Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/55835

Summary

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Abstract

In deze studie beschrijven we een afgekorte-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen. De Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) lost effectief native gevouwen eiwitten in hersenweefsel waardoor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten uit een breed scala van neurodegeneratieve proteinopathies, zoals De ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson en Amyotrofische laterale sclerose en prionziekten. Menselijke controle en AD postmortem hersenen weefsels waren gehomogeniseerde en gesedimenteerd door ultracentrifugatie in aanwezigheid van sarkosyl te verrijken wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten met inbegrip van pathologische gefosforyleerd tau, de belangrijkste component van neurofibrillary klitten in AD. Westelijke bevlekken aangetoond de differentiële oplosbaarheid van geaggregeerde phosphorylated-tau en het wasmiddel-oplosbaar eiwit, vroege Endosome antigeen 1 (EEA1) in controle en AD hersenen. Proteoom analyse bleek ook verrijking van β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), en apolipoproteïne E (beleidsverklaring) in de sarkosyl onoplosbare breuken van AD hersenen vergeleken met die van de controle, consistent met de vorige weefsel fractionering strategieën . Dit eenvoudige verrijking protocol is dus ideaal voor een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van westelijke bevlekken en functionele eiwit co aggregatie testen tot massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Introduction

Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de nauw verwante prionziekten worden gekenmerkt door de geleidelijke accumulatie van proteinopathies wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten in de hersenen met bijbehorende cognitieve achteruitgang. 1 , 2 deze gedeelde pathologische functie wordt beschouwd als een centrale rol in de etiologie en pathofysiologie van deze neurodegeneratieve ziekten. 2 deze aggregaten bestaan meestal uit polymere amyloïde vezels, die zijn samengesteld uit herhalende eenheden van het misfolded eiwit tentoonstellen Kruis β-structuur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemically, amyloïde aggregaten zijn zeer resistent tegen chemische of thermische denaturatie- en solubilisatie,3 , waarin een unieke uitdagingen voor hun zuivering, analyse en studie via traditionele biochemische technieken. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 is niet verwonderlijk dat het wasmiddel onoplosbare eiwitoplossing is de focus van veel onderzoek naar de pathofysiologie van neurodegeneratieve ziekten waarbij de accumulatie van misfolded eiwitten. 6 , 12 , 13 , 14

Biochemische fractionering technieken hebben vaak gebruikt om te verrijken het wasmiddel onoplosbare breuk van postmortem hersenen homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 een van de meest voorkomende methoden omvat de sequentiële winning van weefsel homogenates met buffers en detergentia starheid, gevolgd door ultracentrifugatie te partitioneren van de oplosbare en onoplosbare breuken te verhogen. Een veelgebruikte sequentiële fractionering protocol6,14 houdt de homogenisering van de bevroren weefselmonsters in een wasmiddel-vrije zoutarm (LS)-buffer en de resulterende onoplosbare pellets zijn dan sequentieel geëxtraheerd met buffers met hoog zout, niet-ionogene detergenten, hoge sacharose, zoals Ionische detergentia en tenslotte chaotropes ureum. 6 , 14 een voor de hand liggende nadeel van dergelijke een sequentiële fractionering protocollen is het flink wat tijd en arbeid inzet nodig om ze te voltooien. Waaronder de homogenisering en ultracentrifugatie, een typische vijf stappen fractionering protocol kan duren uren of zelfs dagen in beslag. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 bovendien zoveel pathologische eiwit-aggregaten blijven onoplosbaar in alle, maar de zwaarste omstandigheden19,20 allermeest naar de gegenereerde breuken zijn van beperkte waarde. De minder strenge fractionering stappen met behulp van hoge concentraties van zout en niet-ionogene wasmiddelen zijn dus grotendeels overbodig.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) een uitstekende kandidaat is voor een vereenvoudigde-voor-stapmodus wasmiddel fractionering protocol is. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als een denatureren wasmiddel, sarkosyl is streng genoeg zijn om de overgrote meerderheid van native gevouwen eiwitten in de hersenen solubilize zonder solubilizing misfolded eiwit-aggregaten samengesteld uit bèta-amyloid (Aβ),6,11 gefosforyleerd tau (pTau),6 TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43),14 alpha-synuclein,12,13 scrapie,23 of U1 kleine nucleaire ribonucleoproteins (snRNP's U1) zoals U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Zoals sarkosyl is minder streng zijn dan de alomtegenwoordige anionogene detergentia natrium dodecyl sulfaat (SDS), behoudt het minder robuust oligomere vormen van misfolded eiwit-aggregaten die SDS behandeling niet kunnen weerstaan. 9

We beschreven eerder, een verkorte wasmiddel-fractionering protocol dat vergelijkbaar met de meer bewerkelijke sequentiële fractionering methodologieën resultaten. 5 door het weglaten van de minder strenge fractionering stappen, we konden een facile-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van postmortem menselijke hersenen ontwikkelen. 5 dit gedetailleerde protocol hierin beschreven is geschikt voor een brede waaier van experimentele toepassingen variërend van het westelijke bevlekken en massa spectrometrie gebaseerde proteomics functioneel eiwit misfolding en aggregatie zaaien testen. 5 , 6 , 21

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ethische verklaring: alle weefsels van de hersenen zijn verkregen van de Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) hersenen Bank. Postmortem menselijkeweefsels werden verworven onder juiste institutionele Review Board (IRB) protocollen.

1. homogenisering en fractionering

  1. weefsel selectie
    Opmerking: bevroren postmortem frontale cortex weefsel van gezonde controle (Ctl) en pathologisch bevestigde AD gevallen werden geselecteerd uit de Emory ADRC hersenen bank (n = 2). Post mortem neuropathologische evaluatie van amyloïde plaque verdeling werd uitgevoerd volgens het Consortium om een register voor Alzheimer ' s ziekte semi-kwantitatieve criteria 24, scoren, hoewel neurofibrillary wirwar pathologie was beoordeeld overeenkomstig de Braak tijdelijke systeem. 16
    1. verkrijgen bevroren postmortem hersenweefsel van gezonde controle (Ctl) en pathologisch bevestigde gevallen van het AD. Gebruik makend van containers van droogijs, pincet en een scheermesje, accijnzen ~ 250 mg gedeelten van grijze stof uit elk weefsel monster op getarreerde wegwerp wegen boten, verzorgen om te voorkomen dat het weefsel ontdooien. Het gewicht van elk stuk te worden gehomogeniseerd.
    2. Accijnzen ~ 250 mg van grijze stof via pincet en messcherp visueel inspecteren om te zoeken van de intermediair tussen de buitenste grijze stof en innerlijke witte stof. Vermijd witte stof en nog belangrijker, een grote bloedvaten of bloedige regio's, hersenvliezen of arachnoideavilli mater. Houden van het weefsel door te snel werken en regelmatig wegen boot met hersenweefsel in polystyreen containers met droge ice. tijdens het snijproces bevroren
    3. Record het exacte gewicht van grijze stof weggesneden uit elke bevroren stuk met behulp van een analytische balans. Berekenen van het volume voor zoutarm (LS) buffer (zie tabel 1) nodig voor de homogenisering van de dounce (5 mL/g of 20% w/v).
    4. Bereiden 10 mL LS-buffer met 1 x protease en phosphatase remmer cocktail en chill op ice.
    5. Verwijder gewogen weefsel en wegende boot van droogijs en dobbelstenen in ongeveer 2 x 2 mm stukken als het ontdooit. Overbrenging naar een vooraf gekoeld dounce homogenizer tube van 2 mL op ice.
    6. Voeg toe 5 mL/g (20% w/v) van de ijskoude zoutarm (LS) buffer met 1 X protease en phosphatase remmer cocktail.
    7. Homogenize het hersenweefsel op ijs met behulp van ongeveer 10 slagen van hoge klaring stamper A en 15 lijnen van lage klaring stamper B.
    8. Alle homogenaat overbrengen in een polypropyleen tube van 2 mL, met behulp van een glazen pipet van Pasteur. Label van de buis met “ TH ” (totale homogenaat), het weefsel kast nummer, en homogenaat volume. Aliquot 0.8 mL in een gelabelde 1,5 mL-buis. Eventuele overtollige homogenaat kunnen ook aliquoted en opgeslagen bij -80 ° C.
    9. Aan elke 0.8 mL aliquoot, toevoegen 100 µL van 5 M NaCl en 10% (m/v) sarkosyl aan concentraties van 0,5 M en 1% w/v, respectievelijk. Meng buizen goed door inversie en incubeer op ijs voor 15 min. Label buizen met " TH-S " (totale homogenaat-Sarkosyl) om aan te geven dat de homogenates in sarkosyl-buffer (tabel 1).
    10. Bewerk ultrasone trillingen ten elke buis voor drie 5 s pulsen bij 30% amplitude op ijs (maximale intensiteit = 40%) met behulp van een microtip-sonde.
    11. bepalen de eiwit-concentratie van de homogenates met behulp van het bicinchoninic zuur (BCA) assay 25 methode.
      Opmerking: De gemiddelde eiwitconcentratie van TH-S homogenates voorbereid op een 5 mL LS per gram weefsel is 15-20 mg/mL. De homogenates kan worden gefractioneerde onmiddellijk of opgeslagen bij-80 ° C tot gebruik.
    12. Verdund TH-S homogenates tot 10 mg/mL ijskoud sark buffer (tabel 1) met 1 x protease en phosphatase inhibitors.
    13. Transfer 5 mg proteïne (0,5 mL) van elke TH-S homogenaat in 500 µL polycarbonaat ultracentrifuge buizen en paar-evenwicht met sark-buffer. Buizen in een vooraf gekoeld rotor en de ultracentrifuge bij 180.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. overdracht de sarkosyl oplosbare supernatant (S1) 1,5 mL buizen laden en opslaan bij -80 ° C.
      Opmerking: (Optionele wash) toevoegen 200 µL van sark-buffer naar de ultracentrifuge buizen waarin het wasmiddel onoplosbare breuken (P1) en het verjagen van de pellets (P1) vanaf de onderkant van de ultracentrifuge buizen met behulp van een pipet tip van 200 µL.
    14. Kort pulse-spin de omgekeerde buizen voor 2-3-s (≤ 2500 x g) op een microcentrifuge de pellets (P1) en de buffer overbrengen naar de 1,5 mL tubes hieronder. Resuspendeer de onoplosbare pellets (P1) in de sark-buffer door pipetteren omhoog en omlaag om ervoor te zorgen de pellet is verstoord.
    15. Paar-evenwicht en centrifuge op 180.000 x g voor een extra 30 min bij 4 ° C.
    16. Verwijder de optionele wassen supernatant (S2) en Incubeer de sarkosyl onoplosbare pellets (P2) in 50-75 µL van ureum buffer (tabel 1) met 1 x plaatje (protease en phosphatase remmer cocktail) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur laten solubilize de pellet.
      Opmerking: Warme ureum buffer tot kamertemperatuur alvorens gebruik te vermijden van SDS neerslag. Voor wasmiddel-gevoelige toepassingen, SDS uit ureum buffer weglaten en overwegen de onoplosbare pellet (P2) wassen in laag zout buffer vóór de resuspending in ureum buffer.
    17. Overboeken van de geresuspendeerde pellets (P2) 0,5 mL buizen en met korte (1 s) microtip ultrasoonapparaat bij 20% amplitude (maximale intensiteit = 40%) tot volledig solubilize van de pellets.
    18. Bepalen de concentraties van de eiwitten van de sarkosyl oplosbare (S1) en onoplosbare (P2) fracties met behulp van de BCA assay methode. Deze fracties onmiddellijk gebruik of Bewaar bij-80 ° C tot gebruik of.

2. Immunoblotting

  1. westelijke bevlekken
    Opmerking: westelijke bevlekken werd uitgevoerd volgens de procedures van de eerder gemelde met lichte wijzigingen. 5 , 10
    1. bereiden 40 µg monsters van totale homogenates (TH-S), sark-oplosbare (S1) en sark onoplosbare (P2) breuken in 1 X Laemmli SDS-pagina monster buffer met pH 7 van de TCEP van de 5 mM. Incubeer monsters bij 95 ° C gedurende 5 min.
    2. Load monsters op een geprefabriceerd 10-well 4-12% Bis-Tris SDS-pagina gel. Electrophorese op 80 V voor de eerste centimeter (10 min) en 120 V voor de rest (60 min) of tot de tracking-kleurstof de onderkant van de gel bereikt.
    3. Kunt een verse scheermesje en gel mes split-open de voorgegoten gel-cassette. Zachtjes weg knippen de kammen en de onderkant van de gel met een frisse scheermesje.
    4. Resuspendeer de onoplosbare pellets (P1) in 200 µl sark-buffer met 1 x PIC door pipetteren op en neer.
    5. Overdracht naar een membraan van 0,2 µm nitrocellulose een Bevlekkende machine met behulp van een van de droge overdrachtmethode (Zie de tabel van de materialen).
    6. Blokkeren het membraan in de blokkeerbuffer (BB) zonder Tween 20 voor 30 min, volgde met BB met 0,05% Tween-20 (BB/T) voor 30 min. Spoel na het blokkeren, het membraan in TBS/T (0,1% Tween 20) voor 5 min voor het verwijderen van overtollige blokkeerbuffer.
    7. Voorbereiden 1:1,000 verdunningen van het pT231 van de primaire antilichamen, Tau-2 (pan tau), AT8 en EEA1 in BB/T (0,05% Tween 20).
    8. Broeden de membranen in primair antilichaam oplossing 's nachts bij 4 ° C met circulaire agitatie. Spoel het membraan in TBS/T voor 3 x 15 min.
    9. Sonde het membraan met een verdunning van de 1:20,000 van de fluorescently-label in de buurt van-IR secundair antilichaam in BB/T gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in duisternis op shaker. Spoel het membraan voor 3 x 10 min in TBS/T en 2 x 5 min in eetlepels
    10. Scannen het membraan met behulp van een infrarood imaging systeem bij de juiste excitatie golflengte (b.v. 700 nm (rode kanaal) voor infrarood kleurstof 680 geit anti-muis IgG (H + L) secundaire en 800 nm (groene kanaal) voor infrarood kleurstof 790 ezel anti-konijn IgG (H + L ) secundaire).
    11. De imaging software gebruiken om te kwantificeren signaal intensiteit en het uitvoeren van densitometrie metingen volgens de fabrikant ' s instructies, zorgen voor auto-achtergrond instellen is ingesteld op het gemiddelde van de gehele achtergrond.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De verkorte-voor-stapmodus sarkosyl-fractionering-protocol is gebruikt voor het verrijken van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van controle en AD postmortem hersenen (Figuur 1). Eiwitten uit TH-S, S1, S2 en P2 breuken werden opgelost door SDS-PAGE, vaste gedurende 15 min. in Coomassie blue kleefpoeders buffer gevolgd door zachte vlekken met Coomassie briljant blauw G-250 kleuring buffer. De resuspensie stap is optioneel, omdat er niet detecteerbaar niveaus van proteïne in de Fractie van de S2 (zie 1.1.14). Westelijke vlekkenanalyse (figuur 2A en B) blijkt dat in AD de hersenen, de pathologische hoge moleculaire gewicht gefosforyleerd tau aggregaten sarkosyl onoplosbare waren en zeer weinig pTau bleef in de Sarkosyl oplosbare breuken. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 en omgekeerd, de meerderheid van de pTau in controle hersenen gepartitioneerd in de sarkosyl-oplosbare fractie. 5 , 6 , 10 daarentegen EEA1 voornamelijk partities in de S1 breuk in zowel controle als AD hersenen (figuur 2C). Hier, fungeert EEA1 als een algemene teller voor meest native, niet-pathologische proteïnen toe die inherent sarkosyl oplosbare5. Met name is er iets minder signaal voor EEA1 in de oplosbare fractie (S1) ten opzichte van de Fractie van de TH-S, die aangeeft dat een kleine groep van EEA1 waarschijnlijk sarkosyl onoplosbare, nog onder de limiet van detectie door westelijke vlek met deze specifieke antilichaam is. Het is ook mogelijk dat de lichte afname van de signaalsterkte van EEA1 in de oplosbare fractie (S1) te wijten aan niet-specifieke binding van EEA1 aan de ultracentrifuge buizen is uitleggen ook de lichte afwijking van de verwachte resultaten.

De werkzaamheid van het protocol van de verkorte-voor-stapmodus fractionering (figuur 3A) tegen de meer traditionele scriptingregel sequentiële fractionering methodologie (figuur 3B), het relatieve niveau van sarkosyl onoplosbare benchmark amyloïde precursor eiwit (APP), tau (MAPT), kleine nucleaire ribonucleoprotein U1 - 70K (snRNP70) en apolipoproteïne E (beleidsverklaring) werden vergeleken door label-vrije massaspectrometrie (MS) gebaseerd proteomics over gebundelde controle (Ctl), milde cognitieve stoornissen (MCI) en AD gevallen van eerdere studies7,18 (Figuur 3). Metingen van wasmiddel onoplosbare APP effectief vertegenwoordigt de Aβ peptide, als alle volledig al APP peptiden gekwantificeerd toegewezen aan de regio Aβ van de volledige lengte 695 residu APP eiwit7. Met beide methoden trended de sarkosyl onoplosbare niveaus van alle vier pathologische eiwitten omhoog in MCI en AD gevallen ten opzichte van de besturingselementen, consistent met de sterke correlatie van cognitieve achteruitgang en pathologische Last. Verrijking van deze eiwitten in het wasmiddel onoplosbare breuken (P2) waren over het algemeen opvallend consistent met zowel de-voor-stapmodus18 en scriptingregel fractionering protocollen7.

Er zijn echter kleine verschillen zijn tussen de twee methoden die voordelige of schadelijke afhankelijk van de exacte aard blijken kunnen en doelstellingen van een individuele experiment. De gegevens van de vergelijkende proteomic samengevat in Figuur 3 kan meedelen welk protocol u moet gebruiken afhankelijk van specifieke experimentele parameters en toepassingen. Zoals men verwachten zou, is er een algemene trade-off tussen monster verrijking en zuiverheid, met het protocol van de vereenvoudigde fractionering meer verrijkte monsters met minder verlies van eiwitten dan de methode scriptingregel bieden.

Bijvoorbeeld, vertonen onoplosbare breuken controle opgesteld op basis van het vereenvoudigde protocol (figuur 3A) iets hoger achtergrondniveaus van ziekte-relevante eiwitten dan die bereid via de multi-stap-benadering. Omgekeerd, de techniek-voor-stapmodus fractionering voordeel kan opleveren voor lage-overvloed eiwitten als het totale monster verliezen zijn aanzienlijk verminderd. Bijvoorbeeld, is de relatieve verrijking van sarkosyl onoplosbare APOE in MCI gevallen significant hoger in de onoplosbare breuken bereid via het verkorte protocol (Figuur 3A).

Hoewel beide benaderingen meer dan voldoende zijn te observeren van een aanzienlijke toename van de ziekte-relevant of pathologische misfolded eiwit-aggregaten, de talrijker en uitgebreide fractionering en wassen stappen van de scriptingregel aanpak kunnen genereren een schoner en de meer specifieke proteomic handtekening. Niettemin, onze gegevens verifiëren dat de methode-voor-stapmodus fractionering strookt met de gepubliceerde bevindingen zijn pathologische aggregaten zoals tau neurofibrillary klitten (NFTs), Aβ plaques en scrapie prionen (PrSc) onoplosbaarin sarkosyl, terwijl hun native gevouwen tegenhangers oplosbaar blijven. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26

Door berekening van de relatieve hoeveelheden eiwit dat in het wasmiddel onoplosbare breuken van controle verdelen (n = 3) en AD (n = 3) hersenen (tabel 2), alleen ~ 10% van de totale proteïne-pool is sarkosyl onoplosbare. Wanneer de totale proteïne 5 mg van hersenen homogenaat (TH-S) is gespreide, 10,4% en 11,3% van de Proteoom partities in het wasmiddel onoplosbare breuk in controle en AD, respectievelijk. Hoewel de totale hoeveelheid sarkosyl-onoplosbaar eiwit verrijkt in AD hersenen iets hoger dan controle is, geen significante verschillen tussen de twee groepen werden waargenomen (p = 0.703). Dit geeft aan dat eiwit misfolding en aggregatie is niet wijdverbreid in AD hersenen, maar eerder beperkt tot een smalle en specifieke subset van eiwitten zoals tau, Aβ en U1 snRNP's. 7 , 21 , 22

Figure 1
Figuur 1: Sarkosyl fractionering regeling. (A) A postmortem menselijk brein was gehomogeniseerd in laag zout buffer, waarna sarkosyl NaCl werden toegevoegd aan de eindconcentraties van 1% w/v en 0.5 M, respectievelijk en 15 min op ijs ge¨ uncubeerd. Na ultrasoonapparaat, de homogenates werden gefractioneerde door ultracentrifugatie bij 180.000 x g gedurende 30 min het sarkosyl oplosbare supernatant (S1) en de sarkosyl onoplosbare pellet (P1). De P1-pellet was (optioneel) gewassen met sark-buffer en re-gesedimenteerd door ultracentrifugatie veroorloven de laatste sarkosyl onoplosbare pellet (P2). Dit gedeelte van P2 was ontbindend in ureum buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 3 x 5 s ultrasoonapparaat met een schone microtip-sonde. (B) eiwitten (20 µg) uit TH-S, S1, S2 (10 µL) en P2 breuken werden opgelost door SDS-PAGE, vaste gedurende 15 min. in Coomassie blue kleefpoeders buffer gevolgd door zachte vlekken met Coomassie briljant blauw G-250 kleuring buffer's nachts bij kamertemperatuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: verrijking voor phosphorylated-tau in het wasmiddel onoplosbare Fractie van AD hersenen. (A en B) Eiwit (40 μg) van het totaal (TH-S), oplosbare (S1) en onoplosbare (P2) breuken waren uitgewist met een antilichaam tegen tau phosphorylated op threonine 231 (pT231) of AT8 (pSer202, pThr205) om aan te tonen van de verrijking van pathologische phospho-tau soorten in de onoplosbare breuk (P2) van AD hersenen. In AD hersenen, geaggregeerde ultrahoog moleculair gewicht tau uitsluitend partities in het wasmiddel onoplosbare (P2) breuk. (C) EEA1 diende als een oplosbaar eiwit marker en relatieve laden controle voor de totale (TH-S) en oplosbare (S1) breuken van controle en AD hersenen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Proteoom analyse van pathologische AD eiwitten met een protocol-voor-stapmodus of scriptingregel fractionering. Relatieve niveaus van de representatieve sarkosyl onoplosbare eiwitten APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) en beleidsverklaring over verschillende ziekten onder gebundeld controle, MCI en AD gevallen met de enkele stap (A) of sarkosyl scriptingregel (B) fractionering aanpak. Voor beide datasets, werd eiwit niveau geschat door peptide spectrale wedstrijden (PSMs) van deze eiwitten geïdentificeerd, en om te stellen het maximum op 100 genormaliseerd. PSMs van controle, MCI en AD gevallen (n = 5 elke) werden gebruikt voor de single-set dataset. Voor de scriptingregel benadering, PSMs uit twee repliceren pools van controle, MCI en AD gevallen (n = 5 elke) werden geanalyseerd. Foutbalken geven de waarden van gemiddelde ± S.E.M. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

10% w/v sarkosyl oplossing: 10 g N-lauryl-sarcosine natriumzout per 100 ml ddH2O (roer op RT's nachts)
Laag zout (LS) buffer: 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM sacharose, 1 mM EDTA
Buffer Sarkosyl (sark): LS-buffer + 1% (m/v) sarkosyl + 0.5 M NaCl
Ureum buffer (opslag bij -20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8 M ureum, 2% SDS
4 X SDS laden buffer: 200 mM Tris-HCl pH 6.8, 40% glycerol, 8% natrium dodecyl suflate (SDS), 0,4% bromophenol blauw (BPB) en 20 mM TCEP pH 7.0 in ddH2O
Coomassie kleefpoeders buffer: 40% Methanol, 10% azijnzuur in ddH2O
Coomassie briljant blauw G-250 kleuring buffer: 25% Methanol, 5% azijnzuur, 0,1% coomassie blue G-250 in ddH2O
Coomassie destain buffer: 25% methanol, 5% azijnzuur in ddH2O
1 X Tris gebufferde zoutoplossing (TBS): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl in ddH2O
1 X Tris gebufferde zoutoplossing met tween-20 (TBS/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20 in ddH2O
1 X blokkeren buffer (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% private eiwit (zie lijst van de materialen), 750 mM Methylchloroisothiazolinone in ddH2O
1 X blokkeren buffer met 0,05% Tween-20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% private eiwit (zie lijst van de materialen), 0,05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone in ddH2O

Tabel 1: Buffers lijst.

Monster Volume monster (µL) Concentratie (µg/µL) Totaal eiwit (µg) Gemiddelde totale eiwitten (µg) en S.E.M. % TH-S (5 mg)
CTL 1 70 9.89 692.3
CTL 2 70 7.38 516.6 518.7 (±99.63) 10,4%
CTL 3 70 4,96 347.2
AD 1 70 9.77 683,9
AD 2 70 6.67 466.9 567.0 (±63.20) 11,3%
AD 3 70 7.86 550,2

Tabel 2: Eiwit bedrag in sarkosyl onoplosbare breuken (P2). Gemiddeld, het percentage van de eiwitten die partities in de Fractie sarkosyl onoplosbare van controle (n= 3) en AD (n= 3) hersenen was 10,4% en 11,3%, respectievelijk. Was er geen statistisch significant verschil van de hoeveelheid sarkosyl onoplosbare eiwitten van controle en AD de hersenen, zoals blijkt uit de door de student t-test (p = 0.703) en de standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.) waarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin we introduceren en bespreken van een verkorte-voor-stapmodus wasmiddel-fractionering protocol dat is van toepassing op een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van proteomics massa spectrometrie gebaseerde analyse tot functionele eiwit misfolding testen en westelijke bevlekken. 5 , 6 , 7 , 10 deze methodologie is misschien wel de meeste effectieve wanneer gebruikt bij het bestuderen van neurodegeneratieve proteinopathies zoals Alzheimer, ALS, de ziekte van Huntington, prionziekten en de verschillende tauopathies. In vergelijking met de originele vijf stappen sequentiële fractionering protocol, deze procedure-voor-stapmodus in één dag kan worden voltooid en biedt zeer vergelijkbare resultaten. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22

Een belangrijk aspect van dit protocol is het gebruik van sarkosyl als het fractionering wasmiddel. In tegenstelling tot andere reinigingsmiddelen zoals Triton X-100 of natrium dodecyl sulfaat (SDS) lijkt sarkosyl te zijn zeer geschikt voor deze taak; in termen van starheid en solubilizing van kracht, is het sterk genoeg om de solubilize van de meerderheid van de native gevouwen eiwitten met behoud van het wasmiddel-oplosbaarheid, structuur en functie van ziekte-relevante eiwit-aggregaten die inherent gevoelig voor SDS. 5 , 9 bovendien, in tegenstelling tot SDS, sarkosyl oplosbare bij lage temperaturen en blijft in hoge zout voorwaarden.

Een ander belangrijk kenmerk van dit protocol is de resuspensie van de eerste sarkosyl onoplosbare (P1) pellets die na de eerste ronde van ultracentrifugatie. Deze wassen stap staat de eerste pellets (P1) grondig worden geëxtraheerd en gewassen van eventuele resterende Kruis-besmetten oplosbare of totale homogenaat eiwitten, die een zuiver en welomschreven wasmiddel onoplosbare eiwitoplossing. Zonder de optionele pellet (P1) resuspensie en wassen stap, residuele oplosbare eiwitten kunnen worden uitgevoerd-over in de wasmiddel onoplosbare breuk, mogelijk verstorende latere resultaten en experimenten (d.w.z. immunoblotting of proteomics analyse).

De aard van de onoplosbare en hoge molecuulgewicht van pathologische misfolded eiwit aggregaten (d.w.z. tau, phospho-tau en Aβ soorten) huidige unieke uitdagingen naar hun isolement en analyse via traditionele biochemische technieken. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 in tegenstelling tot oplosbare eiwitten, onoplosbare aggregaten zoals amyloids (Aβ) en hyperphosphorylated tau neurofibrillary klitten (NFTs) kunnen niet worden gemakkelijk gezuiverd van postmortem weefsel door traditionele methoden zoals immunoprecipitation of snel eiwit vloeistofchromatografie (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 aldus het verkorte sarkosyl-fractionering-protocol is een van de enige technieken die het mogelijk maakt facile verrijking en isolatie van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van postmortem hersenen binnen een relatief korte tijd-frame. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27

Terwijl extra stappen kunnen worden gebruikt om te isoleren van een pure, homogene steekproef van geaggregeerde eiwit, is het sarkosyl fractionering protocol voorziet van de facile verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten met relatief weinig tijdverplichting. 5 , 6 ter ondersteuning van deze hypothese, proteomic studies van de sarkosyl onoplosbare Proteoom bevestigen dat de overgrote meerderheid van bekende pathologische aggregatie-naar voren gebogen eiwitten in de sarkosyl onoplosbare Fractie-in zowel traditionele scriptingregel verdelen 6 , 11 , 21 , alsmede onze roman-voor-stapmodus fractionering aanpak. 5 , 7 , 9 , 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken Drs. Jim Lah en Allan Levey, Emory afdeling Neurologie, voor nuttige opmerkingen en suggesties. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de versnelde geneeskunde partnerschap grant (U01AG046161-02), the Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) en een National Institute on Aging toekennen (R01AG053960-01) N.T.S. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk gesteund door de Neuropathologie kern van de Emory Neuroscience NINDS Core faciliteiten subsidie, P30NS055077.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) Thermo Fisher 78441 protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) Fisher Scientific FB505110 microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361545 refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor Beckman Coulter 362224 ultracentrifuge rotor
500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall Beckman Coulter 343776 ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer Home-made N/A SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH Thermo Fisher 77720 reducing agent
(TBS) blocking buffer Thermo Fisher 37542 blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 Thermo Fisher 37543 blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well Thermo Fisher NW04120BOX precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher B0002 SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma Aldrich L5777-50G detergent
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody Chemicon MAB375 antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody Millipore MAB5450 antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) Thermo Fisher MN1020 antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody abcam ab2900 antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A21058 antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher A11374 antibodies
iBlot2 Dry Blotting System Thermo Fisher IB21001 Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini Thermo Fisher IB23002 Gel transfer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
  23. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Tags

Biochemie kwestie 128 neurodegeneratie aggregatie Neuropathologie proteostasis proteinopathy amyloid tau sarkosyl fractionering
Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N.More

Diner, I., Nguyen, T., Seyfried, N. T. Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (128), e55835, doi:10.3791/55835 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter