2012 B/マサチューセッツ/02/2012 を含む三価サブユニットの不活化インフルエンザ ワクチンを受けた 26 の健康なボランティアで評価された/2015 年のインフルエンザ シーズン。2 ワクチン接種者の代表例を図 6に示します。興味深いことに、その特定のインフルエンザ シーズン中にテキサス/2012 A/h3n2 型循環されなかったとシーズンが多少異なるウイルス株に含まれて代わりに: A、h3n2 型、スイス連邦共和国、2013。A、H3N2、テキサス州、2012 と 2013 年 A 月 H3N2/スイス連邦共和国のウイルスのヘマグルチニン 97% 順序のアイデンティティを示すし、は異なる唯一の 11 アミノ酸 (表 4参照)、その位置は図 7で強調表示されます。
図 7: A/h3n2 型インフルエンザのヘマグルチニン比較します。A/テキサス/50/2012 と A/スイス/9715293/2013 株ウイルスのヘマグルチニンを比較しました。インフルエンザ A/ビクトリア/361/201118、テキサスひずみと 95% 98% 順序のアイデンティティを表わす非常に同じようなヘマグルチニンの結晶構造を用いてこれらの系統の血球凝集素結晶構造がないのでスイス連邦共和国の歪みを持つシーケンス id。テキサス州、スイスの系統が異なるアミノ酸位置が強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
A、h3n2 型、スイス連邦共和国、2013 とテキサス/2012 A/h3n2 型ウイルス株の交差反応性の免疫反応を観察した.こんにちは価インフルエンザ A/H3N2/スイス/2013 に対して著しく低かった幾何平均抗体価で誘導される seroprotection (図 8 a) と比較してインフルエンザ A 型 H3N2 2012//テキサス/(図 8 b)。
図 8: 健康なドナーの幾何平均抗体価。幾何平均-抗体 (GMTs) 25 健常者前と後の予防接種の 2 つの異なる抗原を使用して決定されます。A/H3N2/スイス/2013 (A) および A/H3N2/テキサス/2012 (B) の平均抗体価が表示されます。ワクチン接種による免疫応答は、予防接種 (d0) の前に GMTs と比較して (d7 d60)、ワクチン接種後抗体を増加として観察できます。接種後 180 日間、GMTs は再び減少します。注記のうち、唯一 A/H3N2/テキサス/2012 (ワクチンが) 保護抗体価に達する。バーは幾何平均抗体価を示し、ひげが 95% 信頼区間を示します。破線は、seroprotection のしきい値を示します。Seroprotected 人の % (力価 > 1:40) がグラフで表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
予防接種後テキサス/2012 A/h3n2 型に対する抗体価はほとんどの科目で増加A、h3n2 型、スイス連邦共和国、2013 株ワクチンに存在していなかった、A、h3n2 型、スイス連邦共和国、2013 抗体価と同様にいくつかの科目に増加しました。図 9は、線形回帰モデルの 0.745 の R2すべての時間ポイントの両方の抗体価との相関関係を示しています。1 つと同様、2013 年 A 月 H3N2/スイス連邦共和国に対して抗体反応の誘導だった以下の強力です。
図 9: A/h3n2 型インフルエンザ間の交差反応します。すべての個人と時間のポイントの A/H3N2/テキサス抗体は対応する A/H3N2/スイス抗体に対してプロットされます。線形回帰モデルの 0.745 R2を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
使用血液の種類をに基づいて潜在的な凝集
ウイルスのヘマグルチニンは、赤血球を hemagglutinate に別の種依存性を示しています。この種に依存した効果には、赤血球凝集抑制試験も影響します。測定抗ウイルス抗体の特異性を改善するために行った 5 つのウイルス抗原を赤血球の最高の適している型 (A と A/H3N2/テキサス/2012 年インフルエンザ A/H1N1/カリフォルニア/2009 B/マサチューセッツ/02/2012 インフルエンザ B/ブリスベン/60/2008/H3N2/Switzerland/2013) 最大の凝集も最低の交差反応性を達成するために。生物学的標準とコントロール (NIBSC) 各抗原に対するこれらのアッセイを実行する所から陽性コントロール血清使いました。
インフルエンザ b、B/マサチューセッツ/02/2012 による抗体応答が B/ブリスベン/60/2008 に対して保護を提供しないことを観察すること。対照的に、B/ブリスベン/60/2008 に対する抗体は、異なる赤血球 (表 3参照) で 4 倍低価で B/マサチューセッツ/02/2012 に対して交差反応性を示した。関心のモルモット血でしたいない正しく hemagglutinate インフルエンザ * トルコ血前述 A/H3N2/テキサスから離れて相対低交差反応性を hemagglutinate する可能性と高い抗体価を示すに最善を尽くしたと/スイス連邦共和国の系統。
| トルコ | モルモット | チキン | ヒト型 O | |
| B/ブリスベン | 1024 | - | 1024 | 1024 |
| B/マサチューセッツ州 | 1024 | 384 | 768 | 1024 |
| A/H3N2/スイス | 1024 | 1024 | - | 1024 |
| A/H3N2/テキサス | 1024 | 1024 | 512 | 1024 |
| A/H1N1/カリフォルニア | 1024 | 1024 | 768 | 768 |
テーブル 3:肯定的な制御異なった種類を渡ってそれぞれインフルエンザ HA 抗原に対する抗体です。
| 違います | A/H3N2/テキサス/2012 ひずみ | A、h3n2 型、スイス連邦共和国、2013 ひずみ | 位置 |
| 1 | アスパラギン (N) | アラニン (A) | 128 |
| 2 | アラニン (A) | セリン (S) | 138 |
| 3 | イソロイシン (I) | Arginine (R) | 140 |
| 4 | Arginine (R) | グリシン (G) | 142 |
| 5 | アスパラギン (N) | セリン (S) | 145 |
| 6 | フェニルアラニン (F) | セリン (S) | 159 |
| 7 | グリシン (G) | バリン (V) | 186 |
| 8 | プロリン (P) | セリン (S) | 198 |
| 9 | セリン (S) | フェニルアラニン (F) | 219 |
| 10 | アスパラギン (N) | アスパラギン酸 (D) | 225 |
| 11 * | リジン (K) | Arginine (R) | 326 |
| * ヘマグルチニンは残渣 325 で刈り取らため図 8 に示した結晶構造の表示されません。 | |||
表 4: A/H3N2/テキサス/2012 と 2013 年 A 月 H3N2/スイス系統ヘマグルチニンのアミノ酸のリスト
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Discussion
前と後のワクチン接種インフルエンザ ウイルス抗体価の定量化は、ワクチン研究に必要な重要なツールです。Seroprotection などのウイルス感染症に対する保護のサロゲートのメジャーに基づいて (> 1:40) またはセロコン バージョン (力価の 4 倍増)、予防接種戦略をすることができます最適化された9。指定されたプロトコルを使用して判断できます: (i) (ii) 興味のウイルス抗体価と特定のウイルスの赤血球凝集可能性。
変更とトラブルシューティング:
このプロトコルは、WHO 標準12に基づいています。(手順 5. を参照) 血清の準備のため PCR チューブ ストリップを使用して、プロトコルを変更しました。この変更は、作業負荷を大幅に削減し、アッセイのスループットを向上させる助けた。さらに、我々 は効果的なコスト超過が抗原の滴定手順で 4 分の 1 で抗原量を削減しました。サンプル量が限られている場合は特に役立ちます RDE の治療のため血清 (10 μ L) のより低い量を使用できます (例、マウス血清)。背部滴定および肯定的な制御は、適切な内部統制として機能し、赤血球の老化を監視する抗体測定プレートに含まれます。
さらに、赤血球血栓良いビジュアル読み出しのための最適なサイズを設定するのに WHO 標準12のそれらより別の赤血球濃度を使用しました。これを保証するには、測定前に赤血球濃度をチェックをお勧めします。とはいえ、この部分を最適化プロトコル我々 していない、OD や細胞数と吸光度測定などの方法を使用できます。
場合は、RDE は完全に不活性化されず、赤血球は凝集反応を室温で測定する場合 desialylated と逆ハ正井戸とすることができます。我々 は決してこの問題を観察がこの場合、私達は RDE 活性は 4 ° C で有意に低いのでこんにちは 4 ° c を実行する提案します。ただし、4 ° C でこんにちは試金の実行は遅くなります。
技術の制限:
こんにちは試金のいくつかの重要な側面は、次の点: 興味深いことに、血球凝集反応は赤血球 (例えば、トルコまたはモルモット赤血球) の特定の種類に強く依存します。血の最適な型は、特定のウイルス株が評価され、分析を通じて使用される同種血の前にテスト必要があります。ウイルス間の交差反応性の誘導は、わずかに新しいウイルス19,20の場合免疫学的利点を生成可能性があります、低特異性による診断の視点からいくつかの問題があります。したがって、類似のウイルス間の交差反応する必要があります慎重に対処して研究については後述します。赤血球を選択すると特定の種から、交差反応性の量をやや下げることができます。
既存のメソッドの意義:
こんにちは、高い再現性と信頼性の高い結果を提供する老舗のゴールド スタンダード方法です。こんにち HA 茎ループにバインドし、それにより中和と相関する抗体を検出するだけに対し、ELISA などの手法は非中和抗体を検出があります。
プロトコルの中で重要なステップ:
最も重要な手順は、RDE 非特異的阻害剤とバインディングを不活化すると血清治療ウイルスの ha。もう一つの重要なステップです、赤血球の溶血反応の制御時間をかけて彼らの年齢として。
将来のアプリケーション:
プロトコルは潜在的な凝集反応で他のウイルスの使用可能性があります。結果を示されて、ひと血清中のサンプルをここに我々 がのみ、刺激 B 細胞 (データは示されていない) と培養上清中の細胞培養、マウス血清中の抗体価を測定するアッセイを使えます。要約すると、こんにちは、ワクチンによる抗体の迅速かつ再現性のある評価をことができます。
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Disclosures
測光に支えられ「SNSF Ambizione スコア」プログラム (PZ00P3_154709) から助成金研究「Forschungsfond、青少年 strategischer Projekte」Bangeter Rhyner 財団、Stiftungsinfektionskrankheiten バーゼル、バーゼルの大学。L.K. は、オーストリアのグラーツ大学の助成金によって支えられました。J. l. は、システム生物学プログラム (9thコール) で SystemsX.ch イニシアチブ iPhD 交わりによってサポートを確認します。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
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