Summary
Protokollerne præsenteres beskriver, hvordan du udfører en hemagglutination hæmning assay for at kvantificere influenza-specifikke antistof titers fra serumprøver influenza vaccine modtagere. Den første analyse bestemmer optimal virusantigen koncentrationer af hemagglutination. Den anden assay kvantificerer influenza-specifikke antistof titers af hemagglutination hæmning.
Abstract
Antistof titers er almindeligt anvendt som surrogat markører for serologisk beskyttelse mod influenza og andre patogener. Detaljeret kendskab til antistof produktion før og efter vaccination er nødvendig at forstå vaccine-induceret immunitet. I denne artikel beskrives en pålidelig punkt for punkt protokol for at bestemme influenza-specifikke antistof titers. Den første protokol beskriver en metode til at angive de antigen beløb kræves til hemagglutination, som standardiserer koncentrationer til efterfølgende brug i den anden protokol (hemagglutination assay, HA assay). Den anden protokol beskriver kvantificering af influenza-specifikke antistof titers mod forskellige viral stammer ved hjælp af en seriel fortynding af human serum eller celle kultur-analysere (hemagglutination hæmning assay, HI assay).
Anvendes eksempelvis viser vi antistofrespons af en sund kohorte, der modtog en trivalent inaktiverede influenzavaccine. Derudover krydsreaktivitet mellem de forskellige influenzavira er vist og metoder til at minimere krydsreaktivitet ved hjælp af forskellige typer af dyr røde blodlegemer (RBC) er forklaret. Diskussionen fremhæver fordele og ulemper ved de præsenteres assays og hvordan bestemmelse af influenza-specifikke antistof titers kan forbedre forståelsen af vaccine-relaterede immunitet.
Introduction
Infektion med influenza-virus er forbundet med betydelig morbiditet, mortalitet og høj sundhedspleje omkostninger1,2,3,4. Især er ældre, nyfødte, gravide kvinder og patienter med kronisk sygdom i risiko for mere alvorlige kliniske resultater. Vaccination mod influenza virusstammer i omløb er derfor den primære mål at mindske sygdomsbyrden i disse høj-risiko populationer. Stigningen i de enkelte immunrespons efter vaccination, fx, influenza-specifikke antistoffer beskyttende tærskel reducerer enkelte risikoen for infektion og i almindelighed sandsynligheden for viral transmission inden for en befolkning 5. en detaljeret forståelse af vaccine-induceret humorale immunresponset i forskellige befolkninger og på tværs af forskellige aldersgrupper er et nøgleelement til at besvare vigtige kliniske spørgsmål6,7,8 , 9, såsom: Hvorfor har nogle ældre patienter infektioner trods tidligere vaccination? Hvad er en "god" og "tilstrækkelige" vaccine-induceret beskyttelse? Hvor ofte bør en vaccine anvendes til en immunosuppressed patient at nå beskyttende titers? Hvad er den mest effektive dosis? Hvad er virkningen af en roman adjuvans på efter vaccination antistof titers? Måling af vaccine-specifikke antistof produktion kan hjælpe med svar på disse vigtige spørgsmål og forbedre vaccination resultater.
Kvantificering af virus-specifikke antistof titers kan udføres med forskellige immunologiske metoder. Dette omfatter solid-fase10 eller perle-baserede ELISA11 assays, HI assay12og neutraliserende assays13. ELISA-baserede metoder tillade screening af relativt store mængder af serumprøver mod forskellige antigener. Også, patogen-specifikke immunglobulin (Ig) M og IgG kan være særskilt udforsket. Selvom Karakteristik af et antigen, f.eks., den lineære aminosyresekvens eller viruslignende partikel kan påvirke bindingen af antistoffer, spektrum af potentielle epitoper er meget bred og indeholder ikke oplysninger om, hvorvidt et antistof svar har funktionelle relevans.
Derimod neutralisering assay bestemmer potentiale af antistoffer til funktionelt hæmme infektion af celler og derfor afspejler den potentielle neutralisering. Men denne metode er meget arbejdskraftintensive, kræver dyrkning af specifikke cellelinjer og levende vira, og derfor, det er tidskrævende, dyrt og kræver særligt udstyr.
I denne artikel beskrives en trinvis Verdenssundhedsorganisationen WHO-baserede HI protokol12 til at kvantificere influenza-specifikke antistof titers. Hemagglutination er en karakteristisk effekt af nogle vira fører til agglutination af erytrocytter. Hæmning af denne effekt med patient sera tillader måling af hæmmende antistof, som afspejler en neutraliserende virkning.
Vi har ændret arbejdsgangen i WHO-protokol til at tillade en mere effektiv håndtering af flere prøver på samme tid og derved reducere den nødvendige tid. Den første protokol beskriver bestemmelse af agglutination potentialet i en særlig influenza-antigen. Herved kan bestemmes korrekt influenza-antigen koncentration for anden protokol. Denne del bør gentages med hver ny viralt antigen, som hver batch af blod.
Den anden protokol beskriver bestemmelse af influenza-specifikke antistof titers. De præsenterede protokoller er optimeret til undersøgelse af influenzavirus og humant serumprøver dog, det kan også anvendes til musen serumprøver eller cellekultur analysere fra stimuleret immun celler, fxvirus-specifikke B-celler. Resultater kan bestemmes som absolutte målte titers. I mange undersøgelser, vaccine, er de geometriske middelværdi titers og 95% konfidensinterval vist for hver særlig befolkning. For fortolkningen, seroprotection eller serokonversion bruges ofte til at beskrive modtagelighed for en befolkning til en visse virus. Seroprotection er defineret som en titer på ≥1:40 og serokonversion som en mere end 4-fold titer øge med opfyldelsen af seroprotective titers mellem to tidspunkter (mest almindeligt før vaccination og 30 dage efter vaccinationen bruges).
Begge protokoller er nemme at bruge og de kan tilpasses en bred vifte af forskningsspørgsmål. Navnlig, de kan bruges til at bestemme hurtigt og pålideligt antistof titers mod forskellige andre vira med kapacitet til hemagglutination, som mæslinger, polyomaviruses, fåresyge og røde hunde14,15,16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollerne undersøgelse blev godkendt gennem den lokale etiske review board (www.EKNZ.ch) og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagerne.
1. serum samling
- Indsamle serumprøver fra mennesker på tid interessepunkter. For denne undersøgelse indsamlet vi sera dage 0 (tidspunktet for vaccination mod influenza), + 7, + 30, + 60 og + 180 efter vaccination.
- For at opnå serummet, der centrifugeres prøveglassene på 1.200 x g i 10 min. ved stuetemperatur (20-25 ° C).
Bemærk: Ikke centrifugeres blodprøver skal opbevares ved 4 ° C, og længere end 24 timer. - Alikvot serum i forskellige rør (cryo-hætteglas) og fryse ved-80 ° C indtil brug.
- Udføre de efterfølgende assays batch-wise, herunder alle tidspunkter af én person at reducere variation inden for en patient.
2. forberedelse af antigener
Forsigtig: Fem forskellige antigener er anvendt (Se Tabel af materialer). Forberede antigener i et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2).
- Ifølge producentens anvisninger, rekonstruere de samlede indholdet af en frysetørret influenza-antigen ampul med 1,0 mL destilleret vand og tillade den opløste antigen henstår i mindst 5 min. ved stuetemperatur, før du fortsætter.
- Alikvot antigen løsning til 1,5 mL rør og fryse ved-80 ° C indtil videre anvendelse.
3. forberedelse af kolera filtratet
Bemærk: Kolera filtratet bruges som en receptor ødelægge enzym (RDE) Ifølge WHO protokol12. Dette fjerner den serum, som ville forstyrre assay17medfødte hæmmere.
- Rekonstruere den frysetørrede RDE ifølge producentens anvisninger.
- Gemme RDE løsningen i en 15 mL tube ved 4 ° C indtil videre anvendelse.
4. HA Assay
Bemærk: For at sikre, at HI-assays er sammenlignelige mellem flere plader, det samme beløb af viruspartikler skal bruges til hver plade. HA assay (også kaldet HA-titrering) udføres for at kvantificere de viruspartikler nødvendige for hemagglutination, og registreres i HA enheder. En "enhed" af hemagglutination er et operationelt kontor afhængig af den metode, der anvendes til HA-titrering og ikke en måling af et absolut beløb af virus. Således, en HA-enhed er defineret som mængden virus skulle agglutinere et lige saa stort volumen af en standardiseret RBC suspension. Ifølge WHO er standard beløbet anvendes til HI assay 4 HA enheder pr. 25 µL. Se figur 1for en illustration af princippet om HA assay.
Figur 1 : Princippet om hemagglutination og hemagglutination hæmning. Ingen hemagglutination opstår i en negativ kontrol situation uden virus og antistoffer (venstre kolonne), og erytrocytter hemagglutinate kun ved tilstedeværelse af influenzavirus (midterste kolonne). Men hvornår hemagglutinin i influenzavirus er blokeret af virus-specifikke antistoffer så ingen hemagglutination kan forekomme (højre kolonne). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærk: De røde blodlegemer bruges er afhængig af typen af influenzavirus i analysen (tabel 1). Yderligere, for forskellige typer af 96-brønd mikro titer plader, at inkubationstiden samt udseendet af de ikke-agglutineres celler afviger (tabel 2).
| Influenza-antigen | A/Californien/7/09 (H1N1) | A/Schweiz/9715293/2013 (H3N2) | A-Texas-50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 | ||
| RBC arter | Kylling | Marsvin | Marsvin | Tyrkiet | Tyrkiet | ||
Tabel 1: Influenza antigener og tilsvarende arter af røde blodlegemer. Ifølge producentens anvisninger (NIBSC).
| RBC arter | Kylling | Tyrkiet | Marsvin | Menneskelige type O |
| Koncentration af røde blodlegemer (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1% | 1% |
| Type af mikrotiter plade | V bunden | V bunden | U bund | U bund |
| Inkubationstiden, RT | 30 min | 30 min | 1 time | 1 time |
| Fremkomsten af ikke-agglutineres celler | Knappen * | Knappen * | Halo | Halo |
Tabel 2: Assay betingelser med forskellige arter af RBC. Ifølge WHO-protokollen. (* løber når det vippes).
-
Forberedelse af RBC Suspension
- Fortynd RBC stock suspension (10%, v/v; undtagen menneskelige type O) (Se Tabel af materialer) med phosphat bufferet saltvand (PBS) at gøre de ordentlig aviær og pattedyr RBC-koncentrationer på 0,75% og 1%, henholdsvis.
Figur 2 : Plade design af HA assay. HA-titrering udføres i dubletter. Ingen antigen blev tilføjet til kontrol rækker. Se også figur 4 til bestemmelse af de bedste antigen koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Forberedelse af 96-brønd mikro Titer plade
Bemærk: Se figur 2 en oversigt over pladen design.- Tilføj 25 µL af PBS brønde 1 til 12 af hver anvendte række af en 96-brønd mikro titer plade ved hjælp af en multikanalpipette (figur 2). Brug V-formet mikro titer plade, når du arbejder med aviær røde blodlegemer, som kylling og kalkun. Bruge U-formet mikro titer plade, når du arbejder med pattedyr RBC, ligesom marsvin og menneskelige type O (tabel 2).
- Tilsæt 25 µL af influenza-antigen til den første brønd af antigen-rækker, der er arrangeret i dubletter. Ingen antigen er tilføjet til kontrol rækker. Kontrol rækker skal ikke vise en hemagglutination effekt og tjene som negative kontroller (figur 2).
- Udføre en serie 2-fold fortynding ved at overføre 25 µL fra den første brønd af antigen-rækker til successive brønde ved hjælp af en multikanalpipette. Bland hver fortynding trin af pipettering op og ned forsigtigt 10 gange.
- Kassér den endelige 25 µL af de sidste brønde.
- Tilføj 25 µL af PBS brønde 1 til 12 af hver anvendte række ved hjælp af en multikanalpipette, for at nå en samlet maengde paa 50 µL pr. brønd.
- Tilføje 50 µL af RBC suspension til hver anvendt godt ved hjælp af en multikanalpipette.
- Tryk pladen omhyggeligt 10 gange på alle fire sider til at blande.
- Dække pladen med et låg og inkuberes ved stuetemperatur i den passende mængde tid afhængigt af RBC arter anvendes (Se tabel 2). Flyt ikke pladen mens inkubere.
Figur 3 : Agglutination mønstre af aviær og pattedyr RBC. V-formet mikro titer plader bruges, når du arbejder med aviær RBC. Udlæsningen er udført i en skrå plade holdning, og ikke-agglutineres RBC begynder at køre ned danner en tåre-lignende form. U-formet mikrotiter plader bruges, når du arbejder med pattedyr RBC. Udlæsningen udføres derefter i en ikke-skrå position, og ikke-agglutineres røde blodlegemer danner en lille halo. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Læsning pladen
Bemærk: Udlæsningen er lidt anderledes, når du bruger aviær røde blodlegemer i forhold til pattedyr RBC, på grund af de forskellige formede mikro titer brønde (figur 3).- Udlæsning af aviær røde blodlegemer
- Vippe plade 90° til 25 s.
Bemærk: Vippe pladen er afgørende for differentiering af aviær mønstre, da alle tre forskellige typer af agglutination mønstre (helt agglutineres, delvist agglutineres og ikke-agglutineres) vises som en knap når ikke vippes. - Markere resultaterne straks, mens pladen stadig er i en skrå stilling på en udskrevet ordning af 96-brønd plade. Agglutination mønstre af aviær røde blodlegemer er vist i figur 3.
- Vippe plade 90° til 25 s.
- Udlæsning af pattedyr røde blodlegemer
- Mærke resultater på en udskrevet ordning over 96-brønd pladen, uden vippe plade (vandret position på bænken).
Bemærk: Når hemagglutination opstår, de agglutinated celler ikke bilægge til bunden, mens ikke-agglutineres celler vises som en glorie i bunden af brønden. Ring af delvist agglutinated celler er mindre intens og har en større diameter (figur 3).
- Mærke resultater på en udskrevet ordning over 96-brønd pladen, uden vippe plade (vandret position på bænken).
- Bestemmelse af 4 HA enheder.
Bemærk: HA titrering endepunkt er de sidste godt hvor komplet hemagglutination opstår. Dette indeholder godt 1 HA enhed af virus. På grund af de 2-fold fortyndinger af antigenet, to brønde foran HA titrering slutpunkt er brønden, der indeholder 4 HA enheder virus (figur 4).
- Udlæsning af aviær røde blodlegemer
Figur 4 : Udlæsning af HA-titrering med aviær røde blodlegemer til at bestemme titer på 4 HA enheder. Den optimale antigen beløb kræves til hemagglutination måles ved hemagglutination assay (antigen titreres assay). De sidste godt hvor komplet hemagglutination opstår er HA titrering slutpunkt og indeholder 1 HA enhed. På grund af de 2-fold fortyndinger af antigenet, to brønde foran HA titrering slutpunkt, svarer titer til 4 HA enheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. HI Assay
Bemærk: Arbejde-flow i protokollen er blevet optimeret til at give mulighed for en mere effektiv håndtering af flere prøver på samme tid, ved hjælp af PCR rør striber og en thermo cycler (se nedenfor).
-
Forberedelse af serumprøver
Bemærk: Forberede serumprøver i et laboratorium, BSL-2.- Optø frosne serumprøver af hvert tidspunkt af hver person (Se trin 1.2) ved stuetemperatur.
- Tilføje en alikvot af 10 µL af hver prøve, optøede serum til et rør af en PCR rør strip (10-rør i en stribe).
Bemærk: Den store fordel ved hjælp af PCR rør strimler er at en multikanalpipette kan anvendes til følgende trin i HI analysen; Det sparer en masse tid ved test af en stor mængde af serumprøver og når udfører gentagne foranstaltninger af de samme prøver for antistof titers mod forskellige virusstammer. - Gemme aliquoted serumprøver i PCR rør strimler på-80 ° C indtil brug.
- Én dag før HI analysen udføres, tø serum prøve delprøver af interesse ved stuetemperatur.
- Tilføje 10 µL af den passende antiserum til en tom PCR rør.
Bemærk: for at tjene som positiv kontrol, anti-serum mod en specifik virus skal matche den anvendte virus. Den positive kontrol giver mulighed for standardisering af plade ydelse over flere plader. - Tilføj 30 µL af kolera filtratet løsning til hvert serum delprøve og anti-serummet (3 bind af kolera filtratet til 1 bind af serum) ved hjælp af en multikanalpipette.
- Holde PCR-rør i en PCR 96-brønd rack eller en tom tip-box og vortex for 5 s.
- Inkuber prøver natten over ved 37 ° C ved hjælp af en thermo cycler.
- Inkuber prøver ved 56 ° C i 30 min til at inaktivere kolera filtratet ved hjælp af en thermo cycler.
Bemærk: Afhængigt af thermo cycler, dette trin kan programmeres til at yderligere automatisere processen. - Holde PCR-rør i en PCR 96-brønd rack eller en tom tip-box og vortex for 5 s.
- Opbevare prøver ved 4 ° C i køleskabet indtil brug for HI assay.
Figur 5 : Plade design og workflow af HI assay. Fem tidspunkter af to mennesker kan måles på en tallerken. HI titer varierer fra 8 til 1.024. En anti-serum fra dyr af den brugte mængde antigen fungerede som positiv kontrol og en ryg titrering blev udført for at kontrollere, hvis antigen fortynding er lig med 4 HA enheder. Seriel fortynding af serumprøven er vist for 2 individuelle vaccine modtagere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Hej assay
Bemærk: For en illustration af princippet om HI assay Se figur 1. Afhængigt af virussen anvendes forskellige arter af røde blodlegemer til analysen (tabel 1). De forskellige arter af røde blodlegemer er brugt i forskellige typer af plader, 96-brønd, og at inkubationstiden samt udseendet af de ikke-agglutineres celler afviger (tabel 2). For HI assay, er 4 HA enheder af virus eller antigen føjet til rækken 2-fold fortynding af prøverne.-
Fremstilling af antigen
- Beregning af volumen af antigen løsning nødvendig efter antallet af 96-brønd plader anvendes (25 µL antigen pr. godt × 96 = 2.400 µL antigen pr. 96-brønd plade; tilføje 100 µL pr. plade ekstra på grund af brugen af et reservoir for multikanalpipette; ialt 2,5 mL af antige n pr. plade).
Bemærk: For eksempel, hvis måling 100 serumprøver 10 plader er nødvendige (10 prøver pr. plade): 2,5 mL x 10 = 25 mL antigen løsning brug for i alt. - Forberede den passende fortynding af 4 HA enheder for den beregnede mængde ved hjælp af PBS.
Bemærk: 4 HA enheder bestemmes for HA assay. For den passende mængde antigen, ved at dividere den beregnede mængde af titer svarende til 4 HA enheder. For eksempel, 4 HA enheder svarer til en fortynding på 1/64, og vi havde brug for 15.000 µL af antigen løsning er nødvendige: 15.000/64 = 234.4 µL af opløste frysetørrede influenza-antigen er tilføjet.
- Beregning af volumen af antigen løsning nødvendig efter antallet af 96-brønd plader anvendes (25 µL antigen pr. godt × 96 = 2.400 µL antigen pr. 96-brønd plade; tilføje 100 µL pr. plade ekstra på grund af brugen af et reservoir for multikanalpipette; ialt 2,5 mL af antige n pr. plade).
-
Forberedelse af RBC suspension
- Beregning af volumen af RBC suspension behov ud fra antallet af 96-brønd mikro titer plader anvendes (50 µL RBC suspension pr. godt × 96 = 4.800 µL RBC suspension pr. 96-brønd plade; tilføje 200 µL pr. plade ekstra på grund af brugen af et reservoir for den multikanalpipette) .
- Fortynd RBC stock suspension (normalt 10%, v/v; undtagen menneskelige type O) med PBS til at gøre de ordentlig aviær og pattedyr RBC-koncentrationer på 0,75% og 1%, henholdsvis.
-
Forberedelse af 96-brønd mikro titer plade
- Mærke 96-brønd mikro titer pladerne (sample ID, positiv kontrol og tilbage titrering). Tjek venligst plade orientering i figur 5 omhyggeligt.
- Tilsæt 25 µL af PBS til hver brønd undtagen den første brønd i rækken "tilbage titrering" (figur 5, 12th rækken) ved hjælp af en multikanalpipette.
Bemærk: En back titrering blev udført for at kontrollere, hvis den brugte mængde antigen fortynding er lig med 4 HA enheder. En antigen titer på 4 HA enheder er indiceret hvis hemagglutination opstår i de første tre brønde af rækken "tilbage titrering", men ikke i fjerde godt. - Tilføje 50 µL af opløsningen rede antigen (beskrevet i 5.2.1) til den første brønd i rækken "tilbage titrering" (12th rækken).
- Tilføj 25 µL af de RDE-behandlede serumprøver første brønde rækker 1-10 på hver tallerken, ved hjælp af en multikanalpipette.
- Tilføj 25 µL af den passende antiserum til den første brønd i rækken 11th som positiv kontrol.
- Udføre seriel 2-fold fortyndinger ved at overføre 25 µL fra den første brønd i hver række (1-12) efterfølgende brønde ved hjælp af en multikanalpipette. Mix af pipettering op og ned 10 - 15 gange for hver fortynding trin. De samme tips kan bruges til hver fortynding trin pr. prøve.
- Kassér den endelige 25 µL af de sidste brønde.
- Tilføj 25 µL af opløsningen antigen ved hjælp af en multikanalpipette til hver brønd af rækkerne 1 til 11 (serumprøver og anti-serum). De samme tips kan bruges, hvis de ikke røre brøndene.
- Tilsæt 25 µL af PBS i stedet for antigen til hver brønd i rækken "tilbage titrering" (12th rækken).
- Tryk pladen omhyggeligt 10 gange på alle fire sider til at blande.
- Dække pladen med et låg og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Flyt ikke pladen mens inkubere.
- Tilsæt 50 µL af RBC suspension til hver brønd.
- Tryk pladen omhyggeligt 10 gange på alle 4 sider at blande.
- Dække pladen med et låg og inkuberes ved stuetemperatur i den passende mængde tid afhængigt af RBC arter anvendes (Se tabel 2). Flyt ikke pladen mens inkubere.
-
Læsning pladen
Bemærk: HI titer er den reciprokke værdi af den sidste fortynding af (anti-) serum, der fuldstændig hæmmer hemagglutination. Det er vigtigt at overveje at de RDE-behandlede sera blev allerede fortyndet 1:4 og efter trinnet seriel fortynding, sera i de første brønde er fortyndet 1:8, hvilket svarer til en HI titer af 8.- Udlæsning af aviær røde blodlegemer
- Vippe plade 90° til 25 s.
Bemærk: Vippe pladen er afgørende for differentiering af aviær mønstre, da alle tre forskellige typer af agglutination mønstre (helt agglutineres, delvist agglutineres og ikke-agglutineres) vises som en knap når ikke vippes. - Markere resultaterne straks, mens pladen stadig er i en skrå stilling på en udskrevet ordning af 96-brønd plade. Agglutination mønstre af aviær røde blodlegemer er vist i figur 3.
- Vippe plade 90° til 25 s.
- Udlæsning af pattedyr røde blodlegemer
- Mærke resultater på en udskrevet ordning over 96-brønd pladen, uden vippe pladen.
Bemærk: Når hemagglutination opstår, de agglutinated celler ikke at nøjes paa ikke-agglutineres celler vises som en glorie i bunden af brønden. Ring af delvist agglutinated celler er mindre intens og har en større diameter (figur 3). - Bestemme HI af hver prøve og overføre den til en computer-baseret tabel (figur 6)
- Bemærk: Delvist agglutineres wells blev fastsat som en lavere titer. For eksempel, hvis en serumprøven helt hæmmer hemagglutination op til 4. godt (1: 64 fortynding) og de 5th godt (1:128 fortynding) er delvist agglutineres, så HI titer angives til den lavere titer 64 for den endelige analyse (figur 6, 4th rækken).
- Mærke resultater på en udskrevet ordning over 96-brønd pladen, uden vippe pladen.
- Udlæsning af aviær røde blodlegemer
-
Fremstilling af antigen
Figur 6 : Udlæsning af HI assay med aviær RBC. Før og efter vaccination induceret influenza-specifik antistofrespons bestemmes af HI assay. I dette eksempel har person en højere HI titers end person, to. Begge personer, viser en antistofrespons efter vaccinationen 180 dage efter vaccinationen er antistof titers af begge personer faldt igen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før og efter vaccination induceret antistofrespons mod Influenza A H3N2
Vaccine-induceret antistofrespons blev vurderet i 26 raske frivillige, der har modtaget en inaktiveret trivalent subunit influenzavaccine, der indeholder Influenza A/H1N1/Californien/2009, A/H3N2/Texas/2012 og B/Massachusetts/02/2012 inden 2014 / 2015 influenzasæsonen. Figur 6 viser et repræsentativt eksempel på 2 vaccine modtagere. Interessant, under dette særlige influenzasæsonen, A/H3N2/Texas/2012 ikke cirkulerer, og i stedet sæsonen inkluderet den noget anderledes viral belastning: A/H3N2/Schweiz/2013. Den virale hemagglutinin A/H3N2/Texas/2012 og A/H3N2/Schweiz/2013 viser 97% sekvens identitet og adskiller sig kun elleve aminosyrer (Se tabel 4), hvis holdninger er fremhævet i figur 7.
Figur 7 : Hemagglutinin sammenligning af A/H3N2 influenza stammer. Vi sammenlignede hemagglutinin af de virale stammer A/Texas/50/2012 og A/Schweiz/9715293/2013. Da der er ingen hemagglutinin krystal strukturer af disse stammer, brugte vi krystalstruktur af den meget lignende hemagglutinin af influenza-stamme A/Victoria/361/201118, som viser 98% sekvens identitet med Texas stamme og 95% sekvens identitet med Schweiz stamme. Aminosyre positioner som Texas og Schweiz stammer adskiller er fremhævet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Vi observeret en cross-reactive immunrespons for de virale stammer A/H3N2/Schweiz/2013 og A/H3N2/Texas/2012. Hej var titers mod Influenza A/H3N2/Schweiz/2013 betydeligt lavere geometriske middelværdi titers og induceret seroprotection (figur 8A) i forhold til Influenza A/H3N2/Texas/2012 (fig. 8B).
Figur 8 : Geometriske middelværdi antistof-titers af raske donorer. De geometriske middelværdi antistof-titers (GMTs) af 25 raske donorer før og efter vaccinationen bestemmes ved hjælp af to forskellige antigener. De gennemsnitlige titers A/H3N2/Schweiz/2013 (A) og A/H3N2/Texas/2012 (B) er vist. En immunrespons på grund af vaccinationen kan iagttages som stigende titers efter vaccination (d7-d60), i forhold til GMTs før vaccination (d0). 180 dage efter vaccinationen, falde GMTs igen. Bemærk når kun A/H3N2/Texas/2012 (som var i vaccinen) beskyttende titers. Angiver geometriske middelværdi titers, og whiskers angive 95% konfidensintervaller. Den stiplede linje angiver tærsklen seroprotection. % Af seroprotected folk (titer > 1:40) er vist i grafen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Efter vaccination steg antistof titers mod A/H3N2/Texas/2012 i de fleste fag; Selvom A/H3N2/Schweiz/2013 stamme ikke var til stede i vaccinen, forhøjet titer mod A/H3N2/Schweiz/2013 i nogle fag. Figur 9 viser sammenhængen mellem begge titers over alle tidspunkter med en R2 af 0.745 for en lineær regressionsmodel. Som man kunne forvente, var induktion af antistofrespons mod A/H3N2/Schweiz/2013 mindre potent.
Figur 9 : Krydsreaktion mellem A/H3N2 influenza stammer. A/H3N2/Texas titers af hver enkelt og tid punkt plottes mod de tilsvarende A/H3N2/Schweiz titers. En lineær regressionsmodel viser en R2 af 0.745. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hemagglutination potentielle er baseret på typen af blod anvendes
Den virale hemagglutinin viser forskellige artsafhængig potentiale til hemagglutinate erytrocytter. Herom artsafhængig påvirker også hemagglutination hæmning assay. For at forbedre målte anti-viral titers specificitet, vi har vurderet bedst egnet typen af erytrocytter for fem virale antigener (Influenza B/Brisbane/60/2008 og B/Massachusetts/02/2012, Influenza A/H1N1/Californien/2009, A/H3N2/Texas/2012 og A / H3N2/Switzerland/2013) til at opnå den maksimale hemagglutination, men også den laveste krydsreaktivitet. Vi brugte positiv kontrol sera fra National Institute for biologiske standarder og kontrol (NIBSC) mod hvert antigen til at udføre disse assays.
For Influenza B, kunne vi iagttage, B/Massachusetts/02/2012 induceret antistofrespons ikke giver beskyttelse mod B/Brisbane/60/2008. Derimod viste antistoffer mod B/Brisbane/60/2008 krydsreaktivitet mod B/Massachusetts/02/2012 på en 4-fold lavere titer på tværs af forskellige erytrocytter (Se tabel 3). Af interesse, marsvin blod ikke korrekt hemagglutinate med Influenza B. Tyrkiet blod gjorde bedst i at vise potentialet til at hemagglutinate og de højeste titers med relativ lav krydsreaktivitet ud over den tidligere nævnte A/H3N2/Texas og / Schweiz stammer.
| Tyrkiet | Marsvin | Kylling | Menneskelige type O | |
| B/Brisbane | 1024 | - | 1024 | 1024 |
| B/Massachusetts | 1024 | 384 | 768 | 1024 |
| A/H3N2/Schweiz | 1024 | 1024 | - | 1024 |
| A/H3N2/Texas | 1024 | 1024 | 512 | 1024 |
| A/H1N1/Californien | 1024 | 1024 | 768 | 768 |
Tabel 3: Positiv kontrol titers mod respektive influenza HA antigen på tværs af forskellige arter.
| Nej | A/H3N2/Texas/2012 stamme | A/H3N2/Schweiz/2013 stamme | Position |
| 1 | Asparagin (N) | Alanin (A) | 128 |
| 2 | Alanin (A) | Serin (S) | 138 |
| 3 | Isoleucin, (I) | Arginine (R) | 140 |
| 4 | Arginine (R) | Glycin (G) | 142 |
| 5 | Asparagin (N) | Serin (S) | 145 |
| 6 | Fenylalanin (F) | Serin (S) | 159 |
| 7 | Glycin (G) | Valin (V) | 186 |
| 8 | Prolin (P) | Serin (S) | 198 |
| 9 | Serin (S) | Fenylalanin (F) | 219 |
| 10 | Asparagin (N) | Aspartat (D) | 12V |
| 11 * | Lysin (K) | Arginine (R) | 326 |
| * ikke vist i krystalstruktur i figur 8, fordi hemagglutinin var cutted på rester 325. | |||
Tabel 4: Liste over forskellige aminosyrer af hemagglutinin mellem A/H3N2/Texas/2012 og A/H3N2/Schweiz/2013 stammer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantificering af før og efter vaccination influenza virus specifikt antistof titers er et vigtigt værktøj nødvendigt for vaccine undersøgelser. Baseret på erstatningsmålinger beskyttelse mod virusinfektion, såsom seroprotection (> 1:40) eller serokonversion (4-fold titer stigning), vaccination strategier kan være optimeret9. Brug de medfølgende protokoller kan bestemme: (i) hemagglutination potentialet af et bestemt virus, og (ii) antistof titers for en virus af interesse.
Ændring og fejlfinding:
Denne protokol er baseret på WHO standard12. Vi ændrede protokollen ved hjælp af PCR rør strimler for serum præparater (Se trin 5). Denne ændring hjalp betydeligt mindske arbejdsbyrden og til at øge gennemløbet af analysen. Yderligere, vi reduceret antigen beløb med en fjerdedel i antigen titreres trin, der er omkostningseffektive overtid. En lavere mængde af serum (10 µL) kan bruges til RDE behandling, som hjælper især når prøven er begrænset (fx, mus sera). Tilbage titrering og positiv kontrol indgår i antistof måling plade til at tjene som en passende intern kontrol og overvåge ældning af erytrocytter.
Derudover bruges vi forskellige erytrocyt koncentrationer end i WHO standard12 til at angive den optimale størrelse af erytrocyt blodprop for en god visuel udlæsning. For at garantere dette foreslår vi, at kontrollere erytrocyt koncentration før analysen. Selvom vi ikke har optimeret denne del i vores protokol, kunne metoder såsom absorbans måling med OD eller celle optælling bruges.
Hvis RDE ikke er helt inaktiveret, kan røde blodlegemer være desialylated og omvendt HA-positive wells, når hemagglutination er målt ved stuetemperatur. Selv om vi aldrig observeret dette problem, i dette tilfælde foreslår vi udfører HI ved 4 ° C, da RDE aktivitet er betydeligt lavere ved 4 ° C. Dog er udfører HI assay ved 4 ° C langsommere.
Begrænsninger af teknikken:
Et par kritiske aspekter af HI analysen omfatter følgende punkter: interessant, at hemagglutination er stærkt afhængige af den særlige type af erytrocyt (fx, Tyrkiet eller marsvin RBC). Den optimale type af blod bør testes, før en bestemt virusstamme er evalueret og den samme type af blod bør anvendes i hele analysen. Selv om induktion af krydsreaktivitet mellem virus kan generere en immunologisk fordel en smule nye virus19,20, kan dette medføre nogle problemer fra en diagnostisk synspunkt på grund af lav specificitet. Derfor bør cross reaktivitet mellem lignende virus omhyggeligt behandlet og diskuteret i undersøgelser. Ved at vælge erytrocytter fra en bestemt art, kan mængden af krydsreaktivitet sænkes lidt.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
HI er en veletableret guld standard metode giver meget reproducerbare og pålidelige resultater. Andre teknikker såsom ELISA kan opdage ikke-neutraliserende antistoffer, mens HI registrerer kun antistoffer, som binder til HA stem løkke og dermed korrelerer med neutralisering.
Kritiske trin i protokollen:
De mest kritiske trin omfatter serum behandling med RDE til at inaktivere uspecifikke inhibitorer og bindende til HA af virus. Endnu et kritisk skridt er at kontrollere for hæmolyse af erythrocytter som de alder over tid.
Fremtidige ansøgninger:
Protokollen kan anvendes til andre vira med hemagglutination potentiale. Selv om vi har kun vist resultaterne på menneskelige sera prøver her, kan analysen også bruges til at måle antistof titers i mus sera eller i cellekultur supernatanten med stimuleret B-celler (data ikke vist). I Resumé, HI giver mulighed for en hurtig og reproducerbare vurdering af vaccine-induceret antistof titers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.E. blev støttet af en forskning tilskud fra programmet "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung højeste Projekte" universitetet i Basel, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel og Bangeter Rhyner Stiftung. Larsen blev støttet af en bevilling på det tekniske universitet i Graz, Østrig. J.L. anerkender støtte af et iPhD fællesskab af initiativet SystemsX.ch i systemer biologi program (9th opkald).
Acknowledgments
ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
- Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
- Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).
- Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042 (2014).
- Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
- Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282 (2015).
- Egli, A., et al. Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940 (2014).
- O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420 (2014).
- Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
- Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
- Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
- Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
- Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
- Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
- Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
- Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614 (2014).
- Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
- Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).
