Summary
De gepresenteerde protocollen beschrijven het uitvoeren van een hemagglutination inhibitie-test om te kwantificeren van influenza-specifieke antilichamen titers van serummonsters van influenza vaccinontvangers. De eerste bepaling bepaalt optimale virusantigeen concentraties door hemagglutination. De tweede test kwantificeert influenza-specifieke antilichamen titers door inhibitie van de hemagglutination.
Abstract
Antilichamen titers worden vaak gebruikt als surrogaat markers voor serologische bescherming tegen influenza en andere ziekteverwekkers. Gedetailleerde kennis van de productie van het antilichaam pre-en post vaccinatie is vereist voor het begrijpen van de vaccin-geïnduceerde immuniteit. Dit artikel beschrijft een betrouwbaar punt-voor-punt protocol om te bepalen van influenza-specifieke antilichamen titers. Het eerste protocol beschrijft een methode om op te geven van de bedragen van de antigeen vereist voor hemagglutination, die standaardiseert de factor van de concentraties voor latere gebruik in het tweede protocol (hemagglutination assay, HA assay). Het tweede protocol beschrijft de kwantificering van influenza-specifieke antilichamen titers tegen verschillende virale stammen met behulp van een seriële verdunning van menselijk serum of cel cultuur supernatant (hemagglutination inhibitie assay, HI assay).
Als een toegepaste voorbeeld tonen wij de antistofrespons van een gezonde cohort, waaraan een driewaardig geïnactiveerd influenzavaccin aan te leggen. Bovendien, de Kruisallergie tussen de verschillende influenzavirussen wordt weergegeven en methoden om te minimaliseren Kruisallergie met behulp van verschillende soorten dierlijke rode bloedcellen (RBC) worden uitgelegd. De discussie benadrukt de voordelen en nadelen van de gepresenteerde tests en hoe de bepaling van influenza-specifieke antilichamen titers kan de verbetering van het inzicht van de vaccin-gerelateerde immuniteit.
Introduction
Infectie met influenzavirus wordt geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit, mortaliteit en hoge kosten van de gezondheidszorg1,,2,,3,4. Met name lopen ouderen, pasgeborenen, zwangere vrouwen en patiënten met chronische ziekte risico voor meer ernstige klinische resultaten. Daarom is vaccinatie tegen circulerende influenzastammen virus de primaire maatregel tot vermindering van de ziektelast in deze risicovolle populaties. De toename van de individuele immune reactie na vaccinatie, bijvoorbeeld, griep-specifieke antilichamen boven een beschermende drempel vermindert het individuele risico van infectie en in het algemeen de kans op virale overdracht binnen een populatie 5. een gedetailleerde kennis van de vaccin-geïnduceerde humorale immune reactie in verschillende bevolkingsgroepen en in heel verschillende leeftijdsgroepen is een sleutelelement om te beantwoorden van belangrijke klinische vragen6,7,8 , 9, zoals: Waarom hebben sommige oudere patiënten infecties ondanks eerdere vaccinatie? Wat is een "goede" en "voldoende" vaccin-geïnduceerde bescherming? Hoe vaak moet een vaccin worden toegepast op een patiënt immunosuppressie beschermende titers bereikt? Wat is de meest effectieve dosering? Wat is de impact van een roman adjuvans op na vaccinatie antilichamen titers? De meting van de productie van het vaccin-specifieke antilichaam kan helpen deze belangrijke vragen te beantwoorden en vaccinatie resultaten te verbeteren.
De kwantificering van virus-specifieke antilichamen titers kan worden uitgevoerd met diverse immunologische methoden. Het gaat hierbij om solid-phase10 of kraal gebaseerde ELISA11 testen, HI assay12en neutraliseren assays13. ELISA gebaseerde methoden toestaan de screening van relatief grote hoeveelheden serummonsters tegen de verschillende antigenen. Ook pathogeen-specifieke Immunoglobulin (Ig) M en IgG kan worden afzonderlijk onderzocht. Hoewel de kenmerken van een antigeen, bijvoorbeeld, de lineaire aminozuur sequentie of virusachtige deeltjes invloed op de binding van antilichamen hebben kunnen, het spectrum van potentiële epitopes is zeer breed en geeft informatie niet op, of een antilichaam reactie heeft functionele relevantie.
Daarentegen de neutralisatie bepaling bepaalt het potentieel van antilichamen voor de functioneel remming van de infectie van cellen en dus weerspiegelt de potentiële neutralisatie. Echter, deze methode is zeer arbeidsintensief, vereist kweken van specifieke cellijnen en leven van virussen, en daarom, het is tijdrovend, duur, en vereist speciale apparatuur.
Dit artikel beschrijft een stapsgewijze de Wereldgezondheidsorganisatie WHO gebaseerde HI protocol12 om te kwantificeren van influenza-specifieke antilichamen titers. Hemagglutination is een karakteristiek effect van sommige virussen die leiden tot de agglutinatie van erytrocyten. De remming van dit effect met patiënt sera kunt de meting van remmende antilichaam concentraties, waarin een neutraliserende werking.
We hebben de workflow van het WHO-protocol om een meer efficiënte afhandeling van meerdere monsters tegelijk en waardoor de vereiste tijd gewijzigd. Het eerste protocol beschrijft de bepaling van het potentieel van de agglutinatie-eenheden van een bepaald influenza-antigeen. Daarbij wordt de juiste influenza-antigeen-concentratie bepaald voor het tweede protocol. Dit deel moet worden herhaald met elke nieuwe virale antigeen, evenals elke batch van het bloed.
Het tweede protocol beschrijft de bepaling van influenza-specifieke antilichamen titers. De gepresenteerde protocollen zijn geoptimaliseerd voor het onderzoek van het influenzavirus en menselijk serummonsters echter, het kan ook worden toegepast voor muis serummonsters of celkweek supernatant van gestimuleerd immune cellen, bijvoorbeeldvirus-specifieke B-cellen. Resultaten kunnen worden bepaald als absolute gemeten titers. In vele studies van het vaccin, worden de titers meetkundige gemiddelde en het 95%-betrouwbaarheidsinterval weergegeven voor elke bijzondere bevolking. Voor de interpretatie, de seroprotection of de seroconversie worden vaak gebruikt om te beschrijven de gevoeligheid van een bevolking met een bepaalde virus. Seroprotection is gedefinieerd als een titer van ≥1:40 en seroconversie zoals een titer van meer dan 4-fold te verhogen met de verwezenlijking van seroprotective titers tussen twee tijdstippen (meest meestal vóór vaccinatie en 30 dagen na vaccinatie worden gebruikt).
Beide protocollen zijn makkelijk te gebruiken en ze kunnen worden aangepast aan een brede waaier van onderzoeksvragen. In het bijzonder, ze kunnen worden gebruikt om te bepalen betrouwbaar en snel de titers antilichamen tegen diverse andere virussen met de capaciteit voor hemagglutination, zoals mazelen, polyomaviruses, bof of rodehond14,15,16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie protocollen werden goedgekeurd door de lokale ethische review board (www.EKNZ.ch) en geïnformeerde toestemming is verkregen van alle deelnemers.
1. serum collectie
- Verzamelen serummonsters van mensen op tijd punten van belang. Voor deze studie verzameld we sera dagen 0 (tijd van griepvaccinatie), HALSLENGTE + 7 + 30, + 60 en + 180 na vaccinatie.
- Centrifugeer het monster buizen bij 1.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C) voor het verkrijgen van het serum.
Opmerking: Niet-gecentrifugeerd bloedmonsters moeten worden bewaard bij 4 ° C, en niet langer dan 24 uur. - Aliquot het serum in verschillende buisjes (cryo-flesjes) en bevriezing bij-80 ° C tot gebruik.
- Voer de volgende tests batchgewijs, met inbegrip van alle tijd-punten van een persoon te reduceren van variabiliteit binnen een patiënt.
2. voorbereiding van antigenen
Let op: Vijf verschillende antigenen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen). Bereiden van antigenen in een laboratorium Biosafety Level 2 (BSL-2).
- Volgens de instructies van de fabrikant, reconstrueren van de totale inhoud van één ampul van influenza gelyofiliseerd antigeen met 1,0 mL gedestilleerd water en laat het opgeloste antigeen te staan voor een minimum van 5 minuten bij kamertemperatuur voordat u verdergaat.
- Aliquot de antigeen-oplossing tot 1,5 mL tubes en bevriezen bij-80 ° C tot verder gebruik.
3. bereiding van Cholera filtraat
Opmerking: Cholera filtraat wordt gebruikt als een receptor enzym (RDE) volgens de WHO protocol12vernietigen. Dit verwijdert aangeboren remmers uit het serum die met de assay-17 interfereren zou.
- Het reconstrueren van het gelyofiliseerd RDE volgens de instructies van de fabrikant.
- Bewaren de RDE-oplossing in een tube van 15 mL bij 4 ° C tot verder gebruik.
4. HA Assay
Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de HI-assays vergelijkbaar tussen verschillende platen zijn, dezelfde hoeveelheid virusdeeltjes moet worden gebruikt voor elke plaat. De HA-test (oftewel HA-titratie) wordt uitgevoerd om te kwantificeren van de virusdeeltjes nodig voor hemagglutination, en is opgenomen in eenheden van de HA. Een "eenheid" van hemagglutination is een operationele eenheid afhankelijk van de methode die wordt gebruikt voor HA-titratie en is niet een meting van een absolute hoeveelheid virus. Dus, een HA-eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid virus die nodig zijn voor een gelijk volume van een gestandaardiseerde suspensie van RBC agglutineert. Volgens de WHO is het forfaitaire bedrag gebruikt voor de HI-assay 4 HA eenheden per 25 µL. Voor een illustratie van het beginsel van de HA-test Zie Figuur 1.
Figuur 1 : Beginsel van hemagglutination en inhibitie van de hemagglutination. Geen hemagglutination vindt plaats in een situatie van de negatieve controle zonder virussen en antilichamen (linker kolom) en erytrocyten hemagglutinate alleen in aanwezigheid van griepvirus (middelste kolom). Echter, wanneer het hemagglutinine van het influenzavirus wordt geblokkeerd door virus-specifieke antilichamen dan geen hemagglutination kan optreden (rechter kolom). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Opmerking: De RBC gebruikt zijn afhankelijk van het type van influenza-virus in de test (tabel 1). Verder, voor verschillende soorten titer micro 96-wells-platen verschillen de incubatietijd, alsmede het uiterlijk van de cellen niet-agglutinated (tabel 2).
| Influenza-antigeen | A/Californië/7/09 (H1N1) | A/Zwitserland/9715293/2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 | ||
| RBC soorten | Kip | Cavia | Cavia | Turkije | Turkije | ||
Tabel 1: antigenen van Influenza en vergelijkbare soorten RBC. Volgens de instructies van de fabrikant (NIBSC).
| RBC soorten | Kip | Turkije | Cavia | Menselijke type O |
| Concentratie van RBC (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1% | 1% |
| Soort microtiterplaat plaat | V-bodem | V-bodem | U onder | U onder |
| Incubatietijd, RT | 30 min | 30 min | 1 uur | 1 uur |
| Weergave van niet-agglutinated cellen | Knop * | Knop * | Halo | Halo |
Tabel 2: voorwaarden met verschillende soorten RBC Assay. Volgens de WHO-protocol. (* stroomt wanneer gekanteld).
-
Bereiding van de suspensie van RBC
- Verdun de voorraad suspensie van RBC (10%, v/v; behalve menselijke type O) (Zie Tabel van materialen) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te maken van de juiste concentraties voor aviaire en zoogdieren ige suspensie van RBC van 0,75% en 1%, respectievelijk.
Figuur 2 : Ontwerp van de HA-bepaling plate. De HA-titratie wordt uitgevoerd in de duplicaten. Geen antigeen is aan de controle-rijen toegevoegd. Zie ook Figuur 4 voor de bepaling van de beste antigeen-concentratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Voorbereiding van de Titer Micro 96-wells-plaat
Opmerking: Zie Figuur 2 voor een overzicht van het ontwerp van de plaat.- Breng 25 µL van PBS in putjes 1 tot en met 12 voor elke gebruikte rij van een titer micro 96-wells-plaat met behulp van een meerkanaalspipet (Figuur 2). De V-vormige micro titer plaat gebruiken bij het werken met aviaire RBC, zoals kip en kalkoen. De U-vormige micro titer plaat gebruiken bij het werken met zoogdieren RBC, zoals cavia en menselijke type O (tabel 2).
- Voeg 25 µL van influenza-antigeen aan de eerste putje van de antigeen-rijen, die zijn gerangschikt in de duplicaten. Geen antigeen wordt toegevoegd aan het besturingselement rijen. De controle-rijen moeten niet tonen een hemagglutination effect en dienen als negatieve controles (Figuur 2).
- Het uitvoeren van een seriële 2-fold verdunning door overdracht van 25 µL van het eerste putje van de antigeen-rijen aan opeenvolgende putjes met behulp van een meerkanaalspipet. Meng de stap van elke verdunning door pipetteren op en neer zachtjes 10 keer.
- Gooi de laatste 25 µL van de laatste putten.
- Voeg 25 µL van PBS aan 1 tot en met 12 putjes van elke gebruikte rij met behulp van een meerkanaalspipet, om te komen tot een totaal volume van 50 µL per putje.
- Voeg 50 µL van de suspensie van RBC toe aan elk gebruikt goed met behulp van een meerkanaalspipet.
- Tik op de plaat zorgvuldig 10 keer op alle vier zijden te mengen.
- De afdekplaat met een deksel en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende de juiste hoeveelheid tijd afhankelijk van de RBC soorten gebruikt (Zie tabel 2). Verplaats de plaat niet tijdens het broeden.
Figuur 3 : Agglutinatie patronen van aviaire en zoogdieren RBC. V-vormige micro titer platen worden gebruikt bij het werken met aviaire RBC. De uitlezing is uitgevoerd in de positie van een gekantelde plaat, en niet-agglutinated RBC beginnen te lopen die een scheur-achtige vormen. U-vormige microtiterplaat platen worden gebruikt bij het werken met zoogdieren RBC. De uitlezing gebeurt dan in een niet-gekanteld positie, en niet-agglutinated RBC vormen een kleine halo. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Het lezen van de plaat
Opmerking: De uitlezing is iets anders bij het gebruik van aviaire RBC vergeleken met de zoogdieren RBC, vanwege de verschillende gevormde micro titer putten (Figuur 3).- Uitlezing van aviaire RBC
- Kantelen van de plaat 90° voor 25 s.
Opmerking: Kantelen van de plaat is cruciaal voor de differentiatie van de patronen van het aviaire, omdat alle drie verschillende soorten agglutinatie patronen (volledig agglutinated, gedeeltelijk agglutinated en niet-agglutinated) als een knop weergegeven wanneer niet gekanteld. - Mark de resultaten onmiddellijk, terwijl de plaat nog in een gekantelde positie, op een gedrukte programma van de 96-wells-plaat. De patronen van de agglutinatie van de aviaire RBC zijn afgebeeld in Figuur 3.
- Kantelen van de plaat 90° voor 25 s.
- Uitlezing van zoogdieren RBC
- Markeren de resultaten op een afgedrukte regeling van de 96-wells-plaat, zonder te kantelen van de plaat (horizontale positie op de Bank).
Opmerking: Wanneer hemagglutination optreedt, de agglutinated cellen Neem geen genoegen naar de bodem, overwegende dat niet-agglutinated cellen worden weergegeven als een halo op de bodem van de put. De halo van de gedeeltelijk agglutinated cellen is minder intens en heeft een grotere diameter (Figuur 3).
- Markeren de resultaten op een afgedrukte regeling van de 96-wells-plaat, zonder te kantelen van de plaat (horizontale positie op de Bank).
- Bepaling van 4 HA eenheden.
Opmerking: Het eindpunt voor HA-titratie is de laatste put waar de volledige hemagglutination optreedt. Dit bevat ook 1 HA eenheid van virus. Vanwege de 2-fold verdunningen van het antigeen is twee putten voorafgaand aan het eindpunt van de titratie HA de put waarin 4 HA eenheden van virus (Figuur 4).
- Uitlezing van aviaire RBC
Figuur 4 : Uitlezing van de HA-titratie met aviaire RBC te bepalen van de titer van 4 HA eenheden. Het bedrag van de optimale antigeen vereist voor hemagglutination wordt gemeten door de hemagglutination assay (antigeen getitreerd assay). De laatste put waar volledige hemagglutination voorkomt is het eindpunt van de titratie HA en bevat 1 HA eenheid. Vanwege de 2-fold verdunningen van het antigeen, twee putten voorafgaand aan het eindpunt van de titratie HA de titer komt overeen met 4 HA eenheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. HI Assay
Opmerking: De werk-flow van het protocol is geoptimaliseerd voor het toestaan van een meer efficiënte afhandeling van meerdere monsters tegelijk, met behulp van PCR tube strepen en een thermo-cycler (zie hieronder).
-
Bereiding van de serummonsters
Opmerking: Bereiden serummonsters in een laboratorium BSL-2.- Ontdooi de bevroren serummonsters van elk punt van de tijd van elke persoon (zie stap 1.2) bij kamertemperatuur.
- Voeg een aliquoot deel van 10 µL van elke ontdooide serummonster tot een koker van een PCR buis strip (10-buizen in één strook).
Opmerking: Het grote voordeel van het gebruik van PCR buis strips is dat een meerkanaalspipet worden voor de volgende stappen in de HI-bepaling gebruikt kan; Dit bespaart veel tijd bij het testen van een grote hoeveelheid serummonsters en bij het uitvoeren van maatregelen van de dezelfde monsters voor antilichamen titers tegen verschillende virusstammen herhaald. - Bewaren de aliquoted serummonsters in de PCR buis strips bij-80 ° C tot gebruik.
- Een dag voordat de HI-test wordt uitgevoerd, Ontdooi de serum monster aliquots van belang bij kamertemperatuur.
- 10 µL van het desbetreffende anti-serum toevoegen aan een lege buis van PCR.
Opmerking: Om te dienen als positieve controle, het anti-serum tegen een specifieke virus moet overeenkomen met het gebruikte virus. De positieve controle zorgt voor standaardisatie van de prestaties van de plaat over meerdere platen. - Voeg 30 µL van cholera filtraat oplossing aan elk aliquot serum en de anti-serum (3 delen van cholera filtraat 1 volume van serum) met behulp van een meerkanaalspipet.
- Houden van de PCR-buizen in een PCR 96-Wells-rack of een lege tip-box en de vortex voor 5 s.
- Incubeer de monsters 's nachts bij 37 ° C met behulp van een thermo-cycler.
- Incubeer de monsters bij 56 ° C gedurende 30 minuten naar de inactivering van het cholera-filtraat met behulp van een thermo-cycler.
Opmerking: Afhankelijk van de thermo-cycler, deze stap kan worden geprogrammeerd om het proces verder te automatiseren. - Houden van de PCR-buizen in een PCR 96-Wells-rack of een lege tip-box en de vortex voor 5 s.
- De monsters bij 4 ° C bewaren in de koelkast tot gebruik voor de HI-assay.
Figuur 5 : Ontwerp en workflow van de HI-bepaling plate. Vijf keer punten van twee mensen kunnen worden gemeten op een plaat. De HI-titer varieert van 8 tot 1024. Een anti-serum van het gebruikte antigeen diende als positieve controle en een terug titratie werd uitgevoerd om te controleren of de verdunning van het antigeen gelijk is aan 4 HA eenheden. De seriële verdunning van het serummonster weergegeven voor 2 individuele vaccinontvangers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
HI assay
Opmerking: Voor een illustratie van het beginsel van de HI-test Zie Figuur 1. Afhankelijk van het virus, worden verschillende soorten RBC gebruikt voor de bepaling (tabel 1). De verschillende soorten RBC worden gebruikt in verschillende soorten 96-wells-platen en de incubatietijd, alsmede het uiterlijk van de niet-agglutinated cellen verschilt (tabel 2). Voor de HI-assay, worden 4 HA eenheden van virus of antigeen toegevoegd aan de 2-fold verdunningsreeks van de monsters.-
Bereiding van de oplossing van het antigeen
- Berekenen van de hoeveelheid antigeen oplossing nodig volgens het aantal 96-wells-platen gebruikt (25 µL antigeen per goed × 96 = 2400 µL antigeen per 96-wells-plaat; Voeg 100 µL per plaat extra als gevolg van het gebruik van een reservoir voor de meerkanaalspipet; een totaal 2,5 mL antige n per plaat).
Opmerking: als het meten van 100 serummonsters vervolgens 10 platen zijn bijvoorbeeld nodig (10 monsters per plaat): 2,5 mL x 10 = 25 mL antigeen oplossing nodig in totaal. - Maak de juiste verdunning van 4 HA eenheden voor de berekende volume worden gecontroleerd met behulp van PBS.
Opmerking: 4 HA eenheden zijn bepaald voor de HA assay. Voor de juiste hoeveelheid antigeen, deelt u de berekende volume worden gecontroleerd door de titer overeenkomt met eenheden van 4 HA. Bijvoorbeeld, 4 HA eenheden komen overeen met een verdunning van 1/64, en er 15.000 µL van antigeen oplossing nodig zijn: 15.000/64 = 234.4 µL van het opgeloste gelyofiliseerd influenza-antigeen worden toegevoegd.
- Berekenen van de hoeveelheid antigeen oplossing nodig volgens het aantal 96-wells-platen gebruikt (25 µL antigeen per goed × 96 = 2400 µL antigeen per 96-wells-plaat; Voeg 100 µL per plaat extra als gevolg van het gebruik van een reservoir voor de meerkanaalspipet; een totaal 2,5 mL antige n per plaat).
-
Bereiding van de suspensie van RBC
- Berekenen van het volume van de RBC schorsing nodig volgens het aantal titer micro 96-wells-platen gebruikt (50 µL RBC schorsing per goed × 96 = 4800 µL RBC schorsing per 96-wells-plaat; Voeg 200 µL per plaat extra als gevolg van het gebruik van een reservoir voor de meerkanaalspipet) .
- Verdun de voorraad suspensie van RBC (normaal 10%, v/v; behalve menselijke type O) met PBS te maken van de juiste concentraties voor aviaire en zoogdieren ige suspensie van RBC van 0,75% en 1%, respectievelijk.
-
Voorbereiding van de titer micro 96-wells-plaat
- Label de 96-Wells micro titer platen (monster ID, positieve controle en terug titratie). Controleer zorgvuldig in Figuur 5 de stand van de plaat.
- Voeg 25 µL van PBS aan elk putje behalve aan de eerste putje van de rij van "terug titratie" (Figuur 5, 12th rij) met de meerkanaalspipet.
Opmerking: Een terug titratie werd uitgevoerd om te controleren of de gebruikte antigeen verdunning gelijk is aan 4 HA eenheden. Een antigeen-titer van 4 HA eenheden wordt aangegeven als hemagglutination vindt plaats in de eerste drie putten van de rij "terug titratie", maar niet in de vierde goed. - 50 µL van de oplossing van de bereid antigeen (beschreven in 5.2.1) toevoegen aan het eerste putje van de rij van "terug titratie" (12th rij).
- 25 µL van het RDE-behandelde serummonsters toevoegen aan de eerste putten van rijen 1 tot en met 10 op elke plaat, met de meerkanaalspipet.
- 25 µL van het desbetreffende anti-serum aan het eerste putje van de 11th rij toevoegen als positieve controle.
- Seriële 2-fold verdunningen uitvoeren door overdracht van 25 µL van het eerste putje van elke rij (1-12) aan opeenvolgende putjes met behulp van een meerkanaalspipet. Meng door pipetteren omhoog en omlaag 10 - 15 keer voor elke verdunning stap. Dezelfde tips kunnen worden gebruikt voor elke verdunning stap per monster.
- Gooi de laatste 25 µL van de laatste putten.
- Voeg 25 µL van de antigeen-oplossing met behulp van een meerkanaalspipet aan elk putje van de rijen 1 tot en met 11 (serummonsters en anti-serum). Dezelfde tips kunnen worden gebruikt als ze niet de putten raken.
- Voeg 25 µL van PBS in plaats van antigeen aan elk putje van de rij van "terug titratie" (12th rij).
- Tik op de plaat zorgvuldig 10 keer op alle vier zijden te mengen.
- De afdekplaat met een deksel en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verplaats de plaat niet tijdens het broeden.
- Voeg 50 µL van de suspensie van RBC toe aan elk putje.
- Tik op de plaat zorgvuldig 10 keer op alle 4 zijden te mengen.
- De afdekplaat met een deksel en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende de juiste hoeveelheid tijd afhankelijk van de RBC soorten gebruikt (Zie tabel 2). Verplaats de plaat niet tijdens het broeden.
-
Het lezen van de plaat
Opmerking: De HI-titer is de reciproke van de laatste verdunning van (anti-) serum dat volledig hemagglutination remt. Het is belangrijk om te overwegen dat de sera RDE behandeld werden reeds verdund 1:4 en na de seriële verdunning stap, de sera in de eerste putten zijn verdunde 1:8, die correspondeert met een HI-titer van 8.- Uitlezing van aviaire RBC
- Kantelen van de plaat 90° voor 25 s.
Opmerking: Kantelen van de plaat is cruciaal voor de differentiatie van de patronen van het aviaire, omdat alle drie verschillende soorten agglutinatie patronen (volledig agglutinated, gedeeltelijk agglutinated en niet-agglutinated) als een knop weergegeven wanneer niet gekanteld. - Mark de resultaten onmiddellijk, terwijl de plaat nog in een gekantelde positie, op een gedrukte programma van de 96-wells-plaat. De patronen van de agglutinatie van RBC aviaire zijn afgebeeld in Figuur 3.
- Kantelen van de plaat 90° voor 25 s.
- Uitlezing van zoogdieren RBC
- Markeren de resultaten op een afgedrukte regeling van de 96-wells-plaat, zonder te kantelen van de plaat.
Opmerking: Wanneer hemagglutination optreedt, de agglutinated cellen doen niet settelen overwegende dat niet-agglutinated cellen worden weergegeven als een halo op de bodem van de put. De halo van de gedeeltelijk agglutinated cellen is minder intens en heeft een grotere diameter (Figuur 3). - Bepalen van de HI van elk monster en het overbrengen naar een computer gebaseerde tabel (Figuur 6)
- Opmerking: Gedeeltelijk agglutinated wells waren als een lagere titer bepaald. Bijvoorbeeld, als een serummonster volledig hemagglutination tot de 4e goed (in de verdunning 1: 64) en de 5th goed remt (1:128 verdunning) is gedeeltelijk agglutinated, dan de HI-titer is ingesteld op de lagere titer 64 voor de definitieve analyse (Figuur 6, 4th rij).
- Markeren de resultaten op een afgedrukte regeling van de 96-wells-plaat, zonder te kantelen van de plaat.
- Uitlezing van aviaire RBC
-
Bereiding van de oplossing van het antigeen
Figuur 6 : Uitlezing van de HI-assay met aviaire RBC. De pre-en post vaccinatie geïnduceerde influenza specifieke antistofrespons wordt bepaald door HI assay. In dit voorbeeld heeft de persoon een hogere HI titers dan persoon twee. Beide personen tonen een antistofrespons na de vaccinatie; 180 dagen na de vaccinatie zijn de antilichamen titers van beide personen opnieuw gedaald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pre-en post vaccinatie geïnduceerde antistofrespons tegen Influenza A H3N2
De vaccin-geïnduceerde antilichaamrespons in 26 gezonde vrijwilligers die een geïnactiveerd driewaardig subeenheid influenzavaccin aan te leggen met Influenza A/H1N1/Californië/2009, A/H3N2/Texas/2012 en B/Massachusetts/02/2012 voorafgaand aan de 2014 ontvangen evalueerden / 2015 griep seizoen. Figuur 6 ziet u een representatief voorbeeld van 2 vaccinontvangers. Interessant is dat tijdens dat bepaalde griep seizoen, A/H3N2/Texas/2012 was niet circuleren, en in plaats daarvan het seizoen de enigszins verschillende virale spanning opgenomen: A/H3N2/Zwitserland/2013. De virale hemagglutinine van A/H3N2/Texas/2012 en A/H3N2/Zwitserland/2013 Toon 97% reeks identiteit en verschillen in slechts elf aminozuren (Zie tabel 4), waarvan posities worden gemarkeerd in Figuur 7.
Figuur 7 : Hemagglutinine vergelijking van influenza A/H3N2 stammen. Wij vergeleken het hemagglutinine van de virale stammen A/Texas/50/2012 en A/Zwitserland/9715293/2013. Aangezien er geen hemagglutinine kristalstructuren van deze stammen, gebruikten we de kristalstructuur van de zeer soortgelijk hemagglutinine van de stam van influenza A/Victoria/361/201118, waaruit blijkt van 98% reeks identiteit met de Texas stam en 95% de identiteit van de reeks met de stam van Zwitserland. De posities van de aminozuur waarin de Texas en Zwitserland stammen verschillen zijn gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
We hebben vastgesteld een cross-reactive immune reactie voor de virale stammen A/H3N2/Zwitserland/2013 en A/H3N2/Texas/2012. HI waren titers tegen Influenza A/H3N2/Zwitserland/2013 aanzienlijk lager in termen van de meetkundige gemiddelde titers en geïnduceerde seroprotection (figuur 8A) in vergelijking met Influenza A/H3N2/Texas/2012 (Figuur 8).
Figuur 8 : Meetkundige gemiddelde antilichaam-titers van gezonde donoren. Het meetkundige gemiddelde antilichaam-titers (GMTs) 25 gezonde donoren vóór en na vaccinatie worden bepaald met behulp van twee verschillende antigenen. De gemiddelde titers van A/H3N2/Zwitserland/2013 (A) en A/H3N2/Texas/2012 (B) worden weergegeven. Een immuunrespons als gevolg van de vaccinatie kan worden waargenomen als toename van titers na de vaccinatie (d7-d60), in vergelijking met de GMTs vóór de vaccinatie (d0). 180 dagen na de vaccinatie, verlagen de GMTs opnieuw. Van de nota, heeft enige A/H3N2/Texas/2012 (dat was in het vaccin) beschermende titers bereikt. Staven geven meetkundig gemiddelde titers en snorharen geven de 95%-betrouwbaarheidsintervallen. De onderbroken lijn geeft de seroprotection drempel. De % van seroprotected mensen (titer > 1:40) wordt weergegeven in de grafiek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Na de vaccinatie verhoogd de titers antilichamen tegen A/H3N2/Texas/2012 in de meeste onderwerpen; Hoewel de stam A/H3N2/Zwitserland/2013 niet aanwezig in het vaccin was, de titer tegen A/H3N2/Zwitserland/2013 toegenomen in sommige vakken als goed. Figuur 9 toont de correlatie tussen beide titers over alle punten van de tijd met een R-2 van 0.745 voor een lineaire regressiemodel. Zoals men verwachten zou, was de inductie van de antistofrespons tegen A/H3N2/Zwitserland/2013 minder potent.
Figuur 9 : Kruisreactie tussen A/H3N2 influenzastammen. De A/H3N2/Texas titers van elke individuele en tijd punt worden uitgezet tegen de bijbehorende A/H3N2/Zwitserland-titers. Een lineaire regressiemodel toont een R2 van 0.745. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Mogelijke hemagglutination is gebaseerd op het type van bloed gebruikt
De virale hemagglutinine toont verschillende soorten-afhankelijke potentieel aan hemagglutinate van erytrocyten. Dit soort-afhankelijke effect heeft ook gevolgen op de hemagglutination inhibitie-test. Ter verbetering van de specificiteit van gemeten anti-virale titers, we het beste geschikt soort erytrocyten voor vijf virale antigenen geëvalueerd (Influenza B/Brisbane/60/2008 en B/Massachusetts/02/2012, Influenza A/H1N1/Californië/2009, A/H3N2/Texas/2012 en A / H3N2/Switzerland/2013) te bereiken van de maximale hemagglutination, maar ook de laagste Kruisallergie. We gebruikt positieve controlesera van het Nationaal Instituut voor biologische normen en controle (NIBSC) tegen elk antigeen voor het uitvoeren van deze tests.
Voor Influenza B, kunnen wij constateren dat de antistofrespons B/Massachusetts/02/2012 geïnduceerde geen bescherming tegen B/Brisbane/60/2008 bieden. Antilichamen tegen B/Brisbane/60/2008 toonde daarentegen Kruisallergie tegen B/Massachusetts/02/2012 bij een 4-fold lagere titer over verschillende erytrocyten (Zie tabel 3). Van belang, cavia bloed ging niet goed hemagglutinate met Influenza B. Turkije bloed deed best aan te tonen van het potentieel om te hemagglutinate en de hoogste titers met relatieve lage Kruisallergie naast de eerder genoemde A/H3N2/Texas en / Zwitserland-stammen.
| Turkije | Cavia | Kip | Menselijke type O | |
| B/Brisbane | 1024 | - | 1024 | 1024 |
| B/Massachusetts | 1024 | 384 | 768 | 1024 |
| A/H3N2/Zwitserland | 1024 | 1024 | - | 1024 |
| A/H3N2/Texas | 1024 | 1024 | 512 | 1024 |
| A/H1N1/Californië | 1024 | 1024 | 768 | 768 |
Tabel 3: Positieve controle tegen de respectieve influenza HA antigeen over verschillende soorten titers.
| No | A/H3N2/Texas/2012 stam | A/H3N2/Zwitserland/2013 stam | Positie |
| 1 | Asparagine (N) | Alanine (A) | 128 |
| 2 | Alanine (A) | Serine (S) | 138 |
| 3 | Isoleucine (I) | Arginine (R) | 140 |
| 4 | Arginine (R) | Glycine (G) | 142 |
| 5 | Asparagine (N) | Serine (S) | 145 |
| 6 | Fenylalanine (F) | Serine (S) | 159 |
| 7 | Glycine (G) | Valine (V) | 186 |
| 8 | Proline (P) | Serine (S) | 198 |
| 9 | Serine (S) | Fenylalanine (F) | 219 |
| 10 | Asparagine (N) | Aspartaat (D) | 225 |
| 11 * | Lysine (K) | Arginine (R) | 326 |
| * niet weergegeven in de kristalstructuur in figuur 8, omdat het hemagglutinine werd gesneden op residu 325. | |||
Tabel 4: Lijst van verschillende aminozuren van hemagglutinine tussen A/H3N2/Texas/2012 en A/H3N2/Zwitserland/2013 stammen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kwantificering van vóór en na vaccinatie influenza virus specifieke antilichamen titers is een belangrijk instrument voor vaccin studies nodig. Op basis van de surrogaat maatregelen ter bescherming tegen virusbesmetting, zoals seroprotection (> 1:40) of seroconversie (4-fold titer toename), vaccinatie strategieën kunnen worden geoptimaliseerd9. Met de meegeleverde protocollen kunt bepalen: (i) het hemagglutination potentieel van een bepaald virus, en (ii) de antilichamen titers voor een virus van belang.
Wijziging en probleemoplossing:
Dit protocol is gebaseerd op de WHO standaard12. We het protocol aangepast met behulp van PCR buis strips voor serum preparaten (zie stap 5). Deze wijziging bijgedragen tot een aanzienlijke vermindering van de werklast en te verhogen van de doorvoer van de bepaling. Verder, wij het antigeen bedrag met een kwart in de antigeen getitreerd stap, oftewel kosteneffectieve overuren verlaagd. Een lager bedrag van serum (10 µL) kan worden gebruikt voor de behandeling van rde-, waarmee vooral wanneer het bedrag van de steekproef beperkt is (bv, muis sera). De terug titratie en positieve controle zijn opgenomen in de antilichaam meting plaat om te dienen als een goede interne controle en om te controleren van het verouderen van erytrocyten.
Daarnaast gebruikt we verschillende erytrocyt concentraties dan die in de WHO standaard12 te stellen van de optimale omvang van de erytrocyt clot voor een goede visuele uitlezing. Het is raadzaam de controle van de concentratie van de erytrocyt vóór de bepaling uit te voeren om dit te garanderen. Hoewel, we hebben dit deel niet geoptimaliseerd in ons protocol, kunnen methoden, zoals absorptie meting met OD of cel tellen worden gebruikt.
Als de RDE is niet volledig geïnactiveerd, kunnen RBC worden desialylated en omgekeerde HA-positieve wells hemagglutination wordt gemeten bij kamertemperatuur. Hoewel we nooit dit probleem waargenomen, in dit geval raden we het uitvoeren van de HI bij 4 ° C, aangezien rde-activiteit beduidend lager bij 4 ° C. is Uitvoeren van de bepaling van de HI bij 4 ° C is echter langzamer.
Beperkingen van de techniek:
Een paar kritieke aspecten van de HI-bepaling omvatten de volgende punten: interessant, de hemagglutination is sterk afhankelijk van de bijzondere soort erytrocyt (bijvoorbeeld, Turkije of cavia RBC). Het optimale type van bloed moet worden getest voordat een bepaald virusstam wordt geëvalueerd en dezelfde soort bloed gedurende de test dient. Hoewel de inductie van Kruisallergie tussen virussen een immunologische voordeel in het geval van een enigszins nieuwe virus19,20 genereren kan, kan dit sommige problemen veroorzaken vanuit een diagnostische oogpunt als gevolg van lage specificiteit. Daarom moet cross reactiviteit tussen soortgelijke virussen zorgvuldig worden behandeld en besproken in studies. Door te kiezen voor erytrocyten van een specifieke soort, kan de hoeveelheid Kruisallergie enigszins worden verlaagd.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
De HI is een gevestigde goudstandaard methode zeer reproduceerbaar en betrouwbare resultaten leveren. Andere technieken zoals ELISA detecteert niet-neutraliserende antilichamen, overwegende dat de HI detecteert alleen antistoffen die binden aan de HA stam lus en daardoor correleren met neutralisatie.
Kritische stappen binnen het Protocol:
De belangrijkste stappen omvatten de serum behandeling met rde-naar de inactivering van aspecifieke inhibitoren en de binding aan de HA van het virus. Een andere belangrijke stap is te controleren voor hemolyse van de erythrocyten naarmate ze ouder worden na verloop van tijd.
Toekomstige toepassingen:
Het protocol kan worden gebruikt voor andere virussen met potentiële hemagglutination. Hoewel wij hebben alleen resultaten getoond op menselijke sera monsters hier, kan het zijn dat de bepaling ook worden gebruikt voor het meten van antilichamen titers in muis sera of in celkweek supernatant met gestimuleerd B-cellen (gegevens niet worden weergegeven). Kortom maakt de HI een snelle en reproduceerbare beoordeling van vaccin-geïnduceerde antilichamen titers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.E. werd ondersteund door een onderzoek geeft vanuit de "SNSF Ambizione Score"-programma (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Universiteit van Bazel, Basel van Stiftungsinfektionskrankheiten en Bangeter Rhyner Stiftung. L.K. werd gesteund door een subsidie van de Technische Universiteit van Graz, Oostenrijk. J.L. erkent ondersteuning door een iPhD fellowship van het initiatief van de SystemsX.ch in systemen biologie programma (9th oproep).
Acknowledgments
geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
- Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
- Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).
- Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042 (2014).
- Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
- Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282 (2015).
- Egli, A., et al. Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940 (2014).
- O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420 (2014).
- Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
- Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
- Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
- Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
- Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
- Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
- Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
- Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614 (2014).
- Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
- Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).
