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Biochemistry

人死后脑中洗涤剂不溶性蛋白的富集

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/55835

Summary

本文介绍了一种从人死后大脑中浓缩洗涤剂不溶性蛋白集料的简化分馏方法。

Abstract

在本研究中, 我们描述了一个缩写的单步分馏协议, 以丰富的洗涤剂不溶性蛋白聚集从人死后大脑。离子洗涤剂 n-十二烷基肌 (sarkosyl) 有效地 solubilizes 本机折叠蛋白质在脑组织允许丰富的洗涤剂不溶性蛋白聚集从广泛的神经退行性 proteinopathies, 如阿尔茨海默病 (AD), 帕金森氏症和肌萎缩侧索硬化症, 和朊病毒疾病。人的控制和 AD 死后的脑组织均匀化和沉淀的离心存在的 sarkosyl 丰富的洗涤剂不溶性蛋白骨料, 包括病理磷酸化 tau, 纤维的核心组成部分在广告中缠结。西部印迹显示了聚合磷酸化 tau 和洗涤剂可溶性蛋白, 早期 Endosome 抗原 1 (EEA1) 在控制和 AD 脑的差异溶解度。蛋白质组分析还显示, 与对照组相比, 在 AD 脑 sarkosyl 不溶性的片段中, β淀粉样蛋白 (a)、tau、snRNP70 (U1-70K) 和载脂蛋白 E (脂蛋白) 的富集与以前的组织分馏策略相一致.因此, 这一简单的浓缩协议是理想的广泛的实验应用范围从西方印迹和功能蛋白 co-aggregation 化验, 以大规模谱蛋白质组学。

Introduction

神经退行性疾病, 如阿尔茨海默氏病 (AD)、帕金森氏病 (PD)、亨廷顿氏病 (HD)、肌萎缩侧索硬化症 (ALS), 以及与之密切相关的朊病毒疾病, proteinopathies 的特点是逐渐积累洗涤剂-不溶性蛋白质聚集在大脑中伴随着认知能力的下降。1,2这种共同的病理特征被认为在这些神经退行性疾病的病因和病理生理学中起着中心作用。2这些聚合体通常由聚合淀粉样纤维组成, 它们由错误蛋白的重复单位构成, 其表现为跨β结构。1,2,3,4生化, 淀粉样蛋白聚合体对化学或热变性和增溶具有很强的抗性,3在传统生化技术中对其纯化、分析和研究提出了独特的挑战。2,5,6,7,8,9,10,11不难的是, 不溶性的蛋白质组分一直是许多研究神经退行性疾病的病理生理学的焦点, 涉及错误蛋白的积累。6,12,13,14

生化分馏技术经常被用来丰富从死后脑匀的洗涤剂不溶性分数。6,12,13,14最常见的方法之一是对组织匀进行顺序提取, 并增加严格的缓冲剂和洗涤剂, 然后离心分解可溶性和不溶性组分。通常使用的顺序分馏协议6,14涉及在无洗涤剂低盐 (LS) 缓冲液中的冷冻组织样品的均一性, 然后依次提取含有高盐, 非离子洗涤剂, 高蔗糖, 离子洗涤剂, 最后 chaotropes 像尿素的缓冲器。6,14此类顺序分馏协议的一个明显的缺点是完成它们所需的大量时间和人工承诺。包括均匀化和离心, 一个典型的五步分馏协议可能需要几个小时甚至几天的时间来完成。4,6,7,10,15,16,17,18此外, 由于许多病理蛋白聚集物仍然不溶于所有, 但最苛刻的条件19,20大多数生成的分数都是有限的值。因此, 使用高盐浓度和非离子洗涤剂的不太严格的分馏步骤基本上是多余的。

以往的研究表明, 离子洗涤剂 n-十二烷基肌 (sarkosyl) 是一个很好的候选的简化一步洗涤剂分馏协议。5,6,12,13,14,21,22,23作为一种变性洗涤剂, sarkosyl 是严格的, 足以溶解在大脑中的绝大多数本机折叠的蛋白质, 没有磷错误蛋白聚合组成β-淀粉样 (a),6,11磷酸化 tau (pTau),6焦油 DNA 结合蛋白 43 (TDP-43),14 α-核,12,13病,23或 U1 小核均一 (U1 snRNPs), 如 U1-70K。5,21,22由于 sarkosyl 比无处不在的阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠 (sds) 的严格, 它保留了不太坚固的聚形式的错误蛋白骨料, 无法抵御 sds 治疗。9

以前, 我们描述了一个缩写的洗涤剂分馏协议, 取得的结果可与更费力的顺序分馏方法相媲美。5通过省略较不严格的分馏步骤, 我们得以开发出一种简便的单步分馏协议, 用于丰富死后人脑中的洗涤剂不溶性蛋白聚集物。5本文所述的详细协议非常适合于从西方印迹和大量谱蛋白质组学到功能性蛋白质折叠和聚合播种试验等一系列实验应用。5,6,21

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Protocol

道德声明: 所有脑组织都是从埃默里老年痴呆和 #39 的疾病研究中心 (自抗扰) 脑银行获得的。人类死后组织是在适当的机构审查委员会 (IRB) 协议下获得的.

1. 均匀化和分馏

  1. 组织选择
    注意: 从健康控制 (Ctl) 和经病理证实的 AD 病例的冷冻死后额叶皮质组织从埃默里抗扰的脑银行 ( n = 2)。病理评价淀粉样菌斑的分布情况, 根据该协会建立一个老年痴呆症和 #39 的疾病的登记表. 半定量评分标准 24 , 虽然纤维缠结病理学根据 Braak 分期系统评估。 16
    1. 从健康控制 (Ctl) 和经病理证实的 AD 病例中获得冰冻死后的脑组织。利用干冰、钳子和刀片的容器, 在 tared 的一次性重量船上, 从每个组织样品中去除250毫克的灰质部分, 注意防止组织解冻。记录每个工件的重量, 使其均匀化.
    2. 用镊子和剃刀对灰色物质进行250毫克的目测检查, 找出外灰质与内白质之间的界面。避免白质, 更重要的是, 任何大型血管或血腥地区, 脑膜, 或蛛网膜。在切割过程中, 保持组织冷冻, 迅速工作, 并频繁地将称重的船与脑组织放在聚苯乙烯容器中干冰.
    3. 用分析天平记录每个冰冻切片的灰物质的确切重量。计算 dounce 均匀化所需的低盐 (LS) 缓冲器 (见表 1) 的体积 (5 毫升/克或20% 瓦特/伏).
    4. 准备10毫升 LS 缓冲区与1x 蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒和冰镇冰.
    5. 从干冰中取出称重的组织和称量的船, 并在解冻时将其切成大约 2 x 2 毫米的碎片。转到2毫升 pre-chilled dounce 均质管在冰上.
    6. 添加5毫升/克 (20% 瓦特/五) 的 ice-cold 低盐 (LS) 缓冲与1X 蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒.
    7. 质在冰上使用大约10招的高间隙杵 a 和15招低间隙杵 B.
    8. 使用玻璃巴斯德吸管将所有匀浆转移到2毫升聚丙烯管上。把管子和 #8220; #8221; (总匀浆), 组织病例数, 匀浆体积. 和 #160; 分0.8 毫升成一个标签1.5 毫升的管。任何多余的匀浆可以类似 aliquoted 和存储在-80 和 #176; C.
    9. 每0.8 毫升分, 添加100和 #181; L 每5米氯化钠和 10% (w/五) sarkosyl 的浓度分别为0.5 米和1% 瓦特/伏。通过反演和在冰上孵育15分钟的标签管与 #34; TH 和 #34; (总匀浆-Sarkosyl), 以指示匀是在 Sarkosyl 缓冲区 ( 表 1 ).
    10. 几种每管三 5 s 脉冲在冰上30% 振幅 (最大强度 = 40%) 使用 mircotip 探针. #160;
    11. 使用二辛可宁酸测定匀的蛋白质浓度 25 方法.
      注: 每克组织5毫升的匀制备的平均蛋白质浓度为15-20 毫克/毫升。匀可以立即分馏或储存在-80 和 #176; C 直到使用.
    12. 使用 ice-cold 萨克缓冲区 ( 表 1 ) 将匀稀释至10毫克/毫升, 并配有1x 蛋白酶和磷酸酶抑制剂.
    13. 将每个 TH 匀浆的5毫克蛋白 (0.5 毫升) 转化为500和 #181; 聚碳酸酯 ultracentrifuge 管和对萨克缓冲器的配对平衡。将管装入 pre-chilled 转子, ultracentrifuge 在 18万 x g 处为30分钟, 在4和 #176; c. 将 sarkosyl 可溶性清 (S1) 转移到1.5 毫升管, 并在-80 和 #176 上储存; c.
      注: (可选洗涤) 增加200和 #181; 萨克缓冲区 L 的 ultracentrifuge 管含有洗涤剂不溶性分数 (P1), 并从 ultracentrifuge 管底部取出小球 (P1) 使用200和 #181; l 吸管尖端.
    14. 简要脉冲-旋转2-3 秒 (和 #8804; 2500 x g ) 上的反转管, 离心将颗粒 (P1) 和缓冲器转移到下面的1.5 毫升管上。重的不溶性颗粒 (P1) 在萨克缓冲区通过移上下, 以确保颗粒被打乱.
    15. 对平衡和离心机在 18万 x g 为另外 30 min 在4和 #176; C. 和 #160;
    16. 丢弃可选洗涤上清液 (S2), 并在50-75 和 #181 中孵育 sarkosyl 不溶性颗粒 (P2); 尿素缓冲器 ( 表 1 ), 具有 1x PIC (蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒), 室温下30分钟, 溶解颗粒.
      注: 温尿素缓冲液用于室温前, 避免 SDS 沉淀。对于洗涤剂敏感的应用, 从尿素缓冲液中省去 SDS, 考虑在尿素缓冲液溶液前, 在低盐缓冲液中洗涤不溶性颗粒 (P2).
    17. 将悬浮颗粒 (P2) 转换为0.5 毫升管, 并使用短 (1 s) mircotip 超声在20% 振幅 (最大强度 = 40%), 以完全溶解颗粒.
    18. 测定 sarkosyl 可溶性 (S1) 和不溶性 (P2) 组分的蛋白质浓度。使用这些分数立即或存储在-80 和 #176; C 直到使用.

2。免疫

  1. 西方印迹
    注: 根据先前报告的程序进行了轻微修改, 进行了印迹。5 , 10
    1. 准备40和 #181; g 样品中总匀 (TH S), 萨克可溶性 (S1) 和沙克不溶 (P2) 分数在 1X Laemmli SDS 页样本缓冲区与5毫米 TCEP pH 7。在95和 #176 孵育样品; C 为 5 min.
    2. 在预制10井4-12% 双-三页凝胶中装载样品。Electrophorese 在 80 v 为第一厘米 (10 分钟) 和 120 v 为剩下的人 (60 分钟) 或直到跟踪染料到达胶凝体的底部.
    3. 使用新的刀片和凝胶刀来拆分-打开预制凝胶盒。轻轻地把梳子和底部的凝胶与一个新鲜的剃须刀刀片.
    4. 重200和 #181 中的不溶性球团 (P1); 移上下。
    5. 在印迹机上使用干式传输方法将0.2 和 #181; m 硝化纤维素膜 (见材料表).
    6. 阻塞缓冲膜 (bb), 不吐温20为30分钟, 后跟 bb 与0.05% 吐温 20 (bb/T) 为30分钟。阻塞后, 用 TBS/T (0.1% 吐温 20) 冲洗膜, 5 分钟清除多余的阻塞缓冲区.
    7. 准备 1:1, 000 稀释主要抗体 pT231, Tau-2 (盘头), AT8和 EEA1 在 BB/T (0.05% 吐温 20).
    8. 在4和 #176 的一夜之间在主抗体溶液中孵育膜, 循环搅拌。在 TBS/吨冲洗膜 3 x 15 min.
    9. 用1:20,000 稀释的荧光标记近红外二次抗体, 在室温下的60分钟, 在黑暗中的振动筛上探测膜。在 tbs/T 和 2 x 5 分钟的 tbs 中冲洗 3 x 10 分钟的膜.
    10. 在适当的激发波长上使用红外成像系统扫描膜 ( 如红外线染料的 700 nm (红色通道) 680 山羊 anti-mouse igg (h + l) 第二和 800 nm (绿色通道) 用于红外染料790驴兔 igg (h + l) 第二级).
    11. 使用成像软件对信号强度进行量化, 并按照制造商和 #39 的指示执行密度测量, 确保 auto-background 设置为整个背景的平均值.

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Representative Results

缩写的单步 sarkosyl 分馏协议是用来丰富从控制和 AD 死后大脑 (图 1) 的洗涤剂不溶性蛋白集料。S1、S2 和 P2 分数的蛋白质通过 SDS-页解决, 固定在马斯亮蓝色定影液中15分钟, 然后用马斯亮亮蓝 G-250 染色缓冲液进行温和染色。悬浮步骤是可选的, 因为 S2 馏分中的蛋白质含量是不可检测的 (见 1.1.14)。西方印迹分析 ( 图 2A B) 清楚地表明, 在 AD 脑中, 病理上的高分子量磷酸化 tau 骨料是 sarkosyl 不溶的, 很少 pTau 残留在sarkosyl 可溶性馏分。5,6,7,8,10,22相反, 大多数的 pTau 在控制大脑分成 sarkosyl 可溶性分数。5,6,10相比之下, EEA1 主要分成控制和 AD 大脑中的 S1 分数 (图 2C)。在这里, EEA1 作为一个一般标记的大多数本地的, non-pathologic 的蛋白质, 本质上是 sarkosyl 可溶性的5。值得注意的是, 在可溶性分数 (S1) 中, 与 TH S 分数相比, EEA1 的信号稍少一些, 这表明 EEA1 的小池可能 sarkosyl 不溶, 但低于用这种特定抗体检测的西方印迹的限度。同样可能的是, EEA1 在可溶性分数 (S1) 中的信号强度略有下降是由于 EEA1 对 ultracentrifuge 管的非特异性结合, 也可以解释与预期结果稍有偏差。

为了对缩写的单步分馏协议 (图 3A) 的有效性进行基准测试, 对较传统的多级顺序分馏方法 (图 3B), sarkosyl 的相对水平不溶淀粉样前体蛋白 (APP)、tau (MAPT)、小核核糖 U1-70K (snRNP70) 和载脂蛋白 E (载脂蛋白) 通过无标签质谱 (MS) 的蛋白质组学在混合控制 (Ctl), 轻度认知损害 (MCI) 和 AD案例来自以前的研究7,18 (图 3)。洗涤剂不溶性应用的测量有效地代表 a 肽, 因为所有完全胰应用肽定量地映射到 a 区域全长695残滓应用蛋白质7。这两种方法, 在 MCI 和 AD 病例中, 所有四种病理蛋白的 sarkosyl 不溶水平呈上升趋势, 与对照组比较, 与认知衰退和病理负担的强烈相关性一致。总的来说, 这些蛋白质的丰富, 在洗涤剂不溶性分数 (P2) 是显着一致的使用单步18和多级分馏协议7

然而, 这两种方法之间有细微的差异, 这可能证明有利或有害, 这取决于个别实验的确切性质和目标。在图 3中总结的比较蛋白质组数据可能会根据特定的实验参数和应用程序来通知使用哪种协议。正如人们所期望的, 在样品浓缩和纯度之间有一个一般的权衡, 简化的分馏协议提供了比多步骤方法更少的蛋白质损失的更丰富的样品。

例如, 使用简化的协议 (图 3A) 编写的控制不溶性分数比通过多步骤方法制备的疾病相关蛋白的背景水平略高。反之, 单步分馏技术可能有利于丰蛋白, 因为整体样本损失明显减少。例如, 通过缩写的协议 (图 3A) 编写的不溶性分数中, MCI 中 sarkosyl 不溶的载脂蛋白的相对富集显著高。

尽管这两种方法都足以观察到与疾病相关或病理错误蛋白聚合体的任何显著增加, 但多步骤方法的大量和广泛的分馏和洗步可能会产生更清洁和更具体的蛋白质组特征。然而, 我们的数据证实单步分馏法与发表的发现一致, 如 tau 纤维缠结 (NFTs), a 斑块和病朊 (PrSc) 的病理骨料不溶于 sarkosyl,而其本身折叠的对应物仍可溶。5,6,7,8,10,11,23,26

通过计算分割成不溶性控制 (n=3) 和 AD (n=3) 脑 (表 2) 的蛋白质的相对数量, 只有 ~ 10% 的总蛋白池是 sarkosyl 不溶的。当5毫克的脑匀浆总蛋白 (TH S) 的分次, 10.4% 和11.3% 的蛋白质组划分到洗涤剂不溶性分数的控制和 AD 的情况下, 分别。虽然 AD 脑中富含的 sarkosyl 不溶蛋白的总量略高于对照, 但两组间没有显著差异 (p = 0.703)。这表明蛋白质折叠和聚集在 AD 脑中并不普遍, 而是局限于一个狭窄和特定的蛋白质子集, 如 tau、a 和 U1 snRNPs。7,21,22

Figure 1
图 1: Sarkosyl 分馏方案.(a) 死后人脑在低盐缓冲液中均质化, 然后将 sarkosyl 和氯化钠分别添加到1% 瓦/v 和0.5 米的最终浓度, 并在冰上孵育15分钟。在超声后, 匀离心在 18万x g上分馏, 30 分钟, 提供 sarkosyl 可溶性上清 (S1) 和 sarkosyl 不溶性颗粒 (P1)。P1 颗粒 (可选) 用萨克缓冲区和 re-sedimented 离心, 以支付最终 sarkosyl 不溶性颗粒 (P2)。这 P2 分数是溶解在尿素缓冲30分钟室温, 其次是 3 x 5 s 超声与清洁 mircotip 探头。(B) 蛋白质 (20 µg) 从 TH S, S1, S2 (10 µL) 和 P2 分数, 解决了 SDS 页, 固定15分钟马斯亮蓝色定影液后, 温和染色马斯亮明亮的蓝色 G-250 染色缓冲过夜在室温。> 请点击这里查看这个数字更大的版本。

Figure 2
图 2: 在 AD 脑的洗涤剂不溶性部分中磷酸化 tau 的富集.(AB)蛋白 (40 微克) 的总 (TH), 可溶性 (S1) 和不溶性 (P2) 分数被涂抹在苏氨酸 231 (pT231) 或 AT8 (pSer202, pThr205) 的抗体对 tau 磷酸化, 以证明丰富的病理磷 tau 物种在AD 脑的不溶性分数 (P2)。在 AD 脑中, 高分子量聚合头完全分割成洗涤剂不溶 (P2) 分数。(C) EEA1 是一种可溶性蛋白标记物, 是控制和 AD 脑总 (TH S) 和可溶性 (S1) 分数的相对负荷控制。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 使用单步或多级分馏协议的病理 AD 蛋白质的蛋白质组分析.有代表性的 sarkosyl 不溶蛋白应用 (a), tau, snRNP70 (U1-70K) 和载脂蛋白跨不同疾病之间的混合控制, MCI 和 AD 案例使用单步 (A) 或步骤 (B) sarkosyl分馏法。对于这两种数据集, 蛋白质水平是由肽谱匹配 (psm), 这些确定的蛋白质, 并规范化设置最大值为100。psm 从控制、MCI 和 AD 案例 (n=5 ) 分别用于 single-set 数据集。对于多步方法, 分析了来自两个控制池的 psm、MCI 和 AD 案例 (n=5 )。误差线表示平均值± S.E.M. 的值请单击此处查看此图的较大版本.

10% sarkosyl 解决方案: 10 克 n-十二烷基肌钠盐每100毫升的 ddH2O (在 RT 隔夜搅拌)
低盐 (LS) 缓冲: 50 mm HEPES pH 7.0, 250 毫米蔗糖, 1 毫米 EDTA
Sarkosyl (沙克) 缓冲区:LS 缓冲器 + 1% (w/v) sarkosyl + 0.5 米氯化钠
尿素缓冲液 (存储在-20 ° c): 50 毫米三盐酸盐 pH 值 8.5, 8M 尿素, 2% SDS
4X SDS 加载缓冲器: 200 毫米三盐酸盐 ph 6.8, 40% 甘油, 8% 十二烷基 suflate (SDS), 0.4% 溴蓝色 (BPB), 20 mm TCEP ph 7.0 在 ddH2O
马斯亮固定缓冲器: 40% 甲醇, 10% 乙酸在 ddH2O
马斯亮明亮的蓝色 G-250 染色缓冲: 25% 甲醇, 5% 乙酸, 0.1% 马斯亮蓝色 G-250 在 ddH2O
马斯亮 destain 缓冲区: 25% 甲醇, 5% 乙酸在 ddH2O
1X 三缓冲盐水 (TBS): 50 毫米三盐酸盐 pH 7.45, 150 毫米氯化钠在 ddH2O
1X 三缓冲盐水与吐温 20 (TBS/T): 50 毫米三盐酸盐 pH 7.45, 150 毫米氯化钠, 0.1% 吐温20在 ddH2O
1X 阻塞缓冲器 (BB): 50 mm 三盐酸盐 pH 7.45, 150 毫米氯化钠, 1% 专有蛋白质 (见材料列表), 750 mm Methylchloroisothiazolinone 在 ddH2O
1X 阻塞缓冲器, 0.05% 补间 20 (BB/T): 50 毫米三盐酸盐 pH 7.45, 150 毫米氯化钠, 1% 专有蛋白 (见材料列表), 0.05% 吐温 20, 750 毫米 Methylchloroisothiazolinone 在 ddH2O

表 1: 缓冲区列表。

示例 卷样 (µL) 浓度 (µg/µL) 总蛋白 (µg) 平均总蛋白 (µg) 和 S.E.M。 % TH S (5 毫克)
Ctl 1 70 9.89 692。3
Ctl 2 70 7.38 516。6 518.7 (±99.63) 10.4%
Ctl 3 70 4.96 347。2
广告1 70 9.77 683。9
广告2 70 6.67 466。9 567.0 (±63.20) 11.3%
广告3 70 7.86 550。2

表 2: sarkosyl 不溶馏分中的蛋白质量 (P2).平均而言, 分割成 sarkosyl 不溶性分数的蛋白质的百分比 (n= 3) 和 AD (n= 3) 的大脑分别为10.4% 和11.3%。从对照和 AD 脑 sarkosyl 不溶蛋白的数量上没有统计学意义上的差异, 由学生的t测试 (p = 0.703) 和平均值 (S.E.M.) 值的标准误差来证明。

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Discussion

在此, 我们介绍并讨论了一个简化的单步洗涤剂分馏协议, 适用于广泛的各种实验应用范围从质量谱蛋白质组学分析到功能蛋白折叠测定和西部印迹。5,6,7,10这种方法可能是最有效的, 当用于研究神经退行性 proteinopathies, 如阿尔茨海默氏症, ALS, 亨廷顿氏症, 朊病毒疾病和各种 tauopathies。与原来的五步顺序分馏协议相比, 这一步过程可以在一天内完成, 并提供非常相似的结果。5,6,7,9,14,22

该协议的一个重要方面是使用 sarkosyl 作为分馏洗涤剂。与其他洗涤剂类似海卫 X-100 或十二烷基硫酸钠 (SDS), sarkosyl 似乎很适合这项任务;在严格和磷强度方面, 它强大到足以溶解本机折叠的蛋白质的大部分, 同时保持洗涤剂-不, 结构和功能的疾病相关的蛋白质聚合, 本质上是对 SDS 敏感。5,9此外, 与 SDS 不同, sarkosyl 在低温和高盐条件下仍可溶解。

该协议的另一个关键特点是第一轮离心后的第一个 sarkosyl 不溶 (P1) 小球的悬浮。这一洗涤步骤, 使初始颗粒 (P1) 彻底提取和洗涤的任何残留 cross-contaminating 可溶性或总匀浆蛋白, 提供一个纯净的和明确定义的洗涤剂不溶性蛋白质分数。如果没有可选颗粒 (P1) 悬浮和洗涤步骤, 残留可溶性蛋白可以结转到洗涤剂不溶性分数, 可能混淆随后的结果和实验 (即免疫或蛋白质组分析)。

病理错误蛋白聚合体 (tau、磷头和 a 种) 的不溶性和高分子量性质, 对传统生化技术的分离和分析提出了独特的挑战。5,6,7,8,9,12,17,21,26与可溶性蛋白不同, 不溶性聚集物如 amyloids (a) 和 hyperphosphorylated 头纤维缠结 (NFTs) 不能用传统方法 (如沉淀或快速) 从死后组织中轻易纯化。蛋白质液相色谱 (FPLC)。3,5,6,7,11,12,23,27因此, 缩写的 sarkosyl 分馏协议是唯一的技术, 允许在较短的时间内从死后的大脑中简便地浓缩和分离洗涤剂不溶性的蛋白质聚合体。5,6,8,13,15,17,21,27

虽然可以采用额外的步骤来分离一个纯的、同质的聚合蛋白样本, 但 sarkosyl 分馏协议允许对洗涤剂不溶性蛋白质聚合物进行简便的浓缩, 而时间承诺相对较少。5,6为了支持这一假说, sarkosyl 不溶蛋白质组的蛋白质组研究证实, 绝大多数已知的病理性聚集倾向的蛋白质分成 sarkosyl-不溶性 fraction-in 都是传统的多步骤6,11,21以及我们的新单步分馏方法。5,7,9,10

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢 Drs 和利维, 埃默里神经病学系, 提供有用的意见和建议。这项工作的部分资金来自加速医学合作基金 (U01AG046161-02), 埃默里阿尔茨海默病研究中心 (P50AG025688) 和国家老龄补助金研究所 (R01AG053960-01) 运输这项研究也得到了部分的支持, 神经病核心的埃默里神经科学一核心设施补助金, P30NS055077。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) Thermo Fisher 78441 protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) Fisher Scientific FB505110 microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361545 refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor Beckman Coulter 362224 ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall Beckman Coulter 343776 ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer Home-made N/A SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH Thermo Fisher 77720 reducing agent
(TBS) blocking buffer Thermo Fisher 37542 blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 Thermo Fisher 37543 blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well Thermo Fisher NW04120BOX precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher B0002 SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma Aldrich L5777-50G detergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody Chemicon MAB375 antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody Millipore MAB5450 antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) Thermo Fisher MN1020 antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody abcam ab2900 antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A21058 antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A11374 antibodies
iBlot2 Dry Blotting System Thermo Fisher IB21001 Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini Thermo Fisher IB23002 Gel transfer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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生物化学 问题 128 神经 聚合 神经病 proteostasis proteinopathy 淀粉样蛋白 tau sarkosyl 分馏
人死后脑中洗涤剂不溶性蛋白的富集
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Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N.More

Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N. T. Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (128), e55835, doi:10.3791/55835 (2017).

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