Summary
Presentert protokollene beskriver hvordan du utfører en hemagglutination hemming analysen for å kvantifisere influensa-spesifikke antistoffer titers fra serumprøver influensa vaksine mottakere. Første analysen bestemmer optimal viral antigen konsentrasjoner av hemagglutination. Andre analysen kvantifiserer influensa-spesifikke antistoffer titers ved hemagglutination hemming.
Abstract
Antistoff titers brukes ofte som surrogat markører for serologisk beskyttelse mot influensa og andre patogener. Detaljert kunnskap om antistoffproduksjon før og etter vaksinasjon er nødvendig å forstå vaksine-indusert immunitet. Denne artikkelen beskriver en pålitelig punkt-til-punkt-protokoll for å avgjøre influensa-spesifikke antistoffer titers. Første protokollen beskriver en metode for å angi antigen beløpene kreves for hemagglutination, som standardiserer konsentrasjonen for senere bruk i andre protokollen (hemagglutination analysen, HA analysen). Andre protokollen beskriver kvantifisering av influensa-spesifikke antistoffer titers mot ulike viral stammer ved hjelp av en seriell utvanning av menneskelige serum- eller celle kultur supernatants (hemagglutination hemming analysen, HI analysen).
Anvendt eksempel viser vi antistoff responsen på en sunn kohort, som fikk en trivalent deaktivert influensavaksine. I tillegg vises det kryssreaktivitet mellom forskjellige influensavirus og metoder for å redusere kryssreaktivitet ved å bruke ulike typer dyr røde blodlegemer (RBCs) er forklart. Diskusjonen fremhever fordelene og ulempene med de presenterte analyser og hvordan fastsettelse av influensa-spesifikke antistoffer titers kan forbedre forståelsen av vaksine-relatert immunitet.
Introduction
Influensa-viruset er assosiert med betydelig sykelighet, dødelighet og høy helsetilbud koster1,2,3,4. Spesielt er eldre, nyfødte, gravide og pasienter med kronisk sykdom utsatt for mer alvorlige kliniske utfall. Vaksinasjon mot sirkulerende influensa viruset stammer er derfor det primære mål å redusere byrden av sykdom i disse høyrisikogrupper. Økningen av personlige immunrespons etter vaksinasjon, f.eks, influensa-spesifikke antistoffer over en beskyttende terskel, reduserer den personlige risikoen av infeksjon og generelt sannsynligheten for viral overføring innen en befolkning 5. en detaljert forståelse av vaksine-indusert humoral immunrespons i ulike befolkningsgrupper og ulike aldersgrupper er nøkkelen å besvare viktige klinisk spørsmål6,7,8 , 9, som: Hvorfor har noen eldre pasienter infeksjoner til tross for tidligere vaksinasjon? Hva er en "god" og "tilstrekkelig" vaksine-indusert beskyttelse? Hvor ofte bør en vaksine brukes til et svekket immunapparat pasient å nå beskyttende titers? Hva er den mest effektive dosen? Hva er virkningen av en roman adjuvant på etter vaksinasjon antistoff titers? Måling av vaksine-spesifikke antistoffproduksjon kan hjelpe svare på disse viktige spørsmålene og bedre vaksinasjon resultater.
Kvantifisering av virus-spesifikke antistoffer titers kan utføres med ulike immunologiske metoder. Dette inkluderer solid-fase10 eller perle-baserte ELISA11 analyser, HI analysen12og nøytraliserende analyser13. ELISA-baserte metoder gjør screening av relativt store mengder serumprøver mot ulike antigener. Også utforskes patogen-spesifikke immunglobulin (Ig) M og IgG separat. Selv om egenskapene til et antigen, f.eks, lineær aminosyresekvens eller virus-lignende partikler kan påvirke bindingen av antistoffer, spekteret av potensielle epitopes er veldig bredt og gir ikke informasjon på om et antistoff svaret har funksjonelle relevans.
Derimot nøytralisering analysen bestemmer potensialet av antistoffer å funksjonelt hemme infeksjon av celler og gjenspeiler nøytralisering potensielle. Men denne metoden er svært arbeidsintensiv, krever dyrking av cellelinjer og live virus, og derfor det er tidkrevende, dyrt og krever spesialutstyr.
Denne artikkelen beskriver en trinnvis Verdens helseorganisasjon WHO-baserte HI protokoll12 for å kvantifisere influensa-spesifikke antistoffer titers. Hemagglutination er en karakteristisk effekt av noen virus fører til agglutinerende av erytrocytter. Hemming av denne effekten med pasienten sera lar målingen for hemmende antistoff, som gjenspeiler en nøytraliserende virkning.
Vi har endret arbeidsflyten av WHO-protokollen for å tillate en mer effektiv håndtering av flere eksempler samtidig og dermed redusere tidsnok. Første protokollen beskriver fastsettelse av agglutinerende potensialet i en bestemt influensa antigen. Dermed bestemmes riktig influensa antigen konsentrasjon for andre protokollen. Denne delen skal gjentas med hver nye viral antigen, samt hvert parti av blod.
Andre protokollen beskriver fastsettelse av influensa-spesifikke antistoffer titers. Presentert protokollene er optimalisert for etterforskningen av influensavirus og koagulasjon men det kan også brukes for musen serumprøver eller celle-kultur supernatants fra stimulert immunceller, f.eksvirus-spesifikke B-celler. Resultatene kan beregnes som absolutt målt titers. I mange vaksine studier vises de geometriske gjennomsnittet titers og 95% konfidensintervall for hver bestemt populasjon. For tolkning, seroprotection eller serokonversjon brukes ofte til å beskrive mottakelighet for en populasjon visse virus. Seroprotection er definert som en titer ≥1:40 og serokonversjon som en mer enn 4-fold titer øker med oppnåelse av seroprotective titers mellom to tidspunkt (mest brukte pre-vaksinasjon og 30 dager etter vaksinasjon brukes).
Begge protokollene er enkel å bruke og de kan tilpasses et bredt spekter av problemstillinger. Spesielt de kan brukes til å bestemme raskt og pålitelig antistoff titers mot ulike andre virus med kapasitet på hemagglutination, som meslinger, polyomaviruses, kusma eller rubella14,15,16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien protokollene ble godkjent gjennom lokale etiske anmeldelsen bord (www.EKNZ.ch) og skriftlige samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
1. serum samling
- Samle serumprøver fra mennesker på tid interessepunkter. Til denne studien samlet vi sera dager 0 (tiden av influensa vaksinering), 7, 30, + 60 og + 180 etter vaksinasjon.
- For å få serum, sentrifuge eksempel rørene på 1200 x g i 10 min ved romtemperatur (20-25 ° C).
Merk: Ikke-sentrifugeres blodprøver bør lagres på 4 ° C, og lenger enn 24 timer. - Aliquot serum i forskjellige rør (cryo-ampuller) og Frys på-80 ° C før bruk.
- Utføre de påfølgende analyser batch-wise, inkludert alle tid-steder av en person til å redusere variasjonen i en pasient.
2. utarbeidelse av antigener
FORSIKTIG: Fem forskjellige antigener brukes (se Tabell for materiale). Forberede antigener i en grad 2 (BSL-2)-laboratorium.
- I henhold til produsentens instruksjoner, Rekonstituer totale innholdet i én lyofilisert influensa antigen ampullen med 1.0 mL destillert vann og la oppløst antigen stå i minst 5 minutter ved romtemperatur før du fortsetter.
- Aliquot antigen løsningen 1,5 mL rør og fryse-80 ° c til videre bruk.
3. forberedelse av kolera filtratet
Merk: Kolera filtratet brukes som en reseptor ødelegge enzym (RDE) i henhold til WHO protokoll12. Dette fjerner medfødte hemmere serum som ville forstyrre analysen17.
- Gjeninnføre den lyofilisert RDE i henhold til produsentens instruksjoner.
- Lagre RDE løsningen i en 15 mL tube på 4 ° C til fremme bruk.
4. HA analysen
Merk: For å sikre at HI analyser sammenlignbare mellom flere plater, samme mengde viruspartikler må brukes for hver plate. HA analysen (også kalt HA titrering) utføres for å kvantifisere viruspartikler nødvendig for hemagglutination, og registreres i HA enheter. En "enhet" hemagglutination er en driftsenhet avhengig av metoden HA titrering og ikke en måling av et absolutt beløp av virus. Dermed er en HA enhet definert som virus måtte agglutinate en like volum av en standardisert RBC suspensjon. Ifølge WHO er standardbeløpet brukes for HI analysen 4 HA enheter per 25 µL. Se figur 1for en illustrasjon av prinsippet om HA analysen.
Figur 1 : I hemagglutination og hemagglutination hemming. Ingen hemagglutination skjer i en negativ kontroll situasjon uten virus og antistoffer (venstre kolonne), og erytrocytter hemagglutinate kun gjennom influensavirus (midten kolonne). Men kan når hemagglutinin influensa virus er blokkert av virus-spesifikke antistoffer og ingen hemagglutination oppstå (høyre kolonne). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: RBCs brukes er avhengig av type influensa virus i analysen (tabell 1). Videre, for ulike typer 96-brønns mikro titer plater, inkubasjon tid samt utseendet på ikke-agglutinated cellene forskjellig (tabell 2).
| Influensa antigen | A/California/7/09 (H1N1) | A/Sveits/9715293/2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 | ||
| RBC arter | Kylling | Marsvin | Marsvin | Tyrkia | Tyrkia | ||
Tabell 1: influensa antigener og tilsvarende arter av RBCs. I henhold til produsentens instruksjoner (NIBSC).
| RBC arter | Kylling | Tyrkia | Marsvin | Menneskelige type O |
| Konsentrasjonen av RBCs (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1% | 1% |
| Typen være ferdig innen plate | V nederst | V nederst | U bunnen | U bunnen |
| Inkubasjon tid, RT | 30 min | 30 min | 1 time | 1 time |
| Utseendet på ikke-agglutinated celler | Knappen * | Knappen * | Halo | Halo |
Tabell 2: analysen forhold med ulike arter av RBCs. Ifølge WHO protokollen. (* renner da vippet).
-
Utarbeidelse av RBC suspensjon
- Fortynne RBC lager suspensjon (10%, v/v, bortsett fra menneskelig type O) (se Tabell for materiale) med fosfat bufret saltvann (PBS) å gjøre de riktige konsentrasjonene for mennesker, fugler og pattedyr RBCs 0,75% og 1%, henholdsvis.
Figur 2 : Plate utformingen av HA analysen. HA titrering utføres i duplikater. Ingen antigen ble lagt til kontroll radene. Se også Figur 4 for fastsettelse av antigen konsentrasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Forberedelse av 96-brønns mikro Titer Plate
Merk: Se figur 2 for en oversikt av platen.- Legge til 25 µL av PBS brønner 1 til 12 for hver brukte rad av en 96-brønns mikro titer plate med en flerkanals pipette (figur 2). Bruk V-formet mikro titer platen når du arbeider med avian RBCs, kylling og Tyrkia. Bruk U-formet mikro titer platen når du arbeider med pattedyr RBCs, som marsvin og menneskelige type O (tabell 2).
- Legg til 25 µL av influensa antigen i den første brønnen antigen-radene, som er ordnet i duplikater. Ingen antigen legges til kontroll radene. Kontroll radene skal ikke viser en hemagglutination effekt og tjene som negative kontroller (figur 2).
- Utføre en seriell 2-fold fortynning ved å overføre 25 µL fra den første brønnen antigen-radene påfølgende brønner ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland steg fortynning av pipettering opp og ned forsiktig 10 ganger.
- Kast de siste 25 µL av siste.
- Legge til 25 µL av PBS brønner 1 til 12 for hver brukte rad med en flerkanals pipette, for å nå et samlet volum på 50 µL per brønn.
- Legge til 50 µL av RBC suspensjon hver brukes også ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Trykk platen nøye 10 ganger på alle fire sidene å blande.
- Dekk platen med lokk og ruge ved romtemperatur for riktig mengde tid, avhengig av den RBC arter som brukes (se tabell 2). Ikke Flytt plate mens rugende.
Figur 3 : Agglutinerende mønstre av mennesker, fugler og pattedyr RBCs. V-formet mikro titer plater brukes når du arbeider med avian RBCs. Er avlesning utføres i en skråstilt plate posisjon, og ikke-agglutinated RBCs begynner å kjøre ned danner en tåre-lignende figur. U-formet microtiter plater brukes når du arbeider med pattedyr RBCs. Er avlesning utføres deretter i en ikke-vippet stilling, og ikke-agglutinated RBCs danner en liten halo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Lese platen
Merk: Readout er litt annerledes når du bruker avian RBCs sammenlignet pattedyr RBCs, på grunn av forskjellige formet mikro titer brønnene (Figur 3).- Presentasjon av avian RBCs
- Vipp plate 90° for 25 s.
Merk: Vippe platen er avgjørende for differensiering av avian mønstre, fordi alle tre forskjellige typer agglutinerende mønstre (helt agglutinated, delvis agglutinated, og ikke-agglutinated) vises som en knapp når ikke vippet. - Merke resultatene umiddelbart, mens platen er fortsatt i en vinkelrett posisjon, på en trykt ordningen av 96-brønns plate. Agglutinerende mønstre av avian RBCs vises i Figur 3.
- Vipp plate 90° for 25 s.
- Presentasjon av pattedyr RBCs
- Merke resultatene på en trykt ordningen av 96-brønns plate, uten vippe platen (horisontal posisjon på benken).
Merk: Når hemagglutination skjer, agglutinated cellene ikke bosette seg til bunnen, mens ikke-agglutinated celler vises som en halo på bunnen av brønnen. Halo delvis agglutinated cellene er mindre intens og har en større diameter (Figur 3).
- Merke resultatene på en trykt ordningen av 96-brønns plate, uten vippe platen (horisontal posisjon på benken).
- Fastsettelse av 4 HA enheter.
Merk: HA titrering endepunktet er siste brønnen hvor fullstendig hemagglutination oppstår. Dette viser vel 1 HA enhet av virus. 2-fold fortynninger av antigenet, to brønner foran HA titrering sluttpunktet er brønnen som inneholder 4 HA enheter av virus (Figur 4).
- Presentasjon av avian RBCs
Figur 4 : Presentasjon av HA-titrering med avian RBCs å bestemme titer 4 HA enheter. Optimal antigen beløpet kreves for hemagglutination er målt ved hemagglutination analysen (antigen titrering analysen). Siste brønnen hvor fullstendig hemagglutination sted HA titrering sluttpunktet og inneholder 1 HA enhet. På grunn av de 2-fold fortynninger av antigenet, to brønner foran HA titrering sluttpunktet, tilsvarer titer 4 HA enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Hei analysen
Merk:-Arbeidsflyten for protokollen er blitt optimert å tillate en mer effektiv håndtering av flere eksempler på samme tid, ved hjelp av PCR rør striper og en thermo cycler (se nedenfor).
-
Utarbeidelse av serumprøver
Merk: Forberede serumprøver i et BSL-2 laboratorium.- Tine frossen serumprøver av hver tid hver person (se trinn 1.2) i romtemperatur.
- Legge til en aliquot av 10 µL av hver tinte serum prøve en tube med en PCR tube stripe (10-rør i en stripe).
Merk: Den store fordelen med å bruke PCR tube strimler er at en flerkanals pipette kan brukes til følgende i HI analysen; Dette sparer mye tid når testing mye serumprøver og utføre repeterte målinger av samme prøvene for antistoff titers mot ulike viruset stammer. - Lagre de aliquoted serumprøver i PCR tube strimler ved-80 ° C før bruk.
- En dag før HI analysen utføres, tine serum eksempel dele rundt ved romtemperatur.
- Legge til 10 µL av aktuelle anti-serum en tom PCR-rør.
Merk: For å tjene som en positiv, anti-serum mot et bestemt virus må tilsvare brukte viruset. Positiv kontrollen gir standardisering av platen ytelsen over flere plater. - Legge til 30 µL av kolera filtratet løsning hver serum aliquot og anti-serum (3 bind av kolera filtratet 1 volum av serum) ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Holde PCR rør i et PCR 96-brønns stativ eller en tom tips-boks og vortex 5 s.
- Inkuber prøvene overnatting på 37 ° C ved hjelp av en thermo cycler.
- Inkuber prøvene på 56 ° C i 30 min å deaktivere kolera filtratet ved hjelp av en thermo cycler.
Merk: Avhengig av thermo-cycler dette trinnet kan programmeres til å ytterligere automatisere prosessen. - Holde PCR rør i et PCR 96-brønns stativ eller en tom tips-boks og vortex 5 s.
- Lagre prøver på 4 ° C i kjøleskapet til bruk for HI analysen.
Figur 5 : Plate design og arbeidsflyt til HI analysen. Fem tidspunkt av to personer kan måles på en plate. HI titer varierer fra 8 til 1024. En anti-serum av brukte antigen servert som en positiv og en tilbake titrering ble utført for å kontrollere hvis antigen fortynning lik 4 HA enheter. Seriell fortynning av serum utvalget vises for 2 personlige vaksine mottakere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Hei analysen
Merk: Hvis en illustrasjon av prinsippet om HI analysen se figur 1. Avhengig av viruset brukes forskjellige arter av RBCs for analysen (tabell 1). De ulike artene av RBCs brukes i ulike typer 96-brønns plater og inkubasjon tid samt utseendet på ikke-agglutinated cellene er forskjellig (tabell 2). For HI analysen legges 4 HA enheter av virus eller antigen til 2-fold fortynning serien av prøvene.-
Tilberedning av antigen
- Beregne volumet av antigen løsning nødvendig av antall 96-brønns platene brukes (25 µL antigen per godt × 96 = 2400 µL antigen per 96-brønns plate; legge til 100 µL per plate ekstra på grunn av bruken av et reservoar for flerkanals pipette, totalt 2,5 mL av antige n per plate).
Merk: For eksempel hvis måler 100 serumprøver 10 plater er nødvendig (10 prøver per plate): 2,5 mL x 10 = 25 mL av antigen løsning nødvendig totalt. - Forberede riktig fortynning av 4 HA beregnet volumet med PBS.
Merk: 4 HA enheter bestemmes for HA analysen. For riktig mengde antigen, dele beregnet volumet titer tilsvarer 4 HA enheter. For eksempel 4 HA enheter tilsvarer en fortynning av 1/64, og vi trengte 15.000 µL av antigen løsning er nødvendig: 15.000/64 = 234.4 µL av oppløst lyofilisert influensa antigen legges.
- Beregne volumet av antigen løsning nødvendig av antall 96-brønns platene brukes (25 µL antigen per godt × 96 = 2400 µL antigen per 96-brønns plate; legge til 100 µL per plate ekstra på grunn av bruken av et reservoar for flerkanals pipette, totalt 2,5 mL av antige n per plate).
-
Utarbeidelse av RBC suspensjon
- Beregne volumet av RBC suspensjon nødvendig av antall 96-brønns mikro titer platene brukes (50 µL RBC suspensjon per godt × 96 = 4800 µL RBC suspensjon per 96-brønns plate; legge til 200 µL per plate ekstra på grunn av bruken av et reservoar for flerkanals pipette) .
- Fortynne RBC lager suspensjon (normalt 10%, v/v, bortsett fra menneskelig type O) med PBS å gjøre de riktige konsentrasjonene for mennesker, fugler og pattedyr RBCs 0,75% og 1%, henholdsvis.
-
Forberedelse av 96-brønns mikro titer plate
- Etiketten 96-brønns mikro titer plater (prøve-ID, positiv kontroll og tilbake titrering). Kontroller nøye plate retningen i figur 5 .
- Legge til 25 µL av PBS hver godt unntatt den første brønnen i "tilbake titrering" rad (figur 5,12 rad ) bruke den flerkanals pipette.
Merk: En tilbake titrering ble utført for å kontrollere hvis brukt antigen fortynning lik 4 HA enheter. Et antigen titer 4 HA enheter angis hvis hemagglutination oppstår i de første tre brønnene i raden "tilbake titrering", men ikke i fjerde godt. - Legge til 50 µL av forberedt antigen løsningen (beskrevet i 5.2.1 Oppgi) i den første brønnen i "tilbake titrering" rad(12 rad) .
- Legg til 25 µL av de RDE-behandlet serumprøver første brønnene rader 1-10 på hver tallerken med flerkanalslyd pipette.
- Legge til 25 µL av aktuelle anti-serum første brønn på 11th raden som en positiv.
- Utføre føljetong 2-fold fortynninger ved å overføre 25 µL fra den første brønnen for hver rad (1-12) påfølgende brønner ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland ved pipettering opp og ned 10 - 15 ganger for hvert fortynning trinn. Samme tipsene kan brukes for hvert fortynning trinn per prøve.
- Kast de siste 25 µL av siste.
- Legge til 25 µL av antigen løsningen med en flerkanals pipette hver brønn rader 1 til 11 (serumprøver og anti-serum). Samme tipsene kan brukes hvis de ikke berører brønnene.
- Legg til 25 µL av PBS i stedet for antigen i hver brønn i "tilbake titrering" rad(12 rad) .
- Trykk platen nøye 10 ganger på alle fire sidene å blande.
- Dekk platen med lokk og ruge ved romtemperatur for 30 min. Ikke Flytt plate mens rugende.
- Legge til 50 µL av RBC suspensjon i hver brønn.
- Trykk platen nøye 10 ganger på alle 4 sider å blande.
- Dekk platen med lokk og ruge ved romtemperatur for riktig mengde tid, avhengig av den RBC arter som brukes (se tabell 2). Ikke Flytt plate mens rugende.
-
Lese platen
Merk: HI titer er den resiproke verdien av den siste fortynning av (anti-) serum som helt hemmer hemagglutination. Det er viktig å tenke at de RDE-behandlet sera var allerede fortynnet 1:4 og etter føljetong fortynning trinn, sera i første brønnene fortynnes 1:8, som tilsvarer en HI titer 8.- Presentasjon av avian RBCs
- Vipp plate 90° for 25 s.
Merk: Vippe platen er avgjørende for differensiering av avian mønstre, fordi alle tre forskjellige typer agglutinerende mønstre (helt agglutinated, delvis agglutinated, og ikke-agglutinated) vises som en knapp når ikke vippet. - Merke resultatene umiddelbart, mens platen er fortsatt i en vinkelrett posisjon, på en trykt ordningen av 96-brønns plate. Agglutinerende mønstre av avian RBCs vises i Figur 3.
- Vipp plate 90° for 25 s.
- Presentasjon av pattedyr RBCs
- Merke resultatene på en trykt ordningen av 96-brønns plate, uten vippe platen.
Merk: Når hemagglutination skjer, agglutinated cellene ikke slå mens ikke-agglutinated celler vises som en halo på bunnen av brønnen. Halo delvis agglutinated cellene er mindre intens og har en større diameter (Figur 3). - Bestemme HI av hvert utvalg og overføre den til en datamaskin tabell (figur 6)
- Merk: Delvis agglutinated brønner ble bestemt som en lavere titer. For eksempel hvis en serum prøve helt hemmer hemagglutination til 4 godt (1: 64 fortynning) og de 5th godt (1:128 fortynning) er delvis agglutinated, så HI titer er satt til den lavere titer 64 for den endelige analysen (figur 6, 4th rad).
- Merke resultatene på en trykt ordningen av 96-brønns plate, uten vippe platen.
- Presentasjon av avian RBCs
-
Tilberedning av antigen
Figur 6 : Presentasjon av HI analysen med avian RBCs. Før og etter vaksinasjon forårsaket influensa bestemt antistoffet svaret avhenger av HI analysen. I dette eksemplet har person en høyere HI titers enn to. Begge to vise et antistoff svar etter vaksinasjon; 180 dager etter vaksinasjon er antistoff titers for begge to redusert igjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før og etter vaksinasjon indusert antistoffet svaret mot influensa A H3N2
Vaksine-indusert antistoffet svaret ble vurdert i 26 friske frivillige som fikk en deaktivert trivalent delenhet influensavaksine inneholder influensa A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 og B/Massachusetts/02/2012 før 2014 / 2015 influensa sesongen. Figur 6 viser et representativt eksempel på 2 vaksine mottakere. Interessant, under den bestemt influensa sesongen, A/H3N2/Texas/2012 var ikke sirkulerer, og i stedet sesongen inkludert noe annerledes viral belastning: A/H3N2/Sveits/2013. Den viral hemagglutinin A/H3N2/Texas/2012 og A/H3N2/Sveits/2013 viser 97% sekvens identitet og forskjellige bare elleve aminosyrer (se Tabell 4), hvis stillinger er uthevet i figur 7.
Figur 7 : Hemagglutinin sammenligning av A/H3N2 influensa stammer. Vi sammenlignet hemagglutinin av viral stammer A/Texas/50/2012 og A/Sveits/9715293/2013. Siden det er ingen hemagglutinin krystall strukturer av disse stammer, brukte vi krystallstruktur av den svært lignende hemagglutinin av influensavirus A/Victoria/361/201118, som viser 98% sekvens identitet med Texas belastning og 95% sekvensen identitet med Sveits belastningen. Aminosyren posisjonene der Texas og Sveits stammer avvike utheves. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vi observerte en cross-reactive immunrespons for viral stammer A/H3N2/Sveits/2013 og A/H3N2/Texas/2012. Hei var titers mot influensa A/H3N2/Sveits/2013 betydelig lavere geometriske gjennomsnittet titers og indusert seroprotection (figur 8A) i forhold til influensa A/H3N2/Texas/2012 (figur 8B).
Figur 8 : Geometriske gjennomsnittet antistoff-titers sunn givere. De geometriske gjennomsnittet antistoff-titers (GMTs) av 25 friske blodgivere før og etter vaksinasjon fastsettes ved hjelp av to forskjellige antigener. De betyr titers A/H3N2/Sveits/2013 (A) og A/H3N2/Texas/2012 (B) vises. En immunrespons på grunn av vaksinasjon kan observeres som øker titers etter vaksinasjon (d7-d60), sammenlignet med GMTs før vaksinasjon (d0). 180 dager etter vaksinasjon, redusere GMTs igjen. Legg merke når bare A/H3N2/Texas/2012 (som var i vaksinen) beskyttende titers. Barer angir geometriske gjennomsnittet titers, og værhår angir 95% konfidensintervall. Den stiplede linjen angir seroprotection terskelen. % Av seroprotected folk (titer > 1:40) vises i diagrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter vaksinasjon økt antistoff titers mot A/H3N2/Texas/2012 i de fleste fag; Selv om A/H3N2/Sveits/2013 belastningen ikke finnes i vaksinen, økt titer mot A/H3N2/Sveits/2013 i noen fag. Figur 9 viser sammenhengen mellom begge titers over alle tidspunkt med en R2 av 0.745 for en lineær regresjonsmodell. Som man ville forvente, var induksjon av antistoff svaret mot A/H3N2/Sveits/2013 mindre potente.
Figur 9 : Kryssreaksjon mellom A/H3N2 influensa stammer. A/H3N2/Texas titers av hver individuelle og tid plottes mot de tilsvarende A/H3N2/Sveits titers. En lineær regresjonsmodell viser en R2 av 0.745. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hemagglutination potensial er basert på typen blood benyttes
Viral hemagglutinin viser forskjellige arter-avhengige potensial til å hemagglutinate erytrocytter. Denne arter-avhengige effekten også påvirker hemagglutination hemming analysen. For å forbedre spesifisiteten av målt anti-viral titers, vi vurdert best egnet type erytrocytter for fem viral antigener (influensa B/Brisbane/60/2008 og B/Massachusetts/02/2012, influensa A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 og A / H3N2/Switzerland/2013) å oppnå maksimal hemagglutination, men også den laveste kryssreaktivitet. Vi brukte positiv kontrollsera fra National Institute for Biological standarder og kontroll (NIBSC) mot hver antigen utføre disse analyser.
For influensa B, kunne vi observere at B/Massachusetts/02/2012 indusert antistoffet svaret ikke gir beskyttelse mot B/Brisbane/60/2008. Derimot viste antistoffer mot B/Brisbane/60/2008 kryssreaktivitet mot B/Massachusetts/02/2012 på en 4-fold lavere titer over forskjellige erytrocytter (se tabell 3). Av interesse, guinea gris blod ikke riktig hemagglutinate med influensa B. Tyrkia blod gjorde best dukke potensial til å hemagglutinate og de høyeste titers med relativ lav kryss-reaktivitet bortsett fra den tidligere nevnte A/H3N2/Texas og / Sveits stammer.
| Tyrkia | Marsvin | Kylling | Menneskelige type O | |
| B/Brisbane | 1024 | - | 1024 | 1024 |
| B/Massachusetts | 1024 | 384 | 768 | 1024 |
| A/H3N2/Sveits | 1024 | 1024 | - | 1024 |
| A/H3N2/Texas | 1024 | 1024 | 512 | 1024 |
| A/H1N1/California | 1024 | 1024 | 768 | 768 |
Tabell 3: Positive kontroll titers mot respektive influensa HA antigen på tvers av ulike arter.
| nei | A/H3N2/Texas/2012 belastning | A/H3N2/Sveits/2013 belastning | Posisjon |
| 1 | Asparagine (N) | Alanin (A) | 128 |
| 2 | Alanin (A) | Serine (S) | 138 |
| 3 | Isoleucin (I) | Arginine (R) | 140 |
| 4 | Arginine (R) | Glysin (G) | 142 |
| 5 | Asparagine (N) | Serine (S) | 145 |
| 6 | Fenylalanin (F) | Serine (S) | 159 |
| 7 | Glysin (G) | Valin (V) | 186 |
| 8 | Proline (P) | Serine (S) | 198 |
| 9 | Serine (S) | Fenylalanin (F) | 219 |
| 10 | Asparagine (N) | Aspartate (D) | 225 |
| 11 * | Lysin (K) | Arginine (R) | 326 |
| * ikke vises i krystallstruktur i figur 8, fordi hemagglutinin var kappede på rester 325. | |||
Tabell 4: Liste over ulike aminosyrer av hemagglutinin mellom A/H3N2/Texas/2012 og A/H3N2/Sveits/2013 stammer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifisering av pre- og etter vaksinasjon influensa virus spesifikt antistoff titers er viktig for nødvendig for vaksine studier. Basert på surrogat tiltak mot virusinfeksjon, for eksempel seroprotection (> 1:40) eller serokonversjon (4-fold titer økning), vaksinasjon strategier kan være optimalisert9. Ved hjelp av medfølgende protokoller kan bestemme: (i) hemagglutination potensialet for et bestemt virus, og (ii) antistoff titers et virus av interesse.
Modifikasjon og feilsøking:
Denne protokollen er basert på WHO standard12. Vi endret protokollen ved hjelp av PCR tube strimler for serum forberedelsene (se trinn 5). Denne endringen hjalp redusere arbeidsbelastningen og øker gjennomstrømningen av analysen. Videre redusert vi hvor antigenet med en fjerdedel i antigen titrering trinn som er kostnadseffektiv overtid. En lavere mengde serum (10 µL) kan brukes for RDE behandling, som hjelper spesielt når prøven er begrenset (f.eks, musen sera). Tilbake titrering og positiv kontroll er inkludert i antistoff måling platen som en forsvarlig intern kontroll og å overvåke aldring av erytrocytter.
I tillegg har vi brukt ulike røde blodlegemer konsentrasjoner enn WHO standard12 sette den optimale størrelsen på røde blodlegemer blodpropp for en god visuell avlesning. For å garantere dette bør sjekke røde blodlegemer konsentrasjonen før analysen. Selv om vi ikke har optimalisert denne delen i våre protokollen, brukes metoder som absorbansen måling med OD eller cellen teller.
Hvis RDE ikke er fullstendig inaktiv, kan RBCs være desialylated og omvendt HA-positive brønner når hemagglutination er målt ved romtemperatur. Selv om vi aldri observert dette problemet, i dette tilfellet foreslår vi utfører HI ved 4 ° C, siden RDE er betydelig lavere på 4 ° C. Det er imidlertid tregere å utføre HI analysen på 4 ° C.
Begrensninger av teknikken:
Noen viktige sider ved HI analysen omfatter følgende punkter: interessant, hemagglutination er sterkt avhengig av bestemt type røde blodlegemer (f.eks, Tyrkia eller marsvin RBC). Optimal typen blod bør testes før en bestemt viruset belastning evalueres og samme type blod skal brukes i hele analysen. Selv om induksjon av kryssreaktivitet mellom virus kan generere en immunologiske fordel ved en litt nye virus19,20, kan dette forårsake noen problemer fra en diagnostisk synspunkt på grunn av lav spesifisitet. Kryssreaksjon mellom lignende virus bør derfor adressert nøye og diskutert i studier. Ved å velge erytrocytter fra en bestemt arter, kan mengden av kryssreaktivitet noe nedsatt.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder:
HI er en veletablert gullstandarden gir svært reproduserbare og pålitelige resultater. Andre teknikker som ELISA oppdager ikke nøytralisere antistoffer, mens HI bare påviser antistoffer som binder til HA stilk sløyfen og dermed korrelerer med nøytralisering.
Avgjørende skritt i protokollen:
De viktigste trinnene omfatter serum behandling med RDE å deaktivere uspesifikke hemmere og binding til HA av viruset. Et annet viktig skritt er å styre for hemolyse av Målestørrelsen på erytrocytter som de alder over tid.
Fremtidige programmer:
Protokollen kan brukes for andre virus med hemagglutination potensielle. Selv om vi har bare vist resultater på menneskelig sera vareprøver her, kan analysen også brukes til å måle antistoff titers i musen sera eller i cellekultur supernatant med stimulert B-celler (data ikke vist). Oppsummert tillater HI en rask og reproduserbar vurdering av vaksine-indusert antistoff titers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A. ble støttet av en forskning tilskudd fra "SNSF Ambizione Score" program (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" universitet i Basel, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel og Bangeter Rhyner Stiftung. L.K. ble støttet av en bevilgning av det tekniske universitetet i Graz, Østerrike. JL erkjenner støtte av en iPhD fellesskap av SystemsX.ch initiativ i biologi programmet (9th samtale).
Acknowledgments
ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
- Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
- Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).
- Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042 (2014).
- Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
- Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282 (2015).
- Egli, A., et al. Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940 (2014).
- O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420 (2014).
- Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
- Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
- Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
- Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
- Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
- Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
- Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
- Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614 (2014).
- Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
- Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).
